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    Procedes de-separation-et-techniques-readings Procedes de-separation-et-techniques-readings Document Transcript

    • Par Vincent MAKOKHA African Virtual university Université Virtuelle Africaine Universidade Virtual Africana Procédés de séparation et techniques électro-analytiques et spectrochimiques Procédés de séparation et techniques électro-analytiques et spectrochimiques
    • Université Virtuelle Africaine  Note Ce document est publié sous une licence Creative Commons. http://en.wikipedia.org/wiki/Creative_Commons Attribution http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ License (abréviation « cc-by »), Version 2.5. DrScottVanBramer(spectrométriedemasse)ainsiqueDrWilliamReush(spectroscopie moléculaire) de l’Université du Michigan ont autorisé la reproduction de certains textes et diagrammes provenant de leur cours de chimie organique.
    • Université Virtuelle Africaine  I. Procédés de séparation et techniques électro-analytiques et spectrochimiques .................................................................................. 3 II. Prérequis................................................................................................... 3 III. Temps........................................................................................................ 3 IV. Matériels didactiques................................................................................. 3 V. Justification............................................................................................... 4 VI. Contenu..................................................................................................... 4 6.1 Résumé................................................................................................ 4 6.2 Vue d'ensemble................................................................................... 5 6.3 Représentation graphique.................................................................... 7 VII. Objectifs généraux..................................................................................... 7 VIII. Objectifs spécifiques d’apprentissage........................................................ 8 IX. Activités d’enseignement et d’apprentissage............................................ 10 X. Liste des concepts clés (glossaire).......................................................... 15 XI. Liste des lectures obligatoires.................................................................. 21 XII. Listes des liens utiles............................................................................... 23 XIII. Ressources multimédias........................................................................... 31 XIV. Activités d'apprentissage......................................................................... 33 XV. Synthèse du module............................................................................... 106 XVI. Évaluation sommative............................................................................ 108 XVII. Auteur principal du module................................................................... 111 XIII. Références............................................................................................. 112 XIX. Structure du document.......................................................................... 112 Table des matières
    • Université Virtuelle Africaine  I. Procédés de séparation et techniques électro-analytiqueS et spectrochimiques Par Vincent Makokha II. Prérequis/connaissances préalables nécessaires • Structure de l’atome et concept de niveau d’énergie • Introduction aux concepts d’oxydo-réduction (RedOx) • Équilibrage d’équations rédox • Potentiels de réduction standards • Équation de Nernst • Concepts d’échantillonnage • Calculs d’erreur et statistiques • Théorie des liaisons chimiques • Électrochimie III. Volume horaire/temps • Techniques de séparation et chromatographie 25 heures • Techniques électrochimiques 15 heures • Spectroscopie et techniques spectroscopiques atomiques 20 heures • Spectroscopie moléculaire 1 (UV et IR) 30 heures • Spectroscopie moléculaire 2 (RMN) 15 heures • Spectrométrie de masse 15 heures IV. Matériels didactiques Afin de compléter ce module, les ressources et outils suivants seront nécessaires : • Ordinateur, CD-ROMs et ressources virtuelles • Pouvoir accéder à ce module, examens et autres matériels nécessaires à partir d’un ordinateur • Une connexion Internet afin d’accéder au module et aux autres références suggérées. • Pouvoir accéder à des forums de discussion interactifs. • Manuels et matériels de référence recommandés pour l’apprentissage et la compréhension des thèmes du module. • Programme Macromedia Flash Player
    • Université Virtuelle Africaine  V. Justification/importance du module Les différents procédés de séparation et techniques électro-analytiques et spec- trochimiques constituent la base de l’analyse instrumentale et leur application est largement répandue en industrie, en chimie, en biochimie et dans les domaines de l’environnement et de l’enseignement des sciences. Ces techniques sont basées sur les principes de chimie enseignés au niveau scolaire. Ainsi, tout au long de ce module, nous étudierons les principes sur lesquels ces techniques s’appuient et acquerrons les habiletés nécessaires à l’utilisation de ces techniques. L’étude de cette discipline augmente la compréhension des principes de chimie sous-jacents et permet aux ap- prenants de transmettre un meilleur enseignement au niveau scolaire. VI. Contenu 6.1 Résumé Ce module est constitué de trois parties indépendantes relatives aux thèmes suivants : procédés de séparation, techniques chromatographiques, techniques électro-analy- tiques et méthodes spectroscopiques. Il est subdivisé en six unités d’apprentissage reflétant les concepts et approches courants. Les unités portant sur les procédés de séparation et les techniques chromatographi- ques expliciteront les techniques de séparation élémentaires qui sont couramment enseignées dans les écoles. Par la suite, nous nous intéresserons aux techniques de chromatographies en exposant successivement les points suivants : théorie générale, applications et différentes techniques de chromatographie planaire et sur colonne. La section sur les techniques électro-analytiques introduit les principes sur lesquels est basée la potentiométrie et indiquera les applications courantes de celle-ci. Suit la section sur la voltampérométrie (ou voltammétrie) qui débute par les techniques dites polarographiques et qui se terminera par les voltampérométries cyclique et à redissolution anodique. L’unité sur la spectroscopie et les techniques de spectroscopie atomique revoit les concepts suivants : les interactions entre l’énergie et la matière ainsi que les niveaux d’énergie dans les atomes et les molécules. L’unité se termine par une étude des différentes techniques utilisées en spectroscopie atomique. La première unité portant sur la spectroscopie moléculaire s’intéresse d’abord à la théorie spectroscopique dans le spectre de lumière visible et dans la région des rayons ultraviolets (UV). Il est ensuite question de la place de ce concept et de son utilisation dans l’analyse qualitative et quantitative, ainsi que l’instrumentation dans le cadre de la spectrophotométrie moderne dans l’UV-visible. L’étude se poursuit ensuite sur la spectroscopie infrarouge (IR) en débutant par une introduction sur le spectre IR. Il est
    • Université Virtuelle Africaine  ensuite question des pics d’énergie caractéristiques reliés aux groupes fonctionnels des molécules et de l’application de l’IR dans l’identification de composés chimiques ou de groupements fonctionnels moléculaires. La deuxième unité sur la spectroscopie moléculaire commence par une introduction sur le phénomène de résonnance magnétique nucléaire (RMN). Ensuite il est ques- tion de la RMN du proton, de la relation entre le décalage chimique du proton et son environnement chimique et moléculaire ainsi que de l’utilisation de la RMN du proton dans l’identification de groupe fonctionnels moléculaires. L’unité se termine par l’étude la RMN du carbone et de son rôle dans l’analyse de composés. La dernière unité d’apprentissage porte sur la spectrométrie de masse et débute par une introduction sur les principes de base de la technique. Il est ensuite question de l’utilisation de la spectrométrie de masse dans l’identification de composés organiques et de l’instrumentation de la technique. 6.2 Vue d'ensemble UNITÉ I Séparation et techniques chromatographiques - 25 heures • Techniques de séparation - Extraction au solvant - Distillation • Chromatographie - Théorie de la chromatographie - Le processus d’entraînement • Types de techniques de chromatographie - Chromatographie planaire - Chromatographie sur colonne - Chromatographie liquide - Chromatographie en phase gazeuse UNITÉ II Techniques électro-analytiques - 15 heures • Potentiométrie - Électrodes sélectives ioniques - Électrodes à pH en verre - Titrages potentiométriques • Voltampérométrie (voltammétrie) - Polarographie - Polarographie impulsionnelle - Voltampérométrie cyclique - Voltampérométrie à redissolution anodique
    • Université Virtuelle Africaine  UNITÉ III Spectroscopie et techniques de spectroscopie atomique - 20 heures • Spectroscopie - Rayonnement électromagnétique - L’atome et la spectroscopie atomique - Loi de Beer • Techniques de spectroscopie atomique UNITÉ IV Spectroscopie moléculaire 1: uv-visible et ir- 30 heures • Spectroscopie dans l’ultraviolet/visible - Transitions électroniques - Utilisation de l’UV dans l’identification de groupes fonctionnels - Instrumentation de la spectrométrie UV-visible • Spectroscopie infrarouge - Vibrations moléculaires et spectroscopie infrarouge (IR) - Énergies relatives et absorption dans l’IR - Utilisation de la spectroscopie IR dans l’identification de groupes fonctionnels UNITÉ V Spectroscopie moléculaire 2 : résonance magnétique nucléaire - 15 heures • Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) - RMN du proton - Déplacement chimique - RMN du proton et structure de la molécule • Spectroscopie de RMN du carbone UNITÉ VI  Spectrométrie de masse - 15 heures • Spectrométrie de masse - Patrons de fragmentation - Spectre « empreinte digitale »
    • Université Virtuelle Africaine  6.3 Schéma-synthèse VII. Objectifs généraux Les objectifs généraux de ce module sont au nombre de trois : expliquer les concepts fondamentaux de certaines techniques d’analyses modernes, donner aux apprenants du module les habiletés de base pour appliquer ces concepts lors de simulations de problèmes de la vie courante et approfondir la compréhension des étudiants des principes de chimie qui régissent ces techniques. TECHNIQUES DE SÉPARATION ET DE CHROMATOGRAPHIE PROCÉDÉS DE SÉPARATION ET TECHNIQUES ÉLECTRO- ANALYTIQUES ET SPECTROCHIMIQUES TECHNIQUES ÉLECTRO- ANALYTIQUES INTRODUCTION À LA SPECTROSCOPIE / SPECTROSCOPIE ATOMIQUE SPECTROSCOPIE MOLÉCULAIRE 1 SPECTROMÉTRIE DE MASSE SPECTROSCOPIE MOLÉCULAIRE 2
    • Université Virtuelle Africaine  VIII. Objectifs spécifiques d’apprentissage Unité Objectifs d’apprentissages 1. Procédés de séparation et techniques de chromatographie À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : --Réintégrer les méthodes de séparation enseignées à l’école --Expliquer les principes de base de l’extraction au solvant --Résoudre des problèmes numériques hypothétiques concernant l’extraction au solvant --Nommer et dessiner les appareils utilisés pour l’extraction au solvant --Nommer les techniques courantes de chromatographie sur colonne et pla- naire --Expliquer la théorie sous-tendant chacune des techniques de chromatogra- phie planaire et sur colonne --Rappeler l’équipement nécessaire pour la chromatographie sur planaire et sur colonne 2.Techniques électro-analytiques À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : --Rappeler la théorie sur laquelle se base la potentiométrie --Expliquer les applications de la potentiométrie à la mesure de pH, aux électro- des sélectives ioniques et aux stations de titrage automatique --Réintégrer la théorie sous-tendant la voltampérométrie --Interpréter qualitativement et quantitativement des données voltampéromé- triques --Expliquer les concepts de base de l’analyse polarographique --Interpréter des données polarographiques afin d’identifier et de quantifier des composés chimiques 3. Introduction aux techniques spectroscopiques et spectroscopi- ques atomiques À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : --Nommer les parties du spectre électromagnétique --Rappeler les effets du rayonnement sur les atomes et les molécules --Rappeler la loi de Plank et l’appliquer aux problèmes de spectroscopie --Réviser les niveaux d’énergie des électrons dans les atomes et les molécules --Réintégrer la loi de Beer et l’appliquer à des problèmes quantitatifs --Expliquer les niveaux d’énergie des électrons dans les atomes et les transitions électroniques causées par l’absorption de radiations --Expliquer les concepts sur lesquels sont basées les spectroscopies d’émission atomique (SEA), de fluorescence atomique (SFA), et d’absorption atomique (SAA) --Réintégrer les notions d’instrumentation des SEA, SFA et SAA --Faire les calculs nécessaires en se basant sur des observations de SAA, SFA et SEA hypothétiques
    • Université Virtuelle Africaine  Unité Objectifs d’apprentissages 4. Spectroscopie moléculaire 1 : spectroscopie dans l’UV-visible et dans l’IR À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : --Réintégrer la notion de transition électronique causée par l’absorption de rayons UV-visibles --Faire la corrélation entre l’absorption de rayons UV-visibles de fréquences spécifiques et les groupes fonctionnels moléculaires --Utiliser des données hypothétiques pour trouver la concentration d’un liquide en utilisant l’UV --Rappeler les parties d’un spectrophotomètre UV moderne et leurs fonctions --Réintégrer les notions de transitions électroniques causées par l’absorption de rayons IR --Faire la corrélation entre l’absorption de rayons IR de fréquences spécifiques et les groupes fonctionnels moléculaires --Faire la corrélation entre l’absorption de rayons IR de fréquences spécifiques et la structure de molécules organiques simples --Rappeler les parties d’un spectrophotomètre IR moderne et leurs fonctions 5. Spectroscopie moléculaire 2 : Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : --Expliquer le phénomène de résonance magnétique nucléaire --Rappeler les propriétés nucléaires démontrées par la RMN --Expliquer le phénomène de RMN du proton (HRMN) --Corréler les fréquences spécifiques d’absorption HRMN aux groupes fonction- nels moléculaires --Corréler les fréquences spécifiques d’absorption HRMN à la structure molécu- laire de molécules organiques simples. --Expliquer les particularités du phénomène de RMN du carbone-13 --Rappeler la nature des informations fournies par une RMN du carbone-13 --Rappeler les parties d’un spectromètre à RMN moderne et leurs fonctions 6. Spectrométrie de masse À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : --Expliquer comment se produit le phénomène du spectre de masse --Expliquer les règles suivies par la fragmentation dans un spectre de masse --Faire la corrélation entre le spectre de masse et des éléments structurels spécifiques dans une molécule --Utiliser un spectre de masse pour identifier différentes catégories de molécu- les --Utiliser un spectre de masse à haute résolution et un calculateur de masse moléculaire afin d’identifier des éléments structurels --Rappeler les différentes parties d’un spectromètre de masse et leurs fonctions
    • Université Virtuelle Africaine 10 IX. Activités d’enseignement et d’apprentissage Évaluation formative 1) Un atome de béryllium possède 4 protons, 5 neutrons, et 4 électrons. Quel est le nombre de masse de cet atome ? A) 4 B) 9 C) 8 D) 7 2) Le nombre quantique principal le plus bas pour un électron est : A) 1 B) 0 C) 2 D) -1 3) Concernant les acides et les bases, lequel des énoncés suivants est vrai ? a) Les acides et les bases ne réagissent pas ensemble b) Les acides et les bases se neutralisent l’un l’autre c) Un acide mélangé à une base donne une base plus forte d) Un acide mélangé à une base donne un acide plus fort 4) Les solutions neutres ont un pH de : A) 0 B) 1 C) 7 D) 10 5) Comparativement à la charge et la masse d’un proton, un électron a : a) la même charge et une masse inférieure b) la même charge et une masse égale c) une charge opposée et une masse inférieure d) une charge opposée et une masse égale 6) Quelle est la formule empirique du composé ayant la formule moléculaire P4 O10 a) PO b) PO2 c) P2 O5 d) P8 O20
    • Université Virtuelle Africaine 11 7) Laquelle des conversions suivantes nécessite un agent oxydant ? a) Mn3+ --> Mn2+ b) C2 H4 --> C2 H6 c) (2CrO4 )2 - --> (Cr2 O7)2- d) SO2 --> SO3 8) Les halogénures d’hydrogène sont des molécules polaires qui forment des solu- tions acides. Lequel des acides suivants est le plus faible ? a) HI b) HF c) HBr d) HCL 9) Calculez la [H+ ] dans une solution ayant un pH de 8,38. a) 1,21 x 10-2 b) 3,8 x 10-8 c) 2,40 x 108 d) 4,17 x 10-9 10) Dans toutes les cellules électrochimiques, le processus qui prend place à l’anode est ______________ et celui qui se produit à la cathode est ______________. a) oxydation, réduction b) réduction, réduction c) réduction, oxydation d) oxydation, oxydation 11) Quel est l’état d’oxydation du soufre (S) dans le composé H2 SO3 ? a) +4 b) +2 c) 0 d) +6 12) L’électrode standard à hydrogène a un potentiel de référence de : a) -1,00 volt b) 0,76 volt c) 0 d) 1,00 volt
    • Université Virtuelle Africaine 12 13) Choisissez l’équation qui ne représente pas une réaction redox : a) Zn + CuSO4 → ZnSO4 + Cu b) 2H2 O2 → 2H2 O + O2 c) H2 O + CO2 → H2 CO3 d) 2H2 + O2 → 2H2 O 14) Une mole d’électrons a une charge de 96 485 coulombs. Cette quantité est connue des chimistes comme étant : a) 1 watt b) 1 ampère c) 1 joule d) 1 faraday 15) Parmi ces propriétés de l’eau, laquelle explique sa capacité à dissoudre l’acide acétique ? a) La tension de surface élevée de l’eau, qui est causée par la formation de liens hydrogène entre les molécules d’eau adjacentes. b) La capacité de l’eau d’agir comme tampon; absorbant les protons libérés par l’acide acétique. c) La capacité de l’eau de former des liens hydrogène avec les groupements carbonyles et hydroxyles de l’acide acétique. d) Aucune des réponses ci-dessus. 16) Le pH d’une solution correspond à : a) La concentration de l’ion hydrogène, [H+ ] b) log [H+ ] c) -log [H+ ] d) -ln [H+ ] e) -ln [H+ ] 17) Si la concentration de H + dans une solution est 10 - 3 M, quelle sera la concen- tration de OH– dans cette même solution à 25°C ? a) 10- 3 M b) 10- 11 M c) 1011 M d) 2 x 10- 11 M e) 10- 14 M
    • Université Virtuelle Africaine 13 18) Quelle quantité (en ml) d’une solution de HCl 0,4 M est requise pour amener le pH d’une solution de 10 ml de NaOH 0,4 M à 7,0 (pH neutre) ? a) 4 b) 40 c) 10 d) 20 e) 2 19) Un atome duquel des éléments suivants a la plus grande capacité d’attirer un électron ? a) Silicium b) Soufre c) Azote d) Chlore 20) Lequel des éléments suivants a la plus haute énergie de première ionisation ? a) Aluminium b) Sodium c) Calcium d) Phosphore Eléments de réponse 1. b 2. a 3. b 4. c 5. a 6. c 7. d 8. b 9. d 10. a 11. a 12. c
    • Université Virtuelle Africaine 14 13. c 14. d 15. c 16. c 17. b 18. c 19. d 20. d Commentaire pédagogique pour les lecteurs/apprenants Moins de 30% de bons résultats Il est fortement recommandé à l’apprenant(e) de réviser les concepts et connaissances préalables requis avant d’entreprendre l’étude de ce module. Entre 30 et 60% de bons résultats L’apprenant(e) est préparé à entreprendre ce module, mais aura peut-être besoin de recourir à une révision de certains concepts. Au-delà de 60% de bons résultats L’apprenant(e) est bien préparé et maîtrise suffisamment les connaissances préala- bles.
    • Université Virtuelle Africaine 15 X. Concepts-clés (Glossaire) Séparation et chromatographie Éluant (ou, plus rarement, Solvant) est le terme qui désigne le la phase mobile liquide. Diluant : terme désignant un liquide inerte utilisé pour dissoudre l’extractant, et pour diluer le système. Extractant : terme qui désigne un agent d’extraction d’ions métalliques. Raffinat : désigne la phase mobile après qu’un soluté en ait été extrait (le mélange appauvri en soluté). Extrait : désigne la phase enrichie en soluté que l’on obtient après l’extraction. Extraction : désigne l’opération qui extrait un soluté non-désiré d’un liquide orga- nique Revaporisation (Stripping) : Prenons le cas d’une chaudière vapeur qui contient de l’eau (et de la vapeur au dessus du plan d’eau) sous 210ºC - 19 bars (absolus). Si l’on soutire de l’eau celle-ci va se trouver à la pression atmosphérique, or à p = patm la température peut être au maximum de 100ºC : une partie de l’eau va se vaporiser pour atteindre cette température : c’est la revaporisation. Ce procédé peut servir à en réduire la teneur d’un liquide en produits trop volatils, par exemple. Asymétrie : c’est un facteur décrivant la forme du pic chromatographique. La théorie assume une courbe de Gauss symétrique. Le facteur d’asymétrie du pic est le ratio (mesures prises à 10% de la hauteur) de la distance entre l’apex et la deuxième moitié de la courbe chromatographique sur la distance entre l’apex et la première moitié de la courbe. Une valeur supérieure à 1 aura pour résultat une traînée (tailing peak) alors qu’une valeur inférieure à 1 indique un front diffus (fronting peak). Ligne de base: la ligne de base est celle qui est dessinée par le système d’analyse quand le seul signal détecté provient de la phase mobile. Chromatographie : C’est un procédé physique de séparation basé sur la différence d’affinité des substances constituantes à analyser à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile. Volume mort (Vm ): C’est en quelque sorte tout volume externe aux particules imprégnées de liquide (phase stationnaire) contenues dans la colonne. Le volume interstitiel (intra-particules et inter-particules contenues dans la colonne) ajouté au volume extra-colonne (auquel contribue l’injecteur, le détecteur, les tubes connecteurs et les raccords) se combinent pour former le volume mort. Ce volume mort peut être déterminé en injectant dans la colonne un composé inerte, par exemple un liquide qui n’interagirait pas avec la phase stationnaire. On retrouve aussi les abréviations V­0­ ou Vm (pour volume mort).
    • Université Virtuelle Africaine 16 Détecteur : C’est un dispositif électronique qui met en évidence de façon quantitative la présence des composés séparés pendant l’élution. Il existe différents types de dé- tecteurs. Les plus courants sont : les détecteurs de rayonnement dans l’UV-visible, les détecteurs à réfractomètre différentiel, les détecteurs électrochimiques, les détecteurs de conductivité et les détecteurs de fluorescence. Chromatographie de déplacement : c’est un procédé chromatographique où la phase mobile a plus d’affinité que le soluté (l’échantillon) pour la phase stationnaire. L’échantillon est placé sur la colonne et est donc ensuite déplacé par la phase mobile qui est plus fortement absorbée que les différentes composantes de l’échantillon. Les molécules de l’échantillon sont donc poussées devant par la phase mobile. On obtient pour résultat une meilleure élution du soluté. Ces techniques de déplacement sont utilisées principalement en chromatographie liquide à haute performance (CLHP, ou HPLC). Standard externe : c’est un échantillon distinct contenant des quantités connues des composés (ou solutés) d’intérêt. Les standards externes sont utilisés principalement pour l’identification de pics en comparant les temps d’élution. Hydrophile : désigne l’affinité pour l’eau. Ce terme convient autant aux phases stationnaires compatibles avec l’eau qu’aux molécules solubles dans l’eau. La plu- part des colonnes utilisées pour la séparation de protéines sont de nature hydrophile et ne devraient pas absorber ni dénaturer les protéines contenues dans une solution aqueuse. Injecteur : c’est un dispositif servant à injecter de façon précise une quantité prédé- terminée d’échantillon dans le flot de la phase mobile. L’injecteur peut être un simple dispositif manuel ou encore un appareil sophistiqué d’échantillonnage permettant l’injection automatisée de plusieurs échantillons différents (peut être une opération sans surveillance humaine). Coefficient de partage (K) : rapport entre la quantité de soluté dans la phase station- naire et la quantité de soluté dans la phase mobile. Il peut aussi être appelé coefficient de distribution, KD . Temps de rétention (tr ) : désigne le temps entre l’injection et l’apparition du sommet du pic. Le temps de rétention ajusté ou réduit, tr ’, est le temps de rétention soustrait du temps passé dans la phase stationnaire. Volume de rétention (Vr ) : correspond au volume de la phase mobile requis pour éluer une substance de la colonne. On désigne également par Vm le volume mort ou volume nul, KD le coefficient de distribution et Vs , le volume de la phase stationnaire. Phase stationnaire : c’est la phase immobile impliquée dans le processus de chro- matographie. En chromatographie liquide, cette phase peut être un solide, ou encore une paroi ou un support solide enduit de la substance qui joue le rôle de la phase stationnaire. La phase stationnaire choisie est souvent une caractéristique du mode de chromatographie liquide (LC) utilisé. Par exemple, le gel de silice est utilisé en chromatographie d’adsorption, l’enduit d’octadécylsilane est typique de la chroma- tographie en phase inverse, etc.
    • Université Virtuelle Africaine 17 Chimie électro-analytique Courant de bruit de fond : courant qui n’est pas lié à la réaction chimique de l’analyte. Courant capacitif ou chargeant : courant de bruit de fond produit par l’électrode jouant le rôle de capaciteur et devenant chargée. Diffusion : mouvement dans une solution causé par un gradient de concentration. Demi-cellule : c’est la moitié d’une cellule électrochimique contenant une élec- trode, un système conducteur avec un solvant, un analyte et un pont salin assurant la conductivité. Potentiel de demi-vague : c’est le potentiel à la moitié du pic, une mesure du po- tentiel formel. Électrode indicatrice : électrode utilisée en potentiométrie dont le potentiel dépend de l’activité de l’analyte. Électrode sélective ionique : électrode utilisée en potentiométrie qui donne un signal de potentiel en présence de l’ion auquel elle est sélective. Voltampérométrie à balayage linéaire : c’est l’action de mesurer le courant lorsque le potentiel change de façon régulière (linéairement augmenté ou diminué). Migration : mouvement dans une solution causé par un gradient de potentiel. Polarographie : méthode de voltampérométrie où l’électrode de travail est l’électrode à gouttes de mercure. Potentiel ou potentiel électrochimique : mesure de l’énergie d’une réaction élec- trochimique. Fenêtre de potentiel : fenêtre de potentiel pour une électrode ou un solvant donné(e) où les mesures analytiques peuvent être faites. Électrode de référence : demi-cellule de potentiel électrochimique connu et constant ; unités généralement en volts, (V). Électrode d’argent/chlorure d’argent : électrode de référence qui consiste en un fil d’argent recouverte d’un enduit de chlorure d’argent et immergé dans une solution aqueuse saturée.
    • Université Virtuelle Africaine 18 Spectroscopie Spectroscopie d’absorption : type de spectroscopie où l’on mesure la quantité de rayonnement d’une longueur d’onde particulière absorbée par un échantillon d’in- térêt. La longueur d’onde d’absorption dépend de la molécule et de ses différentes transitions électroniques. Loi de Beer-Lamber : c’est une fonction de l’absorbance, la longueur du trajet de la lumière, le coefficient d’absorption molaire et la concentration de l’échantillon : A = εcl. Chromophore : groupement fonctionnel responsable de l’absorption. Ex. : un alcène absorbe à une λmax de 177 nm. Conjugaison : c’est une longue série de liaisons simples, doubles et/ou triples alter- nées, qui provoque le recouvrement des orbitales p. Les systèmes conjugués tendent à absorber dans la région visible. Double liaison : une liaison chimique ou l’orbitale s et deux des orbitales p s’hybrident pour former 3 orbitales sp2 qui formeront une liaison sigma (σ), avec l’hydrogène ou le carbone, par exemple. L’orbitale p restante formera une liaison pi (π) avec un autre carbone hybridé sp2 . Spectre électromagnétique : c’est la région d’énergie électromagnétique où les longueurs d’onde vont de 105 (ondes radio) à 10-14 (rayonnement gamma). Entre ces deux extrêmes se trouvent les régions de l’infrarouge, du visible, de l’ultraviolet et des rayons X. Fluorescence : La fluorescence a lieu lorsqu’un électron à l’état excité qui se trouve dans un état excité, transite vers l’état fondamental. Cette transition s’accompagne d’une perte d’énergie qui se produit en premier lieu par perte de chaleur à travers la relaxation vibrationnelle et ensuite par émission de lumière (fluorescence) lors du retour à l’état fondamental HOMO : acronyme pour Highest Occupied Molecular Orbital ; l’orbitale de plus haute énergie qu’occupe un électron dans la molécule au zéro absolu. LUMO : acronyme pour Lowest Unoccupied Molecular Orbital ; l’orbitale de plus basse énergie inoccupée par un électron dans la molécule au zéro absolu Coefficient d’absorption molaire : c’est une mesure de la quantité de radiation ab- sorbée par unité de concentration d’échantillon dont l’équation peut être réarrangée pour donner : ε = A/cl (loi de Beer-Lambert). Cette valeur est constante pour une substance donnée. Orbitales moléculaires : orbitales qui résultent de l’interaction des orbitales ato- miques lorsque des liaisons chimiques sont formées. Les orbitales liantes sont de moindre énergie que les orbitales atomiques d’origine, les orbitales anti-liantes sont de plus haute énergie et les non-liantes sont d’énergie égale. 
    • Université Virtuelle Africaine 19 Spectroscopie : c’est la méthode où des données sont produites et analysées permet- tant la détermination de structures de molécules. Transmittance : La quantité de rayonnement qui passe à travers un échantillon, c’est- à-dire qui n’est pas absorbée par ce dernier. On obtient le pourcentage de transmission (transmittance) en multipliant par 100 la valeur du quotient du rapport de la quantité d’énergie émise sur la quantité d’énergie passant à travers l’échantillon. Région de l’ultraviolet : c’est la région du spectre électromagnétique d’environ 400 à 10 nm. Elle est séparée en trois sous-domaines : les UV proches (400 à 300 nm), les UV éloignés (300 à 200 nm) et les UV extrêmes (exploités dans le vide uniquement, moins de 200 nm). Ces derniers sont appelés UV extrêmes ou exploités dans le vide (sous vide), car leur radiation est absorbée par l’oxygène. Cela signifie que si l’on désire utiliser les UV extrêmes, l’appareil doit être mis sous vide. Région du visible : la région du spectre électromagnétique de 700 à 400 nm à laquelle l’œil humain est sensible et peut voir la lumière blanche et les couleurs. Longueurd’onde : c’est la mesure des ondes de pic à pic. Par exemple, les ondes radio ont des longueurs d’onde pouvant aller jusqu’à 10 km alors que les rayons gamme possèdent des longueurs d’onde aussi courtes que 10-14 m (0,00000000000001m). Spectrométrie de masse Spectrométrie de masse : c’est la technique dans laquelle un instrument est employé pour produire des ions à partir d’atomes ou de molécules (la source). Ces ions sont séparés selon la valeur du quotient du rapport de leur masse sur leur charge (m/z) (l’analyseur) et ensuite, détectés. Double focus : une combinaison de champs électrostatique et magnétique qui est utilisée pour compenser les variations dans les énergies des ions formés dans la source et ainsi, améliorer la résolution (qv) de l’analyseur (voir aussi systèmes à géométrie normale/ conventionnelle et inversée). Tension d’accélération : potentiel appliqué à la source pour accélérer le mouvement des ions à l’intérieur de l’analyseur. Unité de masse atomique unifiée : l’unité de masse atomique est le 1/12 ème de la masse d’un atome de carbone 12 ( 1 u.m.a = 1,66.10-24 g = 1,66.10-27 kg). . m/z est le rapport de la masse sur la charge de l’ion détecté. Z est souvent égal à 1, mais peut être un nombre entier plus grand, particulièrement en spectroscopie de masse à ionisation par électron-ébullisation (ESI-MS). Ion moléculaire : désigne l’ion formé à partir de la molécule d’origine à l’intérieur de la source. Radical ion : c’est un ion possédant un électron non apparié.
    • Université Virtuelle Africaine 20 Masse moyenne ou relative (Mr ) : c’est la masse d’une particule ou molécule de formule empirique donnée, calculée en utilisant la masse atomique pour chaque élément. Masse exacte : les isotopes ont une masse précise et unique, cela a pour conséquence que la composition en éléments de toute molécule, ou fragment de molécule, peut être calculée à partir de sa masse si elle est déterminée de façon suffisamment précise. Trucs d’apprentissage Le matériel pédagogique contenu dans ce module est présenté en ordre croissant de complexité, du début à la fin de chaque unité. C’est pourquoi il est suggéré d’étudier chaque unité du début jusqu’à la fin, dans l’ordre de présentation. Il est également conseillé à l’apprenant de s’en tenir au nombre d’heures proposé pour chaque unité. Quatre ressources majeures sont proposées pour ce module : le module lui-même, les références en ligne, les livres de référence et l’évaluation formative. L’apprenant devrait utiliser le matériel contenu dans ce module en tant que premier outil d’apprentissage et parcourir l’unité intégralement avant de se référer aux livres de référence et à l’internet. Les ressources en ligne sont indiquées dans le corps du texte du module partout où il serait bénéfique à l’étudiant de les consulter. L’évaluation formative est incluse dans le module afin d’augmenter la compréhension des concepts-clés et de renforcer les compétences. Les apprenants devraient tenter de faire les évaluations dès la fin de la section et les utiliser comme une pratique. L’évaluation sommative examine la compréhension des concepts et évalue ce que l’apprenant a retenu d’une unité donnée.
