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Por que soy rebuena onda les subo esta super práctica. 8-D

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  • 1. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología WESTERN BLOTAlumnos:Arias Orozco Patricia E.Rosario Amaris Guevara GarcíaJessica Wendolyn García PérezAcosta Dent AndreaOrtiz Robles CintiaMoreno Rodríguez EduardoGrupo:4BM3Asignatura:Laboratorio de Biotecnología MolecularProfesora:Dra. Paola Berenice Zarate Segura.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.1
  • 2. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología PRÁCTICA NO. 11 Western Blot 1. OBJETIVOS: 1.1 Objetivo General Conocerá y realizará la técnica de western blot para detección de proteína mediante la reacción antígeno-anticuerpo. 1.2 Objetivos específicos Conocer la metodología para realizar electroforesis en gel de poliacrilamida. Aprender la metodología para realizar una transferencia a membrana de nitrocelulosa. Aplicar la técnica de western blot para detectar proteínas (IgG humana). 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Fundamento Western BlotEl western blot es una técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas basada enla capacidad de unión a anticuerpos específicos. Luego de separar las proteínas en un gelde SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), las bandas de proteínas se transfieren a una membranade nitrocelulosa (electrotransferencia), las bandas individuales de proteína (proteína deinterés) se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal omonoclonal radiomarcado o unido a enzimas específicas para la proteína de interés.Los complejos Ag-AB que se forman en la banda que contiene la proteína reconocida porel anticuerpo pueden visualizarse de diversos modos. Si un anticuerpo radioactivo se unióa la proteína de interés, es posible determinar su posición en la mancha (blot) exponiendouna placa de rayos x a la membrana, un procedimiento que se conoce comoautorradiografía. Sin embargo, en los procedimientos de detección que más se usan suelenemplearse anticuerpos unidos a enzima. Tras la unión del conjugado de enzima yanticuerpo, la adición de un sustrato cromógeno que produce un producto de colorintenso y soluble origina la aparición de una banda de color en el sitio del antígeno blanco.La técnica también puede identificar un anticuerpo específico en una mezcla. En este casolos antígenos conocidos de peso molecular bien definido se separan mediante SDS-PAGE yse transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antígenos conocidos se pruebanluego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo específico para uno o másantígenos. La reacción de un anticuerpo con una banda se detecta mediante el empleo deun anticuerpo secundario radio marcado o ligado a enzima específica para la especia delos anticuerpos en la muestra de estudio (figura 1.).Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.2
  • 3. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Figura 1. Mecanismo de acción molecular western blot 2.2 Purificación de proteínaSe debe tener en cuenta que nuestras proteínas de interés se encuentran en soluciónacuosa de baja salinidad. Al incrementar la concentración de sales en la solución,incorporando lentamente sulfato de amonio, (entre 20-95% de saturación), la proteínacomienza a tener intercambios iónicos con los iones de amonio y sulfato, sustituye lossitios de intercambio que compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, laproteína disminuye su solubilidad y “precipita”.Por lo general las moléculas de mayor peso molecular se precipitan primero. Esta nuevasolución se centrifuga y el precipitado que contiene las proteínas se recupera.El éxito de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la concentración de lasolución. 2.3 DiálisisConsiste en tomar una alícuota del precipitado y dializar mediante el flujo selectivo demateria de una zona de mayor concentración a otra de menor concentración con ayuda dela presión osmótica, es decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentesPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.3
  • 4. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíapor una membrana semipermeable (una membrana que permite el paso selectivo de lasmoléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso molecular).De esta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de moléculas.Es necesario realizar este paso a baja temperatura y en agitación constante, ya que ladiálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientosaleatorios de las moléculas individuales. 2.4 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)La electroforesis es el fenómeno por el cual una molécula que posee carga neta sedesplaza en respuesta a la aplicación de un campo eléctrico. La velocidad de migración omovilidad a través del campo eléctrico dependerá de varios factores como son: laintensidad de dicho campo; la carga neta, tamaño y forma de las moléculas; así como lafuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el cual las moléculas se estánmoviendo. La electroforesis es una herramienta analítica simple, rápida y muy sensible, loque la convierte en una técnica de gran utilidad para la separación y el estudio demoléculas cargadas tales como proteínas y ácidos nucleicos.Para la electroforesis de proteínas se utilizan los geles de poliacrilamida debido a su buenaresolución y gran versatilidad. Además, poseen una serie de ventajas tales como: serquímicamente inertes, estables en un amplio rango de pH, temperatura, fuerza iónica yfácil de generar mediante la polimerización de acrilamida.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.4
