Rekombinasi Genetik

7,637 views
7,325 views

Published on

PPT ini merupakan salah satu materi kuliah BIOTEKNOLOGI yang ditulis oleh Trianik Widyaningrum, M.Si. (dosen Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta).

Butuh lebih banyak materi biologi..???
http://belajar-di-rumah.blogspot.com/

Published in: Education
9 Comments
12 Likes
Statistics
Notes
No Downloads
Views
Total views
7,637
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
70
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
9
Likes
12
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Rekombinasi Genetik

  1. 1. REKOMBINASI GENETIK
  2. 2.  Rekombinasi genetik ialah pembentukan susunan gen baru dengan jalan pemindahan segment DNA dari satu sel ke sel yang lain, yang mampu bereplikasi, ditranskripsi dan ditranslasi. Rekombinasi ini dapat terjadi secara alamiah dan dapat dibuat / direkayasa.
  3. 3. DNA REKOMBINANRekayasa genetic Rekayasa genetic adalah teknik untuk menghasilkan molekul DNA yang berisi gen baru yang diinginkan atau kombinasi gen- gen baru atau dapat dikatakan menipulasi organisme. “To clone = to make identical coples”
  4. 4. Gen Cloning Gen cloning ialah isolasi dan pemurnian gen spesifik dan memindahkan serta menyisipkan gen yang diinginkan dari genom besar yang komplek ke genom kecil yang lebih sederhana kemudian memperbanyak (replikasi) DNA rekombinan ini, dan memasukkan pada sel inang.
  5. 5. Pembuatan DNA rekombinan dapat dibagi menjadi beberapa langkah.1. Isolasi sumber DNA yang diinginkan, ini dapat dikerjakan dengan 3 cara; a) DNA dapat berasal dari total genomic organisme yang diinginkan. Isolasi ini dapat dilakukan dengan bermacam-macam cara. b) DNA yang dibuat dari mRNA yang diisolasi dari jaringan tertentu. Complementary DNA (cDNA) dibuat dengan template mRNA tadi dengan menggunakan enzim ”reverse transcriptase” c) Dapat juga dengan DNA yang dibuat secara invitro dari nukleotida dan enzim polimerase DNA
  6. 6. 2. Pemotongan gen spesifik yang di inginkan, pemotongan ini dilakukan dengan Enzim endonukease restriksi. Enzim ini dapat memutus rantai DNA pada urutan-urutan tertentu yaitu pada gugus urut-urutan palindrom yang spesifik untuk enzim tersebut. Enzim endonukease restriksi tertentu hanya dapat memutus rantai DNA pada urut-urutan tertentu saja, namun dapat bekerja terhadap DNA yang berasal dari organisme apa saja. Jadi suatu fragmen DNA dapat disambung ke DNA lain kalau keduanya diputus endonukease restriksi yang sama. Beberapa enzim endonuklease restriksi memotong dengan menghasilkan ujung tumpul (”blunt end”) contohnya Hindll; dan beberapa yang lain menghasilkan ujung lekat (”sticky end”) misalnya ECORI.
  7. 7. Enzim Restriksi untuk memotong DNA: Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali olehHerbert Boyer pada tahun 1969 dari E.coli. Enzim EcoRImemotong pada bagian antara basa G dan A pada sekuens GAATTC.
  8. 8. 3. Langkah senjutnya ialah menyisipkan gen yang diinginkan ini ke alat pembawa (”cloning vektor”). Vektor ini dapat plasmid. Bacteriofag atau kosmid. Jadi menyambung gen yang telah dipotong tadi ke DNA vektor.
  9. 9.  Penyambungan DNA dilakukan dengan ”enzim ligase”. Seperti telah dikatakan dimuka DNA-DNA yang dipotong dengan enzim endonukease restriksi yang sama akan dapat disambungkan. Hanya saja, kalau pemotongan itu menghasilkan ujung yang lekat, karena ujung-ujung fragmen tadi saling dapat berpasangan.
  10. 10.  Jika hasil pemotongan DNA dengan enzim endonukease restriksi itu ujungnya tumpul tidak dapat disambung. Untuk dapat disambung pada ujung, perlu ditambahkan fragmen DNA. Ada 3 cara penambahan; n Penambahan ekor homopolimer n Penambahan linker n Penambahan adaptor  
  11. 11. Penambahan ekor homopolimer Penambahan ekor homopolimer dilakukan dengan menggunakan enzim terminal transferase. Sedang untuk penyambungannya dengan enzim ligase. (gambar 6) mula-mula plasmid dipotong dengan menggunakan enzin endonuklease restriksi yang menghasilkan ujung tumpul, kemudian diberi ekor poli-T dengan menambahkan dTTP dan enzim terminal transferase. Ekor poli-A pada DNA yang diinginkan akan berpasangan dengan ekor poli-T pada plasmid. Dengan enzim ligase terbentuklah DNA rekombinan atau DNA Khimera.