    • Université Virtuelle Africaine 21 XI. Lectures obligatoires Référence 1 Titre : Spectrometric Methods of identification of organic Compounds Auteurs : Robert M. Silverstein, Francis X. Webster et David J. Kiemle Éditeur : Wiley; 7e édition, 2005 Résumé : Ce livre présente une introduction approfondie sur les trois types de spectroscopie les plus couramment utilisés pour l’identification spectrométrique de composés : spectrométrie de masse, spectrométrie infrarouge et spectrométrie de résonance magnétique nucléaire. L’ouvrage utilise une approche de résolution de problèmes avec chartres et tableaux de référence complets et offre une gamme de problèmes réalistes mettant au défi les chimistes dans l’exercice de leur profession. Justification : L’intention de cette référence est de donner aux étudiants l’opportunité d’acquérir des compétences pratiques d’interprétation de spectres. Il est conseillé à l’apprenant d’utiliser ce livre pour les questions pratiques et pour mieux maîtriser les techniques. En essayant de résoudre deux à trois problèmes sur chacune des techniques, il est possible d’atteindre une maîtrise satisfaisante des techniques de spectroscopie. Ce livre constitue une référence majeure concernant la spectroscopie UV, IR, RMN et la spectrométrie de masse. Référence 2 Titre : Principles of Instrumental Analysis Auteurs : Douglas A. Skoog, F. James Holler et Stanley R. Crouch Éditeur : Brooks Cole, 6e édition, 2006 Résumé : Ce livre met l’accent sur la théorie de base de chacun des types d’ins- truments et de leur principal champ d’application ou d’utilisation, ainsi que de leur sensibilité, leur précision et leurs limites. Justification : Cette référence couvre tous les aspects du module de manière très simplifiée, mais reste tout de même la référence principale en matière de techniques électro-analytiques et chromatographiques.
    • Université Virtuelle Africaine 22 Référence 3 Titre : The Essential Guide to Analytical Chemistry Auteur : Georg Schewdt Éditeur : John Wiley and Sons, 2e édition, 1997 Résumé : Ce livre est une suggestion de référence pratique pour ce module ; il contient tous les éléments du cours dans un format de poche facile à lire. Son format unique contenant des diagrammes colorés, accompagnés de textes concis le rend facile à consulter et permet de trouver rapidement l’information pertinente. En plus de bien illustrer les procédés et instruments, les diagrammes présentent de façon claire et schématique des exemples de la vie courante de diverses applications au moyen de simples spectres. Justification : Ce livre est suggéré en tant que référence complémentaire dans le but de raffiner la compréhension du module pour les apprenants. Il ne devrait pas être utilisé comme principale référence d’apprentissage puisque les sujets n’y sont pas autant traités en profondeur que dans les références 2 et 3.
    • Université Virtuelle Africaine 23 XII. Liens utiles Adresse : http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/carey/student/olc/ch13ir.html Résumé : Ce lien fait référence à une partie d’un vaste cours de chimie qui s’appli- que à ce module. Toutefois, il n’est nécessaire pour l’apprenant de lire les chapitres autres que le treize. Ce chapitre traite du contenu de ce module de façon simple et facile à comprendre. Cette référence apporte une approche alternative pour l’étude du module, comprenant des tutorats de concepts théoriques ainsi que des exemples de problèmes résolus de différents spectres. Justification: Les exemples de spectres fournis par cette référence procurent une bonne pratique de résolution de problèmes associés au module et permettent une meilleure compréhension des concepts.
    • Université Virtuelle Africaine 24 Adresse : http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Spectrophotometry/ Résumé : Ce site contient des notes résumées sur les concepts étudiés dans ce mo- dule. Justification : Ce site est bien et peut aider l’apprenant à mémoriser les notions du module et les concepts-clés.
    • Université Virtuelle Africaine 25 Adresse : http://www.nd.edu/~smithgrp/structure/workbook.html Résumé : Ce site contient un recueil de problèmes de pratique. Justification: Ces problèmes sont utiles pour une meilleure maîtrise des concepts de la spectroscopie moléculaire et de la spectrométrie de masse.
    • Université Virtuelle Africaine 26 Adresse : http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/spectro.htm#contnt Résumé : Ce site contient un cours complet de chimie organique. Justification : L’approche utilisée dans ce cours peut apporter une compréhension plus en profondeur du contenu de ce module.
    • Université Virtuelle Africaine 27 Adresse : http://www.chromatography-online.org/topics/gas/chromatography/detectors. html Résumé : Ce site est l’un des sites sur la chromatographie les plus complets. Justification: Sur ce site, les différents aspects sont traités avec plus de profondeur que ce qui est requis pour le module, mais il peut être utilisé comme référence.
    • Université Virtuelle Africaine 28 Adresse : http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/bnmr.htm Résumé : Ce site offre une bonne revue de la RMN du carbone 13 avec beaucoup d’explications accompagnées d’exemples de spectres. Justification: Les objets d’étude du module sont traités sur ce site moins en profon- deur que ce qui est requis dans le module; il est donc conseillé à l’apprenant de ne l’utiliser qu’en tant que référence.
    • Université Virtuelle Africaine 29 Adresse : http://weather.nmsu.edu/Teaching_Material/soil698/Student_Reports/Spec- troscopy/report.htm Résumé : Ceci est un rapport d’un étudiant sur la spectroscopie d’absorption atomi- que (SAA). Justification: Cette page présente la spectroscopie atomique dans une forme simplifiée.
    • Université Virtuelle Africaine 30 Adresse : http://www.chemguide.co.uk/index.html#top Résumé : Ce site s’adressait originalement aux étudiants du niveau A de chimie du Royaume-Uni. Il a cependant été approfondi et englobe maintenant les objets d’étude des niveauxA, IB, Scottish Advanced Higher et Cambridge International. En fait, ce site est utilisé par les personnes (âgées de 16 à 18 ans environ) suivant l’équivalent de ces cours à travers le monde et par les étudiants débutant leurs cours universitaires. Justification : Ce site contient des explications très simplifiées des objets concernés par ce module.
    • Université Virtuelle Africaine 31 XIII. Ressources multimédias http://www.colby.edu/chemistry/NMR/H1pred.html Résumé : Une bonne sélection d’applications servant à interpréter les spectres IR, de RMN et de masse, réalisée par le Colby College, dans l’état du Maine (USA). Justification : Ce site offre plusieurs outils multimédias pour le renforcement de l’apprentissage de cette unité.
    • Université Virtuelle Africaine 32 http://www.shsu.edu/~chemistry/primers/primers.html Résumé : Ce lien présente un vaste recueil de ressources multimédias concernant tous les thèmes couvert par ce module. Justification : Ce site devrait être utilisé comme une source de références multimé- dias.
    • Université Virtuelle Africaine 33 XIV. Activités d’apprentissage Unité I Procédés de séparation et techniques de chromatographie Résumé de l’activité d’apprentissage À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : • Réintégrer les méthodes de séparation enseignées à l’école • Expliquer les principes de base de l’extraction au solvant • Résoudre des problèmes numériques hypothétiques concernant l’extraction au solvant • Nommer et dessiner les appareils utilisés pour l’extraction au solvant • Nommer les techniques courantes de chromatographie sur colonne et chro- matographie planaire. • Expliquer la théorie sous-tendant chacune des techniques de chromatographie planaire et sur colonne • Rappeler l’équipement nécessaire pour la chromatographie planaire et sur colonne Liste des lectures obligatoires Procédés de séparation http://en.wikipedia.org/wiki/Separation_process http://en.wikipedia.org/wiki/Distillation#Laboratory_scale_distillation http://en.wikipedia.org/wiki/Liquid-liquid_extraction http://en.wikipedia.org/wiki/Separating_funnel http://en.wikipedia.org/wiki/Distillation Chromatographie http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC http://en.wikipedia.org/wiki/Chromatography http://hplc.chem.shu.edu/HPLC/index.html http://www.waters.com/watersdivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-5LTGBH http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/column.html#top
    • Université Virtuelle Africaine 34 Liste de liens utiles pertinents http://www.chromatography-online.org/Principles/Introduction/rs1.html http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/matter/chromatography.shtml http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatogrmenu.html#top http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html#top http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm http://www.forumsci.co.il/HPLC/modes/modes3.htm http://www.chem.ubc.ca/courseware/121/tutorials/exp3A/columnchrom/ http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm2.htm Procédés de séparation Extraction au solvant L’extraction liquide-liquide, aussi connue sous le nom d’extraction au solvant (ou plus rarement, extraction par partage), est une méthode de séparation des compo- sés basée sur leur solubilité relative dans deux liquides différents non-miscibles, habituellement l’eau et un solvant organique. C’est une extraction d’une substance d’une phase liquide dans une autre phase liquide. Dans cette méthode, une solution (généralement aqueuse) contenant un ou des soluté(s) est mise en contact avec un solvant (généralement organique) dans le but de transférer un soluté (ou plus) de la solution aqueuse vers le solvant. Le mélange est agité vigoureusement afin d’augmen- ter l’entrée en contact des particules de la solution avec celles du solvant, on utilise généralement une ampoule à décantation pour cette opération. L’appareil est ensuite laissé au repos afin de permettre aux deux phases de se séparer. Coefficient de partage Le coefficient de partage ou de distribution (K) est le rapport des concentrations d’un composé (ou soluté) dans les deux phases d’un mélange de deux solvants non- miscibles à l’équilibre. Ce coefficient est une mesure de la différence de solubilité du composé entre les deux solvants présents. Normalement, un des solvants choisis est l’eau (ou une solution aqueuse), et le se- cond est un solvant organique (donc hydrophobe), comme l’octanol, par exemple. Ainsi, les coefficients de partage et de distribution sont en quelque sorte une mesure de l’hydrophilie (affinité ave l’eau) ou de l’hydrophobie (incompatibilité avec l’eau) d’une substance chimique. Facteurs influençant l’extraction au solvant La polarité du soluté et la polarité du solvant : en général, les composés polaires seront dissous dans les solvants polaires et les solutés non-polaires se retrouveront dans le solvant organique, à moins que celui-ci ne contienne un nombre suffisant de groupes fonctionnels hydrophiles tels que les groupements hydroxyles ou sulfoniques. Généralement, on ne pourra extraire les composés ioniques à l’aide d’un liquide or- ganique. Ceux-ci pourront être extraits en les faisant réagir avec des agents chélatants (ou complexants) afin de former de grosses entités non-polaires.
    • Université Virtuelle Africaine 35 Distillation Les distillations opérées à l’échelle du laboratoire sont presque exclusivement des distillations discontinues, c’est-à-dire que l’on distille complètement le mélange en ses composés avant de recharger l’appareil avec le même mélange, et l’on répète le processus. L’appareil utilisé, souvent appelé distillerie, est minimal est consiste en une sorte de bouilloire, un bouilleur, dans lequel le liquide de départ est chauffé; un condensateur (ou réfrigérant) dans lequel la vapeur est refroidie et revient à l’état liquide; puis un réceptacle où le liquide purifié concentré (appelé distillat) est recueilli. Il existe plusieurs techniques pour la distillation en laboratoire. Distillation simple Dans la distillation simple, toutes les vapeurs chaudes produites sont immédiatement canalisées dans le condensateur qui refroidit et condense les vapeurs. Par contre, le distillat ne sera pas pur ; sa composition sera identique à la composition de la vapeur à une température et à une pression données, et peut être déterminée par la loi de Raoult. La distillation simple est donc utilisée uniquement pour séparer des liquides dont les points d’ébullition diffèrent significativement (d’au moins 25°C selon la recom- mandation) ou encore pour séparer des liquides d’avec des solides non volatiles ou des huiles. Dans ces cas, les pressions de vapeur des composants sont généralement suffisamment différentes pour que l’on puisse négliger les effets relatifs à la loi de Raoult, ceci étant attribuable au fait que les composantes non volatiles contribuent peu à la vapeur. Toujours dans ce cas et selon l’utilisation visée, le distillat obtenu pourrait être suffisamment pur.
    • Université Virtuelle Africaine 36 Distillation fractionnée Dans plusieurs cas, les points d’ébullition des composantes du mélange seront trop proches l’un de l’autre. On doit alors utiliser la distillation fractionnée afin de séparer adéquatement les composés. Ceci se fera à l’aide de cycles répétés de vaporisation- condensation à l’intérieur d’une colonne Vigreux. Figure 1 : Appareil de distillation fractionnée. (Schéma modifié) Référence : http://en.wikipedia.org/wiki/Fractional_distillation Comment la distillation fractionnée fonctionne-t-elle ? À mesure que la solution à purifier est chauffée, la vapeur s’élève dans la colonne de fractionnement. Lors de l’élévation de la vapeur, celle-ci se refroidit, se condensant sur les parois du réfrigérant et à la surface du matériau de garnissage. Ici, le condensat continue à être chauffé par les vapeurs chaudes qui s’élèvent, et il se vaporise une fois de plus. La composition des nouvelles vapeurs est toutefois déterminée par la loi de Raoult. Chaque cycle de vaporisation-condensation (appelé plateau théorique) donnera une plus pure solution du composé le plus volatile. En réalité, chaque cycle à une température donnée n’a pas lieu à la même position exactement dans la colonne à fractionner, le plateau théorique est donc plus un concept qu’une réalité concrète. Plus on augmente le nombre de plateaux théoriques, meilleure est la séparation. Le garnissage se trouvant à l’intérieur de la colonne de fractionnement a cette utilité. Il est souvent constitué d’un système d’anneaux vrillés, faits de téflon ou de métal, ce afin d’augmenter la surface de contact entre la vapeur et le condensat liquide. Ceci améliore les échanges entre les phases pour un volume de colonne donné et permet ainsi d’augmenter le nombre de plateaux théoriques.
    • Université Virtuelle Africaine 37 Hydrodistillation ou Entraînement à la vapeur Figure 2 : Hydrodistillation. Référence : http://en.wikipedia.org/wiki/Steam_dis- tillation (dernier accès en mars 2008).(Schéma modifié) Comment l’hydrodistillation fonctionne-t-elle ? L’hydrodistillation, aussi appelée entraînement à la vapeur, est une méthode servant à distiller des composés sensibles à la chaleur. Ce procédé implique l’utilisation de vapeur surchauffée (ou vapeur vive) qui sera injectée dans le liquide brut (le liquide organique à distiller). Selon la loi de Raoult, certains des composés ciblés vont s’évaporer, en accord avec leur pression partielle. Le mélange de vapeur est refroidi et condensé, et généralement on obtiendra une couche huileuse ou organique ainsi qu’une couche aqueuse.
    • Université Virtuelle Africaine 38 Distillation sous pression réduite Figure 3 : Appareil de distillation sous pression réduite Certains composés ont de très hauts points d’ébullition. Pour amener ces composés au point d’ébullition, il est souvent préférable de réduire la pression plutôt que d’augmen- ter la température. Une fois la pression abaissée à la pression de vapeur du composé (à une température donnée), l’ébullition ainsi que le reste du processus de distillation peut débuter. Cette technique fait référence à la distillation sous pression réduite et ce procédé est souvent opéré en laboratoire à l’aide d’un évaporateur rotatif. La distillation sous pression réduite est utile pour les mélanges qui ont un point d’ébullition plus élevée que leur température de décomposition à la pression atmos- phérique et qui se décomposeraient si l’on tente de les amener à ébullition sans avoir au préalable abaissé la pression.
    • Université Virtuelle Africaine 39 Chromatographie Théorie sur la chromatographie La chromatographie est un procédé de séparation basé sur les différences d’affinité des substances à analyser à l’égard de deux phases, une phase stationnaire et une phase mobile. Ces composantes contenues dans la phase stationnaire sont retenues plus longtemps dans le système que celles qui sont distribuées sélectivement dans la phase mobile. En conséquence, les solutés sont élués du système à différents temps, selon l’ordre croissant de leurs coefficients de distribution dépendamment de la phase stationnaire ; c’est de cette façon que la séparation s’accomplit. Les échantillons peuvent être de nature gazeuse, liquide ou solide et peuvent varier de simple mélange de deux énantiomères à mélange complexe contenant plusieurs substances chimiques de types très différents. Qui plus est, l’analyse peut être faite moyennant des coûts très élevés et une instrumentation complexe ou encore très simplement sur une plaque de couche mince très peu coûteuse. La chromatographie constitue le fondement d’un très grand nombre de techniques analytiques. Cette partie du module présente les techniques chromatographiques les plus courantes et leurs applications. Le processus d’entraînement L’entraînement (ou développement du chromatogramme) est le terme utilisé pour décrire la façon dont les composantes d’un mélange sont séparées durant le procédé chromatographique. Il y a trois méthodes de base : le développement frontal, le développement par déplacement, et l’élution. La plupart des développements chro- matographiques analytiques se font par élution. Processus d’élution L’élution peut être décrite telle qu’une série de processus d’absorption-extraction continus à partir du moment où l’échantillon est injecté ou déposé dans le système chromatographique jusqu’au temps où le soluté en est extrait. Le processus d’élution est illustré dans la figure représentée ci-dessous.
    • Université Virtuelle Africaine 40 Figure 4 : Le processus d’élution. À mesure que le soluté pénètre dans la phase mobile du système chromatographique, sa concentration s’accroît et devient supérieure à la limite requise (concentration d’équilibre) à la le soluté passe dans la phase stationnaire. Le soluté commence im- médiatement à entrer dans la phase stationnaire. Le soluté commence immédiatement à entrer dans la phase stationnaire. Puisque la quantité de phase mobile atteint la phase stationnaire augmente régulièrement alors la concentration en soluté de cette dernière augmente jusqu‘à atteindre la concentration d’équilibre et commencera à désorber, c’est-à-dire retourner dans la phase mobile. De là, le soluté sera entraîné plus loin dans (ou sur) la phase stationnaire. La phase mobile va continuellement faire progresser le profil de concentration du soluté dans la phase stationnaire, les concentrations dans les deux phases étant constamment en relation. Ceci est illustré grossièrement en figure 4. Ce déplacement amène la concentration du soluté de la phase mobile au devant du pic (fig. 4) à excéder la concentration d’équilibre requise dans la phase stationnaire. En conséquence, une bonne quantité de soluté dans la partie avant du pic (voir figure 4) sort de la phase mobile et pénètre continuellement la phase stationnaire, tentant de rétablir l’équilibre. À l’arrière du pic (fig. 4), c’est la réaction inverse qui se pro- duit : à mesure que le profil de concentration de soluté progresse, la concentration de soluté dans phase stationnaire à l’arrière du pic devient en excès par rapport à la concentration à l’équilibre. Une quantité de soluté doit alors quitter la phase stationnaire et entrer dans la phase mobile afin de rétablir l’équilibre. Ainsi, le soluté progresse à travers le système chromatographique, suite à l’entrée de soluté dans la phase mobile à l’arrière du pic et à son retour dans la phase stationnaire à l’avant du pic. Le soluté est toutefois toujours en transfert entre les deux phases à travers le pic entier, tentant sans cesse d’atteindre ou de maintenir l’équilibre thermodynamique.
    • Université Virtuelle Africaine 41 En résumé, la bande de soluté progresse à travers le système chromatographique suite à un transfert net de soluté de la phase mobile dans la phase stationnaire dans la moitié avant du pic. Ce transfert net de soluté est compensé par le passage de soluté de la phase stationnaire jusqu’à la phase mobile dans la moitié arrière du pic. Efficacité de la séparation chromatographique La distribution des analytes (A) entre les phases peut être décrite de façon assez simple. Un analyte (soluté) est en équilibre entre les deux phases : APhase mobile APhase stationnaire La constante d’équilibre, K, est appelé le coefficient de partage. Il se définit comme étant le rapport de la concentration molaire de l’analyte dans la phase stationnaire sur la concentration molaire de l’analyte dans la phase mobile. Le temps entre l’injection de l’échantillon dans le système et l’atteinte du détecteur par le pic d’analyte est appelé temps de rétention (tr ). Chaque soluté ou analyte contenu dans l’échantillon injecté aura un temps de rétention différent. Le temps nécessaire à la phase mobile pour passer à travers la colonne est appelé temps mort (tm ). Figure 5 : Les concepts de temps de rétention et de temps mort Une variable appelée facteur de rétention (parfois appelé facteur de capacité), k’, est souvent utilisée pour décrire le taux de migration d’un analyte sur une colonne. k’ varie avec la force d’élution du solvant; quand celle-ci augmente, k’ diminue. Le facteur de rétention de l’analyte A est défini comme suit : k’A = (tr – tm ) / tm Les constantes tr et tm sont obtenues facilement à partir du chromatogramme. Lorsque le facteur de rétention d’un analyte est inférieur à 1, alors l’élution est si rapide que la détermination du temps de rétention est très difficile. Les facteurs de rétention élevés (supérieurs à 20), indiquent une élution très longue. Idéalement, le facteur de rétention pour un analyte se situe entre 1 et 5.
    • Université Virtuelle Africaine 42 La quantité α, appelée facteur de sélectivité, décrit la séparation de deux substances (A et B) sur la colonne : α = k ‘B / k ‘A Lors du calcul de α, l’analyte A élue plus rapidement que l’analyte B. Le facteur de sélectivité α est toujours supérieur à 1. Élargissement des pics et efficacité de colonne Pour une séparation optimale, l’obtention de pics nets (effilés) et symétriques est nécessaire. Cela signifie que les causes de l’élargissement des pics doivent être mi- nimisées le maximum possible. Modèle des plateaux théoriques en chromatographie Le modèle des plateaux théoriques suppose que la colonne chromatographique contienne un grand nombre de niveaux distincts, on les appelle plateaux théoriques. Les équilibrations de l’échantillon séparées entre les deux phases mobile et stationnaire se produit sur ces plateaux. L’analyte traverse la colonne par transfert de la phase mobile à l’équilibre d’un plateau à l’autre. Figure 6 : Le concept des plateaux théoriques Les plateaux de la colonne sont un concept théorique pour la mesure de l’efficacité de la colonne, soit en établissant le nombre de plateaux d’une colonne, N (plus il y a de plateaux, mieux c’est), ou la hauteur d’un plateau (la hauteur équivalent à un plateau théorique, HEPT), (plus la hauteur est petite, mieux c’est). Si la longueur de la colonne est définie comme L, alors la HEPT est : HEPT = L/N Le nombre de plateaux théoriques réellement contenus dans une colonne peut être trouvé en examinant le pic chromatographique après l’élution :
    • Université Virtuelle Africaine 43 Où w1/2 correspond à la largeur du pic à mi-hauteur. Tel que suggéré par l’équation ci-dessus, les colonnes se comportent comme si leur nombre de plateaux théoriques changeait en fonction des différents solutés d’un mélange. Théorie dynamique de la chromatographie Voici une description plus réaliste du processus s’opérant à l’intérieur de la colonne qui prend en compte le temps nécessaire au soluté pour atteindre l’équilibre entre les phases mobile et stationnaire (contrairement au modèle des plateaux théoriques qui assume que l’arrivée à l’équilibre est infiniment rapide). La forme du pic chro- matographique résultant est ainsi affectée par la rapidité d’élution. La forme du pic est également influencée par le fait que plusieurs chemins différents peuvent être empruntés par les molécules de soluté lorsqu’elles progressent entre les particules de la phase stationnaire. Si l’on considère les nombreux phénomènes contribuant à l’élargissement des pics, on obtient l’équation de Van Deemter pour la hauteur des plateaux : HETP = A + B / u + C u Où u est la vitesse moyenne de la phase mobile. A, B, et C sont trois facteurs qui contribuent à l’élargissement des pics ; ils sont expliqués ci-dessous. A – Diffusion d’Eddy ou diffusion turbulente La phase mobile progresse dans la colonne remplie de phase stationnaire. Les molécu- les de soluté prendront différents chemins au hasard à travers les particules contenues dans la phase stationnaire. Puisque les différents chemins empruntés seront de lon- gueurs variables, cela occasionnera un élargissement du pic chromatographique. B – Diffusion longitudinale À cause du flux chromatographique, la concentration de l’analyte est moindre sur les bords de la colonne qu’en son centre, de même que les particules au centre du flux chromatographique progressent plus rapidement. L’analyte diffuse du centre vers les côtés, ce qui cause un élargissement du pic. Lorsque la vitesse de la phase mobile est élevée, alors l’analyte reste moins longtemps sur la colonne et cela diminue l’effet de diffusion longitudinale. C - Résistance au transfert de masse L’analyte prend un certain temps pour arriver à l’équilibre entre la phase mobile et la phase stationnaire. Si la vitesse de la phase mobile est élevée et que l’analyte a une forte affinité pour la phase stationnaire, alors la phase mobile va se placer au devant de l’analyte à l’intérieur de la phase stationnaire. Le pic chromatographique de cet analyte s’en trouvera élargi. Plus la vitesse de la phase mobile est élevée, moins les molécules peuvent pénétrer dans la phase stationnaire. Dans ce cas, l’équilibre n’est pas favorisé, la colonne devient moins performante et l’élargissement du pic augmentera.
    • Université Virtuelle Africaine 44 Courbe de Van Deemter Voici un graphique illustrant la relation entre la hauteur du plateau théorique versus la vitesse moyenne linéaire de la phase mobile : Figure 7 : Graphique de la Courbe de Van Deemter Des courbes comme celles-ci sont d’une grande utilité pour déterminer la vitesse optimale de flux de la phase mobile. Résolution Même si le facteur de sélectivité α décrit la séparation des centres des pics, il ne tient pas compte de la largeur de ces pics. La mesure de la résolution est une autre mesure de la bonne séparation des pics. La résolution de deux pics de solutés, A et B, est définie ainsi : La résolution de ligne de base est atteinte lorsque R = 1,5. Il est utile de faire le lien entre la résolution, le nombre de plateaux théoriques de la colonne, le facteur de sélectivité et le facteur de rétention de deux solutés : Afin d’obtenir une haute résolution, les trois variables doivent être maximisées. Une augmentation de N (nombre de plateaux théoriques), en allongeant la colonne mène à une augmentation du temps de rétention et un élargissement du pic – qui n’est pas souhaitable. À la place, afin d’augmenter le nombre de plateaux théoriques, la hauteur équivalente au plateau théorique (HEPT) peut être réduite en diminuant la taille des particules de la phase stationnaire.
    • Université Virtuelle Africaine 45 On remarque souvent que, en contrôlant le facteur de capacité k’, la séparation peut être grandement améliorée. Cela peut être accompli en modifiant la température (en chromatographie gazeuse), ou alors la composition de la phase mobile (en chroma- tographie liquide). Le facteur de sélectivité α peut aussi être manipulé afin d’améliorer la séparation. Lorsque α est près de 1, l’optimisation de k’ et l’augmentation de N ne sont pas suffisantes pour l’obtention d’une bonne séparation en un temps raisonnable. Dans ces cas, k’ est d’abord optimisé, et ensuite α est augmenté par l’une des procédures suivantes : - Changer la composition de la phase mobile ; - Changer la température de la colonne ; - Changer la composition de la phase stationnaire ; - Utiliser des effets chimiques spéciaux comme par exemple incorporer un agent qui a la propriété de se complexer avec un des solutés dans la phase stationnaire). Types de techniques chromatographiques Chromatographie planaire La chromatographie planaire regroupe des techniques de séparation dans lesquelles la phase stationnaire ou se retrouve sur une surface plane. La surface peut être du papier servant de phase stationnaire (chromatographie sur papier), ou une couche de particules solides étendue sur un support tel qu’une plaque de verre (chromatographie sur couche mince). Chromatographie sur papier La chromatographie sur papier est une technique impliquant le dépôt d’une petite quantité de la solution-échantillon en un point situé sur la partie inférieure du papier chromatographique. Le papier est placé dans une cuve scellée dont le fond est recou- vert d’une petite quantité de solvant,. À mesure que le solvant monte sur le papier par capillarité, il rencontre le dépôt contenant l’échantillon et celui-ci commence à se déplacer sur le support de papier avec le solvant. Les divers composés contenus dans l’échantillon vont migrer et parcourir des distances différentes selon qu’elles intera- gissent plus ou moins fortement avec le papier. La vitesse de migration est également influencée par la solubilité des composés dans le solvant. Elle permet le calcul de la valeur d’une grandeur notée Rf et, qui est égale au rapport de la distance parcourue par l’échantillon sur la distance parcourue par le solvant. Cette valeur calculée sera comparée aux valeurs de Rf de composés standards contenues dans un tableau afin d’identifier la substance inconnue contenue dans l’échantillon déposé.
    • Université Virtuelle Africaine 46 Chromatographie sur couche mince (CCM) La chromatographie sur couche mince est semblable à la chromatographie sur papier. Toutefois, au lieu d’utiliser une phase stationnaire de papier, on utilise une plaque de verre ou de plastique enduite d’une mince couche d’adsorbant inerte, tel que le gel de silice, d’alumine ou de cellulose. Comparativement au papier, cette méthode a l’avantage de permettre des élutions plus rapides, de meilleures séparations, et le choix entre différents adsorbants. Les différents composés contenus dans l’échantillon vont migrer et parcourir des différentes distances selon qu’ils interagissent plus ou moins fortement avec l’adsorbant. Elle permet aussi de calculer une valeur de Rf qui sera comparée aux valeurs de Rf de composés standards contenues dans un tableau afin d’identifier la substance inconnue. Figure 8 : Processus de séparation par chromatographie sur couche mince (CCM). Référence : http://www.waters.com/watersdivision/ContentD. asp?watersit=JDRS-5LTGBH
    • Université Virtuelle Africaine 47 Équipement nécessaire pour CCM et chromatographie sur papier Préparation de la plaque En CCM, une variété d’enduits (phase stationnaire) sont disponibles, même si le gel de silice est de loin le plus courant. Les couches minces de cellulose sont réalisées en étendant une mixture aqueuse de poudre de cellulose à l’aide d’un applicateur commercial. Le mélange de cellulose est préparé en ajoutant environ 15g de poudre dans 90ml d’eau distillée et en agitant pendant environ 1 minute dans un mélangeur. La poudre de cellulose utilisée pour les CCM inorganiques provient d’un type spé- cial de micro cristal. En chromatographie de partage, des couches minces prêtes à l’utilisation et préparées avec les adsorbants les plus courants sont disponibles sous forme de plaques de verre ou de plastiques pré-enduites. Des feuilles de plastique pré-enduites de cellulose (qui peuvent également contenir un composé fluorescent aidant à la détection des solutés après l’élution) sont sur le marché et très utiles pour les CCM inorganiques puisqu’elles peuvent être coupées au format désiré. Dépôt de l’échantillon La solution-échantillon à déposer doit contenir entre 0,1 et 10 mg de cations par ml et peut être une substance neutre, ou acide mais diluée. Environ 1 µl de solution est déposé avec une micro-seringue ou micro-pipette près de l’une des extrémités de la plaque (environ 1,5 à 2 cm du bas de la plaque) et séché à l’air. Il n’est pas nécessaire d’équilibrer la plaque et le développement (l’élution) peut commencer immédiatement après que le dépôt soit sec. Élution de la plaque Le chromatogramme est habituellement obtenu par une technique ascendante dans laquelle la plaque est immergée dans le solvant/éluant (on devrait utiliser des solvants redistillés ou de grades à chromatographie) à une profondeur de 0,5 cm. La cuve ou chambre est préférablement tapissée de papiers filtres trempés dans l’éluant; cela a pour effet de provoquer la saturation de la chambre en vapeur de solvant. L’élution se fait jusqu’à ce que le front d’éluant (front de migration) ait parcourue la distance requise (généralement 10 à 15 cm). La plaque est ensuite retirée de la chambre et le front de migration est immédiatement marqué d’un trait à l’aide d’un crayon de plomb. Identification des analytes en CCM et en chromatographie sur papier Les substances colorées peuvent être identifiées directement sur la phase stationnaire qui est blanche, alors que les composés incolores peuvent être détectés en vaporisant sur la plaque un réactif (révélateur) approprié qui provoque la coloration des zones oc- cupées par ces solutés. Certains composés sont fluorescents par irradiation de lumière ultraviolette (UV) et peuvent être repérés de cette façon. Une substance fluorescente est parfois incorporée dans la phase stationnaire et permet ainsi l’identification de certains composés (ceux qui ont absorption dans la région au-dessus de 230 nm) ; le soluté peut être repéré après l’élution comme un point sombre lorsqu’exposé à la lumière UV (lorsque cette méthode de détection est utilisée, l’expérimentateur doit
    • Université Virtuelle Africaine 48 porter des lunettes spéciales afin de protéger ses yeux des rayons UV). Les points ou taches localisés ainsi peuvent être marqués à l’aide d’une aiguille ou d’un crayon de plomb. Chromatographie sur colonne La chromatographie sur colonne est une technique de séparation dans laquelle la phase (ou le lit) stationnaire est placée à l’intérieur d’un tube vertical. La phase stationnaire consiste en de très petites particules ou encore des particules enduites d’un liquide; dans chacun des cas les particules solides agissent comme sup- port et sont placées dans la colonne. Les particules de la phase stationnaire peuvent emplir complètement l’intérieur du tube (colonne remplie) ou être concentrées sur la paroi intérieure du tube laissant un passage ouvert pour la phase mobile au centre du tube (colonne tubulaire ouverte). Chromatographie liquide La chromatographie liquide (LC) est un type de chromatographie sur colonne dans lequel la phase mobile est un liquide. LC peut être opérée à l’aide d’une colonne ou sur une surface plane. Actuellement, la LC qui utilise généralement de très petites particules de remplissage et une pression relativement haute est appelée chromato- graphie liquide à haute performance (CLHP, ou HPLC en anglais). La CLHPest une technique analytique utilisée pour la séparation et l’identification de solutés organiques ou inorganiques dans divers mélanges, notamment des échantillons biologiques, pharmaceutiques, alimentaires, provenant de l’environnement, indus- triels, etc. Dans un tel processus de séparation, le liquide pénètre la phase stationnaire poreuse et élue les solutés par passage dans un détecteur à flux continu. La phase stationnaire est généralement sous forme de particules uniformes de petit diamètre qui remplissent la colonne cylindrique. Une colonne typique est fabriquée dans un matériel rigide (tel que du plastique ou de l’acier inoxydable) et est généralement longue de 5 à 30 cm, avec un diamètre interne de 1 à 9 mm environ.