  • 5. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaEl gel se prepara a partir del monómero de acrilamida (figura 2) que forma largas cadenaslineales, con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos. Figura 2. Estructura de la acrilamida, bisacrilamida y poliacrilamidaLa polimerización de la acrilamida se obtiene por la adición de catalizadores de lapolimerización que inician y aceleran el proceso de formación de un gel tridimensional.Normalmente, el proceso se inicia con la adición de persulfato amónico a una disoluciónacuosa (tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida), seguido de la adiciónde TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilendiamina) que actúa como propagador de la reacción depolimerización a pH básico (el pH ácido retarda la polimerización)(figura 3). Por lo tanto,ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad depolimerización Figura 3. Reacción de polimerización de la acrilamidaEl tamaño de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la concentracióntotal de monómeros. La concentración de acrilamida (% T) representa el porcentaje enpeso del monómero total empleado (acrilamida + bisacrilamida; % p/v) y determina lalongitud promedio de la cadena del polímero. La concentración de bis-acrilamida (% C)Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.5
  • 6. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíarepresenta el porcentaje de este monómero en el gel y determina el grado deentrecruzamiento. Por lo tanto incrementando %T el tamaño de poro decrece (los gelescon %T inferiores a 2.5-3.0% son casi líquidos y los geles con un %T del 30% presentan unreticulado tan denso que moléculas tan pequeñas como 2000-3000 Da difícilmentepueden atravesarlos). Tabla 1. Relación del %T con los kDa de proteína. Concentración de acrilamida kDA (%T) 3-5 >100 5-12 20-150 10-15 10-80 >15 <15La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo encondiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). En el caso del SDS- lasproteínas se solubilizan en un detergente (SDS), desnaturalizándolas y cargándolas concarga negativa a lo largo de la cadena polipetídica (una molécula de SDS por cada dosresiduos de aminoácidos) (figura 4). Debido a que la cantidad de SDS que se une a lasproteínas es prácticamente proporcional a su tamaño, los complejos SDS-proteínaspresentan un valor carga/masa constante y por lo tanto se separan de acuerdo a sutamaño cuando migran desde el cátodo al ánodo a una velocidad relacionada con su pesomolecular. Además del SDS, se emplean otros agentes desnaturalizantes como son unagente reductor, generalmente el 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro (Cys-S-S-Cys) a grupos tioles (Cys-SH). Figura 4. Electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida. El tratamiento de las muestras con agentes desnaturalizantes provoca la desnaturalización de las proteínas, pérdida de la estructura secundaria y la disociación de las subunidades. Las proteínas quedan cargadas negativamente y migran del polo negativo al positivo durante la electroforesis.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.6
  • 7. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas debido a: La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS. Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo sentido. Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo es y las electroforesis son muy rápidas. La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa molecular, que se puede calcular. Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.En esta práctica la electroforesis de proteínas se basa en un sistema discontinuo el cual setiene un gel concentrador y un gel separador, la diferencia entre estos dos es el pH y laconcentración de acrilamida. El fundamento de esta técnica es la siguiente: La movilidad deuna proteína en el gel concentrador es intermedia entre la movilidad de los iones cloruroCl- del gel y la movilidad del ión glicina Gly- del buffer. Por lo tanto, entre ambos frentesexiste una zona de baja conductividad y gran diferencia de voltaje, de forma que lasproteínas se concentran en una zona muy reducida entre ambos iones. Una vez en el gelseparador, el pH básico favorece la ionización de la glicina de forma que sus iones migrana través de los polipéptidos concentrados, justo por detrás de los iones cloruro. A partir deeste momento las proteínas migran a través del gel separador en una zona de voltaje y pHuniforme de forma que se separan en base a su tamaño (figura 5). Figura 5. Sistema discontinuo en gel de poliacrilamida 2.5 IgGLa inmunoglobulina G (IgG) es una de las cinco clases de anticuerpos humoralesproducidos por el organismo. Es la inmunoglobulina más abundante de suero (600-1.800Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.7
  • 8. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíamg por 100 mL), constituye alrededor del 80% del total de lasinmunoglobulinas séricas. Es la inmunoglobulina más pequeña, conun peso molecular de 150.000 Da así puede pasar fácilmente delsistema circulatorio del cuerpo a los tejidos. La síntesis de IgG secontrola principalmente por el estímulo de los antígenos, al apareceruna infección .Esta proteína especializada es sintetizada por elorganismo en respuesta a la invasión de bacterias, hongos y virus.Existen 4 subclases de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).  IgG1, IgG3, IgG4 cruzan con facilidad la placenta y tienen un papel importante en la protección del feto en desarrollo  IgG3 es el activador del complemento más eficaz, seguida por IgG1; IgG2 es menos eficiente y la IgG1 no activa complemento en lo absoluto.  IgG1 e IgG3 se unen con gran afinidad a receptores en células fagocíticas, por consiguiente media las opsonización. 