Trypanosome antvar

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Trypanosome antvar

  1. 1. Tripanosomi & Sleeping Sickness
  2. 2. Tripanosomi & Sleeping Sickness <ul><li>Life cycle e biologia dei tripanosomi </li></ul><ul><li>Sleeping sickness , differenze tra la forma gambiense e quella rodesiense </li></ul><ul><li>Nagana, kachexia e TNF </li></ul><ul><li>Farmaci adoperati per trattare la tripanomiasi </li></ul><ul><li>Mosche Tse tse </li></ul>
  3. 3. Tripanosomi <ul><li>Tripanosomi ed il sistema immunitario </li></ul><ul><li>Importanti meccanismi molecolari sono stati scoperti nel comprendere l’interazione con il sitemna immunitario: trans splicing e GPI anchors </li></ul><ul><li>Le forme che vivono nell’insetto hanno una differente superficie e metabolismo </li></ul>
  4. 4. Perchè la tripanosomiasi così letale? <ul><li>Cosa è sorprendente del ciclo vitale della forma tripomastigote nel sangue umano? </li></ul>
  5. 5. Variazione Antigenica in T. brucei African trypanosome -- sleeping sickness Ha diverse caratteristiche -- variazione antigenica trans-splicing RNA policistronici (eukaryote) RNA editing DNA -- 20 cromosomi (100 - 1000 kb) >100 mini cromosomi (50 - 150 kb)
  6. 6. Perchè la tripanosomiasi così letale? <ul><li>Il numero dei parassiti trovati nel sangue umano ed animale infettato con i tripanosomi non è costante, ma mostra le cartteristiche forme ad onde della parassitemia </li></ul><ul><li>La distanza temporale fra 2 picchi è di circa 5-7 giorni </li></ul>
  7. 7. Perchè la tripanosomiasi così letale? <ul><li>L’ infezione è caratterizzata da onde periodiche di parassitemia </li></ul><ul><li>Ogni onda rappresenta un SINGOLO clone o sierotipo antigenicamente uniforme </li></ul><ul><li>Es. Ab prodotti nella prima settimana verso il clone A non reagiranno con il clone B </li></ul><ul><li>L’esposizione di differenti antigeni viene chiamata </li></ul><ul><ul><li>variazione antigenica </li></ul></ul>
  8. 8. Variazione Antigenica <ul><li>L’intera popolazione di tripanosomi in un animale sembra essere antigenicamente uniforme </li></ul><ul><li>Ma a bassa frequenza sierotipi divergenti (chiamati switched ) vengono a formarsi </li></ul>
  9. 9. Variazione Antigenica Semi-programmata in T. brucei Tsetse fly Rabbit 1: A B C D E etc. Rabbit 2: A B D E etc. Non si conosco i meccanismi di questi controlli………….. passage
  10. 10. Glicoproteine variabili di superfici Coprono completamente la forma del sangue di Tryp (10 7 /cell). ad eccezione della parte basale del flagello. Glycolipid anchor (rilasciata dalla fosfolipasi C). VSG protein -- ~450 amino acidi C-term è più conservato (non esposto) N-term la seq altamente variabile Le strutture 3-D sono molto simili fra loro Almeno 1000 geni VSG sono presenti nel genoma Viene espresso un gene alla volta
  11. 11. VSG locus types in T. brucei Horn and Barry. 2205. Chrom. Res. 13:525
  12. 12. Siti di Espressione VSG Circa 20 siti di espressione per genoma Sono tutti vicini ai telomeri E’ espresso un solo sito alla volta 50 bp repeats 70 bp repeats Expression site associated genes (ESAGs) VSG Telomeric repeats 40 - 60 kb
  13. 13. Meccanismi di VSG Gene Switching 1 . Trasposizione Duplicativa da un VSG telomerico viene sostituito il vecchio gene ( cassette mechanism ) 5’ end della trasposizione- 70 bp repeats poche copie al sito donatore 100aia di copie al sito di espressione 3’ end of della trasposizione- - VSGs simili a C-terminus 3’ regioni non tradotte repeats telomerici
  14. 14. Meccanismi di VSG Gene Switching 2. Conversione Telomerica-- l’intera parte terminale del cromosoma viene convertita non necessita dei repeats di 70 bp 3. Scambio reciproco di telomeri (tra VSG e promotere) 4. In situ switch - il vecchio sito di espressione viene spento un nuovo sito viene attivato