    • Université Virtuelle Africaine 49 Composantes d’un système CLHP Figure 9 : Les différentes composantes d’un système de chromatographie liquide à haute performance. - Le système de distribution de solvant (ou d’éluant) : pousse le flux de solvant à travers l’instrument à débit constant. - Le système d’injection de l’échantillon : introduit l’échantillon à l’intérieur du flot de liquide dans l’instrument. - La colonne : un tube d’acier inoxydable rempli de billes de silicone qui sépa- rent les solutés inconnus que l’on cherche à identifier (par exemple séparer la caféine du sucre). - Le détecteur : un capteur optique (généralement) qui détecte les changements dans les caractéristiques du flux de solvant. - Le système de données : un moyen de contrôler les composantes du système ainsi que d’entreposer, traiter et présenter les données recueillies. Une pompe à haute pression est requise pour forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne à un débit de 0,1 à 2 ml par minute. L’échantillon à séparer est introduit dans la phase mobile par le dispositif d’injection. Celui-ci est manuel ou automatique et est placé avant la colonne. Échelles de chromatographie : La CLHP possède un grand nombre d’applications : - CLHP analytique : identification exacte et haute sensibilité - Semi-préparative : identification et obtention de petites quantités d’un analyte pur (quantité de l’ordre des grammes) - Préparative : obtention de grandes quantités d’analytes purifiés (haute capacité) (de l’ordre des kilogrammes)
    • Université Virtuelle Africaine 50 Modes de séparation en CLHP La séparation d’analytes peut s’opérer par différentes procédures ; chacun de ces mécanismes donne lieu à chacun des différents modes d’application de la CLHP. Chromatographie en phase normale La CLHP en phase normale sépare les analytes en se basant sur la polarité. Cette technique utilise une phase stationnaire polaire et une phase mobile non-polaire, et est employée lorsque l’analyte en jeu est plutôt de nature polaire. L’analyte polaire s’associe à la phase stationnaire et est retenu par elle. La force d’adsorption augmente avec la polarité, et l’interaction entre l’analyte polaire et la phase stationnaire, aussi polaire, augmente le temps d’élution (relativement à la phase mobile). Chromatographie en phase inverse ou inversée La CLHPen phase inverse (en anglais : RP-HPLC) consiste en une phase stationnaire non-polaire et une phase mobile aqueuse, modérément polaire. Une phase stationnaire courante est une silice traitée avec R‑Me2 SiCl (diméthylchlorosilane), où R repré- sente un groupement alkyle tel que C18 H37 – ou C8 H17 –. Le temps de rétention est par conséquent plus long pour les molécules non polaires, celles-ci permettant aux molécules polaires de s’éluer plus facilement. Le temps de rétention est augmenté par l’ajout de solvant polaire à la phase mobile et raccourci par l’ajout d’un solvant plus hydrophobe. Chromatographie d’exclusion stérique La chromatographie d’exclusion stérique, aussi connue sous le nom de chromatogra- phie à perméation de gel ou chromatographie de filtration sur gel, sépare les molécules sur la base de leur taille (volume). C’est généralement une chromatographie de basse résolution. Elle est ainsi souvent réservée pour l’étape finale de perfectionnement de la purification. De plus, cette technique est utile pour la détermination de la structure tertiaire et quaternaire de protéines purifiées; elle est aussi la technique de base pour la détermination du poids moléculaire moyen de polymères naturels et synthétiques. Chromatographie d’échange d’ions ou échangeuse d’ions En chromatographie d’échange d’ions, la rétention est basée sur l’affinité entre les ions du soluté et les sites chargés qui se trouvent sur la phase stationnaire. Les ions de même charge que ceux situés sur cette phase stationnaire sont exclus. Certains types d’échangeurs d’ions comprennent : 1. les résines polystyrènes : permettent les liaisons covalentes qui augmentent la stabilité de la chaîne. Plus de liaisons réduit les déviations et augmente le temps d’atteinte de l’équilibre, et éventuellement améliore la sélectivité. 2. les échangeurs d’ions de cellulose et de dextrine (gels) : ils possèdent des pores de taille plus grande et une faible densité de charges et sont ainsi appropriés pour la séparation de protéines. 3. les échangeurs d’ions de verre à pore contrôlé ou de silice poreuse.
    • Université Virtuelle Africaine 51 Chromatographie de bio-affinité Ce procédé chromatographique repose sur la propriété de certaines substances qui présente une affinité biologique (bio-affinité) pour d’autres composés (par exemple ceux de l’échantillon) et forment avec eux des complexes stables, spécifiques et ré- versibles. La formation de ces complexes fait intervenir des interactions telles que: les forces de Van der Waal ; les interactions électrostatiques, dipôle-dipôle, hydro- phobes ainsi que les liaisons hydrogènes. Une liaison efficace et bio-spécifique se forme par une action simultanée et concertée de plusieurs de ces forces aux sites de liaisons complémentaires. Exercices formatifs sur la chromatographie liquide et la CLHP i) Nommez les principales composantes de la CLHP. ii) Citez trois modes de CLHP. iii) Nommez les différentes échelles en CHLP et un exemple de leur application. Chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse (CPG), aussi parfois appelée chromatographie gaz-liquide, est une technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un gaz. Cette technique est toujours opérée en colonne, laquelle est normalement de type « remplie » ou de type capillaire. La CPG est basée sur un principe d’équilibre de partage de l’analyte entre une phase stationnaire solide (souvent un matériel à base de silicone liquide) une phase mobile gazeuse (le plus souvent de l’hélium ou de l’azote). La phase stationnaire est fixée à l’intérieur d’un tube de verre de petit diamètre (colonne capillaire) ou à une matrice solide à l’intérieur de tube de métal plus large (colonne remplie). Les hautes tempé- ratures utilisées en CPG la rendent inappropriée pour la séparation des protéines ou de biopolymères de hauts poids moléculaires. Instrumentation de la chromatographie en phase gazeuse Figure 10 : Composantes du système à chromatographie en phase gazeuse
    • Université Virtuelle Africaine 52 Un système typique de chromatographie en phase gazeuse est formé de six compo- santes majeures qui sont explicités ci-dessous : Gaz porteur ou gaz vecteur Le gaz porteur doit être chimiquement inerte. Les gaz couramment utilisés sont l’azote, l’hélium, l’argon et le dioxyde de carbone. Le choix du gaz porteur est souvent imposé par le type de détecteur utilisé. Le système de gaz porteur contient des dispositifs qui purifient le gaz en en retirant l’humidité et le dioxygène. Injecteur Pour une efficacité optimale de la colonne, la quantité d’échantillon ne devrait pas être trop grande et devrait être introduite dans la colonne à la manière d’un jet de vapeur (une injection lente de gros échantillons cause l’élargissement de pic et la perte de résolution). La méthode d’injection la plus commune est la suivante ; on utilise une micro-seringue pour injecter l’échantillon à travers le septum de caoutchouc, dans le chambre d’injection se trouvant à la tête de la colonne. La température de la chambre d’injectionoù est injecté l’échantillon est généralement plus élevée d’environ 50° que la température d’ébullition du composé le moins volatile contenu dans l’échantillon. Pour les colonnes remplies, les formats d’échantillons varient du dixième de microlitre jusqu’à 20 µl. Les colonnes capillaires, quant à elles, nécessitent beaucoup moins de quantité d’échantillon, généralement autour de 0,1 à 3 µl. Colonnes Il existe deux types de colonnes ; remplie et capillaire (ou tubulaire). Les colonnes remplies contiennent un support (habituellement fait à la base de terre de diatomées) inerte et finement divisé, et sur lequel est imprégnée la phase stationnaire liquide. La plupart des colonnes remplies sont longues de 1,5 à 10 mètres et possèdent un diamètre de 2 à 4 mm. Les colonnes capillaires ont un diamètre interne de quelques dixièmes de millimètre. On peut retrouver les types suivants : colonne tubulaire ouverte à paroi tapissée (wall- coated open tubular, WCOT) ou colonne ouverte capillaire où la paroi est recouverte d’un matériau support (support-coated open tubular, SCOT). Les colonnes à paroi tapissée consistent en un tube capillaire ayant ses parois recouvertes d’une couche de phase stationnaire liquide. Dans les colonnes à matériau support, la paroi interne du capillaire est recouverte d’un mince film du matériau support en question, tel que la terre de diatomées, sur lequel la phase stationnaire a été adsorbée. Les colonnes SCOT sont généralement moins efficaces que les colonnes WCOT. Ces deux derniers types sont toutefois plus efficaces que les colonnes remplies. Four pour colonnes Pour obtenir des résultats reproductibles, la température des colonnes doit être contrô- lée et maintenue dans des intervalles de l’ordre des dixièmes de degrés. La température optimale de colonne est imposée par la température d’ébullition de l’échantillon. Afin de maintenir une température reproductible, la colonne chromatographique est conservée dans un four pouvant être réglé à différentes températures.
    • Université Virtuelle Africaine 53 Détecteurs Plusieurs types de détecteurs sont utilisés en chromatographie. Des détecteurs dif- férents ont des sélectivités différentes. Un détecteur non-sélectif réagit à tous les composés excepté le gaz porteur. Un détecteur sélectif réagit à une gamme de com- posés ayant en commun une propriété physique ou chimique, alors qu’un détecteur spécifique réagira à un seul composé chimique. Les détecteurs peuvent également être regroupés en deux principaux ensembles : les détecteurs dépendant de la concentra- tion et ceux dépendant du débit massique. La forme du signal donné par un détecteur dépendant de la concentration est liée à la concentration du soluté dans le détecteur. Ceci n’affecte généralement pas l’échantillon. La dilution de l’échantillon par les gaz auxiliaires/d’appoint réduira la réponse du détecteur. Les détecteurs dépendants du débit massique vont habituellement détruire l’échantillon lors de la détection. Le signal reçu est lié au taux auquel les molécules de soluté entrent dans le détecteur. La réponse de ce type de détecteur n’est pas affectée par les gaz auxiliaires. Détecteur Type Gaz auxiliaires/ d’appoint Sélectivité Sensibilité Gamme dynami- que de réponse Ionisation à flamme (FID) Débit massique Hydrogène, air La plupart des composés organiques. 100 pg 107 Capture d’électrons (ECD) Concentration Gaz auxiliaires Halogénures, nitrates, nitriles, peroxydes, anhydrides, organométalli- ques. 50 fg 105 Thermo-ionisation (TID) ou Détecteur azote-phosphore Débit massique Hydrogène, air Azote, phos- phore. 10 pg 106 Photométrique (FPD) Débit massique Hydrogène, air, possiblement oxygène Soufre, phos- phore, étain, bore, arsenic, germanium, sélénium, chrome 100 pg 103 Photo-ionisation (PID) Concentration Gaz auxiliaires Composés aliphatiques, aromatiques, cétones, esters, aldéhydes, ami- nes, hétérocy- cliques, sulfures organiques, quelques orga- nométalliques. 2 pg 107
    • Université Virtuelle Africaine 54 Système de contrôle des données La chromatographie en phase gazeuse moderne utilise des interfaces logicielles programmables et des systèmes ordinés afin de contrôler les paramètres des chroma- tographes tels que le débit gazeux, ainsi que la température du four qui est contrôlé par un programme informatique. Les données générées sont collectées et stockées à l’aide d’ordinateurs. La chromatographie en phase gazeuse n’est strictement qu’un ensemble d’instru- ments analytiques pour l’identification et la quantification de composés chimiques gazeux. Applications qualitative et quantitative de la CPG À cause des complexités des interactions entre les analytes et la colonne, chaque analyte est élué à un temps unique, appelé temps de rétention (tr ). Si deux analytes s’éluent en même temps sur un chromatogramme, c’est probablement parce qu’il s’agit du même composé. On peut obtenir une confirmation en analysant les deux analytes en utilisant différentes colonnes et dans des conditions différentes; si les deux s’éluent au même moment sous toutes les conditions testées, il s’agit alors d’une seule et même substance. Le signal produit par le détecteur est généralement lié à la quantité d’analyte, que ce soit un détecteur soit dépendant du débit massique ou de la concentration. La concentration de l’analyte dans un échantillon inconnu est obtenue en déterminant la réponse du détecteur à une série de solutions standards de concentrations connues, que l’on met en graphique, sous forme de droite (courbe standard). La concentration de l’inconnu peut alors être calculée à l’aide de ce graphique.
    • Université Virtuelle Africaine 55 Évaluation formative 1) i) Citez les principales composantes des chromatographes en phase gazeuse ii) Citez deux types de colonnes en CPG iii) Citez les gaz porteurs les plus courants et indiquez une propriété chimiques commune aux gaz porteurs iv) Citez un type d’échantillon non analysé en CPG et expliquez pourquoi. v) Expliquez clairement ce qu’est un détecteur sélectif. 2) Pour une séparation chromatographique typique donnant des pics nets (résolution ligne de base = 1,5), assumez que N = 3600, k’ = 2, and a = 1.15. Indiquez les effets obtenus si l’on change un de ces paramètres. a) N = 1600 b) k’ = 0,8 c) a = 1,10 3) Afin de réduire la hauteur des plateaux théoriques et d’améliorer la résolution, quels moyens peut-on employer ? Quels sont les inconvénients de chaque mé- thode ? 4) Les facteurs de réponse relatifs pour le p-dichlorobenzène et le p-xylène (relati- vement à la valeur du benzène, assignée à 1) ont été déterminés à 0.624 ± 0.034 and 0.917 ± 0.018, respectivement. Après intégration des pics, les résultats du tableau ci-dessous ont été obtenus. Calculez le pourcentage de chacun de ces gaz dans la composition de chaque échantillon. Surface du pic Échantillon Benzène p-xylène Toluène 1 4592 2984 1238 2 512 3527 5495
    • Université Virtuelle Africaine 56 Unité II Techniques électro-analytiques Résumé de l’activité d’apprentissage À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : • Rappeler la théorie sur laquelle se base la potentiométrie • Expliquer les applications de la potentiométrie à la mesure de pH, aux élec- trodes sélectives ioniques et aux stations de titrage automatique • Réintégrer la théorie sous-tendant la voltampérométrie • Interpréter qualitativement et quantitativement des données voltampéromé- triques • Expliquer les concepts de base de l’analyse polarographique • Interpréter des données polarographiques afin d’identifier et de quantifier des composés chimiques Lectures obligatoires http://en.wikipedia.org/wiki/Electroanalytical_methods Liste de liens utiles pertinents http://www.chem.vt.edu/chem-ed/echem/electroc.html http://www.chem.vt.edu/chem-ed/echem/potentio.html http://electrochem.cwru.edu/ed/encycl/art-a03-analytical.htm http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Voltammetry/ http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/index.html Potentiométrie En potentiométrie, le système de mesure comporte toujours en deux électrodes : l’électrode de mesure, aussi appelée l’électrode indicatrice, et l’électrode de référence. Chacune des électrodes constitue la moitié de la cellule galvanique. C’est seulement quand elles sont placées ensemble dans une solution qu’elles produisent un certain potentiel. Le potentiel tel que décrit ci-haut mesure l’activité des ions plus que leur concen- tration. L’activité a de l’ion mesuré, qui est aussi utilisé dans l’équation de Nernst, est lié à la concentration analytique C à laquelle on s’intéresse habituellement par le coefficient d’activité γ : a = γC
    • Université Virtuelle Africaine 57 Pour les solutions diluées à des concentrations (cM) d’environ 0,0001 mol/L, le coefficient d’activité tend vers 1 et l’activité de l’ion est estimée correspondre à sa concentration. γ est fonction du contenu total en électrolyte. La relation mathématique entre l’activité (aM) de l’ion mesuré dans une solution d’ions et le potentiel mesurée entre l’électrode de référence et l’électrode de mesure est décrite par l’équation de Nernst ci-dessous : re oxid o a a Log ZXF xRXT E 303.2 +Ε= Où E0 est la différence de potentiel entre les deux électrodes à une activité de 1 sous des conditions standards, R désigne la constante universelle des gaz, T est la tempé- rature absolue et F est la constante de Faraday. L’électrode indicatrice contient habituellement une des formes de l’ion en jeu ou un autre type d’ions qui la rend apte à mesurer la forme de l’ion en jeu en solution. En mesurant E, il est donc possible de mesurer la concentration de l’analyte en jeu. Électrodes à pH en verre La couche de verre recouvrant l’électrode à pH en verre consiste en une structure de silicate contenant des ions lithium. Quand la surface de verre est immergée dans une solution aqueuse, une fine couche solvatée (une couche de gel) se forme à la surface du verre dans laquelle la structure du verre devient moins dure. Ceci s’appli- que autant à la paroi interne qu’à la paroi externe du verre. Comme la concentration en ions hydrogène dans le tampon interne de l’électrode est constante (pH = 7), un état stationnaire s’installe sur la surface interne de la couche de verre. Au contraire, si la concentration en ions hydrogène dans la solution à mesurer change, alors un échange d’ions aura lieu à la paroi solvatée externe et causera une modification du potentiel à la surface du verre. C’est seulement quand cet échange d’ions atteindra l’équilibre que le potentiel de l’électrode de verre sera à nouveau stable. Cela signifie que le temps de réponse d’une électrode de verre dépend toujours de l’épaisseur de la couche solvatée. Un contact continu avec la solution aqueuse cause l’épaississe- ment continuel de la couche solvatée – même si cela se fait très lentement, ce qui causera des temps de réponse plus longs. Cela explique pourquoi le conditionnement de l’électrode dans un électrolyte approprié est absolument nécessaire pour assurer une couche solvatée initiale la plus stable possible, afin d’obtenir des résultats aussi reproductibles que possible. Titrages potentiométriques Lors de titrages potentiométriques, une électrode sensible aux ions est utilisée pour suivre les changements de potentiel dans le récipient de titrage. La cellule potentio- métrique, telle que décrite ci-dessus est composée d’une électrode indicatrice et d’une électrode de référence. Le titrant ajouté à la réaction dans le récipient de titrage réagit avec l’analyte et le consume. Au point d’équivalence, il y a un brusque et important changement de potentiel qui indique la consommation totale de l’analyte.
    • Université Virtuelle Africaine 58 La courbe du potentiel en fonction du volume de titrant montre une importante in- flexion au point d’équivalence (E versus volume). Figure 11 : Courbes de potentiel en fonction du volume de titrant (gauche) et courbe de la dérivée du potentiel dE/dV en fonction du temps. Considérons par exemple le titrage de Fe2+ avec Ce4+  ­ : Au début, la solution a seulement des ions Fe2+ , et en ajoutant Ce4+ , une petite quantité de Fe3+ est formée, ainsi le potentiel augmente. Plus l’on ajoute d’ions Ce4+ , plus le potentiel augmente jusqu’à ce que tout le Fe2+ soit consommé et E atteint une sorte de limite. Stations de titrages potentiométriques Les stations de titrages sont des titrateurs électroniques modernes, destinés au titrage de plusieurs ions. Dans une station de titrage, une seringue motorisée électronique- ment contrôlée est utilisée pour donner des volumes mesurés de titrant (V), alors que l’électrode sert à mesurer le potentiel correspondant (E). Ces données sont automati- quement traduites en graphique pour déterminer le point d’inflexion. Les stations de titrages les plus sophistiquées peuvent fournir les résultats finaux d’un titrage avec la possibilité de garder en mémoire les données relatives à E et à V.
    • Université Virtuelle Africaine 59 Voltampérométrie (ou voltammétrie) La voltampérométrie réfère à la mesure de courant résultant de l’application d’une différence de potentiel. Contrairement aux mesures potentiométriques qui emploient seulement deux électrodes, les mesures voltampérométriques utilisent une cellule électrochimique à trois électrodes. L’usage de trois électrodes (l’électrode de travail, la contre-électrode et l’électrode de référence) conjointement à l’instrument nommé potentiostat, offre opportunités très précises pour l’application de potentiel et la mesure du courant résultant. L’électrode de travail est habituellement polarisée, c’est-à-dire que la concentration des ions à la surface de l’électrode est différente de la concentration des ions en so- lution.Ainsi, la diffusion des ions de la solution jusqu’à l’électrode de travail devient un phénomène important. Le courant total I est équivalent à : I = Im + Id . Où Im  est le courant de migration et Id désigne le courant de diffusion. Dans le but de maintenir un courant de migration constant, un autre électrolyte est ajouté à la solution. Ce deuxième électrolyte est appelé « électrolyte support » ; le chlorure de potassium est habituellement utilisé (KCl). Les diverses techniques voltampérométriques utilisées se différencient les unes des autres en premier lieu par le potentiel appliqué à l’électrode de travail pour conduire la réaction, et par le matériau utilisé comme électrode de travail. Les techniques courantes qui seront discutées dans ce module sont les suivantes : • Polarographie • Polarographie impulsionnelle normale ou intégrale (PIN) • Polarographie impulsionnelle différentielle (PID) • Voltampérométrie cyclique • Voltammétrie à redissolution anodique Polarographie En polarographie, l’électrode de travail consiste en une succession de gouttelettes de mercure (tombant lentement d’un tube capillaire) et est habituellement la cathode. L’anode (contre-électrode) est habituellement un bassin de mercure. L’électrolyte désigne la solution d’analyte, lequel doit être un matériau électroactif, auquel on ajoute un électrolyte support en excès (généralement le KCl). Ce type d’électrode de travail est appelé l’électrode à gouttes de mercure (EGM).
    • Université Virtuelle Africaine 60 Figure 12 : Électrode à gouttes de mercure. Si l’on impose un voltage à l’EGM, un courant total It circulera, lequel est composé des courants suivants : It = Id +Im +Ir Où Ir désigne le courant résiduel. Un petit courant jaillira, causé par la charge capacitive des gouttes de mercure et les impuretés réductibles contenues dans l’électrolyte support. Courant de migration Im Les substances électroactives de la solution atteignent l’EGM par deux mécanismes : par migration et par diffusion. Si la concentration de l’électrolyte support est élevée, plus de 100 fois plus importante que celle de l’analyte, alors tout le courant de mi- gration sera porté par l’électrolyte support. Id = 607nD1/2 m2/3 t1/6 c Avec l’excès d’électrolyte support, la substance électroactive va atteindre l’EGM par diffusion. Lorsque le voltage appliqué à l’EGM est augmenté, le courant de diffusion augmente jusqu’à ce qu’il atteigne une valeur limite : Id .
    • Université Virtuelle Africaine 61 D est le coefficient de diffusion de l’espèce électroactive, n est le nombre d’électrons impliqués dans la réaction électrochimique, m est le débit du mercure du capillaire (en mg/s), t est le temps en secondes et c est la concentration de l’espèce électroactive. Il apparaît clairement que le courant de diffusion est proportionnel à la concentration de l’analyte électroactif. Figure 13 : Courant en fonction du voltage. En appliquant un voltage de plus en plus élevé à l’EGM, le courant change tel que le montre le diagramme. Initialement, on ne trouve que le courant résiduel, lequel est stable et faible. En augmentant le voltage, on atteindra le point de potentiel de réduction de l’analyte. Là, le courant commence à augmenter avec le voltage jusqu’à l’atteinte du courant Id , ceci étant le point limite. E1/2 est appelée le potentiel de demi- vague et identifie de façon unique la substance électroactive dans l’analyte. Il y a un certain nombre de limitations aux expériences polarographiques au niveau des mesures analytiques quantitatives. Parce que le courant est mesuré continuellement pendant l’accroissement de la goutte de mercure, il y a une contribution substantielle du courant capacitif. Comme le mercure afflue du bout du tube capillaire, il y a ini- tialement une grande augmentation de la surface de l’électrode. En conséquence, le courant initial est dominé par les effets de charge capacitive à mesure que se charge la surface, cette charge de la surface qui augmente rapidement. Jusqu’à la fin de la durée de vie de la goutte, il y a un petit changement de surface qui diminue la contribution des changements de capacitance au courant total. Au même moment, tout processus rédox qui surviendra résultera en courant faradique qui déclinera approximativement selon la racine carrée du temps (causé par l’augmentation des dimensions de la couche de diffusion de Nernst). La décroissance exponentielle du courant capacitif est bien plus rapide que la décroissance du courant faradique ; ainsi, le courant faradique st plus grand à la fin de la durée de vie de la goutte. Malheureusement, ce processus est compliqué par le changement continuel de potentiel appliqué à l’électrode de travail (l’EGM) tout au long de l’expérience.
    • Université Virtuelle Africaine 62 En soi, le rapport typique signal/bruit de fond d’une expérience polarographique permet une limite de détection de seulement 10-5 ou 10-6 M approximativement. Une meilleure discrimination, dans le but de contrer le courant capacitif, peut être obtenue en utilisant les techniques de polarographie impulsionnelle. Polarographie impulsionnelle Les techniques de polarographie impulsionnelle sont des mesures voltampéromé- triques, qui sont des variantes des techniques de polarographie décrites plus haut, et qui tentent de minimiser le bruit de fond auquel contribue le courant capacitif en éliminant la rampe de potentiel qui varie continuellement et en la remplaçant par une série de sauts de potentiels de courte durée. Polarographie impulsionnelle normale (PIN) En PIN, chaque saut de potentiel commence à la même valeur (un potentiel auquel aucune électrochimie faradique n’a lieu), et l’amplitude de chaque saut subséquent augmente par petits incréments. Lorsque la goutte de mercure se détache du capillaire (ceci se fait à l’aide d’un marteau électromécanique à des intervalles de temps précis), le potentiel est remis à la valeur initiale en préparation d’un nouveau saut. Figure 14 : Forme de la vague de potentiel appliqué en polarographie impul- sionnelle normale.
    • Université Virtuelle Africaine 63 Pour cette expérience, le polarogramme est obtenu en mettant en relation dans un graphique le courant mesuré en fonction du potentiel à chaque saut. Conséquemment, le courant n’est pas mesuré durant la croissance de la goutte de mercure, et le polaro- gramme impulsionnel normal a typiquement une forme sigmoïde. En utilisant des sauts de potentiel discontinus à la fin de la durée de vie de la goutte de mercure (la durée du potentiel appliqué est habituellement celle des dernières 50 à 100 ms de la vie de la goutte qui est d’environ 2 à 4 secondes) l’expérience polarographique a lieu à un potentiel constant appliqué à une électrode ayant une surface presque constante.Après le saut initial de potentiel, le courant capacitif décline exponentiellement tandis que le courant faradique décline selon la racine carrée du temps. Le courant de diffusion est mesuré juste avant le détachement de la goutte, ce qui permet de bien contrer le bruit de fond occasionné par le courant capacitif. La polarographie impulsionnelle normale augmente la sensibilité analytique d’un à trois ordres de magnitude (limites de détection de 10-7 à 10-8 M) relativement à la polarographie traditionnelle. La polarographie impulsionnelle différentielle est une technique polarographique qui utilise aussi une série de sauts de potentiels discontinus plutôt qu’une rampe de potentiel linéaire et continue pour obtenir un polarogramme expérimental. Plusieurs des paramètres expérimentaux sont les mêmes que pour la polarographie impulsion- nelle normale (comme par exemple la durée de vie précise des gouttes de mercure, la durée du saut de potentiel de 50 à 100 ms à la fin de la durée de vie de la goutte). Contrairement à la polarographie impulsionnelle normale, toutefois, chaque saut de potentiel a la même amplitude, et après chaque impulsion le potentiel ne retourne pas à la valeur initiale, mais à une valeur un peu plus élevée que celle de l’impulsion précédente. Polarographie impulsionnelle différentielle Figure 15 : Forme de la vague de potentiel appliqué en polarographie impul- sionnelle différentielle.
    • Université Virtuelle Africaine 64 De cette façon, la forme globale de la vague de potentiel appliquée à l’EGM res- semble plus à une combinaison d’une rampe linéaire de potentiel superposée à une vague discontinue. Le polarogramme en polarographie impulsionnelle différentielle est obtenu en mesurant le courant immédiatement avant le saut de potentiel, et aussi juste avant la fin de la durée de vie de la goutte de mercure. Le courant analytique dans ce cas se trouve à être la différence entre le courant à la fin du saut de potentiel et celui mesuré avant le saut (courant différentiel). Ce courant différentiel est ensuite mis en graphique en fonction du potentiel moyen (la moyenne du potentiel de saut et du potentiel d’avant le saut) afin d’obtenir le polarogramme à impulsion différen- tielle. Parce que le courant est différentiel, le polarogramme ressemble en plusieurs aspects à la courbe sigmoïdale obtenue en polarographie impulsionnelle normale. En conséquence, le polarogramme à impulsion différentielle est formé de pics. La polarographie impulsionnelle différentielle a une capacité encore meilleure pour contrer le courant capacitif parce que cette technique mesure la différence de courant (ce qui aide à soustraire tout courant capacitif résiduel qu’il pourrait rester avant chaque saut). Les limites de détections avec cette méthode polarographique sont de 10-8 à 10-9 M. Voltampérométrie cyclique La voltampérométrie cyclique est une méthode électrochimique qui utilise des mi- croélectrodes ainsi qu’une solution non agitée. Ainsi le courant mesuré est limité par la diffusion de l’analyte à la surface de l’électrode. Le potentiel est appliqué à l’électrode progressivement vers un potentiel plus négatif, et ensuite inversement jusqu’à atteindre le voltage de départ. Le balayage progressif produit un pic de courant pour tous les analytes qui peuvent être réduits à l’intérieur de l’intervalle de potentiel appliqué. Le courant augmentera à mesure que le voltage atteindra le potentiel de réduction de l’analyte, mais ensuite diminuera à mesure que la concentration de l’analyte décroît lorsque celui-ci se consomme près de la surface de l’électrode. Lorsque le potentiel appliqué est renversé, un potentiel sera atteint et celui-ci réoxydera le produit formé dans la première réaction de réduction, et un courant de polarité inverse (par rapport à la première partie du balayage) est produit. Ce pic d’oxydation aura habituellement une forme similaire au pic de réduction. Le courant de pic, ip , est décrit par l’équation de Randles-Sevcik : ip = (2.69x105 ) n3/2 A C D1/2 v1/2 Où n est le nombre de moles d’électrons transférés dans la réaction,Aest la surface de l’électrode, C est la concentration de l’analyte en moles/ml, D désigne le coefficient de diffusion et v est la vitesse de balayage du potentiel appliqué. La différence de potentiel entre les pics de réduction et d’oxydation est théoriquement de 59 mV pour une réaction réversible. En pratique, cette différence est typiquement de 70 à 100 mV. Des différences plus importantes, ou encore des pics asymétriques de réduction ou d’oxydation sont un indice d’une réaction non-réversible. Ces para- mètres du voltampérogramme cyclique rendent cette technique appropriée pour la caractérisation et l’étude mécanistique de réactions rédox à l’électrode.
    • Université Virtuelle Africaine 65 Voltammétrie à redissolution anodique La voltammétrie à redissolution anodique est une méthode où une électrode de mercure est maintenue à un potentiel négatif afin de réduire les ions de métaux lourds en solu- tion et de les faire s’amalgamer sur l’électrode. La solution est agitée pour transporter le plus de particules métalliques possible à l’électrode et ainsi concentrer l’amalgame. Après avoir procédé à la réduction des particules et leur accumulation pendant une certaine période, le potentiel à l’électrode est augmenté pour réoxyder les particules et générer un signal de courant. Le potentiel appliqué utilise généralement le principe de sauts comme en polarographie impulsionnelle normale ou différentielle. La concentration de l’analyte dans l’électrode de mercure, CHg , est donnée par : CHg = (il td ) / (n F VHg ) Où il est le courant limitant durant la réaction de réduction du métal, td est la durée de l’accumulation, n est le nombre de moles d’électrons transférés pendant la première moitié de la réaction, F est la constante de Faraday (96,487 coulombs/mole d’électrons) et VHg est le volume de l’électrode. L’expression pour le courant produit lors de cette méthode dépend du type particulier d’électrode, mais est directement proportionnel à la concentration de l’analyte accumulé sur l’électrode. Le principal avantage de l’analyse à redissolution anodique est la pré-concentration de l’analyte à l’intérieur de l’électrode avant de procéder à la mesure de courant. La méthode de redissolution anodique peut détecter des concentrations aussi faibles que 10-10 M.