2.6 SangreLas sustancias que se forman en el organismo deben ser transportadas de un lugar a otro.Desde y hacia las células corporales. La homeostasis del ambiente interno depende de ello.El principal medio de transporte es un líquido llamado sangre; el sistema transportador esel sistema cardiovascular. Y el sistema complementario de transporte es el sistemalinfático.La sangre no sólo está constituida por líquido, sino también por millones de células. Laparte líquida es el plasma (uno de los tres compartimiento líquidos del organismo), y lascélulas son los elementos figurados de la sangre.La sangre tiene una temperatura de 38ºC, un pH entre 7,35 y 7,45, y corresponde al 8 %del peso corporal. Las funciones de la sangre son: 1. Transporte: Capta las sustancias alimenticias y el oxígeno en los sistemas digestivo y respiratorio, y los libera en las células de todo el cuerpo. Transporta el CO2 de3sde las células hasta los pulmones para ser eliminado. Recoge los desechos de las células y los deja en los órganos excretorios. Capta hormonas y las lleva a sus órganos blancos. Transporta enzimas, amortiguadores y otras sustancias bioquímicas.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.8
  • 9. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología 2. Regulación: del pH mediante las sustancias amortiguadoras. Además regula la temperatura corporal, ya que puede absorber grandes cantidades de calor sin que aumente mucho su temperatura, y luego transferir eses calor absorbido desde el interior del cuerpo hacia su superficie, en donde se disipa fácilmente. Mediante la presión osmótica, regula el contenido de agua de las células, por interacción de los iones y proteínas disueltos. 3. Protección: mediante la coagulación se evita la pérdida excesiva de sangre. Mediante la fagocitosis y la producción de anticuerpos protege contra las enfermedades.Parte corpuscularGlóbulos Rojos: (Eritrocitos o hematíes) Tienen como función transportar el oxígeno a lostejidos eliminando el Anhídrido Carbónico. Proceden a la regulación del equilibrio acido /base de la sangre. Están compuestos por el 65% de agua y el 35 % de sustancias sólidas(95% de hemoglobinas y 5% de lípidos).Poseen en su superficie el antígeno que determina el grupo sanguíneo llamadoaglutinina. Un mm cúbico de sangre contiene un número de glóbulos rojos que va de 4.2a 6 millones.Glóbulos Blancos: (Leucocitos) Tienen la función de defensa del organismo. Algunossirven para destruir las sustancias extrañas al organismo; otros sirven a la creación deanticuerpos.Se dividen en Granulocitos, Linfocitos y Monocitos.Los valores normales van de 4.000 a 10.000 por mm cúbico de sangre.Plaquetas: Son los elementos más pequeños de la sangre. En un mm cúbico hay cerca de300.000 plaquetas. Tienen una vida muy corta, de 3 a 5 días y su función es importante enla coagulación de la sangre.Parte líquidaPlasma: Representa el componente líquido de la sangre gracias a la cual las célulassanguinas pueden circular. El plasma está formado principalmente por agua (90%) en lacual se encuentran disueltas y circulan muchas sustancias como proteínas, azúcar, grasas,sales minerales, hormonas, vitaminas, anticuerpos y factores de la coagulación.Entre las sustancias más importantes que transporta el plasma se encuentran lassiguientes:Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.9
  • 10. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología La Albúmina: Es una proteína que ayuda a mantener el agua del plasma en una proporción equilibrada. Las Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las infecciones. Su disminución acarreará una bajada de defensas. Factores de Coagulación: Son imprescindibles para evitar las hemorragias. La ausencia de algún factor de coagulación puede ocasionar trastornos hemorrágicos ya que se dificulta la formación del coágulo. Otras proteínas transportan sustancias necesarias para el normal funcionamiento de las células (grasas, azúcares, minerales, etc.).El plasma se utiliza para elaborar concentrados específicos de proteínas, que constituyen eltratamiento de varias enfermedades como la hemofilia y otros defectos de la coagulación,inmunodeficiencias con riesgo de padecer múltiples infecciones graves, la trombosis y otras. Plasma Es un líquido acuoso, formado por: 91,5 % de agua 8,5 % de solutos 7 % son albúmina 54% proteínas globulinas 38% fibrinógeno 7 % otras 1 % 1,5 % son otros electrolitos componentes nutrientes gases enzimas, hormonas, amortiguadores vitaminas productos de desecho Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.10
  • 11. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología 3. DESARROLLO EXPERIMENTALSalting In Incubamos 10 min la Se realizó extracción muestra hasta la Centrifugamos 10 min de sangre aparición del coágulo, este se retiró Agitar granitos de sal Recuperamos hasta observar sobrenadante (suero) precipitaciónDiálisis cada dos horas se tenia Estas bolsas se dejaron que cambiar el agua Las muestras se colocaron sumergidas en agua destilada con cuidado de en bolsitas de dialisis destilada con agitacion no dejar las muestras por constante mucho tiempo sin agua Despues de Recuperar las muestras en aproximadamente 8 horas, tubos Eppendorf se detuvo el procesoPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.11
