Azienda Ospedaliero-Universitaria               Università degli Studi di Catania        Policlinico di Catania           ...
Antifungini attivi sulla membrana cellulare                                        Membrana cellulare                     ...
Meccanismo d’azione                     dell’Amfotericina B                    Amfotericina B   PORO    Ergosterolo      F...
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Cell Wall Active Antifungals                                       Cell membrane                                        • ...
FlucytosineFluorinated pyrimidinerelated to flurouracil.                     Nuovi farmaci antifungini                    ...
Nuovi farmaci antifungini in sviluppo clinico                     Echinocandine (2)• Il bersaglio delle  echinocandine è i...
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Resistenza ai farmaci antifungini   La resistenza microbiologica può essere distinta in:   i)    resistenza primaria, anch...
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A Imhof, JCM 2003, 41: 5683-5688             Saggi in terreno liquido                                   YeastOne-Sensititr...
NCCLS conditions for antifungal susceptibility testing  Characteristic            NCCLS M27-A (135)                       ...
Saggi in agar               Diffusione da disco• Impossibilità di determinare la CMI e la CMF• Utilizzo di terreni interfe...
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Il controllo delle micosi gli antifungini

  1. 1. Azienda Ospedaliero-Universitaria Università degli Studi di Catania Policlinico di Catania Dipartimento di Scienze Microbiologiche Laboratorio Centralizzato di Analisi e Scienze Ginecologiche Laboratorio di Micologia Il controllo delle micosi: gli antifungini Prof.Salvatore Oliveri oliveri@unict.it Rappresentazione schematica della cellula fungina e principali bersagli dei farmaci antifunginiDa: Odds et al., Trends Microbiol., 2003 1
  2. 2. Antifungini attivi sulla membrana cellulare Membrana cellulare • Polieni - Amfotericina B - Nistatina (uso topico) • Allilamine, tiocarbamati, morfoline • Azoli - Miconazolo, clotrimazolo (ed altri per uso topico) - Ketoconazolo - Fluconazolo - Itraconazolo - Voriconazolo - Posaconazolo Polieni• L’amfotericina B (AmB), prodotta da Streptomyces nodosus, è stata per molti anni il solo poliene somministrabile per via sistemica• La modalità di azione è atipica per una molecola antimicrobica, in quanto si lega all’ergosterolo presente nella membrana fungina, determinando alterazioni della permeabilità, fuoriuscita di componenti citoplasmatici vitali e la morte dell’organismo. Tale meccanismo fa sì che AmB possa agire su un ampio spettro di specie fungine, come pure sia tossica per le cellule dei mammiferi 2
  3. 3. Meccanismo d’azione dell’Amfotericina B Amfotericina B PORO Ergosterolo Fosfolipidi Membrana cellulare Azoli• Imidazoli (ketoconazolo, miconazolo e clotrimazolo) e triazoli (fluconazolo e itraconazolo) costituiscono il più ampio gruppo di farmaci antifungini• Il loro effetto principale è quello di inibire la 14α-demetilazione del lanosterolo nella via biosintetica dell’ergosterolo, agendo sul citocromo P450, CYP51A1, anche chiamato Erg11p, cioè il prodotto del gene ERG11• In alcune specie fungine tali farmaci possono inibire anche la sterolo ∆22- desaturasi, un enzima coinvolto nell’ultima tappa della biosintesi dell’ergosterolo 3
  4. 4. Azoli (2)• Con la deplezione dell’ergosterolo, risultano alterate la normale permeabilità e fluidità della membrana fungina, con conseguenze secondarie sugli enzimi di membrana coinvolti nella sintesi della parete• Dotati di un ampio spettro di azione, sono attivi nei confronti di dermatofiti, funghi filamentosi, Candida spp., Cryptococcus neoformans e funghi dimorfi come Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis Azole Antifungals for Systemic Infections • Ketoconazole Imidazole • Itraconazole Triazoles • Fluconazole • Voriconazole “2nd generation triazole” Fluconazole Ketoconazole 4
  5. 5. Allilamine• Le allilamine (terbinafina e naftifina) inibiscono l’enzima squalene epossidasi, con conseguente deplezione dell’egosterolo ed accumulo di squalene. Hanno effetto fungicida nei confronti di dermatofiti e funghi filamentosi, ma sono fungistatici per molti lieviti patogeni. A causa della sua notevole efficacia nei confronti dei dermatofiti, la terbinafina è il solo farmaco di scelta per il trattamento di micosi superficiali e infezioni ungueali sostenute da tali muffe Allylamines - Mechanism 5