  12. 12. Penambahan linker Linker merupakan potongan DNA rantai ganda yang dibuat secara invitro dengan urutan nukleotida yang ditetapkan (Caheller et al., 1997). Molekul ini disambungkan pada ujung-ujung tumpul DNA asing yang akan disisipkan/ diinginkan dengan enzim ligase. Kemudian diperlakukan dengan enzin endonuklease restriksi tertentu yang telah disesuaikan dengan pembuatan linker tadi. Setelah terbentuk ujung lekat (”sticky ended”) maka potongan DNA disisipkan ke vektot yang telah dipotong dengan endonuklease restriksi yang sama (gambar 7)
  13. 13. Penambahan adaptor Adaptor seperti juga linker merupakan segmen atau potngan pendek DNA yang dibuat secara invitro, dengan ujung satu lekat satu tumpul, tidak tumpul semula pada linker (Wu et al,. 1978). 1) Misalnya DNA asing yang berisi sisi Bam HI yang akan disisipkan ke vektor dengan tempat pemotongan BamHI. 2) Molekul adaptor Bam mempunyai ujung tumpul dengan gugus fosfat pada ujung 5’ dan ujung yang tidak lekat. 3) Adaptor kemudian disambungkan pada DNA yang akan disispkan 4) DNA asing dengan adaptor yang ditambahkan kemudian difosforilasi pada ujung 5’ yang akhirnya disisipkan pada vektor (gambar 8)
  14. 14. VektorAlat pemindah gen yang diinginkan / dipindahkan, atau ”DNA carrier” disebut ”vektor”. Dikenal 4 macam vektor yang banyak digunakan dalam rekayasa genetik. Plasmid Bacteriophage lambda Kosmid Bacteriophage rantei tunggal (phage M13)Bacteriophage lambda dan phage M13 adalah virus, sedangkan kosmid ialah gabungan “Cohesive ends“ bakteriophage dan plasmid.
  15. 15. Plasmid sebagai VektorSifat-sifat berikut adalah sifat-sifat yang dimiliki plasmid sehingga plasmid sesuai digunakan untuk vektor dalam rekayasa genetik.2) Ukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dalam keadaan utuh3) Mempunya bentuk DNA sirkuler sehinggan tetap stabil pada saat diisolasi4) Melangsungkan independent replikasi/replikasi sendiri, sehingga replikasi berlangsung diluar kontrol sel.5) Terdapat dalam beberapa copy di dalam sel6) Kerap kali memiliki gen untuk resistensi terhadap antibiotik sehingga memudahkan detaksi dan seleksi terhadap plasmid yang berisi gen yang diinginkan.
  16. 16. PLASMIDDALAMPEMBENTUKANDNAREKOMBINAN
  17. 17. Untuk dapat digunakan sebagai vektoryang baik plasmid harus memenuhi sifat- sifat berikut : Harus berukuran kecil Termasuk golongan plasmid “relaxed“ Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau lebih enzin restriksi pada tempat yang tidak esensiil untuk replikasi.Dari plasmid-plasmid yang memenuhi kriteria- kriteria tersebut yang paling banyak dipakai ialah pBR 322.
  18. 18. Sifat-sifat plasmid pBr 322 ialah: Relatif kecil dengan berat molekul 2,6 x 106 Stabil, bertahan pada sel inang (host) dengan jumlah 1-20 copy/sel Dapat diperbanyak jumlahnya sampai 1.000 – 3.000 copy tiap sel (dengan jalan menghambat sintesa protein) DNA asing yang besar (sampai 10 kilobasa) dapat disisipkan Telah diketahui urut-urutan nukleotida sebanyak 4362 nukleotida secara komplit Mempunyai sisi pemutus tunggal untuk enzim restriksi PstI, SalI, EcoRI, HindIII, BamHI Mempunyai dua penanda resistensi untuk antibiotik ampicilin dan tetrasiklin, sehingga mudah diseleksi.
  19. 19. Sel inangSel inang yang baij digunakan untuk gene yang diklonkan harus mempunyai sifat-sifat antara lain:2) Cepat tumbuh3) Mampu tumbuh pada mediun kultur yang murah4) Tidak pathogenik5) Stabil dalam kultur
  20. 20. Dengan demikian E.coli banyak digunakan karena E.coli mempunyai sifat-sifat berikut:n Tumbuh dengan cepatn Kebutuhan nutrisi sederhanan Informasi genetiknya sudah banyak diketahui dengan baikn Kemampuan E.coli untuk dapat menyokong/menampung tumbuhnya hampir semua bakteriophage.