  • 12. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaElectroforesis Gel separador 10mL Gel concentrador 5mL Se preparó en tubos Solución de Solución de acrilamida falcon la solución para acrilamida 3.3mL 0.65mL el gel concentrador y Amortiguador pH Amortiguador pH 6.8 gel separador 8.8 2.5mL 1.25mL H20 4.16mL H20 3.05mL A cada solución se le agrego el persulfato de amonio y TEMED para la preparación del gel y se montaron las placas donde se vertió la solución preparada de acrilamida y se espero a que polimerizara. Una vez preparados los geles, estos se meten en la cámara de electroforesis, se conecta y se deja correr durante 1h aproxWestern blotTransferenciaEn esta práctica se realizó una transferencia por peso (en vez de aplicar corrientesimplemente al sistema de la figura 7 se le aplicaron libros en la parte de arriba), perogeneralmente se realiza una electrotransferencia el cual se montaría de la siguientemanera:Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.12
  • 13. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Figura 6. Electrotransferencia, en la práctica en vez de aplicar el ánodo y cátodo simplemente se aplicaron libros en la parte superior y de esta manera se llevó a cabo una transferencia por peso.Bloqueo de membranaPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.13
  • 14. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaUnión a anticuerpo y revelado Se incubó la memebrana Retiramso solución de con el conjugado de bloqueo y se hicieron 3 anticuerpo -peroxidasa Lavar con PBS 3 veces lavados con PBS 1h a temperatura (agitación continua) ambiente Se incubó la membrana en la solución de Se enjuaga la membrana cromógeno/sustrato H2O MQ y dejar secar hasta que aparecieran las bandas3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN La cantidad de proteínas presentes en el suero de sangre humana son muchas y variadas las M 1 2 3 4 5 proteínas que se pueden encontrar en el suero humano son las siguientes con su correspondiente peso molecular. MOLECULA % en el PESO (Da) suero IgA 170000-720000 IgM 5 al 10% 950000 IgG 150000 IgE 190000 IgD 185000 Fibrógeno 340000 Albumina 69000Como se observa la IgG es la proteína con menor peso molecular, el peso de las IgG segúnel marcador de peso molecular corresponde a las señaladas por las flecha roja en laimagen superior, por lo que podemos decir que si obtuvimos una buena cantidad de IgG yotras proteínas , sin embargo considerando la gran cantidad de proteínas y que son dePráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.14
  • 15. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíapeso molecular más altos estos debieron haber formado varias bandas a lo largo del gellas, más de las que se observan, por lo que se puede decir que quedaron aglomeradas enla parte superior del gel, provocando incluso como se observa en el carril 5 unaaglomeración muy grande, esto ocurrió ya que falto tiempo de corrimiento del gel. Otroaspecto importante es que se cargaron 10чL de muestra lo cual por la cantidad deproteína que se aglomerada podemos decir que fue mucha muestra y pudimos habercargado solamente unos 5чL de muestra de esta manera también hubiéramos podidoobservar menos aglomeración, bandas más nítidas y precisas. Para poder saber con certezaque cantidad de muestra cargar se debe hacer primero una cuantificación de proteínas,para esto se pueden aplicar el método de Bradford, Lowry, ABS a 280nm y muchos otrosmás que también ya vienen en kits.Una vez corrido el gel este se transfirió a una membrana de nitrocelulosa por peso, lo queesperábamos era que las proteínas corridas en el gel junto al marcador se transfirieran a lamembrana, estas al quedar en la superficie tendrán más contacto con el conjugado, seañade el conjugado Ac-Enzima y luego el substrato/cromógeno el cual nos daría elrevelado de las bandas individuales de IgG. Para identificar a IgG se utilizó el conjugado proteína A PEROXIDASA [P-8651 SIGMA] obtenida de Staphylococcus aureus, la cual se utiliza en aplicaciones para Elisa directo, usando IgG humana, la especificidad de los enlaces es IgG solo de mamíferos, excepto rata, cabra y oveja. Se observa en la imagen de la de la membrana que si hubo transferencia ya que el marcador se ve a simple vista aunque al revelar no se notó nada, esto pudo haber sido por los reactivos (tal vez ya no servían) o por la leche, pero al teñir con rojo de ponceau si se notaron las bandas donde hubo unión a IgG ya que las bandas se veían definidas (tenues), todas a la misma altura. Esto nos confirma que si hubo transferencia, bloqueo de la membrana ya que no hubo uniones inespecíficas (no se observaron otras bandas) y que si se realizó la unión Ag-Ac.Preguntas de la Discusión¿Qué es y para que se utilizó el Rojo de Ponceau?Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.15
  • 16. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaConocido también como Ácido Carmínico, se utiliza mezclado con ácido acético (0.1% RojoPonceau, 5% ácido acético) para visualizar proteínas sobre membranas de nitrocelulosa. Esun colorante muy usado, ya que luego puede decolorarse con facilidad con ácidoacético y metanol, y las proteínas pueden ser visualizas posteriormente con un anticuerpo(Western blot). Aunque tiene menor sensibilidad de detecciónque otros colorantes permanentes como el Azul deComassie o la plata, es un método que permite una detecciónrápida.Desventajas  Débil unión al soporte, de baja sensibilidad total de la banda de proteínas  Límite de detección: 250ng  Bajo contrate, bandas rojas difíciles de fotografiar  Tiempo de tinción aproximadamente 5 minutos  Las bandas tienden a desaparecer después de unas horas.¿Cómo reacciona el 4-cloro, 1-naftol?En presencia de HRP y de peróxido de hidrógeno el cloronaftol reacciona forman unprecipitado azul-negro. La reacción es fácilmente controlable, aunque es relativamenteinsensible y difícil de fotografiar.