  15. 15. Expression Sites and ESAGs 20 different expression sites. Different alleles at different expression sites. All transcribed at the same rate BUT mRNAs differ greatly (VSG = 10% of all mRNA). 2 ESAGs - transferrin receptor (flagellar pocket) 1 ESAG - adenylate cyclase other ESAGS -- also expressed in the flagellar pocket? 50 bp repeats 70 bp repeats Expression site associated genes (ESAGs) VSG Telomeric repeats 40 - 60 kb
  16. 16. Variazione Antigenica <ul><li>I Tripanosomi sono coperti da una densa superficie esterna di rivestimento </li></ul><ul><li>Antisieri Varianti Specifici reagiscono fortemente con tale superficie di rivestimento </li></ul><ul><li>Le superfici di rivestimento di cloni diversi sono antigenicamente distinte </li></ul>
  17. 17. Variazione Antigenica <ul><li>Trattamento con tripsina rimuove completamente la superficie di rivestimento del Tripanosoma </li></ul><ul><li>Questo trattamenti abolisce il legame con gli Ab </li></ul><ul><li>Ciò significa che i determinanti antigenici di superficie sono proteine </li></ul>
  18. 18. Variazione Antigenica <ul><li>La superficie del rivestimento è composta interamente da una singola proteina Variant Surface Glycoprotein o VSG </li></ul><ul><li>Questa proteina è altamente immunogenica e distingue i cloni in successivi picchi di parassitemia </li></ul><ul><li>VSG da differenti picchi di parassitemia differiscono nella loro sequenza aa </li></ul>
  19. 19. Le proteine ancore GPI <ul><li>Quando furono sequenziati cDNA (mRNA) codificanti per VSG di T. brucei si vide che codificavano per regioni della regione idrofobica al c-terminale che potevano permettere l’ancoraggio della proteina </li></ul><ul><li>MA, quando furono sequenziate le proteine questa parte della proteina era mancante. </li></ul><ul><li>Come veniva mantenuta questa proteine solubile nella membrana? </li></ul><ul><li>Le VSG sono ancorate nella membrana tramite un ancora glicolipidica ( glycosyl-phosphatidylinositol o GPI ) </li></ul>
  20. 20. Le proteine ancore GPI <ul><li>Le ancore glicolipidiche - GPI - sono presenti nelle membrane di tutti gli organismi </li></ul><ul><li>L’ancora GPI viene sintetizzata da un precursore glicolipidico nel RE per aggiunte sequenziali di molecole di zucchero ad un fosfolipide </li></ul><ul><li>Il precursore maturo contiene un gruppo terminale di etanolammina-P che può formare un legame peptidico con il gruppo carbossilico del c-terminale della proteina </li></ul>
  21. 21. Le proteine ancore GPI <ul><li>L’ aggiunta dell’ancora GPI avviene subito dopo la traduzione della proteina </li></ul><ul><li>La porzione idrofobica al c-terminal della proteina serve come segnale di sequenza che viene tagliato e rimpiazzato con il glicolipide in una reazione di trans-peptidazione </li></ul>
  22. 22. Variation Antigenica <ul><li>Le ancore GPI permettono un packing di molecole molto denso sulla superficie del parasita </li></ul><ul><li>Le VSG formano così una copertura densa sulla superficie del tripanosoma </li></ul><ul><li>Un rivestimento simile si trova con in Leishmania con lipoposfoglicano </li></ul>
  23. 23. Variation Antigenica <ul><li>Tutte le VSG sono glicoproteine di 65 kDa, e sono presenti sulla superficie come dimeri </li></ul><ul><li>Il dominio esterno è altamente variabile e l’unico elemento conservato è la posizione delle cisteine </li></ul><ul><li>Altre proteine (non-variabili) come il recettore del trasporttore dell’ esosio sono pure nascoste nella superficie del rivestimento </li></ul>
  24. 24. Variation Antigenica <ul><li>Il 6-10% del genoma totale dei tripanosomi africani codifica per VSGs (oltre 1000 geni) </li></ul><ul><li>MA 1 solo di questi geni viene espresso ogni volta e gli altri 999 vengono repressi e sono silenti </li></ul><ul><li>A bassa frequenza avviene uno switch per un gene differente, se l’ospite sviluppa Ab contro quel particolare VSG e il nuovo clone viene fortemente selezionato </li></ul><ul><li>Quale è il vantaggio ad esprimere un solo VSG alla volta? </li></ul><ul><li>Come viene controllata l’espressione? </li></ul>