    • Université Virtuelle Africaine 66 Unité III Spectroscopie et techniques spectroscopiques atomiques Résumé de l’activité d’apprentissage À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : • Nommer les parties du spectre électromagnétique • Réviser les énergies relatives des différentes régions du spectre électroma- gnétique • Se rappeler les unités de mesure couramment utilisées en spectroscopie • Rappeler les effets du rayonnement sur les atomes et les molécules • Réviser les niveaux d’énergie des électrons dans les atomes et les molécu- les • Réintégrer la loi de Beer et l’appliquer à des problèmes quantitatifs • Expliquer les niveaux d’énergie des électrons dans les atomes et les transitions électroniques causées par l’absorption de radiations • Expliquer les concepts sur lesquels sont basées les spectroscopies d’émission atomique (SEA), de fluorescence atomique (SFA), et d’absorption atomique (SAA) • Réintégrer les notions d’instrumentation des SEA, SFA et SAA • Faire les calculs nécessaires en se basant sur des observations de SAA, SFA et SEA hypothétiques Liste des lectures obligatoires http://en.wikipedia.org/wiki/Atomic_Orbital http://en.wikipedia.org/wiki/Energy_level http://en.wikipedia.org/wiki/Atomic_absorption_spectroscopy Liste de liens utiles pertinents http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Atomic_spec/ http://www.chem.vt.edu/chem-ed/spec/atomic/aa.html
    • Université Virtuelle Africaine 67 Spectroscopie La spectroscopie est l’étude de l’interaction entre le rayonnement d’ondes, de lumière ou de particules et la matière. La spectrométrie est la mesure de ces interactions et l’instrument utilisé pour cela est un spectromètre ou un spectrographe. Le graphique tracé par l’instrument qui illustre l’interaction est un spectre. La spectroscopie est souvent utilisée en chimie physique et analytique pour l’identifi- cation et la quantification de substances grâce au spectre d’émission ou d’absorption de ces dernières. Cette unité introduit de manière simple le concept de rayonnement et d’interaction avec la matière, la terminologie courante utilisée en spectroscopie ainsi que la loi de Beer qui est régulièrement appliquée en spectroscopie quantitative. Il sera par la suite question des techniques spectroscopiques atomiques courantes. Rayonnement électromagnétique La lumière est une forme de rayonnement électromagnétique. D’autres formes de rayonnements électromagnétiques incluent les ondes radio, les micro-ondes, le rayon- nement infrarouge, les rayons ultra-violets (UV), les rayons X et les rayons gamma. Tous ces types de rayons, connus collectivement comme le spectre électromagné- tique, sont fondamentalement semblables au sens où ils déplacent à 3 x 108 mètres par seconde, tout comme la lumière. L’unique différence entre eux est leur longueur d’onde, laquelle est directement liée à la quantité d’énergie transportée par les ondes. Plus la longueur d’onde de la radiation est courte, plus élevée en est l’énergie. Classification des rayonnements électromagnétiques Les ondes radio sont utilisées pour la transmission de signaux pour la radio et la té- lévision. Les ondes radio ont des longueurs d’onde variant de moins d’un centimètre à des dizaines ou même des centaines de mètres. Les micro-ondes ont des longueurs d’onde pouvant aller du millimètre (l’épaisseur d’une mine de crayon) jusqu’à environ trente centimètres (environ douze pouces). L’infrarouge est la région du spectre électromagnétique qui part de la région visible jusqu’à environ un millimètre (en longueur d’onde). Les ondes infrarouges incluent la radiation thermale. Par exemple, un poêle au charbon en fonction n’émet pas de lu- mière, mais émet des rayons infrarouges qui sont ressentis sous forme de chaleur. La radiation visible (dans le spectre visible) est la partie de la radiation qui peut être perçue par l’œil humain. Le rayonnement ultraviolet a des longueurs d’ondes de l’ordre de 400 nanomètres (nm) jusqu’à environ 10 nm. Les rayons du soleil contiennent des ondes UV qui peuvent brûler la peau. Les rayons X sont des ondes de haute énergie qui ont un fort pouvoir pénétrant et qui sont utilisés extensivement en médecine et dans l’inspection de soudures. Des images de rayons X de notre soleil peuvent fournir d’importants indices à propos
    • Université Virtuelle Africaine 68 des éruptions solaires et d’autres changements sur cet astre qui peuvent affecter la température de l’espace. L’étendue de la longueur d’onde des rayons X va de l’ordre du billionième de mètre jusqu’à environ 10 trillionièmes de mètre. Les rayons gamma ont des longueurs d’onde encore plus petites que 10 trillionièmes de mètre. Ils sont plus pénétrants que les rayons X. Les rayons gamma sont générés par les atomes radioactifs et lors d’explosions nucléaires, et sont utilisés dans plusieurs applications médicales. Des images de notre univers pris à l’aide des rayons gamma ont fourni de l’information importante sur la vie et la mort d’étoiles ainsi que sur d’autres processus violents dans l’univers. Figure 16 : Le spectre de rayonnement électromagnétique. Référence : http://en.wikipedia.org/wiki/Image:EM_Spectrum3-new.jpg#file Unités de mesure de l’énergie du rayonnement électromagnétique La radiation est présumée être de nature particulaire. Une unité de radiation est ap- pelée photon. Chaque photon d’une fréquence particulière est relié à une quantité d’énergie. Cette énergie est donnée par : E= hν ; où E est la quantité d’énergie, h la constante de Planck (h= 6.624x10-34 JS-1 ) et ν la fréquence de radiation exprimée en hertz. L’énergie s’exprime généralement en joules. Interaction de la radiation avec la matière Les énergies requises lors de tous les processus physiques qui passent aux niveaux moléculaire et atomique sont de l’ordre du quanta (minuscules paquets d’énergie indivisibles). S’il n’y a pas de niveau d’énergie disponible ayant un espace adapté au
    • Université Virtuelle Africaine 69 quantum d’énergie du rayon incident, alors le corps sera en quelque sorte transparent pour la radiation, et les rayons à le traverseront. Ainsi, lorsqu’un corps n’absorbe aucune quantité d’énergie qu’il est transparent pour le rayonnement. L’atome et la spectroscopie atomique La spectroscopie atomique comprend trois techniques d’usage analytique : l’émis- sion atomique, l’absorption atomique et la fluorescence atomique. Ces techniques dépendent des transitions électroniques dans les atomes isolés. Parce que les atomes sont isolés, leurs niveaux d’énergie ne sont pas affectés par les atomes avoisinants. Afin de comprendre les relations qui existent entre ces techniques, il est nécessaire de comprendre l’atome lui-même et les processus atomiques impliqués dans chaque technique. Figure 17 : Niveaux d’énergie atomiques L’atome est constitué d’un noyau entouré d’électrons. Chaque élément chimique a un nombre spécifique d’électrons qui sont associés au noyau. Le plus bas état d’éner- gie ; la plus stable configuration électronique, appelée « état fondamental », est la configuration orbitale normale pour un atome. L’atome comporte d’autres orbites «permises» pouvant contenir des électrons, mais qui sont de plus haute énergie. Si de une quantité d’énergie convenable est fournie à un atome, elle est absorbée par l’atome et un électron vers un autre état dit « état excité ». Puisque cet été est instable, l’atome va immédiatement et spontanément retourner à l’état fondamental. L’électron va revenir à sa position orbitale initiale stable, et de l’énergie radiante équivalente à l’énergie initialement absorbée lors du processus d’excitation sera émise. Le processus est illustré en figure 18. Remarquez que dans l’étape 1 du processus, l’excitation est forcée par de l’énergie fournie de l’extérieur. Le processus de désintégration (étape 2) impliquant l’émission de lumière se produit spontanément.
    • Université Virtuelle Africaine 70 Figure 18 : Excitation et Émission (image adaptée de Perkin Elmer Corpora- tion). La longueur d’onde de l’énergie émise est directement liée à l’énergie de la transition électronique qui s’est produite. Puisque chacun des éléments chimiques a une structure électronique unique, la longueur d’onde de la lumière émise est une propriété unique de chaque élément. Comme la configuration d’un gros atome peut être complexe, plusieurs transitions électroniques peuvent se produire, chacune résultant de l’émission d’une lumière de longueur d’onde caractéristique. Ceci est illustré en figure 18. Molécules et spectroscopie moléculaire Pour un processus donné d’excitation, la molécule ou l’atome absorbe une quantité d’énergie distincte. Cela devrait correspondre à une fréquence absorbée. Toutefois, en pratique, un groupe de molécules existe avec plusieurs états d’énergie, chacun se distinguant des autres par une petite quantité d’énergie. Ainsi, un groupe de molécu- les contenu dans un échantillon donnera lieu à une absorption de quantité d’énergie comprise dans un intervalle assez étroit, laquelle donnera une petite bande ou pic d’absorption. Question formative Expliquez pourquoi le spectre d’absorption pour un atome consiste en des lignes distinctes à des longueurs d’onde spécifiques plutôt que des larges bandes telles qu’obtenues pour les molécules. La loi de Beer (ou de Beer-Lambert) Lorsqu’un rayonnement traverse une région contenant des atomes ou des molécules, la radiation est absorbée. Le diagramme représenté ci-dessous montre un faisceau de radiation monochromatique de pouvoir radiant P0 (aussi appelé intensité lumineuse, I0 ), envoyé sur une solution-échantillon. L’absorption a lieu et le faisceau de radiation qui quitte l’échantillon a un pouvoir radiant équivalant à P (ou I).
    • Université Virtuelle Africaine 71 Po P b Figure 19 : Démonstration de la loi de Beer. La quantité de radiation absorbée dépend de la nature de l’échantillon, de sa concen- tration et de la longueur du trajet que doit parcourir la lumière pour traverser l’échan- tillon (en quelque sorte, la longueur de l’échantillon). La quantité de radiation absorbée peut être mesurée à l’aide d’un certain nombre de paramètres : Transmittance : T = P / P0 ; Pourcentage de transmittance : %T = 100 T Absorbance : A = log10 P0 / P A = log10 1 / T A = log10 100 / %T A = 2 - log10 %T  La dernière équation, A = 2 - log10 %T, vaut la peine d’être retenue car elle permet de calculer aisément l’absorbance à partir d’une donnée de pourcentage de trans- mittance.  La relation entre l’absorbance et la transmittance est illustrée en figure 20. Si une lumière traverse une solution sans qu’il y ait absorption, alors l’absorbance est de zéro et le pourcentage de transmittance est de 100%. Si toute cette lumière est absorbée, alors le pourcentage de transmittance est de zéro et l’absorbance est infinie.
    • Université Virtuelle Africaine 72 La loi de Beer-Lambert La loi de Beer ou de Beer-Lambert s’exprime comme suit : A=εbc Où A désigne l’absorbance (sans unités, car A = log10 P0 / P), ε est le coefficient d’absorption molaire (unités : L mol-1 cm-1 ), b est la longueur du trajet de la lumière lorsqu’elle traverse l’échantillon – qui se trouve à être la largeur de la cuvette qui contient l’échantillon ; et où c est la concentration du composé en solution, exprimée en moles par litre (mol.L-1 ). A=εbc %T = 100 P/P0 = e -εbc Supposons que nous avons une solution de sulfate de cuivre (qui paraît bleue parce que son absorption maximale est de 600 nm). Nous observons la façon avec laquelle l’intensité de la lumière (pouvoir radiant) change à mesure qu’elle passe à travers la solution dans une cuvette de 1 cm de largeur. Nous regarderons la réduction à cha- que 0,2 cm tel que montré dans le diagramme représenté ci-dessous. La loi stipule que la fraction de lumière absorbée par chaque couche de solution est la même. Pour notre illustration, nous supposerons que cette fraction est de 0,5 pour chaque « couche » de 0,2 cm et les données suivantes seront calculées : Figure 20 : Courbes de la transmittance et de l’absorbance en fonction du trajet de lumière A = εbc nous dit que l’absorbance dépend de la quantité totale de composé se trou- vant dans le trajet de lumière à travers la cuvette. Si nous traçons le graphique de l’absorbance en fonction de la concentration, nous obtiendrons une droite passant par l’origine (0, 0). Notez que la loi n’est pas valable pour les concentrations élevées. La non validité de cette loi ne sera pas considérée ici.
    • Université Virtuelle Africaine 73 Figure 21 : La loi de Beer et la concentration de l’échantillon analysé La relation linéaire entre la concentration et l’absorbance est simple et directe, c’est pourquoi nous préférons exprimer la loi de Beer-Lamber utilisant l’absorbance comme la mesure de l’absorption plutôt que le pourcentage de transmittance. Absorption molaire Le coefficient d’absorption molaire ε est une mesure de la quantité de lumière ab- sorbée par unité de concentration. L’absorption molaire étant constante pour une substance particulière donnée, alors si la concentration de la solution diminue de moitié, l’absorbance diminuera de la même façon tel qu’attendu. Prenons un composé ayant une très grande valeur d’absorption molaire : 100 000 L mol-1 cm-1 , lequel étant en solution dans une cuvette de 1 cm de largeur et donnant une absorbance de 1. ε = 1 / 1b c Alors, c = 1 / 100 000 = 1X10-5 mol/L Considérons un composé ayant une valeur très faible de ε, disons 20 L mol-1 cm-1 , lequel étant en solution dans une cuvette de 1 cm de largeur et donnant une absor- bance de 1. ε = 1 / 1 b c Alors, c = 1 / 20 = 0,05 mol/L Le β-carotène est un composé organique contenu dans les légumes et qui est respon- sable de la couleur orangée des carottes. On le trouve à des concentrations excessi- vement basses. Vous ne serez pas surpris d’apprendre que le coefficient d’absorption molaire du β-carotène est de 100 000 L mol-1 cm-1 .
    • Université Virtuelle Africaine 74 Évaluation formative 1. Une mole de photons (le nombre d’Avogadro de photons : 6,23 x1023 photons) représente 1 Einstein (de rayonnement). Calculez l’énergie, en calories, d’un Einstein à une longueur d’onde de 3000 Å. 2. Un composé de masse moléculaire de 280 absorbe 65% de la radiation à une certaine longueur d’onde dans une cuvette de 2 cm, à une concentration de 15 mg/mL. Calculez son absorption molaire à cette longueur d’onde. 3. Une solution d’ADN (poids moléculaire inconnu) de 20 ppm isolée de Esche- richia coli a donné une absorbance de 0,80 dans une cuvette de 2 cm. Calculez l’absorption molaire de la molécule. Techniques spectroscopiques atomiques Les électrons, dans les atomes, existent sur les différents niveaux d’énergie. Ces niveaux ont des énergies bien définies et les électrons qui s’y déplacent absorbent ou émettent l’énergie équivalente à la différence entre ces niveaux. En spectroscopie atomique, l’énergie absorbée pour déplacer un électron à un niveau de plus haute énergie et/ou l’énergie émise pour déplacer un électron vers un niveau de plus basse énergie est sous forme de photon (une particule de lumière). Parce que cette énergie est précisément définie, il est possible d’identifier l’atome par l’énergie de cette transition. La longueur d’onde de la lumière peut être reliée à son énergie. C’est habituellement plus facile de mesurer la longueur d’onde de la lumière que de mesurer directement son énergie. La spectroscopie atomique peut par la suite être divisée en absorption, émission et fluorescence. En spectroscopie d’absorption atomique, la lumière traverse un grand nombre d’ato- mes. Si la longueur d’onde de la lumière a une énergie correspondant à la différence d’énergie entre deux niveaux d’énergie dans les atomes, une portion de la lumière sera absorbée. La relation entre la concentration des atomes, la distance parcourue par la lumière à travers une solution d’atomes et la portion de lumière absorbée est donnée par la loi de Beer-Lamber. L’énergie stockée dans les atomes peut être émise de différentes façons. Lorsque cette énergie est émise sous forme de lumière, on appelle cela la fluorescence. La spectros- copie de fluorescence atomique mesure cette émission de lumière. La fluorescence est généralement mesurée à un angle de 90 degrés de la source d’excitation afin de minimiser le captage de lumière diffuse provenant de la source d’excitation. Pour obtenir une telle rotation, on utilise souvent un prisme de Pellin-Broca installé sur une table tournante, lequel séparera aussi la lumière en son spectre pour une analyse plus rigoureuse. La longueur d’onde, encore une fois, permet d’identifier l’atome. Pour de faibles absorbances (et ainsi des concentrations faibles), l’intensité de la lumière fluorescée est directement proportionnelle à la concentration d’atomes. La fluorescence atomique est habituellement plus sensible (peut détectée de plus faibles concentrations) que les techniques d’absorption atomique.
    • Université Virtuelle Africaine 75 Émission atomique En émission atomique, un échantillon est placé dans un environnement de haute énergie thermique dans le but d’amener l’atome à un état excité à partir duquel il sera capable d’émettre de la lumière. La source d’énergie peut être un arc électrique, une flamme, ou, découvertes plus récemment, les sources à plasma (mélange gazeux conducteur d’électricité). Le spectre d’émission d’un élément exposé à une telle source d’énergie consiste à déterminer les longueurs d’onde d’émissions permises, commu- nément appelées lignes d’émission à cause de la nature distincte des longueurs d’onde d’émission (ce spectre d’émission peut être utilisé comme caractéristique unique pour l’identification qualitative de l’élément chimique). L’émission atomique avec l’arc électrique comme source d’énergie est largement utilisée en analyse qualitative. Les techniques d’émission atomique peuvent également être utilisées pour déterminer la quantité d’un élément présent dans un échantillon. Pour une analyse « quantitative », l’intensité de la lumière émise à la longueur d’onde de l’élément chimique à iden- tifier est mesurée. L’intensité d’émission à cette longueur d’onde est d’autant plus forte que le nombre d’atomes de l’analyte est grand. La technique de photométrie de flamme est une application d’émission atomique pour l’analyse quantitative. Absorption atomique La capacité d’un atome à absorber des longueurs d’onde de lumière très spécifiques est utilisée en spectrométrie d’absorption atomique. La quantité qui nous intéresse en absorption atomique est la quantité de lumière qui est absorbée, à la longueur d’onde de résonance, à mesure que la lumière traverse le nuage d’atomes. À mesure que le nombre d’atomes augmente dans le trajet de la lumière, la quantité de lumière absorbée augmente aussi de manière prévisible. En mesurant la quantité de lumière absorbée, il est possible de déterminer la quantité de matière de l’élément-analyte présent. L’usage de sources de lumières spécifiques et une bonne sélection de la longueur d’onde permet la détermination quantitative d’un élément individuel en présence d’autres éléments, rendant cette technique très sélective. Le nuage d’atomes requis pour la mesure d’absorption atomique est produit en four- nissant suffisamment d’énergie thermique à l’échantillon pour dissocier les composés chimiques en atomes libres. Ceci est accompli en aspirant une solution d’analyte dans la flamme. Dans des conditions adéquates, la plupart des atomes seront à l’état fondamental et ainsi pourront absorber la lumière provenant d’une source lumineuse, à la longueur d’onde d’analyse. Fluorescence atomique Dans cette technique, les atomes à l’état fondamental créés dans une flamme sont excités en les exposant à un faisceau de lumière. L’émission résultant de la désin- tégration des atomes excités par la source lumineuse est mesurée. L’intensité de cette « fluorescence » augmente dans le même sens que la concentration d’atomes, fournissant la base pour la détermination quantitative.
    • Université Virtuelle Africaine 76 La lampe-source pour la fluorescence atomique est fixée à un certain angle compa- rativement aux autres composantes du système optique, ainsi le détecteur de lumière capte seulement la fluorescence de la flamme et non la lumière provenant de la lampe elle-même. Il est avantageux de maximiser l’intensité de la lampe pour cette méthode, car la sensibilité est directement reliée au nombre d’atomes excités, (la sensibilité de la méthode est fonction de l’intensité de la lumière excitante). Les atomes n’émettent pas à la même longueur d’onde que la radiation utilisée pour l’excitation. Analyse quantitative par absorption atomique Le processus d’absorption atomique est illustré en figure 22. La lumière à la longueur d’onde de résonance, d’intensité initiale Io , est dirigée vers la zone de la flamme contenant les atomes à l’état fondamental. L’intensité lumineuse initiale est abaissée d’une quantité déterminée par la concentration d’atomes du compartiment. La lumière est ensuite dirigée vers détecteur, où l’intensité réduite, I, est mesurée. Figure 22 : Le phénomène d’absorption atomique.
    • Université Virtuelle Africaine 77 Évaluation formative i. Pourquoi est-il souhaitable d’avoir une source lumineuse nette et précise en spectroscopie d’absorption atomique ? ii. Expliquez pourquoi la spectrométrie d’émission atomique à flamme est sou- vent aussi sensible que la spectrométrie d’absorption atomique, même s’il est possible que seulement une petite fraction des atomes soient excités par la flamme. iii. Pourquoi une flamme d’oxyde nitreux/acétylène de haute température est parfois nécessaire en spectrométrie d’absorption atomique ? iv. Pourquoi ajoute-t-on parfois des concentrations élevées de sels de potassium aux standards et aux échantillons dans les techniques d’absorption ou d’émis- sion utilisant la flamme ? v. Les interférences chimiques sont plus présentes dans les flammes moins chaudes, telles qu’à air-propane, cependant ce type de flamme est privilégié pour la détermination de métaux alcalins. Dites pourquoi. vi. On mesure la quantité de calcium dans une solution-échantillon par spectro- métrie d’absorption atomique. Une solution stock de calcium est préparée en dissolvant 1,834 g de CaCl• 2H2 0 dans l’eau jusqu’à obtenir 1 litre. Cette solution est ensuite diluée à 1 :10. Les standards de travail sont préparés en diluant la seconde solution à respectivement 1 :20, 1 :10 et 1 :5. L’échantillon est dilué à 1 :35. Du chlorure de strontium est ajouté à toutes les solutions avant la dilution, suffisamment pour obtenir 1% (p/v) afin d’éviter les interférences causées par les phosphates. Un blanc est préparé à 1% SrCl. Les signaux d’absorbance obtenus par l’ordinateur suite à l’aspiration des solutions dans une flamme air-acétylène sont les suivants : Blanc : 1,5 cm Standards : 10,6 ; 20,1 et 38,5 cm Échantillon : 29,6 cm Quelle est alors la concentration en calcium de l’échantillon, en parties par million (ppm) ?
    • Université Virtuelle Africaine 78 Unité IV Spectroscopie moléculaire I : UV-visible et infra-rouge Résumé de l’activité d’apprentissage À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : • Expliquer les niveaux d’énergie dans les molécules ainsi que les transitions produites par l’absorption de rayons UV et visibles. • Expliquer les concepts sur lesquels se base la spectroscopie en UV-visible • Utiliser un spectre UV-visible hypothétique afin d’identifier des groupements fonctionnels spécifiques dans une molécule • Expliquer comment le coefficient d’extinction molaire est utilisé pour l’ana- lyse quantitative • Utiliser des données fictives pour calculer la concentration de solutions • Nommer les parties d’un spectrophotomètre UV moderne et leurs fonctions • Réintégrer les notions de transitions électroniques causées par l’absorption de rayons IR • Faire la corrélation entre l’absorption de rayons IR de fréquences spécifiques et les groupes fonctionnels moléculaires • Faire la corrélation entre l’absorption de rayons IR de fréquences spécifiques et la structure de molécules organiques simples • Se remémorer les parties d’un spectrophotomètre IR moderne et leurs fonc- tions Liste des lectures obligatoires http://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_energy_state Liste de liens utiles pertinents http://www.scienceofspectroscopy.info/edit/index.php?title=UV_Absorption_Ta- ble http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/uvvisab4.htm http://www.scienceofspectroscopy.info/edit/index.php?title=UV-Visible_Spec- troscopy http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Spectrophotometry/
    • Université Virtuelle Africaine 79 Liste de ressources multimédias pertinentes http://www.cem.msu.edu/~parrill/AIRS/name_list.html Spectroscopie dans le spectre ultraviolet-visible Transitions électroniques L’absorption d’énergie lumineuse par des composés organiques dans les régions du visible et de l’ultraviolet du spectre implique la transition d’électrons dans les orbitales σ, π, et n, de l’état fondamental vers des états de plus haute énergie. Ces états d’énergie plus grande sont appelés orbitales anti-liantes. L’orbitale anti-liante associée à la liaison σ est notée σ* (sigma étoile) et l’orbitale liée au lien π est π* (pi étoile). Plusieurs molécules contiennent des atomes avec des électrons de valence qui ne sont pas directement impliqués dans la formation de liaisons, ceux-ci sont appelés non-liants ou électrons n et sont principalement situés dans les orbitales atomiques de l’oxygène, du soufre, de l’azote et des halogènes. Les électrons n ne font pas de liaisons, ainsi, il n’y a pas d’orbitales anti-liantes associés à eux. La présence d’un électron sur une orbitale anti-liante indique que la molécule est dans un état de haute énergie. La densité électronique entre les noyaux atomiques est moindre qu’à la même distance du noyau dans un atome isolé. À l’état excité, quelques-uns des électrons de la molécule (mais pas tous), occupent une orbitale anti-liante. Les transitions électroniques (→) qui ne sont pas incluses dans les régions de l’UV ou du visible sont des types suivants : σ→σ*, n →σ*, n →• π *, and •n → π*. L’énergie requise pour la transition σ→σ* est très grande; conséquemment, les composés dans lesquels tous les électrons de valence sont impliqués dans la formation de liaisons simples, tels que les hydrocarbures saturés, n’absorbent pas dans la région normale des ultraviolets. Figure 23 : Les transitions électroniques qui ont lieu suite à l’absorption de rayons UV et de lumière visible.
    • Université Virtuelle Africaine 80 Les composés ne contenant pas d’électrons non-liants dans les atomes d’oxygène, d’azote, de soufre et d’halogènes sont capables d’absorption grâce aux transitions n→σ*. Celles-ci sont de plus faible énergie que les transitions σ→σ*, ainsi les mo- lécules possédant des électrons non-liants peuvent généralement absorber dans la région normale des ultraviolets. Les transitions vers les orbitales non-liantes π* sont seulement associées aux liaisons insaturées (doubles ou triples liens) de la molécule ; celles-ci requièrent encore moins d’énergie et ont lieu à des longueurs d’onde plus grandes, donc assez fréquemment à l’intérieur de la région des ultraviolets. Le diagramme ci-dessus montre les énergies relatives générales d’excitation électronique pour ces transitions. Les transitions de haute énergie (σ→σ*) ont lieu à de plus courtes longueurs d’onde et les transitions de plus faible énergie n→π* ont lieu à des longueurs d’onde plus longues. Effet de l’environnement structural Des groupements fonctionnels identiques se trouvant dans des molécules différentes n’absorberont pas nécessairement exactement à la même longueur d’onde. Le chan- gement d’énergie pour une transition particulière dicte la position de l’absorption d’un groupe donné. Les transitions au sein de groupements fonctionnels identiques, mais se trouvant dans différentes molécules, n’auront pas automatiquement le même besoin en énergie à cause des environnements structuraux qui sont différents. Les molécules avoisinantes ont un effet minime, mais non-négligeable, sur l’état d’énergie d’un chromophore. Effet de conjugaison Si deux groupes chromophores ou plus sont présents dans une molécule et sont séparés par deux simples liaisons ou plus, l’effet sur le spectre est généralement additif ; il y a une petite interaction électronique entre les chromophores isolés. Toutefois, si deux groupes chromophores sont séparés par une seule simple liaison (un système conjugué), un grand effet sur le spectre se produit parce que le système d’électrons π s’étend sur au moins quatre centres atomiques. Quand deux chromophores sont conjugués, la bande d’absorption de haute intensité est habituellement déplacée de 15-45 nm vers les longueurs d’onde plus longues relativement au simple chromo- phore non-conjugué. Le coefficient d’extinction molaire L’ordre de grandeur du coefficient d’extinction molaire pour une absorption parti- culière est directement proportionnelle à la probabilité d’une transition électronique particulière ; plus une transition donnée est probable, plus grand est le coefficient d’extinction molaire. En général, un type donné de chromophore aura toujours un coefficient d’extinction molaire d’à peu près la même ampleur dans différentes molé- cules. Toutefois, l’extinction devrait être considérée lorsque vient le temps d’assigner un pic d’absorption à un chromophore donné, car l’absorption est caractérisée par l’énergie et la probabilité de transition.
    • Université Virtuelle Africaine 81 L’effet de solvant Les structures électroniques des états de haute énergie des molécules sont soit plus polaires ou moins polaires qu’à l’état fondamental. Celles qui sont plus polaires à l’état excité voient leur pic d’absorption déplacé de 10 à 40 nm vers de plus longues longueurs d’onde dans les solvants polaires et vice versa. Identification de groupements fonctionnels à l’aide de l’UV Un groupement fonctionnel isolé, non-conjugué avec un autre groupement est appelé chromophore s’il a une absorption de nature distinctive ou caractéristique dans la région UV-visible. Si plusieurs composés possèdent le même groupement fonctionnel sans présence de complications, tous les composés vont généralement absorber à des longueurs d’onde très voisines et auront le même (ou presque) coefficient d’extinction molaire.Ainsi, il est facile de voir que le spectre d’un composé, lorsque comparé avec les données de la littérature pour des composés connus, peut être d’une aide précieuse pour l’identification de groupes fonctionnels présents dans une molécule. Instrumentation pour la spectrométrie UV-visible Figure 24 : Spectrophotomètre à double faisceau
    • Université Virtuelle Africaine 82 La lumière vient de la source et un mince rayon pénètre par la fente 1, le réseau de diffraction sélectionne la longueur d’onde requise et un mince rayon est à nouveau sélectionné par la fente 2. Le filtre laisse passer le rayon à la longueur d’onde permise uniquement vers le miroir 2. Ce dernier dirige le faisceau à travers un miroir (half mirror) qui laisse passer la moitié du faisceau vers le miroir 3 et l’autre moitié vers le miroir 4 afin de former le faisceau de référence et le faisceau-échantillon. Évaluation formative Ces exercices renforcent les connaissances acquises dans la section précédente sur l’identification de chromophores à l’aide de l’UV. 1) Lequel, parmi les composés suivants, absorbe dans la région UV ? a) CO2 b) H2 c) CH3 CO 2) Placez les composés suivants dans l’ordre croissant de la fréquence ou nombre d’onde auquel ils vont absorber : a) CH3 CO b) CH2 =CH-CH=CH2 c) CH2 =CH-CH=CH-CH=CH2 3) Identifiez les transitions électroniques possibles qui pourront permettre l’absorp- tion dans l’UV dans les composés suivants : a) CH3 CO b) CH2 =CH-CH=CH2 c) CH3 CN Spectroscopie infra-rouge (IR) Vibration moléculaire et spectroscopie IR Une molécule n’est pas un assemblage d’atomes rigide. Une molécule est un système de balles de masses variées, correspondant aux atomes d’une molécule, ainsi que de ressorts de différentes forces correspondant aux liens chimiques de la molécule. Ceux-ci peuvent donc subir diverses vibrations. Il y a deux sortes de vibrations fondamentales pour les molécules : les vibrations d’élongation (stretching), où la distance entre les atomes augmente ou diminue mais ceux-ci restent dans le même axe de liaison et les vibrations de déformation (bending ou deformation), où la position de l’atome change relativement à l’axe de liaison d’origine. Les différentes vibra- tions d’élongation et de déformation d’une liaison demandent une certaine quantité d’énergie. Pour les transitions impliquant ces vibrations, la fréquence correspond au rayonnement infra-rouge. Lorsque de la lumière infra-rouge, à cette même fréquence se dirige sur la molécule (rayon incident), l’énergie est absorbée et l’amplitude de cette vibration augmente. Lorsque la molécule retourne à l’état fondamental depuis l’état excité, l’énergie absorbée au départ est restituée sous forme de chaleur.