¿Por qué utlizar membranas de nitrocelulosa y cual es el tamaño del poro?Membrana de nitrocelulosa pura contiene la mayor capacidad de enlace posible.Compatibles con diversos procedimientos de detección, como procedimientos isotópicos ycolorimétricos o quimioluminiscentes o fluorescencia. La membrana no requiere estarimpregnada con metanol y por lo tanto es selectiva para proteínas hidrófilas. Antes de latransferencia, la membrana se humedece con agua y luego con el buffer de transferencia.Tamaño de poro de 0,2 μm que garantiza una elevada retención de proteínaspequeñas de peso inferior a 20 kD, reduciendo el paso de la muestra sin enlace.¿Por qué utilizamos Proteína-A Peroxidasa P-8651 SIGMA?La proteína A es un polipéptido de 42000 Daltons constituyente habitual de la paredcelular de Staphilococcus aureus. Se ha estudiado con gran detalle la interacción entre laproteína A y los anticuerpos: la proteína A tiene cuatro potenciales lugares de unión a losanticuerpos, sin embargo sólo se puede usar uno a la vez. Sin embargo la proteína A esclaramente bifuncional permitiendo la formación de complejos multiméricos. En lasmoléculas de anticuerpo la región de unión a la proteína A se encuentra en las regionesconstantes segunda y tercera de la cadena pesada. Por ello, cualquier anticuerpo tiene alPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.16
  • 17. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíamenos dos lugares de unión a la proteína A, y esto es una organización ideal para laformación de complejos multiméricos.La afinidad de la proteína A depende de las regiones Fc del anticuerpo, dependientes de lasubclase. La proteína A tiene alta afinidad por los anticuerpos humanos, de burro, conejo,perro, cerdo y cobaya, menor afinidad pero aún útil por ratón, vaca o caballo, y es baja ypor ello poco útil para detectar anticuerpos de oveja, cabra, rata o gallina. En este últimocaso se suele emplear un anticuerpo puente de una especie por la que tenga alta afinidad.Hay tres propiedades de la proteína A que la hacen muy útil en los estudiosinmunocitoquímicos: 1. Debido a que la región de unión con el anticuerpo reside en la región Fc, la unión a proteína A no cambia la capacidad del anticuerpo de unirse a su antígeno. 2. Incluso una proteína A desnaturalizada renaturaliza fácil y rápidamente recuperando su capacidad de unión. 3. Aunque la afinidad de la proteína A por el anticuerpo es elevada la unión antígeno- anticuerpo se puede romper con facilidad reduciendo el pH.La proteína A se ha empleado en gran cantidad de métodos inmunoquímicos, acoplada aisótopos radiactivos (detección en Western blot), a marcadores fluorescentes, oro coloidal,etc..., unida a resinas en la confección de lechos cromatográficos para la purificación deanticuerpos.En la actualidad la proteína A se purifica tanto de fuentes naturales (S. aureus) como apartir de sistemas de sobreexpresión de proteínas recombinantes.Fuente: Staphylococcus aureusPropiedades:Forma: Polvo liofilizadoAplicaciones: Elisa directo, usando IgG humanaTemperatura de almacenamiento: -20 °CEspecificidad: Enlaces a IgG solo de mamíferos, excepto rata, cabra y oveja.Forma Física: Polvo liofilizado incluido con citrato de sodio como buffer. Proteínadeterminada por absorbancia a 205 nm.Seguridad: Uso de gafas, guantes y filtro respirador¿Cuál es la función de B MERCAPTOETANOL?Se utiliza en la electroforesis SDS-PAGE, se trata de un tipo de electroforesisdesnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia dePráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.17
  • 18. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíaagentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDSque desnaturaliza y recubre a la proteína), y se separan como cadenas polipeptídicasaisladas.Algunas proteínas pueden ser desnaturalizadas por 2-mercaptoetanol por medio de suhabilidad para separar puentes disulfuro: cysS-Scys + 2 HOCH2CH2SH → 2 cysSH + HOCH2CH2S-SCH2CH2OHPor medio de la ruptura de los puentes S-S, la estructura terciaria así como la estructuracuaternaria de algunas proteínas se pueden ver disruptas. Si una proteína consta de variascadenas polipeptídicas distintas unidas mediante puentes disulfuro, la acción del 2-mercaptoetanol separará las cadenas polipeptídicas distintas. Por ello, el 2-mercaptoetanolse emplea profusamente para analizar el estado de oligomerización de las proteínas.El 2-mercaptoetanol se puede reemplazar por ditiotreitol (DTT) o el menos oloroso tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en aplicaciones biológicas.4 CONCLUSIONES  Para la purificación de las proteínas del suero obtenido primero se hizo la precipitación por el método de salting in, luego una separación de las proteínas de la sal añadida por medio de una diálisis el cual es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales  Se llevó a cabo una electroforesis de proteínas en un gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE).  La cantidad de muestra que se agrega a los pozos debe ser de acuerdo a la cantidad de proteínas que tenemos de muestra, en este caso se cargaron 10чL los cuales al correr el gel podemos decir que fue demasiado y con 5чL hubiera bastado. Aunque es recomendable hacer una previa cuantificación de proteína.  La transferencia del gel a la membrana de nitrocelulosa fue por peso, la banda del marcador fue visible desde un principio lo que nos decía que si hubo transferencia. Al revelar con el sustrato/cromógeno no se identificaronPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.18