  6. 6. Cell Wall Active Antifungals Cell membrane • Polyene antibiotics • Azole antifungals DNA/RNA synthesis • Pyrimidine analogues - Flucytosine Cell wall • Echinocandins -Caspofungin acetate 5-fluorocitosina (5-FC)• In origine sviluppato come agente antineoplastico, agisce come antifungino attraverso la sua conversione a 5-fluorouracile (5-FU) nelle cellule target. Il 5-FU viene incorporato nell’RNA, determinando la terminazione prematura di catena, ed inibisce la sintesi del DNA attraverso i suoi effetti sulla timidilato sintetasi• Ha attività fungicida, tuttavia lo spettro di attività è limitato ai lieviti patogeni (Candida spp. e Cryptococcus neoformans)• 5-FC non viene utilizzata nella pratica clinica singolarmente, ma in associazione (ad es. con AmB) a causa del rapido sviluppo di resistenza primaria e secondaria (risultante da difetti negli enzimi permeasi, deaminasi e fosforibosil trasferasi) 6
  7. 7. FlucytosineFluorinated pyrimidinerelated to flurouracil. Nuovi farmaci antifungini Echinocandine (1)• Le echinocandine sono metaboliti fungini secondari, costituiti da un core ciclico esapeptidico con una catena lipidica laterale responsabile dell’attività antifungina.• Scoperti negli anni ’70 solo alla fine degli anni ’90 tre composti della classe echinocandine, anidulafungina, caspofungina e micafungina sono entrati nello sviluppo clinico 7
  8. 8. Nuovi farmaci antifungini in sviluppo clinico Echinocandine (2)• Il bersaglio delle echinocandine è il complesso delle proteine responsabili della sintesi dei β-1,3 glucani della parete, sebbene il preciso meccanismo d’azione rimanga sconosciuto Resistenza ai farmaci antifungini • La resistenza ai farmaci antifungini ha componenti cliniche e microbiologiche • Per resistenza clinica si intende il fallimento del trattamento e la persistenza dell’infezione nonostante la terapia antifungina appropriata. Una risposta clinica adeguata è a sua volta dipendente non solo dalla sensibilità del microrganismo patogeno ma anche da vari fattori, quali il sistema immune, la penetrazione e distribuzione del farmaco, la “compliance” del paziente e l’assenza di un focolaio di infezione protetto o persistente (es. catetere o ascesso) 8
  9. 9. Resistenza ai farmaci antifungini • La resistenza microbiologica di un dato patogeno fungino deve essere ritenuta come una variabile quantificabile, determinata mediante la misurazione della sensibilità al farmaco (es. MIC), e deve essere definita rispetto ad una popolazione di riferimento. • Un fungo patogeno resistente ad un dato farmaco è perciò un microrganismo che ha una “minimal inhibitory concentration” (MIC) più alta del valore medio calcolato nella popolazione totale • Pertanto la resistenza microbiologica o in vitro di un dato patogeno è basata sulla determinazione delle MIC In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of Aspergillus terreus, with head-to-head comparison to voriconazole 80 70 60 n° of isolates 50 40 AMB 30 VOR 20 10 0 0.06 0.25 1 4 16 MIC (mcg/ml)Sutton et al., JCM, 1999, 37: 2343-2345 9
  10. 10. Resistenza ai farmaci antifungini La resistenza microbiologica può essere distinta in: i) resistenza primaria, anche definita come resistenza intrinseca, che si osserva prima dell’esposizione in vitro o in vivo al farmaco ii) resistenza secondaria (o resistenza acquisita) che compare dopo l’esposizione ad un agente antifungino e può essere reversibile o acquisita stabilmente Meccanismi di resistenza ai polieni• La resistenza microbiologica ad AmB può essere intrinseca o acquisita• La resistenza intrinseca è comune ad alcune specie di Candida (C. lusitaniae) e a Trichosporon beigelii• La resistenza acquisita è spesso associata con alterazioni nel contenuto dei lipidi di membrana e specialmente dell’ergosterolo• Sono stati descritti ceppi clinici di C. albicans resistenti a AmB che mancavano di ergosterolo e accumulavano altri steroli a causa di un difetto dell’enzima sterolo ∆5,6-desaturasi• Un altro meccanismo alla base della resistenza sarebbe mediato da un’incrementata attività della catalasi, che potrebbe contribuire a diminuire il danno ossidativo prodotto da AmB 10
  11. 11. Mechanisms of resistance to polyenes Low ergosterol content in the cell membrane of Aspergillus spp. decreases the activity of AMB Walsh et al., JID, 2003, 188:305-319 Meccanismi di resistenza alla 5-FC• Anche nei confronti di tale farmaco la resistenza può essere intrinseca o acquisita• La resistenza intrinseca può presentarsi per un difetto della citosina permeasi, mentre quella acquisita deriva dall’incapacità di metabolizzare 5-FC a 5-FUTP e 5-dUMP oppure può essere dovuta alla perdita di un feedback di controllo della biosintesi della pirimidina• A causa dell’elevata resistenza intrinseca a 5-FC, tale composto è di gran lunga utilizzato in associazione con altri agenti antifungini, per esempio, con AmB 11