    • Université Virtuelle Africaine 83 Bandes d’absorption fondamentale et non fondamentale Une molécule non linéaire qui contient n atomes a 3n-6 vibrations fondamentales possibles. Des bandes d’absorption (non fondamentale) additionnelles peuvent avoir lieu à cause de la présence soit de bandes harmoniques qui surviennent à des intensités considérablement plus basses, à ½, 1/3, ¼ de la longueur d’onde (les harmoniques apparaissent à des fréquences multiples de la vibration fondamentale ; donc X fois le nombre d’onde), soit de bandes de combinaison (soit la différence ou la somme de deux nombres d’onde différents ou plus). Si toutes les vibrations consistaient en absorption infra-rouge, le nombre de pics obtenu serait trop grand pour être utile, cependant, une vibration qui absorbe en IR doit consistait en une variation du mo- ment dipolaire électrique.Ainsi, seules les liaisons reliant deux molécules différentes peuvent absorber en IR. Énergies relatives des absorptions IR Les vibrations de déformation requièrent généralement moins d’énergie et ont lieu à de plus grandes longueurs d’onde (à de plus faibles fréquences ou nombres d’onde) que les vibrations d’élongation. La triple liaison (absorption vers 4,4 à 5,0 µm, 2300 à 2000 cm-1 ) est plus forte que la double liaison (absorption vers 5,3 à 6,7 µm, 1900 à 1500 cm-1 ), laquelle est plus forte que la liaison simple (C–C, C–N, et C–O, absorption vers 7,7 à 12,5 µm, 1300 à 800 cm-1 ). Lorsque la liaison simple implique le très petit atome d’hydrogène (C–H, O–H, ou N–H), les vibrations d’élongation ont lieu à une fréquence considérablement plus grande (2,7 à 3,8 µm, 3700 à 2630 cm-1 ). Le lien O–H absorbe près de 2,8 µm (3570 cm-1 ). Par exemple, si le spectre présente une forte bande à 5,82 µm (1718 cm-1 ), il est presque certain que le composé contient un groupement carbonyle. Le spectre en lui-même ne fournit pas toujours l’information sur la nature du groupe- ment ; le composé peut être un aldéhyde, une cétone, un acide, un ester, ou un amide. Donc, si l’on désire identifier un groupe fonctionnel, le spectre doit être examiné en détails pour l’identification de bandes d’absorption et utilisé conjointement avec (et ne peut pas toujours remplacer) les réactions chimiques classiques ainsi que la détermination de la solubilité. D’autre part, même si l’on ne doit pas accorder trop d’importance à l’absence de preuves, si le spectre ne montre pas de bande d’absorp- tion typique d’un certain groupe fonctionnel, cela signifie que la molécule à identifier ne contient pas le groupement fonctionnel en question. Par exemple, si le spectre ne démontre pas d’absorption dans la région de 5,4 à 6,3 µm (1850 à 1587 cm-1 ), l’échantillon ne contient pas de groupement carbonyle. Un bon nombre des bandes d’absorption montrées par les composés organiques dans la région IR ne peuvent être interprétées avec certitude.
    • Université Virtuelle Africaine 84 Identification de groupements fonctionnels à l’aide de la spectroscopie IR Spectre IR des hydrocarbures saturés Les hydrocarbures saturés présentent des absorptions résultant des vibrations typiques de groupes présents au sein de ce type de molécule, telles que l’élongation C–H (~3,39 µm à 3,54 µm et 2950 à 2820 cm-1 ), la déformation –CH2 – (6,86 µm et 1458 cm-1 ), et la déformation C–CH3 (6,86 à 7,28 µm et 1458 à ~1380 cm-1 ). Les absorptions faibles près de 13,85 µm (722 cm-1 ) sont causées par les vibrations de déformation du groupement –(CH2 )n –, lorsque n > 4. Absorption IR de O–H Si un groupe méthyle d’un hydrocarbure saturé est remplacé par un atome d’oxygène, ceci produit une apparence d’absorption causée par la forte vibration d’élongation C–O près de 9 μm (~1110 cm-1 ). Le spectre change de manière très prévisible ; il montre désormais des bandes d’absorptions associées aux vibrations d’élongation O–H et C–O en plus des bandes produites par les chromophores hydrocarbures présents. Le spectre du propan-1-ol, CH3 –(CH2 )–CH2 OH, en est un bon exemple (figure 24 ci-dessous) ; l’absorption forte et large présente à ~2,9 µm (~3448 cm-1 ) est due à la vibration d’élongation O–H et est typique de l’association polymérique des groupes hydroxyles . Son élargissement est causé par les liens hydrogènes. Figure 25 : Spectre IR du 1-propanol
    • Université Virtuelle Africaine 85 Absorption IR de C–O Cétones Si un composé contient des groupes carbonyles, l’absorption causée par la vibration d’élongation C–O est généralement parmi les plus fortes. Les groupes carbonyles des cétones absorbent généralement vers 5,7 à 6,0 µm (1754 à 1667 cm-1 ) ; la position de l’absorption sur le spectre est sensible, entre autres, à la taille de l’anneau (cycle) dans des composés cycliques et au degré d’insaturation conjuguée. Aldéhydes L’absorption due à la vibration d’élongation du carbonyle dans les aldéhydes apparaît environ dans la même région que pour les cétones. L’autre caractéristique notable de l’absorption du groupement aldéhyde est la présence de deux faibles bandes causées par la vibration d’élongation de C–H. La longueur d’onde de cette absorption est plus grande (nombre d’onde diminué) comparativement à la position normale de l’élongation C–H de 3,4 µm (294 cm-1 ) à environ 3,55 et 3,68 µm (environ 2820 et 2720 cm-1 ). La présence de deux bandes d’absorption dans cette région est causée par le mode d’élongation symétrique et asymétrique des liens C–H et C=O. Esters et lactones La position d’absorption de la vibration d’élongation des esters et des lactones dé- pendant, tout come les cétones, des insaturations conjuguées et de la taille du cycle. L’absorption se fait néanmoins dans la même région, en général, que pour les liaisons C=O. Acides carboxyliques L’absorption produite par la vibration d’élongation des groupes carbonyles d’un acide carboxylique saturé (5,83 µm, 1715 cm-1 ) est déplacée vers une plus grande longueur d’onde (nombre d’onde plus petit) s’ils sont conjugués avec un groupe insaturé (par exemple, l’acide benzoïque : 5,88 µm et 1701 cm-1 ). Amides Tous les amides montrent une forte absorption due à l’élongation des carbonyles et les absorptions résultant des vibrations d’élongation N–H des amides primaires et secondaires sont de l’ordre de 2,8 à 3,2 μm (~3570 à 3125 cm-1 ). Amines L’absorption la plus typique des amines est celle des vibrations d’élongation du lien N–H vers 2,8 à 3,0 μm (~3570 à 3333 cm-1 ). Dans les solutions diluées et les solvants inertes pour cette région du spectre, les amines primaires montrent deux bandes nettes, ce qui est dû aux vibrations d’élongation symétriques et asymétriques de N–H ; les amines secondaires montrent une seule bande et pour les amines tertiaires, on n’y retrouve aucune bande d’absorption.
    • Université Virtuelle Africaine 86 Liaison éthylène C=C En raison de la faible intensité d’absorption des vibrations d’élongation de la liaison C=C, des solutions concentrées d’alcènes devraient être utilisées ; l’absorption se produit dans la région de 5,95 à 6,17 μm (~1680 à 1620 cm-1 ). Les absorptions sont plus intenses si la liaison éthylène est conjuguée avec un groupement insaturé. La bande d’absorption due à la vibration d’élongation alcènique de C=C–H est un petit pic à 3,19 µm (3135 cm-1 ) près de la bande plus large d’absorption d’un alcane pro- duite par la vibration d’élongation C–H. Liaisons triples Les absorptions résultant des vibrations d’élongation des liaisons triples carbone- carbone (C≡C) des composés acétyléniques ont lieu vers 4,4 à 4,8 µm (~2275 à 2085 cm-1 ). L’absorption est faible, spécifiquement si la liaison acétylène n’est pas terminale. Les vibrations d’élongation ne sont qu’une expansion ou contraction linéaire de la molécule, ainsi le moment dipolaire n’est pas tellement affecté. L’absorption causée par l’élongation acétylénique C–H apparaît comme une forte bande nette près de 3,0 µm (~3333 cm-1 ). L’absorption causée par la vibration d’élongation de la triple liaison des nitriles a lieu dans la même région environ que pour les acétylènes, cependant l’absorption est considérablement plus intense. Cette absorption pour le benzonitrile, par exemple, apparaît à 4,44 µm (2252 cm-1 ). Composés aromatiques Les structures aromatiques sont identifiées par la présence de quatre bandes d’ab- sorption vers 6 à 7 µm (1667 à 1429 cm-1 ) sur le spectre. Les pics se trouvent près de 6,25, 6,32, 6,67, et 6,90 µm (1600, 1580, 1500, and 1450 cm-1 ) et sont causées par les vibrations C=C dans le plan du squelette de la molécule. La seconde bande est fréquemment observée en tant que petit renflement sur le premier pic, mais est intensifiée si le noyau aromatique est conjugué avec un groupe insaturé ; la qua- trième bande est fréquemment masquée par la forte absorption due aux vibrations de déformation –CH2 – si des groupes aliphatiques sont présents. L’absence de pics d’absorptions dans ces régions du spectre est une bonne indication que le composé ne contient pas de cycle aromatique. Un bon nombre de bandes d’absorption d’intensités variables apparaissent dans la région de 10 à 15 µm (1000 à 670 cm-1 ) qui sont produites par les vibrations de déformations C–H. Ces absorptions dépendent du nombre d’hydrogènes libres avoisinants que le noyau aromatique possède. Un composé aromatique contenant cinq atomes d’hydrogène adjacents absorbe fortement autant vers 13,3 et 14,3 μm (~750 et 700 cm-1 ) ; si le composé contient quatre atomes d’hydrogène avoisinants, comme par exemple un o-benzène disubstitué, il absorbe fortement, seulement près de 13,3 μm (~750 cm-1 ). Les absorptions restantes reliées à un plus petit nombre atomes d’atomes d’hydrogènes voisins du noyau (plus haut degré de substitution sur le noyau aromatique) sont habituellement faibles et difficiles à identifier. Une
    • Université Virtuelle Africaine 87 absorption près de 14,3 μm (~700 cm-1 ) est d’une importance particulière ; si le composé n’absorbe pas de façon forte dans cette région, il ne peut être un composé benzénique mono-substitué. Le spectre du biphényle ainsi que d’autres composés benzéniques mono-substitués montrent ce genre de bandes d’absorptions. La région du spectre des composés benzéniques près de 5 à 6 μm (2000 à 1670 cm-1 ) contient des bandes d’absorption de faible intensité qui sont des bandes harmoniques ou des bandes de combinaison. Le nombre et la position relative de ces bandes sont remarquablement tributaires du type particulier de substitution du cycle benzène. Évaluation formative 1) Placez les liaisons suivantes dans l’ordre croissant de la fréquence d’absorption IR de leurs vibrations d’élongation. a) C–N b) N–H c) O–H 2) Laquelle des liaisons suivantes donnera une absorption IR ? a) H–H b) C–H c) O–O d) C–O Spectre infrarouge : il est important de se rappeler que l’absence d’une bande d’ab- sorption peut souvent fournir plus d’information sur la structure d’une molécule que la présence d’une bande. Soyez attentifs et évitez de trop porter votre attention sur les bandes d’absorptions sélectionnées, cela pourrait vous faire manquer les autres. Interprétation d’un spectre IR Observez les absorptions suivantes qui sont en ordre décroissant d’importance : • Les absorptions de C–H se trouvent entre 3100 et 2850 cm-1 . Une absorption plus haute que 3000 cm-1 indique un lien C=C, soit un alcène ou un composé aromatique. Confirmez le cycle aromatique en trouvant les pics vers 1600 et 1500 cm-1 et les C=H de déformation hors plan pour avoir les patrons de substitutions sous les 900 cm-1 . Confirmez les groupes alcènes avec les bandes à 1640-1680 cm-1 . Les pics d’absorption entre 3000 et 2850 cm-1 sont produits par des hydrogènes aliphatiques. • Les absorptions de groupes carbonyles (C=O) se trouvent entre 1690 et 1760 cm-1 ; cette forte bande indique autant un aldéhyde, une cétone, un acide carboxylique, un ester, un amide un anhydride ou un halogénure d’acyle. L’identification de l’aldéhyde peut être confirmée par la présence d’une bande vers 2840 à 2720 cm-1 . • Les absorptions des liaisons O–H et N–H se trouvent entre 3200 et 3600 cm-1 . Celles-ci peuvent indiquer autant un alcool (O–H), une amine ou un amide contenant un N–H ou un acide carboxylique. Pour –NH2 , on observera un doublet.
    • Université Virtuelle Africaine 88 • L’absorption de la liaison C–O se situe entre 1080 et 1300 cm-1 . Ces pics sont normalement arrondis comme les pics O–H et N–H et sont proéminents. Les acides carboxyliques, les esters, les éthers, les alcools et les anhydrides donnent tous ce genre de pic. • Les triples liaisons C≡C et C≡N absorbent autour de 2100 à 2260 cm-1 ; leurs pics sont petits mais visibles. • Un groupement méthyle peut être identifié avec l’absorption de C–H vers 1380 cm-1 . Cette bande est divisée en un doublet pour les groupes isopropyles (aussi parfois appelés gem-diméthyles, c’est-à-dire ayant deux groupes méthyles sur le même carbone). • La structure de composés aromatiques peut aussi être confirmée à partir d’un patron de faibles bandes harmoniques et de combinaisons trouvées vers 2000 à 1600 cm-1 .
    • Université Virtuelle Africaine 89 Unité V Spectroscopie moléculaire II : Résonance magnétique nucléaire (RMN) Résumé de l’activité d’apprentissage À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : • Expliquer le phénomène de résonance magnétique nucléaire • Réviser les propriétés nucléaires démontrées par la RMN • Expliquer le phénomène de RMN du proton (HRMN) • Corréler les fréquences spécifiques d’absorption HRMN aux groupes fonc- tionnels moléculaires • Corréler les fréquences spécifiques d’absorption HRMN à la structure molé- culaire de molécules organiques simples. • Expliquer les particularités du phénomène de RMN du carbone-13 • Réviser la nature des informations fournies par une RMN du carbone-13 • Réviser les parties d’un spectromètre à RMN moderne et leurs fonctions Liste des lectures obligatoires http://www.scienceofspectroscopy.info/edit/index.php?title=NMR_Spectros- copy http://en.wikipedia.org/wiki/NMR_spectroscopy#Chemical_Shift http://www.mhhe.com/physsci/chemistry/carey/student/olc/ch13nmr.html#basi Liste de liens utiles pertinents ttp://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/uvvisab4.htm http://www.scienceofspectroscopy.info/edit/index.php?title=UV-Visible_Spec- troscopy http://www.scienceofspectroscopy.info/edit/index.php?title=UV_Absorption_Ta- ble- non open source UV visible http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Spectrophotometry/ http://www.chem.ucla.edu/cgi-bin/webspectra.cgi?Problem=bp1&Type=C http://www.chem.ucla.edu/~webspectra/search.html
    • Université Virtuelle Africaine 90 Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, plus couramment appelée spec- troscopie RMN est le nom donné à la technique qui exploite les propriétés magnétiques de certains noyaux atomiques. Les plus importantes applications pour les chimistes organiques sont la spectroscopie RMN du proton et du carbone 13. On peut obtenir plusieurs types d’informations à partir d’un spectre RMN. Encore plus que l’utilisation de l’IR pour identifier des groupements fonctionnels moléculaires, l’analyse d’un spectre RMN fournit de l’information sur le nombre et le genre des entités chimiques dans la molécule. La RMN peut être appliquée à une grande variété d’échantillons, autant en solution qu’à l’état solide. Dans cette unité, la RMN du proton est introduite et ses applications dans l’identifi- cation de composés organiques sont mises en évidence. Phénomène de la RMN Les noyaux possèdent un spin mécanique, ou moment angulaire. Le moment angulaire total dépend du spin nucléaire, ou nombre de spin, lequel peut avoir les valeurs 0, ½, 1, 3/2, selon le noyau considéré. La valeur numérique du nombre de spin est reliée au nombre de masse et au numéro atomique du noyau. Nombre de masse Numéro atomique Nombre de spin Impair Pair ou impair ½ , 3/2 , 5/2... Pair pair 0 Pair Impair 1, 2, 3… Le noyau tourne autour de son axe (spinning) et cela crée en un champ magnétique autour du noyau. Ainsi, le noyau devient un petit aimant de moment magnétique µ. Chaque noyau pour lequel I > 0 aura alors un moment magnétique caractéristique.
    • Université Virtuelle Africaine 91 Évaluation formative 1) Dites ce qui fait distingue le moment magnétique nucléaire du nombre de spin nucléaire. 2) Lesquels, parmi les noyaux suivants ont un moment magnétique? a) Oxygène, nombre de masse 16, numéro atomique 8 b) Carbone, nombre de masse 12, numéro atomique 6 c) Azote, nombre de masse 14, numéro atomique 7 d) Carbone 13 e) proton RMN du proton (HRMN) Les noyaux les plus utiles pour la RMN organique sont le proton (nombre de masse 1, numéro atomique 1) et le carbone 13, parce qu’ils sont présents dans plusieurs composés organiques. Le proton a un nombre de spin de ½ ; le noyau magnétique peut donc prendre n’im- porte quelle orientation (2I +1), de - ½ à ½ par sauts de 1 selon la direction du champ magnétique appliqué. Un proton de I = ½ pourra donc prendre seulement une des deux orientations possibles qui correspond aux niveaux d’énergie de ±µH dans un champ magnétique donné, où H est la force du champ magnétique extérieur. Ainsi, ces niveaux d’énergie sont dits quantiques. Figure 26 : Résonance magnétique nucléaire (RMN)
    • Université Virtuelle Africaine 92 Un proton dans un champ magnétique externe statique ne peut avoir deux orienta- tions correspondant aux énergies de ±µ. L’orientation de basse énergie correspond à l’état dans lequel le moment nucléaire magnétique est aligné parallèlement au champ magnétique externe, et l’orientation de haute énergie est l’état où le moment magné- tique est aligné de façon anti-parallèle (opposé) au champ magnétique appliqué. Il est possible de faire des transitions entre ces deux orientations ; la fréquence ν de la radiation électromagnétique nécessaire pour une telle transition est donnée par ν = -(2μHo )/h où Ho est la force du champ magnétique externe, et h est la constante de Planck. Notez que, contrairement aux absorptions en UV et en IR, la fréquence de cette absorption est dépendante du champ magnétique appliqué. Les transitions induites par la radiation obéissent aux règles suivantes : 1) La probabilité d’une transition vers le haut par absorption d’énergie du champ magnétique est exactement égale à la probabilité d’une transition vers le bas par un processus provoqué par le champ. 2) Les transitions spontanées d’un état de plus haute énergie vers un niveau de plus basse énergie sont négligeables. Effets non-radiatifs Les effets de radiation seuls ne produisent pas de RMN observable. Toutefois, il y a deux effets non-radiatifs qui peuvent avoir lieu, dont un qui rend la RMN possible. 1) Deux noyaux voisins peuvent échanger un spin, ainsi l’un devient parallèle et l’autre, anti-parallèle. Ceci est appelé relaxation spin-spin. 2) Un effet de réseau résultant de l’agrégation de tous les autres noyaux présents qui ont des transitions énergétiques variées peut survenir ; ainsi quelques noyaux anti-parallèles peuvent perdre de l’énergie et devenir parallèles. Cela fait que les noyaux de plus faible énergie sont légèrement en excès, quelques noyaux de ce groupe (en excès) vont absorber de l’énergie et ainsi produire un phénomène de RMN. Glissement chimique (ou déplacement chimique) Ce ne sont pas tous les atomes d’hydrogène d’une molécule qui absorberont exac- tement à la même fréquence ν. L’effet magnétique senti par un noyau hydrogène, donné par Heff = Ho - δHo . δHo est appelé déplacement chimique et mesure l’effet électronique des atomes avoisinants d’un proton donné. Le paramètre de déplacement, δ, est défini ainsi : ∆ ν = fréquence du proton – fréquence du standard (TMS, tétraméthylsilane) Comme on ne peut obtenir que des valeurs d’absorptions relatives, un standard est utilisé. Les valeurs du déplacement chimique des protons dans un composé particulier sont alors déterminées en référence à ce standard. On peut utiliser le standards de deux façons : comme une référence externe (le standard est habituellement placé dans un petit capillaire contenu dans le tube d’échantillon) ou encore comme référence interne (le standard est dissous dans la solution d’échantillon à mesurer). La RMN du proton moderne utilise le tétraméthylsilane (TMS) comme standard.
    • Université Virtuelle Africaine 93 Corrélation de la HRMN avec la structure moléculaire Les fréquences de résonance du proton peuvent être mesurées avec une précision d’environ ± 0,02 ppm relativement à un standard interne. La figure 26 ci-dessous fournit une corrélation générale du type de structure avec la position d’absorption. Les groupes fonctionnels listés dans la figure 26 sont liés aux atomes de carbones saturés. Toutes les valeurs d’absorption écrites ici sont des valeurs de δ. Figure 27 : Paramètres de déplacement chimique de différents atomes d’hy- drogène Effet inductif et électronégativité Les électrons autour du proton créent un champ magnétique qui est opposé au champ magnétique appliqué. Les groupes électronégatifs liés au système C–H diminuent la densité d’électrons autour des protons, ainsi il y a moins de blindage (déblindage), donc le déplacement chimique augmente. Ces effets sont cumulatifs, ainsi plus il y a de groupes électronégatifs, plus il y a de déblindage et plus les déplacements chimiques sont importants. Ces effets inductifs ne sont pas seulement ressentis par les protons immédiatement adjacents, car la rupture de la densité électronique a une influence sur une grande portion de la chaîne. Toutefois, l’effet diminue rapidement à mesure que l’on s’éloigne du groupement électronégatif.
    • Université Virtuelle Africaine 94 Interactions spin-spin L’énergie impliquée pour la transition d’un spin donné est presque la même pour chaque proton d’une molécule. Les bandes d’absorption, mesurées selon la surface qu’elles couvrent, sont le rapport du nombre de protons dans chaque groupe. Le spec- tre à basse résolution de l’éthanol (figure 26) montre trois pics d’absorption dans un rapport de surface 1 : 2 : 3, correspondant à –OH, –CH2 –, et –CH3 , respectivement. Figure 28 : Spectre RMN à basse résolution de l’éthanol À de plus hautes résolutions, les pics de l’éthanol attribués aux protons des groupe- ments méthylène et méthyle paraissent comme des mutiplets. L’absorption du méthyle (CH3 ) est divisée en trois surfaces relatives 1 : 2 : 1 et celle du méthylène (CH2 ) est divisée en quatre pics 1 : 3 : 3 : 1. Cela s’explique par le fait que CH3 interagit avec CH2 en le séparant en 4 et le groupe méthylène interagit avec le groupement CH3 en le divisant en 3. Cet effet est appelé les interactions spin-spin. L’ampleur des multiples séparations résultant des interactions spin-spin est fonction de la force du champ magnétique appliqué.
    • Université Virtuelle Africaine 95 Figure 29 : Spectre RMN de haute résolution de l’éthanol Liaison hydrogène Les protons impliqués dans la liaison hydrogène (habituellement –OH ou –NH) sont typiquement observés sur une grande étendue de valeurs. Plus il y a de liaisons hydrogène, plus le proton est déblindé et plus haute sera son déplacement chimique. Toutefois, puisque le nombre de liaisons hydrogène est influencé par des facteurs tels que la solvatation, l’acidité, la concentration et la température, il peut être souvent difficile à prédire. Spectroscopie RMN du carbone La puissance et l’utilité de la spectroscopie HRMN en tant qu’outil pour l’analyse structurale sont très importantes. Malheureusement, quand des portions significatives d’une molécule ne contiennent pas de liaisons C–H, il n’en sort pas d’information très utile. Par exemple, les composés polychlorés tels que le chlordane, les composés po- lycarbonylés comme l’acide croconique et les composés possédant des triples liaisons (pour ces trois types d’exemples, voir les carbones en orangé dans les structures de la figure ci-dessous). Figure 30 : Molécules dont les structures ne peuvent être identifiées par HRMN.
    • Université Virtuelle Africaine 96 Même lorsque de nombreux groupements C–H sont présents, interpréter sans ambi- guïtés un spectre de HRMN n’est pas toujours possible. Le diagramme suivant illustre trois paires d’isomères (A et B), lesquels montrent des spectres HRMN similaires. Même si la détermination précise des déplacements chimiques devrait permettre de distinguer la première paire de composés, la deuxième et la troisième paires (encadrées en rouge et vert) pourrait être difficiles à identifier par cette seule technique. Figure 31 : Molécules qui pourraient ne pas être distinguées par HRMN Ces difficultés pourraient être facilement résolues si les atomes de carbone d’une molécule pouvaient être détectés au même titre que les atomes d’hydrogène. Puis- que l’isotope majeur du carbone (12 C), ne possède pas de spin, cette option n’est pas réaliste. Heureusement, le carbone possède deux isotopes stables dans la nature, dont 1,1% de carbone 13 C. Ce dernier a un spin I = ½ et donc, en principe, il devrait être possible de mener une expérience de RMN de carbone. Si l’isotope 13 C était natu- rellement plus abondant dans tous les composés, la RMN de proton deviendrait bien plus compliquée à cause du couplage fréquent de 13 C et de 1 H en liaisons simples. Problèmes techniques associés à la RMN du carbone : 1. L’abondance de 13 C dans un échantillon est très faible (1,1%), ainsi des échan- tillons plus concentrés sont requis. 2. Le noyau de 13 C est plus de cinquante fois moins sensible qu’un proton dans l’expérience de RMN, cette difficulté s’ajoutant à la précédente. 3. Les atomes H liés à l’atome de 13 C divisent son signal RMN de 130 à 270 Hz, compliquant le spectre. Ces problèmes peuvent être résolus au moyen de deux techniques : Le découplage hétéro-nucléaire lors duquel les signaux de découplage par l’hydrogène nucléaire sont retirés du spectre de carbone ainsi que la technique d’impulsion dans laquelle une impulsion est utilisée pour recueillir plusieurs signaux d’un seul atome de carbone sont des méthodes additives pour donner un signal plus fort.
    • Université Virtuelle Africaine 97 Lorsqu’acquis de cette manière, le spectre RMN du carbone d’un composé montre un unique signal net pour chaque carbone structuralement distinct dans une molécule (rappel : les couplages avec protons ont été enlevés du spectre). Le spectre du cam- phre, indiqué ci-dessous, est un exemple typique. Une comparaison avec le spectre HRMN pourrait permettre de voir les caractéristiques avantageuses de la RMN du carbone. La dispersion des déplacements chimiques de 13 C est près de vingt fois plus grande que pour les protons, et cela ajouté au manque de signaux de découplage fait en sorte que chaque carbone structuralement distinct produira vraisemblablement un signal individuel. Les seuls signaux clairement identifiables dans le spectre de RMN du proton sont ceux des groupements méthyles. Les protons restants ont des signaux de résonance entre 1,0 et 2,8 ppm relativement au TMS et ils se chevauchent mal à cause du découplage spin-spin. Figure 32 : RMN du carbone 13 du camphre Contrairement à la HRMN, la force relative des signaux de RMN du carbone n’est pas normalement proportionnelle au nombre d’atomes générant chacun de ces signaux. À cause de cela, le nombre de signaux distincts et leurs déplacements chimiques sont les informations les plus importantes fournies par un spectre de carbone. La distribution générale des déplacements chimiques du carbone associée aux différents groupes fonctionnels est résumée dans la chartre ci-dessous. Gardez à l’esprit que ces inter- valles de valeurs sont des estimations, et peuvent ne pas englober tous les composés d’une classe donnée. Notez aussi que l’étendue sur plus de 200 ppm de valeurs de déplacements chimiques montrée ici est bien plus grande que celle observée pour les déplacements de l’hydrogène.
    • Université Virtuelle Africaine 98 Intervalles de déplacements chimiques du 13 C* (à champ magnétique faible) *Pour des échantillons en solution de CDCl3 . L’échelle de δ est relative au TMS, pour lequel δ = 0. Figure 33 : Intervalles de déplacements chimiques
    • Université Virtuelle Africaine 99 Évaluation formative 1) Le spectre à 60 MHz montré en figure 32 est celui du C10 H13 NO2 . Les ca- ractéristiques significatives du spectre IR sont l’élongation C═O et un pic d’élongation N–H. Déduisez la structure de ce composé à partir des données de déplacements chimiques, de courbe d’intégration et de couplages du spec- tre. Figure 34 : C10 H13 NO2 2) Le spectre RMN du carbone 13 d’un des isomères de l’acétate de butyle (C4 H9 OCOCH3 ) a montré des signaux à δ 22, 28, 80 et 170. Quelle est sa structure ? Pourquoi l’intensité du pic à δ28 est-elle beaucoup plus intense que celle à δ22 (d’un facteur d’environ huit) ? Comment la multiplicité et l’intensité du signal sur un spectre HRMN de ce composé confirmeraient vos déductions ?
    • Université Virtuelle Africaine 100 Unité VI Spectrométrie de masse Résumé de l’activité d’apprentissage À la fin de cette unité, les lecteurs seront capables de : • Expliquer comment se produit le phénomène du spectre de masse • Expliquer les règles suivies par la fragmentation dans un spectre de masse • Faire la corrélation entre le spectre de masse et des éléments structurels spé- cifiques dans une molécule • Utiliser un spectre de masse pour identifier différentes catégories de molécu- les • Utiliser un spectre de masse à haute résolution et un calculateur de masse moléculaire afin d’identifier des éléments structurels • Réviser les différentes parties d’un spectromètre de masse et leurs fonctions Liste des lectures obligatoires http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/spectro.htm#contnt http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng Liste de liens utiles pertinents http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Mass_Spec/index.html/ Spectrométrie de masse Un spectromètre de masse identifie les composés en l’ionisant et en le brisant en morceaux appelés fragments (ou ions-fragments), et en analysant ces fragments en les faisant passer à travers un analyseur. L’analyseur classe les ions-fragments selon les rapports de leur masse à leur charge. Les résultats de l’analyseur sont donnés sous forme d’un spectre de masse. Un petit échantillon du composé est ionisé, habituellement en cations, par arrachement d’électrons (par la source d’ions). Les ions sont classés et séparés selon leur masse et leur charge (par l’analyseur de masse). Les ions séparés sont ensuite détectés et comptés, et les résultats sont affichés sur un ordinateur. Parce que les ions sont très réactifs (ils peuvent réagir avec les molécules environ- nantes), l’ionisation et l’analyse se font dans une enceinte où l’on réalise un vide poussé.
    • Université Virtuelle Africaine 101 Source d’ions Dans la source d’ions, les molécules de l’échantillon sont bombardées par des électrons de haute énergie venant d’un filament chauffé et accélérés par un champ électrique. Les ions formés à la suite de ce bombardement sont pris à part par une plaque attractive chargée, et accélérés vers d’autres électrodes qui ont des fentes où les ions passent sous forme de faisceau. Quelques-uns de ces ions se fragmentent en cations plus petits ou en fragments neutres. Par la suite, la molécule donne un grand nombre de cations qui forment un faisceau ionique. Isotopes Puisque le spectromètre de masse sépare et détecte des ions de différentes masses, il distingue facilement les différents isotopes d’un élément donné. Cela se manifeste plus explicitement pour les composés contenant du brome et du chlore, tel qu’illustré dans les exemples suivants. Puisque les molécules de brome ont seulement deux atomes, le spectre de gauche sera surprenant si l’on s’attendait à une masse atomique unique de 80 unités de masse atomique (u.m.a.) pour le brome. Les cinq pics du spectre montrent clairement que le brome, dans la nature, consiste en un mélange de presque moitié-moitié d’isotopes de masses de 79 et 81 respectivement. Ainsi, la molécule de brome peut être composée de deux atomes 79 Br (masse de 158 u.m.a.), de deux atomes de 81 Br (162 u.m.a.) ou encore de la combinaison la plus probable : 79 Br-81 Br (160 u.m.a.). La fragmentation du Br2 en deux cations de brome donne alors deux pics de taille égale à 79 et à 81 u.m.a. Dibrome (Br2 ) Chrorure de méthylène Chlorure de vinyle (chloroéthylène) Figure 35 : Spectre de masse du brome, du chlorure de méthylène et du chlorure de vinyle
    • Université Virtuelle Africaine 102 Le deuxième et le troisième spectre montrent que le chlore est aussi composé de deux isotopes, le plus abondant ayant une masse de 35 u.m.a, et l’isotope mineur ayant une masse de 37 u.m.a. La composition isotopique précise de ces deux halogènes est la suivante : Chlore :   75,77 % 35 Cl et 24,23 % 37 Cl Brome :   50,50 % 79 Br et 49,50 % 81 Br La présence de chlore ou de brome au sein d’une molécule ou d’un ion est facilement détectée en observant l’intensité des rapports des ions différant de 2 unités de masse. Dans le cas du chlorure de méthylène, l’ionisation moléculaire consiste en trois pics de rapports m/z de 84, 86 et 88 unités de masse, et leurs intensités décroissantes peuvent être calculées à partir des abondances naturelles en pourcentages mentionnées ci-haut. La perte d’un atome de chlore donne lieu à deux ions-fragments isotopiques à m/z = 49 et 51 u.m.a., ce qui montre clairement la présence d’un seul atome de chlore (84-35=49, par exemple). Le fluor et l’iode, au contraire, sont mono-isotopiques. Ils ont des masses de 19 et de 127 u.m.a. respectivement. Remarquez que la présence d’halogènes au sein d’une molécule ou d’un ion-fragment ne change pas la règle de masse pair-impair mentionnée plus haut. Deux autres éléments communs ont des signatures isotopiques utiles : le carbone, dont 1,1 % de l’abondance naturelle est sous forme de 13 C, et le soufre, qui a les isotopes 33 S et 34 S présents naturellement à 0,76 % et 4,22 % respectivement. Par exemple, le petit pic m/z = 99 dans le spectre du 4-méthyl-3-pentène-2-one est causé par la présence d’un unique atome de 13 C dans la molécule. Bien que de moindres importances, 15 N et 18 O apportent aussi une mince contribution à la masse des ions satellites contenant ces éléments. Patrons de fragmentation La nature des fragments fournit un indice de la structure moléculaire, mais si l’ion moléculaire (pic majoritaire) a une durée de vie de moins de quelques microsecon- des, il sera impossible de l’observer. La plupart des composés organiques donnent des spectres de masses qui incluent l’ion moléculaire. Il est possible de changer les conditions d’ionisation afin de parvenir à observer l’ion moléculaire pour les com- posés où celui-ci ne sort pas sur le spectre. Parmi les composés organiques simples, les ions moléculaires les plus stables sont ceux provenant de composés aromatiques (cycliques), de systèmes conjugués π- électrons et de cycloalcanes. Les alcools, les éthers et les alcanes hautement ramifiés montrent une grande tendance à se fragmenter. Les fragments stables apparaîtront dans le spectre final.