  • 19. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología bandas (pudieron haber sido los reactivos), pero al teñir con rojo de ponceau si obtuvimos bandas individuales correspondientes a IgG5 BIBLIOGRAFÍA Y REFERENCIASKindt, J. Thomas, Goldsby, A. Richard, Inmunología de Kuby, 6ta. Edición, Editorial McGrawHill, México 2007, páginas 551.Berg Jeremy Mark, BIOQUIMICA, Edit. Reverte, Primera Edición, España 2008, Págs.consultadas: 68 -78.Tobin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamidegels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA1979;76(9):4350-4354.http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdfhttp://www.westernblotting.org/ 6. ANEXO (DISCUSIÓN DEL ARTÍCULO)Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:Procedure and some applications  La técnica de electroforesis produce réplicas de las proteínas separadas en geles de poliacrilamida con una alta fidelidad.  En términos generales, las membranas de nitrocelulosa se han utiliza para retener las proteínas de la solución diluida para su posterior determinación cuantitativa.  Se demostró que las proteínas inmovilizadas en membranas de nitrocelulosa se pueden utilizar para detectar lo respectivos anticuerpos.  Con anticuerpos marcados radiactivamente o conjugado con peroxidasa- el método es suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de antígeno separados por electroforesis, y este simple procedimiento también se puede utilizar para mostrar el resultado de la presencia de pequeñas cantidades de de anticuerpos en un suero de título bajo.  Debido a que el antígeno se inmoviliza en una membrana, el anticuerpo no es necesario para formar un precipitado con el antígeno. La técnica por lo tanto tiene el potencial para el análisis de las proteínas inmunoelectroforético mediante el uso de unión de fragmentos Fab o unión de los anticuerpos contra un factor determinante, como los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas. Esto no se podía hacer por las técnicas inmunoelectroforéticas.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.19
  • 20. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología  El procedimiento descrito también tiene potencial como una herramienta para detección sueros patológicos que contienen autoanticuerpos  La identificación precisa de los componentes inmunogénicos puede ser una herramienta de diagnóstico útil para diversas condiciones patológicas.  Otra ventaja de la inmovilización de proteínas de nitrocelulosa es la facilidad de procesamiento para la autorradiografía.  Técnicas convencionales, decoloración y secado de geles de poliacrilamida toma muchas horas, y las condiciones exactas de secado son extremadamente crítica. Cuando las proteínas son transferidos a un soporte de nitrocelulosa, la electroforesis toma una hora, las manchas y decoloración menos de 10 minutos, y el secado de un adicional de 5 min. Así pues, esto es a la vez más rápido y más simple que los procedimientos convencionales, y lo elimina el procedimiento tedioso y peligroso de remojar los geles en diphenyloxazol.  La técnica ha sido desarrollada para detectar anticuerpos específicos contra las proteínas ribosomales. Sin embargo, es aplicable a cualquier procedimiento analítico en función de la formación de ligando proteínas-complejos.  Interacciones que posiblemente se puede analizar de esta forma incluyen a hormonas receptor, el receptor de AMP cíclico, proteína e interacciones de ácido nucleico.  El ligando también puede ser una proteína. Las enzimas separadas en geles de poliacrilamida también podría ser convenientemente localizadas en transferencias mediante ensayos in situ.  Un requisito indispensable para estas aplicaciones es que la proteína no es dañada por la adsorción proceso y que los sitios de unión siendo accesibles al ligandos y sustratos.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.20
  • 21. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Chiron RIBA HCV 3.0 SIA Prueba para Hepatitis C 1. Introducción El HCV es un virus de RNA de simple cadena positiva, de unos 9,500 nucleótidos, que nunca pasa en su ciclo celular por fase de DNA. Se le considera el único representando del género Hepacivirus, perteneciente a la familia de los Flaviviridae. Es un virus con envoltura glucolipídica. Su genoma contiene una única pauta de lectura abierta (ORF) que codifica para una poliproteína precursora flaqueada pro dos regiones no codificantes en ambos extremos 5’ y 3’.CARACTERISTICAS DEL GENOMAEl genoma del VHC está compuesto por una única cadena lineal de ARN de polaridadpositiva, no segmentado. Consiste en:  una región 5 UT o NCR (región no codificadora) de aproximadamente 340 nucleótidos  una región codificadora de proteína, de 9400 nucleótidos, que codifica presumiblemente un precursor polipeptídico de aproximadamente 3000 aminoácidos  una pequeña región 3UT (región no codificadora) de aproximadamente 50 nucleótidos.Este genoma de ARN tiene una alta tasa de sustitución de bases (2x10-3) por año. Estoresulta en una gran diversidad genética entre las diferentes cepas y dentro de la mismacepa, a lo largo del tiempo, pudiendo agrupar a los VHC en tipos. Hasta el momento hansido identificados cerca de 10 variantes, diagnosticadas con test inmunoenzimáticos y portécnicas de biología molecular (reacción en cadena de la polimerasa -PCR).CARACTERISTICAS DE LAS PROTEINAS VIRALESLas poliproteínas codificadas de aproximadamente 3000 aminoácidos son en 7 proteínas:  Una proteína de la nucleocápside de 190 aminoácidos;  Dos proteínas de la envoltura de 190 y 370 aminoácidos, respectivamente.Las 4 proteínas restantes son proteínas no estructurales:  Una proteína llamada NS2 de 250 aminoácidos con función de unión a membrana  La proteína NS3 de 500aa con funciones de proteasa-helicasa  La proteína NS4 de 460aa con función de unión a membrana  La proteína NS5 de 1050aa con probable función de polimerasaSe han identificado regiones hipervariables en todos los genes que codifican proteínasvirales, pero los más variables son los que codifican para las proteínas de la envoltura.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.21