  12. 12. Meccanismi di resistenza agli azoli I meccanismi di resistenza agli azoli possono essere così suddivisi: 1. alterazioni nel trasporto del farmaco o ridotto accumulo di azoli nella cellula dovuto alla up- regolazione di geni “multidrug trasporter” (MDR1, CDR1 e CDR2). 2. alterazioni del target cellulare: i. diminuzione dell’affinità di Erg11p (per insorgenza di mutazioni) ii. aumento del contenuto cellulare di Erg11p (per up- regolazione genica 3. alterazioni della via biosintetica dell’ergosterolo, mediante inattivazione della sterolo ∆5,6-desaturasi Types of multidrug efflux transporters in yeast Plasma membraneNH2 A B A B NH2 COOH COOH ATP ADP ATP ADPATP-binding cassette (ABC)-transporters Major FacilitatorsC. albicans CDR1, CDR2 (Candida drug resistance), 170 kDa C. albicans CaMDR1 (Multidrug- 2 x 6 transmembrane domains (TM) resistance), 63 kDa- 2 nucleotide binding folds in Walker A and B domains - 2x6 transmembrane domains (TM)- Efflux a large variety of drugs - Effluxes a large variety of drugs Sanglard et al. (1995), AAC 39: 2378-2386; (1997), Microbiology 143: 405-416 12
  13. 13. Azole resistance mechanisms: enhanced efflux by upregulation of multidrug transporter genes Major Facilitator multidrug transporter CaMDR1 Lanosterol Azole ERG11resistant yeast 14α-demethylated sterols Ergosterol ATP Binding Cassette (ABC) multidrug Transporter Echinocandins - spectrum Highly active Very active Some activity Candida albicans, Candida parapsilosis Coccidioides immitis Candida glabrata, Candida gulliermondii B. dermatididis Aspergillus fumigatus Scedosporium species Candida tropicalis, Aspergillus flavus Paecilomyces variotii Candida krusei Aspergillus terreus H. capsulatum Candida kefyr Candida lusitaniae Pneumocystis carinii Low MIC ,with Low MIC, but without Detectable activity, fungicidal activity and fungicidal activity in which might have good in-vivo activity. most instances. therapeutic potential for man (in some cases in combination with other drugs). 13
  14. 14. Echinocandins-Spectrum vs. Moulds• Active against Aspergillus species – Glucan synthase localized in apical tips Staining with antisera to glucan• Activity against other yeast synthase subunit and moulds is less well (Fks1p) described or variable Aniline blue staining of β (1-3) glucans – stains only at apex Beauvais et al. J. Bacteriol 2001;183:2273-79 Echinocandins act at the apical tips of Aspergillus hyphae DiBACBowman et al. Antimicrob Agent Chemother 2002;46:3001-12 14
  15. 15. A Imhof, JCM 2003, 41: 5683-5688 Saggi in terreno liquido YeastOne-Sensititre • Possibilità di determinare la CMI e la CMF • Semplicità di interpretazione e di lettura • Possibilità di saggiare funghi filamentosi farmaci da saggiare e loro concentrazioni terreno di crescita pH temperatura e tempo di incubazione inoculo fungino controlli lettura interpretazione dei risultati 15
  16. 16. NCCLS conditions for antifungal susceptibility testing Characteristic NCCLS M27-A (135) NCCLS M38-P (133)Suitability Yeasts Conidium- and spore-forming fungiInoculum 0.5 × 103-2.5 × 103 CFU/ml 0.4 × 104-5 × 104 CFU/mlInoculum Spectrophotometric, with reference Spectrophotometric, with specificatiionstandardization to a 0.5 McFarland BaSO4 turbidity of a target optical density that varies standard by fungal genusTest medium RPMI 1640, buffered to pH 7.0 with Same as M27-A 0.165 M MOPSFormat Macrodilution or microdilution MicrodilutionTemp 35°C 35°CDuration of 48 h (Candida spp.), 72 h 48 h (most fungi)incubation (C. neoformans)End point Optically clear well for amphotericin Prominent growth reduction from B, ~80% reduction in growth control (~50%) for flucytosine, (macrodilution testing with azoles), fluconazole, and azoles; optically clear prominent decrease in turbidity well for amphotericin B; the T-level (microdilution testing with revision will propose the use of an flucytosine and the azole optically clear end point for antifungals) intraconazole and the newer azoles (e.g., voriconazole) Da Rex, J. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14: 643-658 Interpretative Breakpoints for Isolates of Candida Species Drug Concentration (µg/ml) Susceptible Susceptible Resistant Dose-DependentFlucytosine ≤4 (8-16) ≥ 32Fluconazole ≤8 16-32 ≥ 64Itraconazole ≤ 0,125 0,25-0,5 ≥1Voriconazole* ≤1 2 ≥4NCCLS: M27-A2 2002*CLSI: M27-S2 2006 16
  17. 17. Saggi in agar Diffusione da disco• Impossibilità di determinare la CMI e la CMF• Utilizzo di terreni interferenti con l’attività dei farmaci• Assenza di crescita per alcune specie fungine• Eventuale difficoltà di interpretazione e di lettura• Semplicità e rapidità di esecuzione• Relativa economicità E-test• Possibilità di determinare la CMI• Impossibilità di determinare la CMF• Utilizzo di terreni interferenti con l’attività dei farmaci• Assenza di crescita per alcune specie fungine• Eventuale difficoltà di interpretazione e di lettura• Semplicità e rapidità di esecuzione• Possibilità di saggiare funghi filamentosi 17

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