    • Université Virtuelle Africaine 103 Hydrocarbures Le spectre de masse du dodécane illustre le comportement d’un alcane non ramifié. Puisqu’il n’y a pas d’hétéroatomes dans cette molécule, il n’y a pas d’électrons de valence non-liants. En Conséquence, le caractère du radical cationique de l’ion moléculaire (m/z = 170) est délocalisé sur tous les liens covalents. La fragmentation des liaisons C–C a lieu parce que ces liaisons sont généralement plus faibles que les liaisons C–H, et cela produit un mélange de radicaux alkyles et de carbocations alkyles. La charge positive réside normalement sur le fragment le plus petit, une série homologue de cations hexyles (m/z = 85), pentyles (m/z = 71), butyles (m/z = 57), propyles (m/z = 43), éthyles (m/z = 29) et méthyles (m/z = 15) est donc observée. Ces cations sont accompagnés d’une série des carbocations alcényles correspondant (m/z = 55, 41 et 27) formés par la perte de 2 H. Tous les ions-fragments significatifs de ce spectre sont des ions à nombre pair d’électrons. Dans la plupart des spectres d’alcanes, les ions propyle et butyle sont les plus abondants. Hétéroatomes La présence d’un groupement fonctionnel, plus particulièrement si celui-ci possède un hétéroatomeYsans électron de valence non-liant (Y= N, O, S, X etc.), peut altérer dramatiquement le patron de fragmentation d’un composé. Cette influence est présu- mée se produire à cause de la « localisation » de la composante radical-cation de l’ion moléculaire sur l’hétéroatome. Après tout, il est plus facile d’enlever (d’ioniser) un électron non-liant qu’un électron impliqué dans une liaison covalente. En localisant la partie réactive, certains processus de fragmentation seront favorisés. Ceux-ci sont résumés dans le diagramme ci-dessous, où l’encadré vert du haut montre des exemples de tels ions moléculaires « localisés ». Les deux premières voies de fragmentation mènent à des ions à nombre pair d’électron et la troisième voie, l’élimination, mène à un ion avec un nombre impair d’électrons. Notez l’utilisation de différentes flèches courbées démontrant le déplacement d’un unique électron comparativement aux déplacements de paires d’électrons.
    • Université Virtuelle Africaine 104 Figure 36 : Clivages d’hétéroatomes. Adapté de Spectroscopy http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spec- trpy/spectro.htm# Dernier accès en février 2008. Les distributions de charges montrées ci-dessus sont courantes, mais pour chaque pro- cessus de fragmentation la charge peut quelquefois être portée par d’autres composés (neutres), et les deux types d’ions sont observés. Des trois réactions de fragmentation décrites ici, l’alpha- fragmentation est généralement favorisée pour les composés azotés, oxygénés et sulfurés. En effet, dans le spectre du 4-méthyl-3-pentène-2-one et du N,N-diéthylméthylamine montrés précédemment, les ions-fragments majeurs viennent d’alpha-fragmentation. Plus d’exemples de l’influence des groupes fonc- tionnels sur la fragmentation sont fournis par une sélection de composés qui peuvent être examinés en cliquant le bouton de gauche plus bas. Spectre « empreinte digitale » La complexité des patrons de fragmentation a mené à des spectres de masse utilisés en tant qu’empreintes digitales pour identifier des composés. L’identification de polluants environnementaux, de résidus de pesticides sur les aliments et de substances illicites sont quelques exemples de cette application. Des échantillons extrêmement petits d’une substance inconnue (un microgramme ou moins) sont suffisants pour une telle analyse. Le spectre de masse de la cocaïne ci-dessous montre comment un laboratoire médicolégal peut déterminer la nature d’un échantillon de drogue inconnu. Même si une fragmentation considérable s’est produite au sein des molécules, plusieurs des ions les plus abondants (identifiés par les numéros en magenta) peuvent être reconnus à l’aide des trois mécanismes de clivages expliqués plus haut.
    • Université Virtuelle Africaine 105 Figure 37 : Spectre de masse « empreinte digitale » de la cocaïne. Les ions-fragments à nombre impair d’électrons sont souvent formés par des réarran- gements caractéristiques dans lesquels les fragments neutres stables sont perdus. Les mécanismes pour quelques-uns de ces réarrangements ont été identifiés en suivant le cours d’isotopes marqués dans les ions moléculaires. Évaluation formative 1) Un composé organique A est composé de carbone, d’hydrogène et d’azote, le carbone constituant 60 % de la masse. Le spectre de masse montre un ion mo- léculaire à m/z = 112 u.m.a. Répondez aux questions suivantes : a) Écrivez une formule moléculaire plausible pour le composé A : C H N b) Combien de cycles et de doubles liaisons doivent être présents dans le composé A ? 2) Un autre composé, nommé B, contient du carbone, de l’hydrogène et de l’oxy- gène. Son spectre de masse montre également un ion moléculaire à m/z = 112 u.m.a. a) Écrivez une formule moléculaire plausible pour le composé B, sachant que ce composé contient des triples liens, mais pas de cycles : C H O 3) Les composé C est composé seulement de carbone, d’oxygène et d’hydrogène, et montre un ion moléculaire à m/z = 180 u.m.a. sur le spectre de masse. Le carbone compte pour 60 % de la masse moléculaire. a) Écrivez une formule plausible pour le composé C : C H O b) Combien de cycles et de doubles liaisons doivent être présents dans le composé C ?
    • Université Virtuelle Africaine 106 XV. Synthèse du module Dans l’unité I, les méthodes de séparation enseignées à l’école, qui sont l’extraction au solvant et la distillation, ont été approfondies. Pour chacune, les techniques ont été définies, les conditions d’application de chaque méthode ont été explicitées et les équipements nécessaires pour exécuter chacune sont aussi présentés. Plus loin dans l’unité, les techniques de chromatographie sont introduites en débutant par la théorie générale, incluant différents types d’élutions (développements). Les principaux types de chromatographie ont été introduits, incluant la chromatographie sur papier, sur couche mince ; l’équipement nécessaire à leur exécution a aussi été étudié. Ensuite, la chromatographie sur colonne a été introduite, l’instrumentation également étudié, incluant différents types de colonnes et de détecteurs. Dans la dernière partie du mo- dule, la chromatographie liquide a été abordée, et la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) présentée en détails incluant diverses applications de celles-ci, l’instrumentation nécessaire et les méthodes majeures de séparation par CLHP. Dans l’unité II, les techniques électrochimiques les plus courantes sont introduites, La partie relative à la potentiométrie englobe la théorie de la potentiométrie et ses applications pour la mesure du pH utilisant l’électrode de verre, l’électrode sélec- tive ionique ou l’électrode rédox, en mettant l’accent sur leur application dans les stations de titrage automatiques. La seconde partie de l’unité discute différentes techniques de voltampérométrie en débutant par une revue générale de la théorie de voltampérométrie, suivie par les techniques de polarographie basées sur l’électrode à gouttelettes de mercure. L’unité se termine par une discussion sur les techniques de voltampérométrie cyclique et à redissolution anodique. Les techniques de spectroscopie et de spectrométrie atomique sont le sujet de l’unité III. La spectroscopie est introduite avec un rappel des différentes composantes du spectre électromagnétique, leurs énergies relatives, les termes communs en spectros- copie et les unités de mesures. L’interaction entre le rayonnement et la matière est étudiée en profondeur ainsi que l’utilisation de ces techniques pour l’analyse qualita- tive et quantitative autant en spectroscopie moléculaire et qu’atomique. La dernière définit trois méthodes majeures de spectroscopie atomique, le phénomène menant à leur existence, et comment elles peuvent être utilisées pour l’analyse qualitative et quantitative. L’unité se termine en faisant un survol de l’instrumentation. Spectroscopie moléculaire I discute de la spectroscopie UV-visible et IR, en débutant par les phénomènes de base de chacune. Les transitions électroniques donnant lieu aux spectres UV-visibles sont étudiées, ainsi que la corrélation possible avec les groupes fonctionnels spécifiques. Les facteurs affectant l’absorption des différents groupe- ments sont identifiés. Des exemples d’utilisation de la spectroscopie UV-visible en identification structurale sont présentés. Cette étude se termine par l’application de cette technique en analyse quantitative et par l’instrumentation nécessaire. La dernière partie de l’unité présente la spectroscopie IR et le phénomène la sous-tendant. Ceci est
    • Université Virtuelle Africaine 107 suivi de l’étude des pics d’absorption typiques des groupements majeurs fonctionnels ainsi que la corrélation entre le spectre IR et la structure moléculaire. Spectroscopie moléculaire II se rapporte à la résonance magnétique nucléaire. L’unité débute par la description du phénomène de RMN, les propriétés nécessaires pour qu’un noyau puisse être utilisé en RMN et les influences de l’environnement structurel sur la technique. L’unité inclut l’explication de la corrélation de la RMN du proton avec les éléments fonctionnels spécifiques de la molécule, les interactions spin-spin, et la corrélation entre l’amplitude des pics et le nombre d’atome d’hydro- gènes ainsi que la relation entre la position des pics, l’environnement moléculaire et les groupes fonctionnels. L’unité aborde ensuite la RMN du carbone 13 en mettant l’accent sur la technique en elle-même, sur ses limites en ce qui a trait à l’information fournie, et comment la RMN du carbone-13 peut être un complément de la RMN du proton dans la déter- mination de la structure d’une molécule. La spectrométrie de masse débute avec les principes sous-tendant cette technique, et la manière d’obtenir un spectre. Ceci est suivi par les règles de fragmentation, comment la présence d’isotopes affecte cette dernière et pour finir, on discute de la corrélation entre les pics du spectre et la structure de la molécule étudiée.
    • Université Virtuelle Africaine 108 XVI. Évaluation sommative 1) Calculez l’énergie des photons pour un rayonnement de longueur d’onde de : a) 635 nm (dans le visible) b) 18, nm (dans l’ultra-violet) c) 58,6 mm (dans l’infra-rouge) 2) Le spectre RMN du carbone 13 d’un des isomères de l’acétate de butyle (C4 H9 O- COCH3 ) a montré des signaux à δ 22, 28, 80 et 170. Quelle est sa structure ? Pourquoi l’intensité du pic à δ28 est-elle beaucoup plus intense que celle à δ22 (d’un facteur d’environ huit) ? Comment la multiplicité et l’intensité du signal sur un spectre HRMN de ce composé confirmeraient vos déductions ? 3) Pour une séparation chromatographique typique donnant des pics nets (résolution ligne de base = 1,5), sachez que N = 3600, k’= 2, et a = 1.15. Indiquez les effets obtenus si l’on change ces paramètres, un à la fois : a) N = 1600 b) k' = 0,8 c) a = 1,10 4) Afin de réduire la hauteur des plateaux théoriques et d’améliorer la résolution, quels moyens peut-on prendre ? Quels inconvénients viennent avec chaque approche ? 5) a) Pourquoi les spectres atomiques sont-ils différents des spectres moléculaires ? b) Pourquoi les spectres atomiques de Ca° et de Ca+ sont-ils différents ? c) Quelle différence y a-t-il entre la spectroscopie atomique d’émission et la spectroscopie atomique d’absorption ?
    • Université Virtuelle Africaine 109 6) Un liquide ayant une plaisante odeur sucrée (point d’ébullition = 101°C) donne le spectre IR ci-dessous et le spectre MS montré un peu plus bas. Déterminez la structure de ce composé.
    • Université Virtuelle Africaine 110 7) Pour chacun des composés A à F, indiquez le nombre de groupes carbone structuralement distincts, et également le nombre de groupes distincts d’atomes d’hydrogènes équivalents. Entrez un nombre de 1 à 9 dans chacune des boîtes à cet effet.   A Nombre d’atomes de carbone distincts : Nombre de groupes distincts d’hydrogène : B Nombre d’atomes de carbone distincts : Nombre de groupes distincts d’hydrogène : C Nombre d’atomes de carbone distincts : Nombre de groupes distincts d’hydrogène : D Nombre d’atomes de carbone distincts : Nombre de groupes distincts d’hydrogène : E Nombre d’atomes de carbone distincts : Nombre de groupes distincts d’hydrogène : F Nombre d’atomes de carbone distincts : Nombre de groupes distincts d’hydrogène :
    • Université Virtuelle Africaine 111 XVII. Auteur du module Vincent Makokha a fait ses études à l’Université Makerere (Makerere University Kampala). Il y a obtenu un diplôme de baccalauréat en sciences (B.Sc.) en chimie industrielle en 1991 ainsi qu’un diplôme de maîtrise (M.Sc.) en chimie analytique en 2000. Il a ensuite travaillé en industrie et dans diverses organisations industrielles et en recherche en tant que spécialiste en chimie analytique. Plus tard, il a rejoint l’Université Kyambogo où il enseigne la chimie théorique et pratique. Vincent est marié à Florence ; ils ont deux enfants nommés Collette et Vivienne. Trucs d’apprentissage Ce module a pour but de présenter aux apprenants les techniques analytiques instru- mentales en chimie les plus courantes. Les trois objectifs principaux sont : • Faire connaître les principes sous-tendant ces techniques analytiques • Apporter les habiletés nécessaires pour l’interprétation des données analytiques générées par les divers instruments • Permettre aux apprenants de mettre à profit leurs nouvelles connaissances et habiletés en s’exerçant à l’aide de résolution de problèmes de chimie. Pour les étudiants qui n’en sont pas encore aux études graduées, il peut être ardu de composer avec le niveau de complexité des informations et habiletés de ce module. Pour ce module, maintes ressources sont suggérées et plusieurs d’entre elles sont dédiées à la pratique professionnelle et les étudiants gradués et sont donc plus ou moins pertinentes pour nous. Le matériel d’étude a donc été sélectionné et présenté dans une forme simple afin de fournir une connaissance efficace de la matière à l’étude, laissant la possibilité aux étudiants très enthousiastes d’approfondir leurs connaissances tout en ne désarçonnant pas l’étudiant moyen. Le support de base à l’enseignement est le matériel présenté dans le module, lequel forme le squelette du cours. Les textes recommandés et les ressources en ligne sont nécessaires pour approfondir les connaissances reliées au module, car elles fournissent plus de détails et des pratiques supplémentaires aux apprenants. La tâche principale du professeur de formation en ligne est d’encourager l’apprenant et de le faire progresser à travers chacune des activités d’apprentissage. Chaque unité devrait être examinée en entier et maîtrisée avant le passage à l’unité suivante. Le matériel d’étude devrait préférablement être traité dans l’ordre de présentation du module.
    • Université Virtuelle Africaine 112 XIII. Références 1. Crow D.R. : Principles and applications of Electrochemistry Chapman and Hall, 2nd Edition 1996 2. Galen Wood Ewing Instrumental methods of chemical analysis Publisher: MacgrawHill. 1986 3. Braun. D Robert Introduction to chemical Analysis Publisher: McGrawHill 1st Edition 1982. 4. Heslop R.B, Wild Gillian M.. S I Units in chemistry Applied Science Pu- blishers, 1971. 5. Hobarth Willard, Lynne Merritt, John Dean, and Frank Settle, Instrumental Methods ofAnalysisWadsworth Publishing Company; 7 Sub edition (February 1988) XIX. Structure du document Document Microsoft Word : Procédés de séparation et techniques électro-analytiques et spectrochimiques - version finale.doc Document en format PDF : Procédés de séparation et techniques électro-analytiques et spectrochimiques - version finale.pdf Spectométrie d’absorption atomique (SAA) Instruments en absorption atomique Voltampérométrie cyclique Distillation Spectre électromagnétique Niveaux d’énergie Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie liquide à haute performance (CLHP, HPLC) Spectroscopie infra-rouge Électrodes sélectives ioniques Spectrométrie de masse Potentiométrie Séparation et chromatographie
    • 1 SÉPARATION, TECHNIQUES ÉLECTROANALYTIQUES ET SPECTROMÉTRIQUES Lectures Obligatoires Source: Wikipedia.org
    • 2 Table des matières Chromatographie .............................................................................................................................5 Définitions ....................................................................................................................................5 Étymologie ...................................................................................................................................5 Histoire ........................................................................................................................................5 Principe ........................................................................................................................................6 Exemple : la chromatographie sur papier ....................................................................................7 Étapes d'une analyse quantitative ................................................................................................8 Grandeurs caractéristiques en analyse chromatographique sur colonne ......................................9 Vitesses de déplacement des solutés ..........................................................................................9 Facteur de capacité .................................................................................................................10 Élargissement des bandes et efficacité d'une colonne ..............................................................11 Résolution de la colonne .........................................................................................................12 Méthodes d'optimisation ........................................................................................................12 Chromatographie en phase liquide à haute performance ..................................................................12 Principe .......................................................................................................................................13 Appareillage et fonctionnement ..................................................................................................13 La pompe ................................................................................................................................13 L'injecteur ...............................................................................................................................14 La colonne ...............................................................................................................................14 Le détecteur ............................................................................................................................15 Les différentes phases stationnaires ............................................................................................15 Phase normale .........................................................................................................................15 Phase inverse ..........................................................................................................................15 Paramètres de chromatographie ..................................................................................................16 Caractéristiques géométriques de la phase stationnaire ...........................................................16 Caractéristiques opératoires de la phase mobile .......................................................................16 Grandeurs caractéristiques en chromatographie ..........................................................................17 Spectroscopie infrarouge ................................................................................................................18 Base et théorie ............................................................................................................................18 Préparation de l'échantillon .......................................................................................................19 Méthode classique ......................................................................................................................20
    • 3 Aperçu des longueurs d'ondes d'absorption pour les molécules organiques ...............................21 Usages et applications ................................................................................................................22 Effets isotopiques .......................................................................................................................22 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ...................................................................23 Spectroscopie infrarouge en deux dimensions ............................................................................23 Analyse de corrélation par spectroscopie infrarouge bidimensionnelle ...................................24 Spectroscopie infrarouge bidimensionnelle non-linéaire .........................................................24 Spectroscopie rotationnelle .............................................................................................................25 Comprendre un spectre de rotation .............................................................................................26 Classification des molécules selon leur comportement rotationnel ...........................................26 Structure d'un spectre de rotation ............................................................................................27 Détermination expérimentale des spectres ..................................................................................32 Applications ................................................................................................................................32 Spectrométrie de masse...................................................................................................................33 Structure d'un spectromètre de masse .........................................................................................33 A quoi sert la spectrométrie de masse ? .......................................................................................34 La source d'ionisation ..................................................................................................................36 L'ionisation électronique (EI) ....................................................................................................36 L'ionisation chimique (CI) .........................................................................................................36 L'ionisation par bombardement d'atomes rapides (FAB) ...........................................................37 L'ionisation par électronébulisation (électrospray) (ESI) ............................................................37 L'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) ............................................................38 La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) .....................................................38 L'analyseur ..................................................................................................................................39 L'analyseur quadripolaire .........................................................................................................39 Le piège ionique quadripolaire ("trappe d'ions") .......................................................................41 Le temps de vol ........................................................................................................................41 Le FT-ICR ..................................................................................................................................43 L'orbitrap ................................................................................................................................44 L'analyseur à secteur magnétique ............................................................................................45 Le détecteur ................................................................................................................................47 La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) ..........................................................................47
    • 4 Le triple quadripôle ..................................................................................................................48 MSn en piège quadripolaire ("trappe d'ions") ............................................................................49 Hybride ...................................................................................................................................49
    • 5 Chromatographie La chromatographie est une technique d'analyse qualitative et quantitative de la chimie analytique dans laquelle l'échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile (liquide, gaz ou fluide supercritique) le long d'une phase stationnaire (papier, gélatine, silice, polymère, silice greffée etc). Chaque espèce se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases. La chromatographie est aussi utilisée dans les laboratoires d'analyses médicales par exemple pour évaluer la quantité de vitamines dans le sang. Elle est aussi très utilise dans le domaine sportif pour savoir si un athlète s'est dopé. La chromatographie est également utilisée pour analyser les substances (poudres, liquides...) prélevées sur une scène de crime dans le cadre d'investigations en police scientifique. La chromatographie analytique est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un mélange et apprécier leur concentration. La chromatographie préparative est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de collecter des fractions. Définitions [] Chromatographie : méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. Phase stationnaire : phase fixe soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface plane. Phase mobile : phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, en entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes. Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) d’élution. Étymologie [] Le mot chromatographie vient du grec ancien Khrôma qui signifie "couleur" et Graphein qui signifie "écrire" Histoire []
    • 6 Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1906, le premier à utiliser le terme chromatographie. À partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à partir du grec khrôma- pour couleur et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais cette explication; mais tswett est le mot russe pour « couleur ». En 1952, Martin et Synge reçurent le prix Nobel de chimie pour leur invention de la chromatographie de partage.[1] Principe [] La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation (et éventuellement d'autres renseignements donnés par la détection). Il s'agit de chromatographie analytique. Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions, de les récolter pour les identifier par d'autres techniques: c'est la chromatographie préparative. Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon la nature de la phase mobile :  la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ;  la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ;  la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ;  la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ;  la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais). On peut aussi les nommer selon les interactions développées par la phase stationnaire :  la chromatographie d'adsorption/d'affinité ;
    • 7  la chromatographie de partage ;  la chromatographie à échange d'ions ;  la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL) ;  la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais) ; Ou selon le support de la phase stationnaire :  la chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) : la phase stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou différence de pression ;  la chromatographie planaire[2] (qui recouvre CCM et chromatographie sur papier) : la phase stationnaire est sur la surface d'un support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité. Enfin, un nouveau type de chromatographie commence à trouver des applications : la chromatographie à 2 dimensions. Exemple : la chromatographie sur papier [] schéma d'une chromatographie sur papier Résultat d'une chromatographie de base sur papier filtre. Fait avec des feuilles d'épinard La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit.
    • 8 Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne. Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. La chromatographie sur papier demande un certain temps (généralement plusieurs heures). Une fois l'opération terminée, généralement quand le front de solvant (éluant) est presque arrivé en haut du papier, le papier est retiré de la cuve et on laisse évaporer le solvant. Le résultat est appelé chromatogramme. Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'échantillon. Les substances peuvent être identifiées en calculant la valeur Rf qui peut être comparée à celles se trouvant dans les tables. Cette valeur est calculée de la façon suivante : Rf = (distance parcourue par l'échantillon) / (distance parcourue par le solvant) Il y a plusieurs façons d'identifier les endroits où se trouvent les produits ainsi séparés : 1. les produits sont colorés, il n'y a rien de spécial à faire. 2. les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette. 3. sinon, il faut utiliser un révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les détruisant) et dont le résultat sera coloré. Pour séparer des mélanges complexes de substances similaires, il peut être utile d'employer la chromatographie à deux dimensions. Celle-ci s'effectue en deux étapes entre lesquelles on change de solvant et on tourne le papier de 90°. Les interactions développées par le nouveau solvant seront différentes, ce qui a la séparation dans cette deuxième dimension et permettra une meilleure séparation globale. La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées et redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins. Étapes d'une analyse quantitative [] Cette section est vide, pas assez détaillée ou incomplète. Votre aide est la bienvenue ! 1. Choix de la méthode o Analytes à étudier : nature et nombre o Nombre d’analyses o Exactitude recherchée 2. Échantillonnage 3. Préparation de l’échantillon
    • 9 o Mise en solution o Extraction des analytes de l’échantillon o Concentration o Rendement de l’extraction 4. Éliminer les interférences o Effet de matrice o Purification de l’extrait 5. Analyse chromatographique o Directe o Après traitement (méthylation, sylilation…) o Étalonnage o Linéarité 6. Calcul des résultats o Exactitude o Evaluation d’incertitude Grandeurs caractéristiques en analyse chromatographique sur colonne [] Vitesses de déplacement des solutés [] Le pouvoir séparateur d’une colonne est fonction des vitesses relatives d’élution. Ces vitesses sont donc fonction du coefficient de distribution des solutés entre les 2 phases : Coefficient de distribution : où CS est la concentration du soluté en phase stationnaire et CM la concentration du soluté en phase mobile. Temps de rétention tR : temps qui s’écoule entre l’injection de l’échantillon et l’apparition d’un pic de soluté sur le détecteur d’une colonne chromatographique. Temps mort tM : temps nécessaire pour qu’une espèce non retenue par la phase stationnaire traverse la colonne. Vitesse linéaire moyenne de déplacement du soluté :
    • 10 où L est la longueur de la colonne. Vitesse linéaire moyenne de la phase mobile : Relation entre vitesse de déplacement et coefficient de distribution : où VS et VM sont les volumes de solutés respectivement dans la phase stationnaire et mobile (aussi appelé volume mort), or ces volumes sont proportionnels aux volumes des 2 phases respectivement, ils peuvent donc être estimés si on connaît la structure géométrique de la colonne. Temps réduit t'R : t'R = tR − tM Volume réduit V'R : V'R = VR − VM Débit D : Certains paramètres qui affectent les vitesses relatives des analytes peuvent être modifiés :  Vitesse linéaire de la phase mobile  Coefficient de diffusion dans la phase mobile  Coefficient de diffusion dans la phase stationnaire  Facteur de capacité k’  Diamètre des particules support  Epaisseur de la couche liquide sur la phase stationnaire Facteur de capacité [] Facteur de capacité k' : paramètre expérimental important permettant de décrire la vitesse de progression des solutés dans les colonnes. C’est le rapport des quantités d’un analyte présentes à l’équilibre dans les 2 volumes de phase stationnaire et mobile adjacentes. Le facteur de capacité
    • 11 depend de la température (CPG), du remplissage de la colonne (CPG), de la composition de la phase mobile et stationnaire (HPLC)...  k'<1 : élution trop rapide  1<k'<5 : élution optimale  5<k' : élution trop lente Facteur de sélectivité α : rapport du coefficient de distribution du soluté qui est retenu le plus sur le coefficient de distribution du soluté qui est retenu le moins. Le facteur de sélectivité de deux analytes permet d’estimer à quel point la colonne peut les séparer. Il est donc utilisé pour calculer le pouvoir séparateur d’une colonne. α>1 toujours. Élargissement des bandes et efficacité d'une colonne [] L’efficacité d’une colonne dépend du degré d’élargissement du pic qui se produit à mesure que l’analyte parcourt la colonne. Cet élargissement dépend du temps de séjour de l’analyte dans les 2 phases :  tR grand : pics larges ;  tR petit : pics fins. L’efficacité d’une colonne s’évalue à partir de l’un ou l’autre de ces deux termes :  H = hauteur équivalente à un plateau théorique  N = nombre de plateaux théoriques L’efficacité augmente quand N augmente ou quand H diminue à L constante. σ est la variance, ω est la largeur de la base du pic, δ la largeur du pic à mi-hauteur : et ou L’importance des effets cinétiques sur l’efficacité de la colonne dépend essentiellement de la durée de contact entre la phase mobile et la phase stationnaire, dépendant elle-même de la vitesse d’écoulement de la phase mobile. L’élargissement des pics est minimisé en réduisant la granulométrie du matériau de remplissage et le diamètre de la colonne. En effet la phase
    • 12 stationnaire est granulée et le solvant occupe le volume des interstices, ce volume est appelé volume mort de solvant. H augmente avec ce volume et diminue avec le diamètre de la colonne. Résolution de la colonne [] La résolution RS d'une colonne est la mesure quantitative de son aptitude à séparer deux analytes A et B :  Si RS > 1,5 : séparation complète de A et B  Si : séparation incomplète de A et B  Si RS < 0,75 : analytes A et B mal séparés Remarque : une résolution de 1,5 correspond à un recouvrement des pics de 1%. Lien entre résolution et nombre de plateaux théoriques : Cette relation permet de remarquer que la résolution RS d'une colonne est proportionnelle à la racine carrée de sa longueur car le nombre de pics théoriques N est proportionnel à la longueur L de la colonne. Avec une phase stationnaire donnée on peut améliorer la résolution de la colonne en augmentant le nombre de plateaux théoriques donc en augmentant la longueur de la colonne. Mais ceci augmente la durée de l’analyse, un compromis est donc nécessaire. Méthodes d'optimisation []  Modification de la hauteur équivalent à un plateau théorique (diamètre colonne, granulométrie…)  Modification du facteur de capacité (composition phase mobile, température, solvant…)  Modification du facteur de sélectivité (composition phase mobile, température colonne, composition phase stationnaire, effets chimiques (complexes…) Chromatographie en phase liquide à haute performance La chromatographie en phase liquide à haute performance — CLHP, mais on trouve plus fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) depuis les années 1990 — est une technique de séparation analytique en fonction de l'hydrophobicité et
    • 13 préparative des molécules d'un composé ou un mélange de composés. Pour certains, HP signifie « haute pression ». Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie, ainsi qu'en chimie analytique. Principe [] L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelée phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très petite taille). Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants. En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente si les "grains" qui la composent sont de diamètre plus petit. Les pics obtenus sont plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien séparés, on peut donc bien les différencier), le seuil de détection est également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas). La combinaison de ces attributs - rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation « haute performance ». Les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers liquides organiques (alcools, acétonitrile, dichlorométhane, ...). Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit "gradient" ou "élution graduée" (en opposition au mode "isocratique", pour lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse). Par exemple, sur une colonne apolaire, en utilisant un mélange eau/méthanol comme phase mobile, les composants les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol alors que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec une concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase stationnaire, on commencera par une concentration élevée en méthanol ou le contraire. Appareillage et fonctionnement [] La pompe [] C'est la partie qui sert à stocker l'éluant et à l'injecter sous pression dans la colonne. Elle est composée de :  Deux pistons alternatifs  Réservoirs de phase mobile  Électrovannes  Amortisseur de pulsations  Système de purge et d'amorçage  Capteur de pression On utilise une pompe pour une élution isocratique ou plusieurs pour une élution par gradient.
    • 14 L'injecteur [] Des tubes en acier inoxydable, en Teflon, en PEEK ou en silice fondue permettent de relier la ou les pompes à l'injecteur chromatographique. Il y a plusieurs types d'injecteurs :  Boucle d'injection : permet la répétabilité du volume d'injection  Injecteur seringue  Extraction sur phase solide en ligne La colonne [] Elle dépend du type de chromatographie en phase liquide que l'on veut faire et donc de la nature et du nombre de composés que l'on veut séparer. Il peut y avoir plusieurs colonnes parallèles. Il y a donc plusieurs types de chromatographies en phase liquide : La chromatographie d'adsorption [] Article détaillé : Chromatographie d'adsorption. Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants. La chromatographie de partage [] Article détaillé : Chromatographie de partage. Dans cette chromatographie les analytes sont séparés en fonction de leur affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de la polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux types de chromatographie de partage :  liquide - liquide : la phase stationnaire consiste en une très fine couche de liquide répartie par adsorption physique à la surface du matériau support le plus inerte possible. Les composants sont séparés comme dans une extraction liquide-liquide, sauf que la répartition des composants se fait lors du passage dans la phase liquide et non par agitation.  liquide - solide ou liquide - phase greffée : la phase stationnaire consiste en une espèce organique liée par des liaisons chimiques à la surface des particules du matériau support. La chromatographie par échange d'ions [] Article détaillé : Chromatographie à échange d'ions. La phase solide est une résine insoluble munie de groupes fonctionnels capable de dissocier. Ce sont, habituellement, des groupes "acide sulfonique" (SO3H) pour les échangeurs de cations et "ammonium quaternaire" (N(R)3) pour les échangeurs d'anions.