  25. 25. Variation Antigenica <ul><li>Solo un singolo mRNA codificante per un singola proteina VSG viene misurata </li></ul><ul><li>L’espressione di un VSG è controllata al livello dell’inizio della trascrizione </li></ul><ul><li>Regolazione dell’attività del promotere viene adoperata per controllare l’espressione genica in tutti gli organismi </li></ul>
  26. 26. La transcrizione nei tripanosomi è policistronica <ul><li>MA, nei tripanosomi sono stati identificati solo pochi promotori e questi non sembrano controllare l’espressione dei geni </li></ul><ul><li>Anche sorprendentemente è stato visto che la trascrizione nei tripanosomi è policistronica </li></ul><ul><li>Nei batteri l’ mRNA viene tradotto in proteine, nei tripanosomi viene ulteriormente processato e questa maturazione conferisce un ulteriore livello di controllo </li></ul>
  27. 27. La transcrizione nei tripanosomi è policistronica <ul><li>Le prime 39 (5’) coppie di basi di tutti i mRNA dei tripanosomi sono identici; </li></ul><ul><li>Inoltre, queste sequenze, non vengono trovata nel locus genetico di questi geni </li></ul><ul><li>Singoli mRNA maturi derivano da trascritti policistronici tramite un processo chiamato trans-splicing </li></ul><ul><li>Con questo meccanismo mRNA per un singolo gene viene tagliato da un trascritto policistronico ed un piccolo frammento di RNA trascritto da un locus differente ( the splice leader ) viene attaccato al 5’ terminale </li></ul>
  28. 28. Trans-splicing <ul><li>Il meccanismo e gli enzimi utilizzati per il trans-splicing sono simili al cis-splicing </li></ul><ul><li>Il cis splicing è un processo che rimuove gli introni da un mRNA di un gene eucariote </li></ul><ul><li>Lo splicing è compiuto da un complesso di small nuclear proteins ed RNA - lo spliceosoma </li></ul>
  29. 29. Trans-splicing <ul><li>Trans-splicing ( cutting and joining 2 RNA differenti) è molto simile al cis-splicing ( cutting and joining 1 stesso RNA) </li></ul>
  30. 30. Variazione Antigenica <ul><li>Se non è il promotore forse è la locazione precisa nel genome che predispone l’espressione di una specifica VSG </li></ul><ul><li>Ma allora come possono essere accesi? </li></ul>
  31. 31. VSG venono espressi da siti di espressione policistronica vicino ai telomeri <ul><li>Geni VSG attivi sono sempre localizzati alla “fine” di un cromosoma (telomeri) </li></ul><ul><li>Geni vengono letti da 20 siti di espressione ma solo 1 alla volta </li></ul><ul><li>Come viene reclutata una sequenza e come ciò è controllato? </li></ul>
  32. 32. Sono stati scoperti diversi meccanismi
  33. 33. Variazione Antigenica <ul><li>Transposizione di geni VSG avviene per ricombinazione intra- o inter- molecolare </li></ul><ul><li>Ciò spiega lo switching ma non perché solo un gene alla volta è attivo e gli altri silenti </li></ul>
  34. 34. Variazione Antigenica <ul><li>La regulazione può aversi per modifica della cromatina </li></ul><ul><li>In realtà siti attivi ed inattivi differiscono nella quantità di una speciale base modificata base chiamata J ( β -glucosyl-hydroxy-methyluracil) </li></ul><ul><li>a chicken or an egg? </li></ul>
  35. 35. L’amanita http://www.mushroomexpert.com Amanita bisporingea
  36. 36. Gli mRNA codificanti per VSG vengono transcritti da Pol I <ul><li>L' α -amanitina è un potente inibitore dell’ RNA polymerasi </li></ul><ul><li>Cells have specialized RNA polymerases to transcribe different genes </li></ul><ul><li>L’ mRNA che codifica per proteine viene trascritto da Pol II (enzima che è inibito da α amanitina) </li></ul><ul><li>Ribosomal RNA è transcritto da Pol I (che è resistente alla tossina) </li></ul><ul><li>Il trascritto di una VSG è insensibile alla α -amanitina che implica che è trascritta da Pol I </li></ul>Drug rRNA tubulin VSG

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