  • 22. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Figura 7. Debido a la estructura viral, el virus es genéticamente inestable y muta muy rápido. Esto quiere decir que se vuelve resistente a los agentes antivirales lo cual hace su tratamiento más difícil. Figura 8. Ciclo de replicación del virus dentro de la célulaPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.22
  • 23. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaPara el diagnóstico del virus se realizan dos tipos de pruebas se utilizan en el diagnóstico ytratamiento de la infección por VHC: las pruebas serológicas que detectananticuerpo específico contra los virus de la hepatitis C (anti-VHC) ypruebas moleculares para la detección de ácido nucleico viral.Pruebas molecularesAlgunas de las técnicas moleculares más usadas se presentan en la siguiente tabla:Pruebas serológicas:Las pruebas que detectan anti-HCV se utilizan para detección y diagnóstico del virus. Sepuede detectar en el suero o plasma usando inmunoensayos. Para el diagnóstico deHepatitis C en un principio se evidenciaban la presencia de anticuerpos para tres antígenosvirales: C-100 (proteína codificada por región no estructural 3 y 4), C-22 (proteínaestructural del Core) y 33C (proteína no estructural de la región NS3). Hoy en día ya seutilizan otros antígenos recombinantes y algunas de las siguientes pruebas:Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.23
  • 24. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaAbbott HCV EIA 2.0:Es un inmunoensayo que antígenos recombinantes (HC-34(E.Coli), HC-31 (E. Coli NS3proteína no estructural y NS4) y c100-3 (levadura NS3/NS4 con SOD) que se adhieren alos anticuerpos que se encuentran en las muestras infectadas.ORTHO_HCV Version 3.0 ELISASe utilizan micropocillos que contienen antígenos recombinados del virus de la hepatitis.La tecnología de Elisa utiliza el principio que los antígenos o anticuerpos que produce elvirus se pueden detectar por el antígeno o anticuerpo complementario que está ligado auna enzima capaz de reaccionar con un substrato cromógeno. Los antígenosrecombinantes q se utilizan en esta prueba son c22-3, c200 y la NS5.VITROS_ Anti-HCV assayEs un inmunoensayo de diagnóstico in vitro para la detección cualitativa de anticuerpos deinmunoglobulina G al virus de la hepatitis C (anti-VHC) en suero y plasma.La especificidad de estos inmunoensayos es del 99%. Falsos positivos se dan generalmentecuando las pruebas se hacen en poblaciones donde el virus se encuentra en menorPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.24
  • 25. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologíacantidad. Falsos negativos pueden ocurrir cuando hay enfermedades contra el sistemainmune como el VIH, trasplante de órganos o en pacientes con hemodiálisis.Para la confirmación de estos resultados con inmunoensayos se puede utilizar la “Therecombinant immunoblot assay, Chiron RIBA HCV 3.0 SIA” (utilizado en clase).CHIRON® RIBA® HCV 3.0 SIAEnsayo en tira inmunoabsorbente (SIA) para la detección de anticuerpos frente al virus dela hepatitis C (anti-HCV) en suero o plasma humano.La detección de anti-HCV mediante la metodología del SIA se basa en las técnicas deabsorción Western y de puntos, en las que inmunógenos específicos (es decir,poliproteínas antigénicas) codificados por el genoma del HCV son inmovilizados sobre unamembrana como soporte. La visualización de la reactividad de los anti-HCV de lasmuestras con las proteínas individuales codificadas por el HCV se logra utilizando unconjugado enzimático de anti-IgG humana de cabra, marcada con peróxidasa.Los dos antígenos recombinantes (c33c y NS5) y dos de los péptidos sintéticos (c100p y 5-1-1p) proceden de regiones putativas no estructurales del virus, mientras que el tercerpéptido (c22p) corresponde a la proteína putativa de la nucleocápside (núcleo) viral. Dadoque los antígenos recombinantes c33c y NS5 del HCV se producen como proteínasindividuales de fusión con superóxido dismutasa humana (SODh), también se ha incluidoSODh recombinante como banda de control en la tira. La banda de control SODh permitela detección de anticuerpos frente a SODh que no son específicos para las porcionescodificadas de los antígenos recombinantes del HCV. El antígeno c33c del HCV se produceen bacterias (E. Coli) genéticamente manipuladas, mientras que el antígeno NS5 y el SODhdel HCV se producen en levadura (S. Cerevisae) manipulada genéticamente. Estacombinación de antígenos tiene mayor especificidad y sensibilidad de reconocimiento. A)Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.25
  • 26. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología B) Figura 9. DEL KIT A) Genoma del HCV y proteínas recombinantes, B) Las regiones donde se ubican los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos a lo largo del genoma del virus.Las bandas en las tiras están ordenadas de la siguiente manera:Banda 2 contiene dos péptidos sintéticos 5-1-1(p) and c100 (p), para la región del NS4 delgenoma del virus.Banda 3 contiene el antígeno recombinante c33-c de la región NS3 del virus.Banda 4 contiene c22 (p) de la región del core del HCV.Banda 5 contiene la región NS5 región del genoma del virus. Figura 10. Tira que se utiliza para la prueba y el antígeno o péptido inmovilizado en cada bandaPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.26