    • 15 La chromatographie d'exclusion stérique [] Article détaillé : Chromatographie d'exclusion stérique. Les composants sont séparés selon leur dimension moléculaire. La phase stationnaire est composée d'un matériau poreux (petites particules de silice ou de polymères), les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de séjour dans la colonne augmente lorsque la taille des analytes diminue. La chromatographie chirale [] Article détaillé : Chromatographie chirale. Cette technique de chromatographie consiste en la formation de liaisons non covalentes entre les énantiomères du substrat et l'absorbant chromatographique chiral donnant des complexes diastéréoisomères ayant des affinités de liaisons différentes. Elle sert donc en particulier à séparer des énantiomères. Le détecteur [] Il existe plusieurs types de détecteurs :  Détecteur à absorption UV ou visible  Détecteur à indice de réfraction  Détecteur UV à barrette de diodes (DAD)  Détecteur à fluorescence  Détecteur de type spectromètre de masse (MS)  Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL)  Détecteur électro-chimique (DEC) Les différentes phases stationnaires [] Phase normale [] Les colonnes en phase normale sont des colonnes dont la phase stationnaire est polaire et acide. La phase normale la plus utilisée est à base de gel de silice : à sa surface se trouvent des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-). Ces groupes permettent à la silice de retenir les composés à analyser par des liaisons hydrogènes. Cette phase sert ainsi principalement à séparer des composés polaires. Phase inverse [] La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des chaînes alkyles (ou autres selon la polarité recherchée) ont été greffées au niveau des groupes silanols (end-capping). En général, la phase stationnaire est majoritairement composée de petites particules de silice sur
    • 16 lesquels on a greffé des fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles à 8 ou 18 atomes de carbones. Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent engendrent des interactions hydrophiles parasites, qui rendent les résultats non reproductibles surtout pour les molécules basiques. Pour éviter cela, la surface de la silice est généralement recouverte par une fonction méthyle et les fonctions silanols ne sont plus libres mais sous la forme (Si-O-CH3), c'est cette étape que l'on appelle "end- capping". Les fonctions chimiques utilisées pour le "end-capping" peuvent toutefois être de nature très diverses et les colonnes de dernières générations résistant à des pH extrêmes sont généralement "end-capped" avec des fonctions proposant une plus grande gène stérique, tel que le tert-butyle (Si-O-C(CH3)3). Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution. Cette phase stationnaire est dite "inverse" car de polaire et hydrophile (sans les "greffes"), la phase devient apolaire et hydrophobe. Paramètres de chromatographie [] La qualité et la durée d'une séparation peuvent changer avec la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile utilisées. Mais pour un même type de phase stationnaire et une même phase mobile, la qualité et la durée d'une séparation peuvent aussi être modifiées par les caractéristiques géométriques et opératoires de ces deux phases. Caractéristiques géométriques de la phase stationnaire []  la longueur L et le diamètre interne dc de la colonne  le diamètre des particules de phase stationnaire dp Caractéristiques opératoires de la phase mobile []  la vitesse linéaire de l'écoulement u  la perte de charge ou pression appliquée ΔP entre l'entrée et la sortie de la colonne (la pression de sortie étant généralement atmosphérique). Elle est donnée par la loi de Darcy où η est la viscosité de la phase mobile et Φ est le facteur de résistance à l'écoulement qui dépend de la forme des particules et de la qualité du remplissage de la phase stationnaire. Pour des colonnes bien remplies de particules sphériques ou irrégulières, la formule empirique suivante, établie avec les unités usuelles, permet le calcul commode d'une estimation de ΔP en fonction du débit F de la phase mobile avec une incertitude inférieure à 25%
    • 17 Remarque : la loi de Darcy est à l'hydraulique ce que la loi d'Ohm est à l'électricité. La pression hydraulique est analogue au potentiel électrique, le débit de liquide est analogue à l'intensité du courant, la perméabilité hydraulique est analogue à la conductivité électrique, la pressurisation et la dépressurisation d'une colonne chromatographique sont respectivement analogues à la charge et à la décharge d'un condensateur électrique. Grandeurs caractéristiques en chromatographie [] Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la forme d'une courbe du signal détecté en fonction du temps : c'est le chromatogramme. Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caractéristiques différentes :  le temps de rétention ou tR, temps du maximum du pic. On appelle t0 ou temps de rétention nulle le temps correspondant à un composé non retenu chromatographiquement.  la largeur du pic, mesurée à mi-hauteur : ω1/2, ou à sa base, par l'intersection des tangentes du pic à ses points d'inflexion avec la ligne de base : ω. De là peuvent être calculées plusieurs caractéristiques de la colonne pour la séparation des pics :  le facteur de rétention k' du pic, par la formule  l' efficacité N ou nombre de plateaux théoriques, reliée à la largeur du pic par la formule Cette valeur mesure la finesse du pic. À partir de cette valeur peut être calculée la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) H, qui permet de comparer des colonnes de longueur différente  la sélectivité α entre deux pics 1 et 2 (2 étant plus retenu que 1), définie par le rapport de leurs deux facteurs de rétention Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics. Plus elle est supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés.
    • 18  la résolution RS entre les pics 1 et 2 Cette valeur mesure la qualité de séparation et d'absence de recouvrement entre les 2 pics considérés. La résolution ainsi définie est l'objectif de la séparation chromatographique. C'est une fonction des trois caractéristiques (efficacité, sélectivité et rétention), elles-mêmes définies ci-dessus, dont l'expression est Cette expression montre notamment qu'une même résolution peut être obtenue dans des conditions chromatographiques ou bien très efficaces (optimisation cinétique) ou bien très sélectives (optimisation thermodynamique). Quoi qu'il en soit, la performance qui caractérise la technique HPLC est définie par le pouvoir de résolution par unité de temps, ce qui n'implique pas systématiquement l'utilisation de la pression la plus haute possible. Spectroscopie infrarouge La spectroscopie infrarouge (parfois désignée comme spectroscopie IR) est une classe de spectroscopie qui traite de la région infrarouge du spectre électromagnétique. Elle recouvre une large gamme de techniques, la plus commune étant un type de spectroscopie d'absorption. Comme pour toutes les techniques de spectroscopie, elle peut être employée pour l'identification de composés ou pour déterminer la composition d'un échantillon. Les tables de corrélation de spectroscopie infrarouge sont largement présentes dans la littérature scientifique. Base et théorie [] La partie infrarouge du spectre électromagnétique est divisée en trois régions : le proche, le moyen et le lointain infrarouges, nommés en relation avec le spectre visible. L'infrarouge lointain, allant approximativement de 400 à 10 cm-1 (1000–30 μm), mitoyen de la région micro- onde, a une énergie faible et peut être utilisé pour la spectroscopie rotationnelle. L'infrarouge moyen, allant approximativement de 4000 à 400 cm-1 (30–1,4 μm) peut être utilisé pour étudier les vibrations fondamentales et la structure rovibrationnelle associée. Le proche infrarouge, plus énergétique, allant approximativement de 14000 à 4 000 cm-1 (1,4–0,8 μm) peut exciter les vibrations harmoniques. Les dénominations et classifications de ces sous-régions sont essentiellement des conventions. Elles ne sont pas basées sur des divisions strictes ou sur des propriétés moléculaires ou électromagnétiques exactes. La spectroscopie infrarouge exploite le fait que les molécules possèdent des fréquences spécifiques pour lesquelles elles tournent ou vibrent en correspondance avec des niveaux
    • 19 d'énergie discrets (modes vibratoires). Ces fréquences de résonance sont déterminées par la forme des surfaces d'énergie potentielle, les masses atomiques et par le couplage vibronique associé. Afin qu'un mode vibrationnel dans une molécule soit actif dans l'infrarouge, il doit être associé à des modifications du dipôle permanent. En particulier, dans les approximations de Born-Oppenheimer et harmonique, lorsque le hamiltonien moléculaire correspondant à l'état fondamental électronique peut être approximé par un oscillateur harmonique au voisinage de la géométrie moléculaire d'équilibre, les fréquences de résonance sont déterminées par les modes normaux correspondant à la surface d'énergie potentielle de l'état fondamental électronique moléculaire. Néanmoins, les fréquences de résonance peuvent être dans une première approche liées à la force de la liaison, et aux masses atomiques de terminaison. Donc, la fréquence des vibrations peut être associée à une liaison particulière. Les molécules diatomiques n'ont qu'une seule liaison, qui peut être étirée. Les molécules les plus complexes ont beaucoup de liaisons, et les vibrations peuvent être conjuguées, ce qui conduit à des absorptions infrarouges à des fréquences caractéristiques qui peuvent être liées à des groupes chimiques. Ainsi par exemple, les atomes d'un groupe CH2, que l'on trouve communément dans les composés organiques peut vibrer de six manières différentes : étirements (stretching) symétriques et antisymétriques, cisaillement (scissoring), bascule (rocking), agitation hors du plan(wagging) et torsion (twisting) : étirement symétrique étirement antisymétriqu e Cisaillement Bascule Agitation Torsion Le spectre infrarouge d'un échantillon est établi en faisant passer un faisceau de lumière infrarouge au travers de cet échantillon. L'examen de la lumière transmise indique la quantité d'énergie absorbée à chaque longueur d'onde. On peut le faire avec un faisceau monochromatique, avec une modification de la longueur d'onde dans le temps, ou en utilisant un instrument à transformée de Fourier afin de mesurer toutes les mesures d'onde simultanément. On peut alors produire les spectres en absorbance ou en transmittance, et indiquer les longueurs d'ondes d'absorption. L'analyse de ces caractéristiques indique des détails de la structure moléculaire de l'échantillon. Cette technique fonctionne quasiment exclusivement sur les échantillons présentant des liaisons covalentes. Des spectres simples sont obtenus à partir d'échantillons avec peu de liaisons actives dans l'infrarouge et avec de hauts degrés de pureté. Les structures moléculaires plus complexes conduisent à plus de bandes d'absorption et donc à des spectres plus complexes. Cette technique a cependant été utilisée pour la caractérisation de mélanges très complexes. Préparation de l'échantillon []
    • 20 Les échantillons gazeux ne nécessitent que peu de préparation avant purification, mais par contre requièrent normalement une cellule de mesure avec une longueur de parcours importante (typiquement entre 5 et 10 cm), les gaz n'absorbant que peu dans l'infrarouge. Les échantillons liquides peuvent être placés entre deux plaques d'un sel très pur (habituellement le chlorure de sodium, ou sel de table, bien qu'un nombre important d'autres sels comme le bromure de potassium ou le fluorure de calcium soit aussi utilisé). Les plaques sont transparentes à la lumière infrarouge et n'introduisent donc pas de bandes supplémentaires dans le spectre. Cependant, comme de nombreux sels sont très solubles dans l'eau, les échantillons et agents de lavage doivent être anhydres. Les échantillons solides peuvent être préparés de quatre manières majeures. La première d'entre elles est de broyer l'échantillon avec un agent liant (souvent du nujol) dans un mortier avec un pilon. Un film mince de ce broyat est appliqué sur les plaques et mesuré. La deuxième méthode consiste à moudre finement une quantité de l'échantillon avec un sel purifié spécialement (comme le bromure de potassium) afin de supprimer les effets de diffusion des gros cristaux. Ce mélange poudreux est ensuite comprimé dans une presse afin de fournir une pastille translucide au travers de laquelle un faisceau de spectromètre peut passer. La troisième technique est dite de déposition de film, et est principalement utilisée pour les matériaux polymères. L'échantillon est tout d'abord dissous dans un solvant non hygroscopique et adéquat. Une goutte de cette solution est déposée à la surface d'une cellule de KBr ou de NaCl. La solution est ensuite évaporée jusqu'à séchage complet et le film ainsi formé sur la cellule est analysé directement. Il faut faire attention à ce que le film ne soit pas trop épais, empêchant la lumière de le traverser. Cette technique permet des analyses qualitatives. La quatrième méthode est l'utilisation de la microtomie afin de découper un film mince (de 20 à 100 μm) dans un échantillon solide. C'est l'un des plus importants moyens d'analyse des produits plastiques rejetés, par exemple, car cette technique préserve l'intégrité physique globale de l'échantillon. Il est important de savoir que les spectres obtenus à partir de différentes méthodes peuvent présenter de légères différences entre eux en raison des états physiques des échantillons. Méthode classique []
    • 21 Schéma de fonctionnement d'un spectromètre infrarouge « classique ». Dans un spectromètre infrarouge « classique » (il existe des montages spéciaux dépendants des activités poursuivies), un rayon de lumière infrarouge est produit et séparé en deux faisceaux. L'un passe au travers de l'échantillon, l'autre au travers d'une référence qui est parfois le composé dans lequel l'échantillon a été dissous. Les faisceaux sont ensuite réfléchis jusqu'à un détecteur, après être passés par un séparateur qui alterne rapidement les faisceaux entrant dans le détecteur. Les deux signaux sont comparés et le spectre ainsi obtenu tracé. L'utilisation d'une référence permet :  d'éviter les fluctuations de sortie de source qui peuvent affecter les données. Ces fluctuations ont des origines diverses, comme le vieillissement.  d'éviter la prise en compte des effets de solvant (la référence est habituellement le solvant pur correspondant à celui dans lequel l'échantillon est dissous). Aperçu des longueurs d'ondes d'absorption pour les molécules organiques []
    • 22 Quelques domaines d'absorption correspondant à divers types de liaisons chimiques. Les nombres d'ondes sont exprimées en cm-1 . Usages et applications [] La spectroscopie infrarouge est très répandue dans la recherche académique et l'industrie en tant que technique simple et sure de mesure, de contrôle de qualité et de mesure dynamique. Elle est, par exemple, utilisée en médecine légale pour les cas criminels ou civils pour la caractérisation de la dégradation polymérique. Elle est sans doute la technique de spectroscopie appliquée la plus utilisée[réf. nécessaire] . Les instruments d'acquisition sont maintenant miniaturisés et donc transportables, même pour des usages en extérieur. Avec l'accroissement des technologies de filtrage informatique et de traitement des résultats, les échantillons en solution peuvent maintenant être mesurés précisément (l'eau présente une large absorbance sur les longueurs d'ondes intéressantes, ce qui rend un spectre non traité ininterprétable). Certains instruments possédant leurs propres bases de données, l'identification peut ainsi également être automatisée. En se calant sur une fréquence spécifique dans le temps, les modifications dans les propriétés ou la quantité d'une liaison particulière peuvent être mesurées. Cette méthode est particulièrement utile pour mesurer le degré de polymérisation en production. Les instruments de recherche modernes peuvent acquérir des mesures sur la largeur du spectre voulue aussi souvent que 32 fois par seconde. Cela peut se faire dans le même temps que d'autres mesures par d'autres techniques, ce qui permet l'observation de réactions et processus chimiques de manière plus rapide et plus précise. La spectroscopie infrarouge est une technique probante à la fois en chimie organique et en chimie inorganique. Ainsi on peut l'utiliser en analyse de surface dans l'industrie de la micro- électronique[1] pour des semi-conducteurs comme le silicium, l'arséniure de gallium, le séléniure de zinc, le silicium amorphe, le nitrure de silicium, etc. Effets isotopiques [] Les différents isotopes d'espèces particulières peuvent donner des détails fins en spectroscopie infrarouge. Ainsi, la fréquence d'étirement O-O de l'oxyhémocyanine est expérimentalement déterminées à 832 et 788 cm-1 pour ν(16 O-16 O) et ν(18 O-18 O) respectivement. Si l'on considère la liaison O-O comme un ressort, la longueur d'onde d'absorption ν peut être calculée : où k est la constante de ressort pour la liaison, et μ est la masse réduite du système A-B :
    • 23 (mi est la masse de l'atome i). Les masses réduites de 16 O-16 O et 18 O-18 O peuvent être approchées par 8 et 9 unités atomiques, respectivement. Donc : Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier [] Article principal : spectroscopie à transformée de Fourier. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF, en anglais Fourier transform infrared spectroscopy - FTIR) est une technique de mesure pour l'acquisition de spectres infrarouges. Au lieu d'enregistrer la quantité d'énergie absorbée lorsque la fréquence de lumière infrarouge varie (monochromateur), la lumière infrarouge passe au travers d'un interféromètre. Après avoir traversé l'échantillon, le signal mesuré est un interférogramme. Après que le signal a subi une transformée de Fourier, on obtient un spectre identique à celui obtenu par une spectroscopie infrarouge conventionnelle (dispersive). Les spectromètres IRTF sont moins chers que les spectromètres conventionnels, la construction d'interféromètres étant plus facile que celle de monochromateurs. De plus, la mesure d'un spectre est plus rapide en IRTF car l'information à toutes les fréquences est collectée simultanément (une mesure au moyen d'un appareil dispersif dure par exemple une demi-heure ; elle dure deux minutes avec un appareil IRTF). Cela permet à de nombreux échantillons d'être analysés et moyennés ensemble, ce qui améliore la sensibilité. En raison de ces nombreux avantages, la très grande majorité des spectromètres infrarouges modernes sont des instruments IRTF. Un exemple d'application hors laboratoire de ces appareils est l'analyse des gaz de combustion des moteurs thermiques des véhicules. La sonde est introduite dans le pot d'échappement et seules deux fréquences sont exploitées : 2 350 cm-1 pour le dioxyde de carbone et 2 170 cm-1 pour le monoxyde de carbone. Dans cet exemple, le spectromètre à transformée de Fourier a remplacé le spectromètre dispersif qui nécessitait des ampoules contenant des concentrations bien définies des deux gaz analysés. Spectroscopie infrarouge en deux dimensions [] Article principal : Spectroscopie infrarouge en deux dimensions. Plusieurs techniques de spectroscopie infrarouge sont dites en deux dimensions car elles permettent d'extraire de l'information supplémentaire par rapport à une technique plus classique (monodimensionnelle) en analysant les phénomènes de couplage en utilisant un paramètre supplémentaire à la fréquence.
    • 24 Analyse de corrélation par spectroscopie infrarouge bidimensionnelle [] Cette technique est l'application à la spectroscopie infrarouge de l'analyse de corrélation bidimensionnelle. En étendant l'information spectrale obtenue sur un échantillon perturbé, l'analyse spectrale est simplifiée et sa résolution améliorée. Les spectres bidimensionnels synchrone et asynchrone représentent un survol graphique des modifications spectrales induites par une perturbation (comme un changement de concentration ou de température) ainsi qu'une relation entre modifications spectrales pour deux nombres d'ondes (fréquences) différents. Spectroscopie infrarouge bidimensionnelle non-linéaire [] Séquence d'impulsions utilisée pour l'obtention d'un spectre infrarouge bidimensionnel par transformée de Fourier. La période τ1 est habituellement appelée temps de cohérence et la période τ2, le temps d'attente. La fréquence d'excitation est obtenue par transformée de Fourier le long de l'axe τ1. La spectroscopie infrarouge bidimensionnelle non-linéaire[2],[3] est, en quelque sorte, la « version infrarouge » de la spectroscopie de corrélation. Cette technique a été rendue possible avec le développement de lasers infrarouges à pulsations femtosecondes. Dans ces expériences, un ensemble de pulsations de « pompage » sont appliquées à l'échantillon. Ce train de pulsations est suivi d'un temps d'attente pour permettre au système de se relaxer. Ce temps dure typiquement de 0 à quelques picosecondes et sa durée peut être contrôlée avec une résolution d'une dizaine de femtosecondes. Une pulsation sonde est ensuite envoyée, déclenchant un signal d'émission de l'échantillon. Le spectre infrarouge bidimensionnel non-linéaire est un graphique bidimensionnel de corrélation de la fréquence ω1 excitée par les pulsations pompes et de la fréquence ω3 excitée par la pulsation sonde après le temps d'attente. Cela permet l'observation des couplages entre différents modes vibratoires. En raison de sa très haute résolution temporelle, cette technique peut être utilisée pour observer la dynamique moléculaire à l'échelle de la picoseconde. Cette technique est cependant très largement encore non répandue mais devient de plus en plus populaire en recherche fondamentale. Comme pour la résonance magnétique nucléaire bidimensionnelle (RMN 2D), cette technique permet d'obtenir un spectre en deux dimensions avec des pics corrélés contenant les informations de couplage entre les différents modes. Cependant, contrairement à la RMN 2D, cette technique prend aussi en compte les excitations vers les harmoniques. Ces excitations sont perceptibles dans des pics d'absorption d'états excités en dessous de la diagonale et des pics de corrélation. En RMN 2D deux techniques distinctes, la COSY et la NOESY sont fréquemment utilisées. Les pics de corrélation dans la première sont réliés à du couplage scalaire, tandis que dans la seconde ils
    • 25 sont liés au transfert de spin entre les différents noyaux. En spectroscopie infrarouge bidimensionnelle non-linéaire, un temps d'attente nul correspond à la technique COSY, et un temps d'attente non nul permettant des transferts de populations vibrationnelles à la technique COESY. La "variante COSY" a été utilisée pour la détermination de structures secondaires de protéines[4] . Spectroscopie rotationnelle Partie du spectre de rotation-vibration du chlorure d'hydrogène gazeux, montrant la présence de branches P et R. L'axe x correspond à la fréquence, l'axe y à la transmittance. La spectroscopie rotationnelle, de rotation ou micro-onde étudie l'absorption et l'émission d'une onde électromagnétique (habituellement dans la région microonde du spectre électromagnétique) par des molécules associées aux modifications correspondantes du nombre quantique de rotation de la molécule. L'utilisation de micro-ondes en spectroscopie a été rendue possible en raison principalement du développement de la technologie associée pour le RADAR durant la Seconde guerre mondiale. La spectroscopie rotationnelle n'est réellement possible qu'en phase gazeuse quand le mouvement de rotation est quantifié. Le spectre de rotation d'une molécule (au premier ordre) nécessite que la molécule possède un moment dipolaire et que les centres de charge et masse soient distincts, ou, de manière équivalente, qu'il existe une différentiation de deux charges distinctes. C'est l'existence de ce moment dipolaire qui permet au champ électrique de la lumière (micro-onde) d'exercer un couple sur la molécule, ce qui la fait tourner plus rapidement (en excitation) ou lentement (en désexcitation). Les molécules diatomiques comme le dioxygène (O2) ou le dihydrogène (H2)
    • 26 n'ont pas de moment dipolaire et par conséquent n'ont pas de spectre purement rotationnel. Cependant, les excitations électroniques peuvent conduire à une distribution asymétrique de charge et donc induire un moment dipolaire. Dans de telles circonstances, ces molécules auront un spectre rotationnel. Les molécules diatomiques hétérogènes comme le monoxyde de carbone (CO) possède l'un des spectres de rotation les plus simples. C'est également le cas pour des molécules triatomiques comme le cyanure d'hydrogène (HC≡N) pour les molécules linéaires ou l'isocyanure d'hydrogène (HN=C:) pour les molécules non-linéaires. Plus le nombre d'atomes croît, plus le spectre devient complexe, les raies dues à différentes transitions commençant à se superposer. Comprendre un spectre de rotation [] En mécanique quantique, la libre rotation d'une molécule est quantifiée, ce qui fait que l'énergie de rotation et le moment angulaire ne peuvent prendre seulement que certaines valeurs fixes. Ces valeurs sont liées de manière simple au moment d'inertie, I, de la molécule. En général pour une molécule quelconque il y a trois moments d'inertie IA, IB et IC liés à trois axes orthogonaux A, B et C avec pour point d'intersection le centre de masse du système. Les molécules linéaires constituent un cas à part. Ces molécules possèdent une symétrie cylindrique et un de ces moments d'inertie (IA, qui est le moment d'inertie pour une rotation autour de l'axe de la molécule) est négligeable (i.e. ). Classification des molécules selon leur comportement rotationnel [] La convention générale est de définir les axes tels que l'axe A possède le plus faible moment d'inertie (et donc la plus grande fréquence de rotation) et les autres axes tels que . Parfois, l'axe A est associé avec l'axe de symétrie de la molécule s'il existe. Dans ce cas, IA n'a pas besoin d'être le plus faible moment d'inertie. Afin d'éviter la confusion, on gardera la précédente convention dans la suite de l'article. Le schéma particulier des niveaux d'énergie (et donc des transitions dans le spectre de rotation) pour une molécule est déterminé par sa symétrie. Une façon intéressante de considérer les molécules consiste à les diviser en quatre classes différentes selon leurs symétries structurales. Ces classes sont : 1. les molécules linéaires (ou rotateurs linéaires) 2. les toupies symétriques (ou rotateurs symétriques) 3. les toupies sphériques (ou rotateurs sphériques) 4. les toupies asymétriques (ou rotateurs asymétriques). Molécules linéaires [] Comme mentionné ci-dessus, pour une molécule linéaire. Dans la plupart des cas, IA est considéré comme nul. Pour une molécule linéaire, la séparation des raies du spectre de rotation peut être liée directement au moment d'inertie d'une molécule, et pour une molécule avec des masses atomiques données, et être directement utilisée pour la détermination des longueurs de liaisons chimiques (structure). Pour les molécules diatomiques, ce procédé est trivial et peut
    • 27 être faire par une mesure simple. Pour les molécules linéaires avec plus de deux atomes, cela requiert plus de travail, et il est alors nécessaire de mesurer des molécules dans lesquelles plus d'un isotope de chaque atome a été substitué (cela donne en pratique un ensemble d'équations couplées pouvant être résolues pour les longueurs de liaisons). On pourra citer comme exemples de molécules linéaires : le dioxygène, le monoxyde de carbone, le radical hydroxyle (•OH), le dioxyde de carbone (CO2), le cyanure d'hydrogène, le sulfure de carbonyle (O=C=S), le chloréthyne (HC≡CCl) ou l'acétylène (HC≡CH). Toupies symétriques [] Une toupie symétrique est une molécule pour laquelle deux des moments d'inertie sont identiques. Pour des raisons historiques, les spectroscopistes divisent ces molécules en deux classes, les toupies symétriques oblates (en forme de disque) avec IA = IB < IC et les toupies symétriques prolates (en forme de cigare) avec IA < IB = IC. Leurs spectres sont assez différents, et sont immédiatement reconnaissables. Comme pour les molécules linéaires, la structure des toupies symétriques (longueurs de liaison et angles) peuvent être déduites de leurs spectres. On peut citer comme exemples de toupies symétriques :  oblates : le benzène (C6H6), le cyclobutadiène (C4H4), ou l'ammoniac (NH3).  prolates : le chloroforme (CHCl3), le propyne (CH3C≡CH) Toupies sphériques [] Les toupies sphériques peuvent être considérées comme un cas spécial de toupies symétriques dont les trois moments d'inertie sont égaux (IA = IB = IC). On peut citer comme exemples : le tétramère de phosphore P4, le tétrachlorure de carbone (CCl4), l'ion ammonium (NH4 + ) ou l'hexafluorure de soufre (SF6). Toupies asymétriques [] Une toupie asymétrique possède trois moments d'inertie différents. La plupart des grosses molécules sont des toupies asymétriques, même si elles présentent un fort degré de symétrie. Généralement, pour de telles molécules, une interprétation simple du spectre est impossible. Parfois, les toupies asymétriques présentent des spectres similaires à ceux d'une molécule linéaire ou d'une toupie symétrique, auquel cas la structure moléculaire doit aussi être similaire à celle d'une molécule linéaire ou d'une toupie symétrique. Pour le cas le plus général, cependant, tout ce qui peut être fait est de lisser le spectre sur trois moments d'inertie. Si la formule moléculaire est connue, on peut présupposer la structure probable, et à partir de cette structure, calculer les moments d'inertie. Si ceux-ci correspondent bien aux moments mesurés, on peut dire que la structure est déterminée. Dans cette approche, la substitution isotopique est invalide. Quelques exemples : l'anthracène (C14H10), l'eau (H2O) - à cause des doublets non liants de l'oxygène central - ou le dioxyde d'azote (NO2) (pour des raisons similaires à l'eau). Structure d'un spectre de rotation [] Molécules linéaires
    • 28 Diagramme des niveaux d'énergie décrivant certaines des transitions impliquées dans le spectre de rotation-vibration infrarouge d'une molécule linéaire : la branche P (où ΔJ = − 1), la branche Q (pas toujours permise, ΔJ = 0) et la branche R (ΔJ = 1). Ces molécules ont deux modes de rotation dégénérés (IB = IC, IA = 0). Comme on ne peut distinguer les deux modes, un seul nombre quantique de rotation (J) afin de décrire le mouvement de rotation d'une molécule. Les niveaux d'énergie de rotation ( ) de la molécule basée sur le modèle du rotateur rigide peut être exprimé comme :
    • 29 où est la constante de rotation de la molécule et est liée au moment d'inertie de la molécule IB = IC par : Les règles de sélection imposent que lors de la durée d'émission ou d'absorption le nombre quantique de rotation varie d'une unité, i.e. . Les localisations des raies dans un spectre de rotation seront données par : où indique le niveau d'énergie le plus bas et le niveau d'énergie le plus élevé impliqués dans la transition. La hauteur des raies est déterminée par la distribution des molécules dans les différents niveaux et la probabilité de transition entre les deux niveaux d'énergie. On observe que, pour un rotateur rigide, les raies de transition sont espacées de manière égale dans l'espace des nombres d'onde. Cependant, ce n'est pas toujours le cas, sauf pour le modèle du rotateur rigide. Pour un modèle non rigide, on doit considérer les modifications du moment d'inertie de la molécule. Deux des raisons principales pour cette prise en compte sont :  la distorsion centrifuge : lorsqu'une molécule tourne, la force centrifuge peut agir sur les atomes en les éloignant vers l'extérieur. Le moment d'inertie de la molécule augmente, donc décroît. Afin de prendre en compte la correction de distorsion centrifuge, un terme est ajouté aux niveaux d'énergie de rotation de la molécule. où est la constante de distorsion centrifuge. L'espacement des raies pour le mode rotationnel est modifié en conséquence,  l'effet de la vibration de rotation : une molécule est toujours en vibration. La molécule vibrant, ses moments d'inertie sont modifiés. Il existe de plus une force fictive, un couplage de Coriolis, entre le mouvement vibrationnel du noyau dans le repère en rotation (non-galiléen). Cependant, tant que le nombre quantique de vibration ne change pas (i.e. la molécule est dans un seul état de vibration), l'effet de la vibration sur la rotation n'est pas important, le temps de vibration étant beaucoup plu court que le temps de rotation. Le couplage de Coriolis est parfois négligeable également si l'on s'intéresse aux nombres quantiques de vibration et de rotation faibles.