  21. 21.  Tetapi ternyata masih ada kekurangan karena E.coli berbahaya kalau dipakai dalam jumlah besar, sebab E.coli biasa jidup pada usus dan potensial untuk menjadi pathogenik. Namun telah dapat dibuat modifikasinya untuk menghilangkan kekurangan tersebut, dan karena proses biokimianya dan genetika E.coli sudah banyak diketahui maka E.coli merupakan sel inang yang paling banyak dipakai untuk mempelajari kloning. Disamping E.coli, Bacillus subtilis dan khamir Saccharomyces cerevisiae juga banyak dipakai.
  22. 22. 3. Memasukkan DNA rekombinan yang terbentuk ke sel inangMemasukkan DNA rekombinan atau khimera DNA (yaitu vektor yang berisi genom yang diinginkan/disisipkan) ke dalam sel inang dapat dilakukan dengan;2) Transformasi3) Transfeksi4) DNA-packaging5) Microinjection
  23. 23. Transformasi Masuknya molekul DNA apa saja ke sel hidup (baik sel prokariotik maupun eukariotik) disebut transformasi. (Brown, 1986). Teknik transformasi pada E.coli dengan perlakuan CaCl 2 yamg dilakukan oleh Mendel dan Higa (1970) menunjukkan bahwa E.coli dapat menyerap DNA bakteriophage lambda; dan pada percobaan selanjutnta oleh Cohen et al., 1972 menunjukkan E.coli dapat juga menyerap DNA plasmid dengan perlakuan sama (CaCl2) menyebabkan prespitasi DNA pada dinding sel bagian luar, dan mungkin garam tersebu menyebabkan terjadinya perubahan dinding sel yang menaikkan kemampuan mengikat DNA. Pengruh perendaman hanyalah pengikat DNA pada dinding sel , tidak penyerapan masuk ke sel. Jadi pada saat DNA ditambahkan ke sel yang sudah diperlakukan hanya terjadi pengikatan DNA pada bagian luar dinding. DNA baru masuk meresap ke sel setelah suhu dinaikkan 0
  24. 24. Transfeksi Transfeksi sama dengan transformasi, hanya perbedaanya pada transfeksi yang masuk bukan plasmid tetapi DNA phange atau virus. Seperti juga dengan plasmid; DNA phange juga dicampurkan dengan sel E.coli yang sudah mengalami perlakuan, kemudian masuknya DNA diinduksi dengan kejutan pemberian panas (”heat- shock”)
  25. 25. DNA-packaging Transfeksi dengan molekul DNA lambda tidak begitu efisien dibanding deng n infeksi sel dengan partikel phange yang masak. Maka lebih efisien kalauu molekul DNA phange itu dikemas di dalam partikel phange.
  26. 26. Microinjection Cara lain untuk memasukkan DNA ialah dengan microinjection yaitu suatu cara yang menggunakan jarum yang sangat kecil (super kecik) yang dipakai untuk menyuntikkan atau memasukkan molekul DNA secara langsung ke inti sel yang di traansformasi. Di sini DNA tidak perlu disematkan pada vektor, sebab biasanya penggabungan DNA pada kromosom inang dapat terjadi.
  27. 27. 4. Menyeleksi clone (rekombinan)Untuk menyeleksi sel bakteri yang mengandung vektor yang berisi gen yang kita inginkan dapat ditempuh beberapa cara yaitu:2) Cara genetik3) Hibridisasi asam nukleat4) Immunokimia
  28. 28.  Diambil contoh cara genetik dengan vektor plasmid dan sel inangnya E.coli . Plasmid yang dipakai sebagai vektor berisi dua gen resisten terhadap antibiotik yaitu tetrasiklin dan ampisilin. Plasmid dipotong dengan endonuklease spesifik yang memotong gen resisten ampisilin. Den asing yang diinginkan disisipkan pada tengah-tengah gen resisten terhadap ampisilin, maka gen ini tidak aktif lagi. Jadi plasmid yang berisi gen yan diinginkan tidak akan tumbuh pada media yang berisi ampisilin.
  29. 29. Hibridisasi asam nukleat Banyak cara telah dikembangkan untuk menyeleksi dengan jalan hibridisasi, yang paling umum adalah cara Grunstein and Hogness (1975). Cara seleksi ini menggunakan RNA ”probe” yang radioaktif.
  30. 30.  Koloni yang akan diseleksi pertama-tama dibuat replikanya pada petri agar, yang sebelumnya telah dilapisi kertas filter nitroselulosa. Ini dibuat dua buah (petri yang satu disimpan untuk referen/acuan. Kertas filter yang telah membawa koloni diambil diperlakukan dengan basa (0,5 N NaOH) sehingga koloni bakteri lisis dan DNA-nya mengalami denaturasi (DNA jalin tunggal) tertinggal pada kertas nitroselulodsa. DNA ini ditambatkan pada kertas erat-erat dengan jalan di oven pada suhu 800C. RNA yang dibuat radioisotop dihibridisasikan ke DNA dan hasil hibridisasi dipantau dengan autoradiografi. Koloni yang memberikan autoradiografi positif adalah koloni yang dicari (mengandung DNA yang diingikan).

×