  • 27. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologíaLa prueba se basa en tres etapas en donde se utilizan los antígenos recombinantes y lospéptidos sintéticos inmovilizados como bandas individuales como se muestra en la figuraanterior. • Incubación de las tiras con las muestras y controles: Los anticuerpo específicos se fiajran en las bandas correpondientes de antígeno y/o Primera peptidos sinteticos de la tira etapa: • Incubación con el conjugado: El conjugado se fija a la banda de IgG Segunda humana del complejo Ag-Ac. etapa • Detección enzimática por agua oxigeanda y 4-cloro 1-naftol: reacción enzimática con un produco de color azul-negro en cada banda donde Tercera fijación especifica a cada uno de los antigenos recombinanates y/o etapa péptidos recombinantes. 2. OBJETIVOSObjetivo general: Aplicar el kit para la prueba del virus de la hepatitis C a las muestras traídas a clasey ver si son positivas o negativas.Objetivos específicos:  Conocer en que consiste el ensayo en tira inmunoabsorbente.  Identificar los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos que usa la prueba para el reconocimiento del virus.  Aplicar la metodología a las muestras y comprobar si son positivas o negativas. 3. DESARROLLO EXPERIMENTALAntes de comenzar la metodología preparar: 1. Componentes a temperatura ambiente (15 a 30 °C) 2. Mezclar reactivos suavemente (evitar formación de espuma) 3. Preparar solución tampónPráctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.27
  • 28. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Colocar una tira en cada tubo ( Identificar las muestras y Añadir 1mL de diluyente a un tubo por muestra y por controles con el numero cada tubo (la tira debe estar cada control) correspondiente a cada tira. cubierta) Colocar los tubos en un Añadir 240чL de la muestra o oscilador (16 a 20 ciclos por Tapar e invertir para mezclar del control minuto) de 4 a 4:30h Añadir 1mL de diluyente a Decantar todo el liquido cada tubo y volver a colocar Decantar todo el liquido en el oscilador de 30 a 35 min. Añadir 1mL de solucion de Agragar 30mL adicionales de Añadir 1mL de conjugado por tampon de lavado en cada solución tampon. Con un cada tira al recipiente. Incubar tubo, luego verter el liquido y volumen total de 60mL. Luego en agitador de 9 a 11min. las tiras en los reipientes de decantar el liquido. Repetir (preparar sustrato) lavado con 10mL de solución esto dos a tres veces. tampón Transferir las tiras a papel Una vez termianda la Añadir 1mL de sustrato por absorebente y retirar exceso incubación decantar el tira en el recipiente. Incubar de agua, dejar secar en la conjugado, lavar las tiras con de 15 a 20 min. Luego lavar las obscuridad 30min, 30mL de soluciión tampón, tiras con 60mL de H2= MQ, temperatura ambiente, decantar y repetir dos veces. repetir uan vez mas. interprtar tiras.Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.28
  • 29. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓNSegún los controles que manejamos y las muestras, estas concuerdan con los controlespositivos, por lo que las muestras indican positivo para el virus de hepatitis ya que huboreacción en cada una de las bandas lo cual nos indica que hubo unión Ag-Ac del virus concada antígeno y péptido específico para el virus.Este tipo de ensayo se pude utilizar como prueba confirmatoria de otros ensayos (ELISA) ytambién poder diferenciar entre positivos y falsos positivos. La combinación de antígenosrecombinantes y péptidos inmovilizados en cada tira los cuales son específicos para ciertaregión en el genoma del virus la hacen una prueba de alta especificidad y sensibilidad aldiagnóstico del virus.Otra ventaja que presenta esta prueba es que es posible volverla automatizada, así se evitala el análisis subjetivo, esto se puede observar en el artículo presentado por el JOURNALOF CLINICAL MICROBIOLOGY, de Feb. 1998, p. 387–390 Vol. 36, No. 2 titulado: AutomatedRIBA Hepatitis C Virus (HCV) Strip Immunoblot Assay for Reproducible HCV DiagnosisDonde se utiliza un procesador que mide la intensidad de las bandas de control, antígenoy péptidos, lo que hace el sistema es iluminar cada banda y medir la luz reflejada demanera diferencial con el fondo blanco. Un algoritmo interpola valores relativos deintensidad para cada banda las cuales tienen asignadas valores de referencia. Con esto sien alguna tira tenemos duda ya que las bandas puede que se vean muy tenues con estopodemos comprobar si el paciente es positivo o no (como en la tabla presentada abajo).Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.29
  • 30. Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología Figura 11. Tabal de comparación entre la prueba manual y en la que se aplica el procesador. 5. CONCLUSIONES  El ensayo en tira inmunoabsorbente consiste en que en las tiras se encuentran inmovilizados antígenos recombinantes y péptidos sintéticos, los cuales representan cada banda, estos en presencia del virus darán una reacción Ag-AC. Seguido de esto se agrega el conjugado de IgG con peróxidasa para llevar a cabo una reacción enzimática de color azul-negro en donde haya habido unión.  Los antígenos recombinantes y péptidos sintéticos son: c100, c33-c, c22 (p), región NS5 del genoma del virus.  Las muestras alas que se les aplico el procedimiento dieron iguales a las tiras de los controles positivos lo que quiere decir que las muestras dan positivo al virus de hepatitis C. 6. REFERENCIAS  P. MARTIN,1* F. FABRIZI,1 V. DIXIT,1 S. QUAN,2 M. BREZINA,1 E. KAUFMAN2, K. SRA,2 R. DINELLO,2 A. POLITO,2 AND G. GITNICK1 Automated RIBA Hepatitis C Virus (HCV) Strip Immunoblot Assay for Reproducible HCV Diagnosis, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 0095-1137/98/$04.0010, Feb. 1998, p. 387–390  Theodore Sy, M. Mazen Jamal, Epidemiology of Hepatitis C Virus (HCV) Infection, International Journal of Medical Sciences, ISSN 1449-1907 www.medsci.org 2006 3(2):41-46, 2006  Marc G. Ghany,1 Doris B. Strader,2 David L. Thomas,3 and Leonard B. Seeff4, Diagnosis, Management, and Treatment of Hepatitis C: An Update, AASLD PRACTICE GUIDELINES, HEPATOLOGY, April 2009Práctica Western Blot Laboratorio de Biotecnología Molecular Pág.30