Inmunologia 4
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    Inmunologia 4 Inmunologia 4 Document Transcript

    • Informe de Técnica de Inmunofluorecencia Inirecta (IFI) por Miguel Angel Figueroa Núñez Inmunología Clínica TM. Marcelo Ramirez Sandoval
    • TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN 2 ¿QUÉ ES LA INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA? ¿PRINCIPIO DE LA TECNICA? SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA OBJETIVOS 2 2 3 3 MATERIALES Y METODOS 4 MATERIALES UTILIZADOS METODO OCUPADO DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO PROCEDIMIENTOS CONTROL DE CALIDAD INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS RESUMEN DE LA TECNICA 4 4 4 5 6 7 7 INTERPRETACIÓN 8 RESULTADOS OBTENIDOS LECTURA DE LOS RESULTADOS VALORES DE REFERENCIA INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS SIGNIFICADOS CLÍNICOS DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN BIBLIOGRAFÍA 1 8 13 13 14 14 15 16
    • INTRODUCCION ¿QUE ES LA INMUNOFLU ORECENCIA INDIRECTA? La inmunofluorecencia indirecta es un examen que se realiza a travez de la capacidad de poder ver por medio de un microscopio UV la estimulación de un anticuerpo marcado con un fluorocromo. Se realiza mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta, que es la técnica de elección para el screening de detección de estos autoanticuerpos debido a su alta sensibilidad cuando el resultado es positivo con un título alto (1/160). Sin embargo presenta una baja especificidad, por lo cual, su resultado siempre debe ser interpretado dentro del contexto clínico del paciente. Ante un resultado positivo, y dependiendo del patrón obtenido, generalmente es necesario continuar los estudios serológicos en busca de los antígenos específicos asociados, para lo cual se utilizan inmunoensayos de mayor especificidad, como el ELISA. PRINCIPIO DE LA TECN ICA Para la detección de AAN se emplea la técnica de inmunofluorescencia indirecta IFI, utilizando como sustrato laminas de monocapas de la línea celular HEp-2 (Human Epithelioma type - 2,) esta línea celular deriva de carcinoma laríngeo humano), utilizando como conjugado un antisuero (anti-inmunoglobulina G humana) conjugado con fluoresceína isotiocianato (FITC) la cual emite fluorescencia color verde al observarse bajo luz ultravioleta de alta energía (495 nm). Beck observo en 1961, que los sueros positivos muestran patrones muy diferentes de fluorescencia nuclear, los que se describen como Homogéneo, Periférico, Nucleolar, Moteado y centrómero. Actualmente ha cobrado gran importancia la incorporación en los informes de la presencia de patrón citoplasmático cuando éste es observado, debido a la gran ayuda en el diagnóstico, cuando se trata de anticuerpos anti-mitocondrias o anticuerpos anti-músculo liso. Otro punto importante es la información de patrones mixtos 2
    • SU UTILIDAD EN LA IN MUNOLOGÍA CLÍNICA La detección de autoanticuerpos en autoinmunes como:        el diagnóstico de diferentes enfermedades Lupus Eritematoso Sistémico. Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo. Síndrome de Sjogren. Esclerosis Sistemática Progresiva. Síndrome de CREST. Cirrosis Biliar Primaria. Artritis Reumatoide OBJETIVOS 1. 2. 3 Detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra: a. Antígenos tisulares, como anticuerpos antinucleares (ANA), antimitocondriales (AMA), antimúsculo liso (ASMA), anti-DNA, antiendomisio (AAE) y anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) mediante el método de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Identificar los diferentes patrones y sustratos utilizados.
    • MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES UTILIZADO S INSUMOS              PBS (Solución Buffer Fosfato) preparado 4 Placas Anticuerpos antinucleares. Conjugado anti-inmunoglobulina G humana Universal (FITC) 5.0 ml. Inc. Medio de montaje Kit de detección Anticuerpos Antinucleares. Micropipeta de 100 ul, 200ul, 1000ul Puntas para Micropipetas (amarillas 200 ul. Azules 1000 ul.) Tubos de Khan 75x13 mm Cámara Húmeda de Incubación Papel Filtro Porta objetos 26x76 mm Cubre objetos 24x50 mm Cronómetro Guantes EQUIPOS   Microscopio para inmunofluorescencia Vortex DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO Para la detección de autoanticuerpos presentes en muestras de sueros, se emplea la técnica de inmunofluorescencia indirecta IFI, utilizando como sustrato:      Para ANA, láminas de monocapas de la línea celular HEp-2 (Human Epithelioma type-2, derivado de carcinoma laríngeo humano). Para ANCA, láminas de células polimorfos nucleares. Para ASMA corte de tejido de hígado de rata. Para AMA corte de tejido de riñón de rata. Para Antiendomisio corte de tejido de esófago de mono. Se agrega sobre estos sustratos el suero del paciente en estudio a una determinada dilución dependiendo del autoanticuerpo específico que se busca. La unión antígeno-anticuerpo se evidencia utilizando como conjugado un antisuero (anti-inmunoglobulina humana) conjugado con fluoresceína isotiocianato (FITC) la cual emite fluorescencia color verde al 4
    • observarse bajo luz ultravioleta de alta energía (495 nm) en un microscopio de fluorescencia con luz incidente. PROCEDIMIENTO 1 2 3 4 Retirar del refrigerador el número de placas o pocillos de células HEp-2 y el Conjugado anti-inmunoglobulina G Humana Universal FITC. Dejar que todos los reactivos se estabilicen a la temperatura ambiente por 20 minutos. Preparar solución PBS pH 7.2 Dejar que las muestras se descongelen a temperatura ambiente por 20 minutos. Diluir las muestras de suero con PBS según la siguiente tabla con PBS, mezclar. Examen AAN ADNA ASMA AMA ANCA EMA Sustrato HEp-2 C.luciliae Riñón/Estom. Riñón/Estom. P.M.N. Esof./mono Conjugado AntiIGG h. Immco 2100 Immco 2100 Immco 2100 Bindig Site Mico 2113 AntiIGG h. AntiIGG .h. AntiIGG h. AntiIGG h. AntiGAMh Dilución 1/40 1/10 1/20 1/20 1/20 1/2.5 Vol.Mx ul. 25 25 25 25 25 100 Vol.PBS ul 1000 250 500 500 500 150 5 6 7 8 9 10 11 12 5 Preparar cámara húmeda, se debe mojar el papel filtro que está en ella con PBS y eliminar el excedente Extraer el número de placas según el examen a realizar y colocarlas en la cámara húmeda. Enumerar las placas Utilizar en los 2 primeros pocillos de las placas, control positivo, negativo cada vez que se realice la técnica Colocar 30 ul de Control negativo en el primer pocillo, 30 ul de control positivo en el segundo pocillo. Colocar 30 ul de las muestras diluidas en los siguientes pocillos dependiendo del número de muestras a analizar, verificar que los pocillos queden completamente cubiertos Tapar la cámara húmeda con las placas en su interior. Incube por 30 minutos a temperatura ambiente. No mover la cámara. Hacer un esquema de las placas en el cuaderno de registros de IFI dibujando exactamente el número de placas ocupadas y poniendo en cada cuadro que representa un pocillo en número de la muestra procesada.
    • 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Lavar las placas durante 10 minutos en la misma cámara húmeda de incubación, agregando PBS hasta cubrirlas. Eliminar el PBS y lavar nuevamente por 10 minutos. Eliminar nuevamente el PBS y secar las placas con papel absorbente evitando que los pocillos entren en contacto con éste Colocar las placas en la cámara húmeda y agregar 30 ul. de conjugado correspondiente según el sustrato utilizado a cada pocillo. Tapar la cámara húmeda e incubar 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad Lavar nuevamente 2 veces por 10 minutos con PBS en oscuridad. Secar las placas con papel absorbente y agregar medio de montaje a cada pocillo de la placa. Leer con microscopio de fluorescencia en habitación oscura. Determinar el patrón de fluorescencia nuclear y registrar las lecturas de exámenes en registro de IFI. Si la muestra es positiva en la dilución de detección, determinar el valor realizando diluciones múltiplo de 2 Ej. 1/80(Que no se tomara en cuenta en esta ocasión)1/160, hasta 1/640, si él título de la muestra en estudio es mayor informar titular hasta punto final. CONTROL DE CALIDAD Como anteriormente hemos realizado los controles de calidad se deben colocar a principio de los pocillos de reacción siendo primero en control negativo y segundo el control positivo. El Control Positivo debe proporcionar el marcaje específico descrito en el apartado anterior. El Control Negativo no debe proporcionar marcaje específico alguno. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, así como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables. También es importante considerar estos puntos: • • • 6 Capacidad para revelar la presencia de anticuerpos. Ser metódico en el uso de los materiales para esta técnica y así observar una buena corrida electroforética. Seguir las instrucciones de la técnica.
    • INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS  Informar Resultado (negativo ó positivo), patrón nuclear y título obtenido. RESUMEN DE LA TECNICA Después de colocar las muestras en cada placa seguir el siguiente esquema. INCUBAR 30 MINUTOS A 20 -25 °C LAVAR 2 VECES POR 10 MINUTOS CON PBS pH 7.25 AGREGAR CONJUGADO E INCUBAR 30 MIN.A 20-25 °C EN OSCURIDAD LAVAR 2 VECES POR 10 MINUTOS CON PBS pH 7.25 AGREGAR MEDIO DE MONTAJE Y LEER EN MICROSCOPIO DE IFI INFORMAR PATRON Y TITULO OBSERVADO 7
    • INTERPRETACIÓN RESULTADOS OBTENIDOS Los dos primeros 2 pocillos son los controles positivo y negativo respectivamente, mientras el control positivo presento un marcaje especifico, el control negativo mostro un marcaje inespecífico, suave y homogéneo. Luego en el pocillo 1 se coloca el control de patrón homogéneo (H), este se puede observar en la imagen 2 que se muestra como ejemplo a continuación. IMAGEN 2 8
    • A continuación en el pocillo 2 se coloca el control Moteado (M) se presentan en la imagen 3 que proponemos como ejemplo de enseguida. IMAGEN 3 Después en el pocillo 3 se coloca el control Nuclear (N) que se expone en la Imagen 4 que sigue a continuación. IMAGEN 4 Y por último en el pocillo numero 4 colocamos el control del patrón centromérico (C) que está en la presente imagen 5. IMAGEN 5 9
    • Luego después de los controles pasamos las muestras las cuales dan negativas hasta el suero 42 el cual resulta positivo y se realizan 3 diluciones, de las cuales solo usaremos 1/160 y 1/320. Las imágenes obtenidas se muestran a continuación. SUERO 12, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 6) SUERO 22, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 7) 10
    • SUERO 32, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 8) SUERO 42, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 9) 11
    • SUERO 42, DILUCIÓN 1/160, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 10) SUERO 42, DILUCIÓN 1/320, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 11) 12
    • LECTURA DE LOS RESULTADOS Imagen 12. La observación de marcaje fluorescente específico descrito a continuación indica un resultado positivo a la dilución recomendada. ANA: Existen diferentes patrones de fluorescencia nuclear que pueden coexistir en un mismo suero e incluso modificarse con la dilución del mismo. Los principales patrones anti-nucleares son:      Homogéneo: Fluorescencia uniforme y homogénea en todo el interior del núcleo de la célula en interfase. Fluorescencia intensa en las células en mitosis. Periférico: Marcaje en la periferia del núcleo, de mayor intensidad en el perímetro interior, y marcaje homogéneo en el resto del núcleo. Moteado: Marcaje fluorescente en forma de granulado grueso. Los nucléolos no están marcados. Los gránulos pueden tener tamaños y formas diversas dependiendo del antígeno que reacciona. Nucleolar: Existen dos patrones nucleolares: o Marcaje nucleolar de patrón homogéneo. A menudo acompañado de un débil marcaje homogéneo en el resto del núcleo. o Marcaje moteado de los nucléolos en células en interfase. Marcaje puntual de las regiones organizadoras de los cromosomas mitóticos. Centromérico: Punteado discreto en las células en interfase (46 puntos o múltiples). Los puntos se alinean con los cromosomas en las células en metafase. Las muestras positivas pueden titularse. Se define el título como la dilución mayor que da resultado positivo. Cuando no se observa ninguno de los marcajes específicos descritos, el resultado es negativo para los autoanticuerpos indicados. VALORES DE REFERENCIA Los valores de referencia indican negatividad he inespecificidad del marcaje de la de las células HEp-2 en los pocillos. 13
    • INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS Como se describe anteriormente, los sueros, 12, 22, 32 resultaron ser negativas, las cuales presentaron un patrón homogéneo e inespecífico en todas las células. Sin embargo en el suero 42 se observa positividad así como en sus posteriores diluciones, delas cuales podemos decir que tienen un patrón moteado. SIGNIFICADOS CLÍNICOS ANA: La determinación de anticuerpos anti-nucleares tiene una sensibilidad superior al 95% para el lupus eritematoso sistémico, y una baja especificidad2. Homogéneo: Indicativo de lupus eritematoso sistémico. Periférico: En pacientes con enfermedades del tejido conectivo. Moteado: Asociado al lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma. Nucleolar: En aproximadamente un 50-70% de pacientes con solapamiento de escleroderma y polimiositis/dermatomiositis. Se presenta en hasta un 33% de pacientes con escleroderma sistémica, especialmente con complicaciones renales2. Centromérico: En pacientes con esclerosis sistémica, especialmente en la forma de la enfermedad con implicación cutánea (80%). Ocasionalmente, en otras enfermedades conectivas3. El diagnóstico clínico no debe basarse exclusivamente en el resultado de este ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio. DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN Como se menciona anteriormente, el suero 42 es el único que presenta positividad nuclear, con un patrón moteado. Este patrón esta asociado al lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma. El experimento se realizó con normalidad y no presento mayores dificultades, sin embargo solo fue posible fotografiar las muestras debido al tiempo que llevaba ver y analizar cada uno de los sueros, para ver su patrón he indicar el resultado. Debido a los antecedentes podemos decir que la se describieron anteriormente, puedo decir que el suero 42 es positivo, con una concentración de anticuerpos mayor a 1/320, probablemente con Lupus Eritematoso Sistémico, pero debe ser confirmado con otros análisis y con la clínica del paciente. Esto también es un antecedente de cómo podemos utilizar la capacidad de fijación de las células a un portaobjetos (HEp-2) y ver como se unen los anticuerpos presentes en los 14
    • sueros problemas, los cuales se conjugan con Anticuerpos marcados con FITC, lo que dará como resultado un color verde como respuesta a la estimulación con luz ultravioleta. Esta tecnología resulta de vital importancia y hoy está en gran parte de los laboratorios y campos clínicos de Chile, pero es un análisis caro y requiere de entrenamiento por parte de los que lo manipulan y observan. Por lo que se convierte en una herramienta de gran ayuda aprenderla, reconocerla y ponerla en práctica para salir altamente preparados para enfrentar la labor clínica. REFERENCIAS 1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6. 2) Figueroa, Miguel. Fotografías prueba Inmunofluorecencia Indirecta. 2013. 6-11. Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnología, Ramo Inmunología Clínica. 3) Imágenes obtenidas en google (obtenidas bajo es buscador de imágenes (1-5). 2013. https://www.google.cl/search?q=inmunofluorescencia+indirecta+en+celulas+he p-2&espv=210&es_sm=93&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=ebGUq2AGdWq4APOv4HoDQ&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1137&bih=595&d pr=0.9#es_sm=93&espv=210&q=inmunofluorescencia+indirecta+en+celulas+h ep-2+patron+centromerico&tbm=isch&imgdii=_ 4) Imagen 12 obtenida del inserto: ” ANTI-NUCLEAR ANTIBODIES hep-2 (ANA-hep-2)”. BioSystem. 2006. 5) Robles Marhuenda, A. Ramos-Casals, M. “Significado clínico de los anticuerpos antinucleares”. 2005. Doyma.es. 15