    • 30 Toupie symétrique Le mouvement de rotation d'une molécule-toupie symétrique peut être décrit pas deux nombres quantiques de rotation indépendants (deux axes de rotation ayant les mêmes moments d'inertie, la rotation autour de ces axes ne nécessite qu'un nombre quantique de rotation pour une description complète). Au lieu de définir les deux nombres quantiques de rotation pour les deux axes indépendants, on associe l'un des nombres quantiques (J) avec le moment angulaire total de la molécule et l'autre (K) avec le moment angulaire de l'axe ayant un moment d'inertie différent des autres (i.e. l'axe C pour une toupie symétrique oblate et A pour une prolate). L'énergie de rotation d'une telle molécule, basée sur les postulats du rotateur rigide peut être exprimée en termes des deux nombres quantiques de rotation définis ci-dessus comme il suit : où et pour une molécule prolate ou pour une molécule oblate. Les règles de sélection pour ces molécules fournissent des indications pour les transitions possibles, par : . Cela est dû au fait que K est associé à l'axe de symétrie de la molécule et donc qu'elle ne possède pas de dipôle franc dans cette direction. Il n'y a donc pas d'interaction de ce mode avec les photons. Cela donne les nombres d'ondes de transition : ce qui est identique au cas d'une molécule linéaire. Dans le cas des rotateurs non rigides, la correction de distorsion centrifuge au premier ordre est donnée par : Les indices de la constante de distorsion centrifuge D indiquent que le mode de rotation impliqué et ne sont pas fonction du nombre quantique de rotation. La localisation des raies de transition sur un spectre est donnée par :
    • 31 Toupie sphérique Les molécules sphériques n'ayant pas de moment dipolaire, elles ne présentent pas de spectres purement rotationnels. Toupie asymétrique Le spectre de ce molécules présente habituellement de nombreuses raies en raison des trois modes de rotation différents et de leurs combinaisons. L'analyse suivante est valide pour le cas général et se réduit aux cas spéciaux précédents dans les limites appropriées. A partir des moments d'inertie, on peut définir un paramètre asymétrique κ tel que : variant de -1 pour une toupie symétrique prolate à 1 pour une toupie symétrique oblate. On peut définir un hamiltonien de rotation réduit dépendant de J et κ. La représentation matricielle (symétrique) est quasi-diagonale, avec des coefficients nuls partout sauf sur la diagonale principale et la seconde sous-diagonale. Le hamiltonien peut être formulé de six manières différentes, selon l'orientation et l'arrangement des axes par rapport au référentiel absolu. Pour la plus asymétrique, la représentation des éléments diagonaux dans l'orientation main droite est, pour : Hk,k(κ) = κk2 et les éléments non nuls hors diagonale principale (indépendants de κ) sot : . La diagonalisation de H donne un ensemble de 2J + 1 niveaux d'énergie rotationnelle Ek(κ) réduits. Les niveaux d'énergie rotationnelle pour le rotateur asymétrique de moment angulaire total J est alors donné par : Interactions hyperfines En plus de la structure principale observée dans les spectres microondes imputable au mouvement de rotation des molécules, un ensemble d'interactions plus « subtiles » sont responsables de petits détails dans ces spectres, et leurs études donne une compréhension vraiment profonde de la mécanique quantique des molécules. Les interactions principales responsables de ces légères modifications dans les spectres (séparations supplémentaires et déplacements de raies) sont dues aux interactions magnétiques et électrostatiques dans la
    • 32 molécule. Les forces particulières de ces interactions dans différentes molécules, mais en général, l'ordre de ces effets est (dans l'ordre décroissant) :  interaction entre spins électroniques : se produit dans des molécules avec deux électrons non appariés ou plus, et est une interaction entre dipôles magnétiques.  interaction entre spin électronique et rotation moléculaire : la rotation d'une molécule correspond à une dipôle magnétique qui interagit avec le moment magnétique dipolaire de l'électron.  interaction entre spin électronique et spin nucléaire : il s'agit de l'interaction entre le moment magnétique dipolaire de l'électron et le moment magnétique dipolaire du noyau s'il existe.  interaction entre gradient de champ électrique et quadrupôle électrique nucléaire, ou interaction entre le gradient de champ électrique du nuage électronique d'une molécule et les moments électriques quadrupolaires du noyau s'ils existent.  interaction entre spins nucléaires : les moments magnétiques nucléaires interagissent entre eux. Ces interactions donnent lieu à des niveaux d'énergies caractéristiques qui sont montrés par des techniques spectroscopiques de résonance magnétique comme la RMN ou la RPE, où ils représentent les « séparations à champ nul » qui sont toujours présentes. Détermination expérimentale des spectres [] Cette section est vide, pas assez détaillée ou incomplète. Votre aide est la bienvenue ! La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) peut être utilisée afin d'étudier les spectres de rotation expérimentaux. Les spectres à ces longueurs d'ondes présentent de manière typique de l'excitation rovibrationnelle, c'est-à-dire un mode à la fois vibrationnel et rotationnel pour une molécule. Traditionnellement, les spectres micro-ondes sont obtenus par un procédé simple dans lequel un gaz sous faible pression est introduit dans un guide d'onde entre une source micro-onde (de fréquence variable) et un détecteur micro-onde. Le spectre est obtenu par modification de la fréquence de la source et détection simultanée de la variation d'intensité de la radiation transmise. Ce dispositif expérimental recèle une difficulté majeure liée à la propagation de l'onde micrométrique dans le guide d'onde. La taille physique du guide restreint la fréquence de radiation pouvant être transmise. Pour une taille de guide donnée (comme pour une bande X) il y a une fréquence de coupure, et les micro-ondes aux petites fréquences ( longueurs d'ondes les plus importantes) ne peuvent être propagées. De plus, lorsque la fréquence croît, des modes supplémentaires de propagation deviennent possibles, correspondant aux différentes vitesses de la radiation se propageant dans le guide d'onde (cela peut être comparé à un rebond de l'onde dans le guide, avec différents angles de réflexion). Le résultat final de ces considérations est que chaque taille de guide d'onde est utile seulement sur un intervalle étroit de fréquences et doit être remplacé par un guide plus adapté une fois les fréquences limites dépassées. Applications [] Cette section est vide, pas assez détaillée ou incomplète. Votre aide est la bienvenue !
    • 33 La spectroscopie rotationnelle est utilisée fréquemment en chimie physique afin de déterminer la structure des petites molécules (comme l'ozone, le méthanol ou l'eau) avec une haute précision. Les autres techniques « classiques » comme la diffractométrie de rayons X ne sont pas satisfaisantes pour ces molécules (particulièrement en phase gazeuse) et ne sont pas assez précises. Cependant, la spectroscopie rotationnelle n'est pas pertinente dans la détermination de molécules de tailles plus importantes, comme les protéines. La spectroscopie micro-onde est l'un des principaux moyens par lesquels les constituants de l'univers sont déterminés depuis la Terre. Elle est particulièrement utile pour la détection des molécules dans le milieu interstellaire. Ainsi, l'une des découvertes les plus surprenantes de la chimie interstellaire fut la découverte de molécules à longues chaines carbonées dans ce milieu. C'est dans la perspective de trouver ce type de molécules en laboratoire qu'Harold Kroto vint dans le laboratoire de Richard Smalley et Robert Curl, où il était possible de vaporiser du carbone dans des conditions d'énergies très importantes. Cette expérience collaborative conduisit à la découverte du C60 qui leur valut le prix Nobel de chimie en 1996. Spectrométrie de masse La spectrométrie de masse (mass spectrometry ou MS) est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse, et de caractériser leur structure chimique. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). La spectrométrie de masse est utilisée dans pratiquement tous les domaines scientifiques : physique, astrophysique, chimie en phase gazeuse, chimie organique, dosages, biologie, médecine... Structure d'un spectromètre de masse [] Structure d’un spectromètre de masse Le spectromètre de masse, initialement conçu par le britannique Joseph John Thomson, comporte une source d'ionisation suivie d'un ou plusieurs analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z, d'un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal, et enfin d'un système informatique pour traiter le signal. Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z (ou m/q, q représentant la charge) des ions détectés selon l'axe des abscisses et l'abondance relative de ces ions selon l'axe de ordonnées.
    • 34 Le spectromètre de masse se compose donc de quatre parties :  Le système d’introduction de l’échantillon : l’échantillon peut être introduit directement dans la source, sous forme gazeuse, liquide (infusion directe) ou solide (canne d’introduction directe, dépôt sur plaque MALDI, ...) ou encore par l'association à une méthode séparative (chromatographie en phase liquide, chromatographie en phase gazeuse, électrophorèse capillaire , ...).  La source d'ionisation : elle consiste à vaporiser les molécules et à les ioniser. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs types de sources existent et sont utilisés en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. o L'ionisation électronique (EI), l'ionisation chimique (CI) et la désorption-ionisation chimique (DCI) o Le bombardement par atomes rapides (FAB), atomes métastables (MAB) ou ions (SIMS, LSIMS) o Le couplage plasma inductif (ICP) o L'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et la photoionisation à pression atmosphérique (APPI) o L'électronébulisation ou électrospray (ESI) o La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI), activée par une surface (SELDI) ou sur silicium (DIOS) o L'ionisation-désorption par interaction avec espèces métastables (DART)  L’analyseur : il sépare les ions en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Il existe des analyseurs basse résolution : le quadripôle ou quadrupôle (Q), le piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), et des analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes : le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR) et l'Orbitrap. Ces analyseurs peuvent être couplés entre eux pour réaliser des expériences de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). En général, un premier analyseur sépare les ions, une cellule de collision permet de fragmenter les ions, et un second analyseur sépare les ions fragments. Certains analyseurs, comme les pièges à ions ou le FT-ICR, constituent plusieurs analyseurs en un et permettent de fragmenter les ions et d'analyser les fragments directement.  Le détecteur et système de traitement : le détecteur transforme les ions en signal électrique. Plus les ions sont nombreux, plus le courant est important. De plus, le détecteur amplifie le signal obtenu pour qu'il puisse être traité informatiquement. A quoi sert la spectrométrie de masse ? []  Identification : o Suivant
    • 35 Spectre du toluène en banque de spectres par ionisation électronique le type d'ionisation utilisé, un spectre de masse peut être caractéristique d'une molécule. Ainsi en le comparant avec des banques de spectres, il est possible d'identifier la molécule. o Lors de l'utilisation d'un analyseur haute résolution (TOF, secteur magnétique, FTICR, Orbitrap), la spectrométrie de masse permet de mesurer avec précision la masse mono- isotopique d'un ion et d'en déduire sa formule brute.  Analyse structurale : o La parité de la masse mesurée est fonction de la parité du nombre d’atomes d’azote que possède une molécule (règle de l’azote). o Chaque atome possède un ou plusieurs isotopes qui sont de masses différentes par définition. Ainsi, la proportion de chaque isotope observé sur un spectre de masse, c'est-à-dire le massif isotopique, est caractéristique de la présence de certains atomes et de leur nombre dans l'ion mesuré (en particulier les éléments Cl, et Br, qui présentent des isotopes M et M+2 en quantité notable). o Les ions peuvent se fragmenter dans un spectromètre de masse : dans la source d'ionisation, dans l'analyseur ou dans une cellule de collision. Comme les fragmentations respectent des lois précises de chimie en phase gazeuse, l'étude de ces fragments permet de déterminer la structure des ions.  Quantification : o Un spectromètre de masse est un détecteur universel et très sensible. Sa gamme linéaire va de 3 à 7 ordres de grandeur, d'où la possibilité d'obtenir une quantification fiable sur un domaine large.  Imagerie : o L'analyse point par point d'une surface par spectrométrie de masse avec ionisation adéquate (MALDI, SIMS, DESI) permet de générer des images ioniques, représentant la répartition de chaque ion issu de cette surface. Cette technique d'imagerie est très
    • 36 utilisée pour la recherche de biomarqueurs (identification dans une coupe de tissu de composés spécifiques d'une région définie). La source d'ionisation [] Les ionisations EI et CI, qui nécessitent un certain niveau de vide, sont préférentiellement utilisées en couplage avec la chromatographie en phase gazeuse (la CI fonctionnant à partir d'une source EI). En revanche, les deux sources à pression atmosphérique (électrospray et APCI) dites à "ionisation douce", sont principalement utilisées en couplage avec la chromatographie en phase liquide. L'ionisation électronique (EI) [] Source d'ionisation électronique Des électrons émis par un filament rencontrent les molécules qui entrent dans la source : lors de la rencontre, si l'énergie cinétique des électrons est suffisante, un électron est arraché de la molécule M, la transformant en un ion radical M+o . Celui-ci peut ensuite se fragmenter suivant son énergie interne. L'EI conduit ainsi à un spectre assez fourni, avec de nombreux fragments, très riche en informations structurales. L'ionisation chimique (CI) [] Source d'ionisation chimique En plus du dispositif EI ci-dessus, un gaz réactif est introduit dans la source et ionisé par impact électronique. S'ensuit une série de réactions qui donne naissance à des ions pouvant réagir avec
    • 37 les molécules d'analyte arrivant dans la source. Ce type de réactions ions-molécules produit principalement (en mode positif) des ions [MH] + , et [M+adduit+H]+ , permettant ainsi d'accéder à la masse moléculaire de l'analyte. Le méthane, l'isobutane et l'ammoniac sont parmi les gaz d'ionisation chimique les plus utilisés. L'ionisation par bombardement d'atomes rapides (FAB) [] Elle permet d'analyser des molécules non vaporisables sous vide (grosses molécules biologiques). L'ionisation est effectuée par expulsion en phase vapeur des ions contenus dans un échantillon liquide suite à un bombardement d'atomes rapides (Ar ou Xe). Les molécules ainsi ionisées n'ont pas beaucoup d'énergie interne, la fragmentation est donc faible mais l'ion moléculaire est facilement reconnaissable et la masse moléculaire est facile à déterminer. L'échantillon est mélangé en solution à une matrice liquide non volatile (glycérol,thioglycérine, alcool m-nitrobenzylique). Un faisceau à haute énergie (de l'ordre de 4 à 10 keV) d'atomes neutres (Ar ou Xe) est envoyé sur l'échantillon et la matrice dans la chambre de collision causant ainsi les phénomènes de désorption et d'ionisation. Les ions préexistants en solution sont expulsés en phase gazeuse et accélérés vers l'analyseur. L'ionisation par électronébulisation (électrospray) (ESI) [] Article détaillé : Ionisation par électronébuliseur (ESI). Source d'ionisation par électrospray Son principe est le suivant : à pression atmosphérique, les gouttelettes de solutés sont formées à l'extrémité d'un fin capillaire porté à un potentiel élevé. Le champ électrique intense leur confère une densité de charge importante. Sous l'effet de ce champ et grâce à l'assistance éventuelle d'un courant d'air co-axial, l'effluent liquide est transformé en nuage de fines gouttelettes (spray) chargées suivant le mode d'ionisation. Sous l'effet d'un second courant d'air chauffé, les gouttelettes s'évaporent progressivement. Leur densité de charge devenant trop importante, les gouttelettes explosent en libérant des microgouttelettes constituées de molécules protonées ou déprotonées de l'analyte, porteuses d'un nombre de charges variable. Les ions ainsi formés sont ensuite guidés à l'aide de potentiels électriques appliqués sur deux cônes d'échantillonnage successifs faisant office de barrières avec les parties en aval maintenues sous un vide poussé (<10-5 Torr). Durant ce parcours à pression élevée, les ions subissent de multiples collisions avec les molécules de gaz et de solvant, ce qui complète leur désolvatation. En faisant varier les potentiels électriques appliqués dans la source il est possible de provoquer des fragmentations plus ou moins importantes.
    • 38 L'avantage de cette méthode d'ionisation comme pour l'APCI est l'obtention d'ions multichargés, pour les macromolécules, polymères. Elle permet d'autre part de générer une ionisation "douce" : des ions moléculaires sont formés en majorité. L'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) [] Article détaillé : Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Les échantillons liquides sont directement introduits dans un nébuliseur pneumatique. Sous l'effet d'un jet d'air ou d'azote, le liquide est transformé en fin brouillard. Un chauffage assure la désolvatation des composés. Ces derniers sont ensuite ionisés chimiquement à pression atmosphérique : en général, la phase mobile vaporisée joue le rôle de gaz d'ionisation et les électrons sont obtenus à partir de décharges d'électrode couronne. L'ionisation des composés est très favorisée lors de ces techniques car la fréquence des collisions est élevée à pression atmosphérique. L'APCI est une technique analogue à l'ionisation chimique (CI), elle fait appel à des réactions ions-molécules en phase gazeuse, mais à pression atmosphérique et conduit essentiellement à la formation d'ions [MH]+ ou [M-H]- . La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) [] Article détaillé : Désorption-ionisation laser assistée par matrice. Source d'ionisation MALDI Un faisceau laser pulsé est utilisé, généralement dans le domaine des ultraviolets, pour désorber et ioniser un mélange matrice/échantillon cocristallisé sur une surface métallique, la cible. Les molécules de matrice absorbent l'énergie transmise par le laser sous forme de photons UV, s'excitent et s'ionisent. L'énergie absorbée par la matrice provoque sa dissociation et son passage en phase gazeuse. Les molécules de matrice ionisées transfèrent leur charge à l'échantillon. L'expansion de la matrice entraîne l'échantillon au sein de la phase gazeuse dense où il va finir de s'ioniser. L'ionisation de l'échantillon a donc lieu soit dans la phase solide avant la désorption, soit par transfert de charge lors de collisions avec la matrice excitée après désorption. Elle conduit à la formation d'ions monochargés et multichargés de type [M+nH]n+ , avec une nette prépondérance pour les monochargés.
    • 39 L'analyseur [] Les analyseurs se différencient par leur principe de mesure du rapport m/z des ions, qui est :  la dispersion des ions, fondée sur leur moment ou leur énergie cinétique (instruments à secteur magnétique ou électrique)  la séparation dans le temps, fondée sur la vitesse des ions (TOF)  la transmission des ions traversant un champ électrodynamique (quadripôle)  le mouvement périodique dans un champ magnétique ou électrodynamique (pièges ou trappes à ions) L'analyseur quadripolaire [] Un quadripôle (ou quadrupôle) est constitué de quatre électrodes parallèles de section hyperbolique ou cylindrique. Les électrodes opposées distantes de 2r0 sont reliées entre elles et soumises au même potentiel. Coupe d'un quadripôle Les électrodes adjacentes sont portées à des potentiels de même valeur, mais opposés de sorte que l'écart de potentiel soit égal à υ0. Ce potentiel υ0 résulte de la combinaison de tensions, l'une continue (U) l'autre alternative (V) de haute fréquence f : En appliquant cette différence de potentiel entre chaque paire d'électrodes, il se crée un champ électrique quadripolaire. Un point de coordonnées (x,y,z) situé dans le champ électrique sera alors soumis au potentiel :
    • 40 Diagramme de stabilité d'un ion dans un quadripôle La trajectoire d'un ion pénétrant dans le quadripôle sera donc uniforme selon l'axe z et décrite par les équations de Mathieu selon les deux autres axes. Il est possible de définir en fonction des valeurs U et V des zones de stabilité telles que les coordonnées x et y de l'ion restent strictement inférieures à r0. L'une d'entre elles est exploitée en spectrométrie de masse (voir figure) (Les ions qui se trouvent dans cette zone auront donc une trajectoire stable dans le quadripole et seront détectés). En gardant constant le rapport U/V, on obtient une droite de fonctionnement de l'analyseur. Un balayage de U avec U/V constant permet l'observation successive de tous les ions dont la zone de stabilité est coupée par la droite de fonctionnement. La résolution entre ces ions est d'autant plus grande que la pente de la droite est élevée. Schéma de la trajectoire stable d'un ion traversant le quadripôle En l'absence de tension continue, tous les ions de rapports m/z supérieurs à celui fixé par la valeur de V appliquée auront une trajectoire stable (x et y < r0), le quadripôle est alors dit transparent et sert de focalisateur d'ions. Les principaux avantages du spectromètre quadripolaire résident dans sa souplesse d'utilisation, sa résolution unitaire sur toute sa gamme de masse, sa vitesse de balayage satisfaisante, ainsi que son adaptabilité à différentes interfaces permettant le couplage avec la chromatographie gazeuse ou liquide.
    • 41 L'analyseur octopolaire [] Analyseur octopolaire Identique à l'analyseur quadripolaire mais avec 8 électrodes, cet analyseur sert uniquement à la focalisation des ions. Le piège ionique quadripolaire ("trappe d'ions") [] Schéma de la trajectoire des ions dans un piège ionique (en vert) C'est un piège ionique où la préparation, l'analyse et la détection des ions s'effectuent dans un même espace, suivant des séquences temporelles successives. Le piège est constitué de trois électrodes à section hyperbolique : une électrode annulaire encadrée par deux électrodes-chapeaux (d'entrée et de sortie) qui forment les calottes supérieure et inférieure du dispositif. Une tension en radiofréquence combinée ou non à une tension continue U est appliquée entre l'électrode centrale et les deux électrodes calottes.[1] Le champ résultant est alors tridimensionnel. Les domaines de stabilité des ions sont à nouveau déterminés par les équations de Mathieu. Celui exploité est défini tel que lorsque les ions en sortent, leur trajectoire radiale reste stable contrairement à celle selon l'axe des z. Un balayage de l'amplitude de la radiofréquence V entraînera donc l'expulsion des ions piégés selon cet axe, vers le détecteur.[2] [3] Les trajectoires stables des ions, au sein du champ quadripolaire résultant sont tridimensionnelles, en forme de huit. Le temps de vol [] Article détaillé : Spectromètre de masse à temps de vol.
    • 42 L'analyseur à temps de vol consiste à mesurer le temps que met un ion, accéléré préalablement par une tension, à parcourir une distance donnée. Le rapport masse sur charge est directement mesurable à partir du temps de vol. Trajectoire d'un ion dans l'analyseur à temps de vol en mode linéaire Un analyseur à temps de vol se compose d'une zone d'accélération où est appliquée la tension accélératrice, et d'une zone appelée tube de vol, libre de champ. Les ions accélérés pénètrent dans le tube de vol libre de tout champ. La séparation des ions ne va donc dépendre que de la vitesse acquise lors de la phase d'accélération. Les ions de rapport m/z le plus petit parviendront au détecteur les premiers. Pour chaque groupe d'ions de même rapport m/z, un signal est enregistré au niveau du détecteur sous la forme d'une fonction temps/intensité. Ce mode de détection comporte cependant certaines limitations en termes de résolution : ainsi deux ions identiques, de même vitesse initiale, mais localisés à deux points différents, entreront dans le tube de vol à des vitesses et des temps différents. Celui le plus loin du détecteur à l'origine sera accéléré plus longtemps et aura donc un temps de vol plus court, d'où une dispersion en temps et en énergie. Le mode réflectron permet de pallier ce phénomène. Trajectoire d'un ion dans l'analyseur à temps de vol en mode réflectron
    • 43 En mode réflectron, un miroir électrostatique impose un champ électrique de direction opposée à celle du champ accélérateur initial, et donc du mouvement des ions. Ces derniers voient ainsi leur trajectoire modifiée : ils pénètrent dans le réflectron et en ressortent avec une vitesse longitudinale de sens opposé à leur vitesse initiale. Les ions les plus énergétiques arrivent les premiers au niveau du réflectron et vont y pénétrer plus profondément, ils seront donc réfléchis dans un temps plus long. De cette façon, tous les ions de même rapport m/z se trouvent focalisés sur un même plan, le détecteur du réflectron étant placé sur le plan de focalisation de ces ions.En outre, le réflectron permet d'allonger la distance de vol sans pour autant augmenter la taille de l'analyseur : les ions mettent plus de temps pour atteindre le détecteur, et réduisent aussi leur dispersion en temps, la résolution s'en trouve donc grandement améliorée. Le FT-ICR [] Schéma d'une cellule cubique ICR L’analyseur à résonance cyclotronique d’ion se compose d’une cellule ICR (de configuration cubique par exemple) qui comporte notamment six plaques sous tension, isolées les unes des autres. L’application d’un champ magnétostatique B suivant l’axe z soumet les ions à la force de Lorentz F = ez v ^ B. Leur mouvement dans le plan (xy) est alors « cyclotronique », c’est-à-dire circulaire uniforme de fréquence f= eB/(2π.m/z). Les ions sont par ailleurs confinés suivant l’axe z par un champ électrostatique imposé par les deux plaques parallèles au plan (Oxy), résultant de l’application d’une tension faible. Une fois piégés dans la cellule, les ions ont donc la même trajectoire mais pas la même position à un instant déterminé (a).
    • 44 Etapes de la spectrométrie de masse ICR : a) ions avant excitation, b) Excitation des ions jusqu’à atteindre une certaine orbite, c) mouvement cohérent des ions de même m/z créant le courant induit Il convient donc de donner aux ions de même m/z un mouvement d’ensemble en les mettant en phase, par résonance cyclotronique. Pour cela, les ions m/z sont excités par un champ alternatif de fréquence correspondant à leur fréquence cyclotron : pour exciter tous les ions d’une certaine gamme de m/z, une tension contenant toutes les fréquences cyclotron correspondantes est imposée. Les ions sont alors accélérés, mis en phase et voient le rayon de leur orbite augmenter (b). Le courant induit par le mouvement cohérent des ions de même m/z sera mesuré sur les plaques de détection (c) : ce sera une sinusoïde amorti de fréquence cyclotronique. Le courant induit total mesuré sera donc la somme de sinusoïdes amorties des fréquences cyclotroniques correspondant aux ions de m/z excités par résonance. La fréquence cyclotron étant proportionnelle à 1/(m/z), l’inverse de la transformée de Fourier du courant obtenu permet d’aboutir au spectre de masse en m/z. Cet analyseur a l’une des meilleures résolutions qui soient (Rs>100 000), dès lors le spectre MS a une plus grande capacité de pics, ce qui maximise la quantité d’informations pour l’analyse de mélanges complexes. Cependant, la largeur des pics étant proportionnelle à (m/z)², la résolution est meilleure aux m/z inférieures à 5000 Th. L’excellente précision du FT-ICR sur la mesure de masse (5-10 ppm) lève ou diminue les ambiguïtés sur l’identification des composés. La gamme de masse dépend de la valeur du champ magnétique, elle s’étend jusque 27000 Da pour un champ de 7 T. En revanche, la gamme dynamique est assez restreinte, avec 2-3 décades, car cet analyseur par confinement souffre du même défaut que le piège quadripolaire, la coexistence possible d’un nombre limité d’ions. Dès lors, les pics très minoritaires dans le spectre de masse présenteront une mesure de masse moins précise. Le FT-ICR permet l’analyse en MS/MS dans la cellule même, avec possibilités variées d’activation des ions et donc de fragmentations sélectives. L'orbitrap []
    • 45 Trajectoire des ions dans un orbitrap (en rouge) L’orbitrap se compose d’une électrode creuse, à l’intérieur de laquelle est placée coaxialement une électrode en forme de fuseau. La forme particulière de ces deux électrodes permet l’imposition d’un champ électrostatique quadro-logarithmique avec la tension : . avec Rm rayon caractéristique de l’électrode centrale, k courbure du champ, et C une constante. Le champ est en particulier quadripolaire suivant l’axe z des électrodes. Les ions sont injectés tangentiellement à l’électrode centrale et piégés autour d’elle par la force électrostatique qui compense les forces centrifuges. Le mouvement des ions se décompose alors ainsi : un mouvement circulaire autour de l’électrode centrale dans le plan (xy) et un mouvement oscillatoire de va-et-vient selon l’axe z.[4] En particulier, les ions d’un m/z donné seront sur la même trajectoire circulaire qui oscille axialement avec une fréquence f. f est indépendante de la vitesse ou de l’énergie des ions et s’exprime comme 1/2π√(km/z). De la même façon que pour le FT-ICR, le courant induit par ces oscillations permet par une transformée de Fourier d’accéder aux m/z. La précision des mesures de m/z est particulièrement bonne (1-2 ppm) et la résolution (jusque 100 000) rivalise avec celle du FT-ICR, d’autant qu’étant proportionnelle à 1/√(m/z), elle diminue moins vite avec le rapport m/z que dans le cas du FT-ICR. La gamme dynamique est satisfaisante (> 3 décades).[5] L’orbitrap est principalement utilisée en spectrométrie de masse en tandem, associée à un piège linéaire. L'analyseur à secteur magnétique []
    • 46 Schéma de la structure d’un spectromètre de masse : exemple d'un spectromètre de masse à secteur magnétique associé à une source d'ionisation d'impact électronique L'ion est éjecté dans un milieu dans lequel règne un champ magnétique uniforme perpendiculaire au plan de la trajectoire. Du fait de la force de Lorentz, la trajectoire se courbe, et le point d'impact de l'ion (donc sa déviation) permet de connaître sa masse à partir de la charge. En effet, soit le champ magnétique (dirigeant ) de coordonnées et la vitesse initiale orthogonale à , elle dirige . On a alors: . D'où, en écrivant la relation fondamentale de la dynamique : . Soit: où . Posons . On a alors .
    • 47 En résolvant, . Et donc: (à l'aide des conditions initiales). Il s'agit bien de l'équation paramétrique d'un cercle de rayon . Le spectromètre mesure ensuite les distances d'impact lorsque la particule a effectué un demi- cercle. La distance au point d'origine correspond au diamètre donc au double du rayon donné par la dernière formule. La charge de la particule permet donc d'en déduire sa masse. Le détecteur [] Comme les analyseurs et les sources, il existe différents types de détecteurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents, mais leur rôle reste le même, compter les ions. C'est une partie placée sous vide (10-5 - 10-7 Torr).  Les plaques photographiques sont le détecteur historique. La plaque est enduite d'une émulsion de bromure d'argent, son noircissement donne une valeur relative de l'intensité du flux (quantité d'ions). Cette technique est très peu sensible.  Le cylindre de Faraday a pour principe le suivant : le transfert de charge de l'ion est détecté sur une surface conductrice, puis le signal est amplifié. Cette technique est précise mais peu sensible, avec une certaine lenteur de mesure et un bruit de fond important.  Le multiplicateur d'électrons est le détecteur le plus courant. Le signal est amplifié par la formation d'électrons secondaires à l'aide de tubes en verre dopés au plomb (dynode). Il possède une bonne sensibilité, avec une amplification forte mais il est moins précis que le cylindre de Faraday. Il a en outre une durée de vie limitée. La galette de microcanaux, autre détecteur, peut être considérée comme assemblage de multiplicateurs d'électrons.  Le multiplicateur de photons est dérivé du multiplicateur d'électrons : le signal est amplifié par la formation d'électrons secondaires à l'aide de tubes en verre dopés au plomb (dynode). Ceux-ci sont accélérés vers un écran phosphorescent où ils sont convertis en photons. Ces photons sont ensuite détectés par le photomultiplicateur. Il présente une bonne sensibilité, avec amplification forte mais le balayage est moins rapide qu'avec un multiplicateur d'électrons. La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) [] Voir aussi : Séquençage par spectrométrie de masse
    • 48 La spectrométrie de masse en tandem consiste à sélectionner un ion par une première spectrométrie de masse, à le fragmenter, puis à effectuer une deuxième spectrométrie de masse sur les fragments ainsi générés. Elle peut être réalisée à l'aide de nombreux appareils combinant des secteurs magnétiques, électriques, quadripolaires ou des temps de vol, mais également au sein d'un même analyseur dans le cas d'une trappe d'ions. Le triple quadripôle [] Structure d'un triple quadripole Un triple quadripôle résulte de l'association de deux analyseurs quadripolaires en série, séparés par une cellule de collision souvent constituée d'un quadripôle plus court. Cette combinaison de quadripôles permet de travailler en MS simple ou en tandem. Pour réaliser une acquisition en MS, il suffit de n'appliquer qu'une tension alternative à l'un des analyseurs pour le rendre "transparent" comme la cellule de collision, celle-ci ne contenant alors pas de gaz. Lors d'une acquisition en MS/MS, la cellule de collision est remplie d'un gaz inerte (argon par exemple) sous une pression relativement élevée (10 − 2 torr). L'énergie cinétique de l'ion sélectionné est convertie lors de ses collisions successives en énergie interne. La dissociation de l'ion se réalisera lorsque son énergie interne sera devenue supérieure à l'énergie d'activation nécessaire à la fragmentation. Cette technique de dissociation activée par collision (CAD) peut être amplifiée en augmentant l'énergie cinétique des ions sélectionnées par application d'une différence de potentiel entre la source et la cellule de collision. L'analyse MS/MS peut être menée selon quatre modes différents selon l'information recherchée : le mode descendant est le plus utilisé pour obtenir des informations structurales, les deux modes (ascendant et perte de neutre) sont d'un usage plus restreint et permettent de mettre en évidence
    • 49 des ions ayant des particularités communes. Le quatrième mode (Multiple Reaction Monitoring ou MRM), dérivé du mode descendant, est voué à la quantification.  en mode descendant, l'ion à étudier est sélectionné en focalisant le premier analyseur sur son rapport m/z. Les fragments formés dans la cellule de collision sont séparés par le deuxième analyseur et analysés. Le spectre obtenu présente à la fois l'ion précurseur (ou ion parent) et ses ions fragments (ou ions produits).  en mode ascendant, le premier analyseur balaie une gamme de masse tandis que le deuxième est focalisé sur un seul rapport m/z. Tous les ions générés en source et capables de donner un fragment de même rapport m/z seront donc ainsi détectés.  en mode perte de neutre, les deux analyseurs balaient une gamme de masse simultanément et avec un décalage de masse constant. Le spectre établi présentera alors tous les ions parents capables de se fragmenter en générant un neutre de masse égale au décalage imposé.  en mode MRM, l'ion parent à étudier est sélectionné par le premier analyseur et fragmenté dans la cellule de collision, comme en mode descendant. En revanche, le second analyseur est focalisé sur l'ion produit. Ce mode de fonctionnement présente une double sélectivité, au niveau des sélections de l'ion parent et de l'ion produit. En outre les deux analyseurs étant fixées à des tensions constantes, la sensibilité de détection est améliorée par rapport à d'autres modes de balayage, faisant de la MRM un mode de choix pour la quantification. MSn en piège quadripolaire ("trappe d'ions") [] Au sein d'un piège quadripolaire ("trappe d'ions"), l'analyse en tandem se réalise dans un premier temps par sélection d'ions dont la valeur m/z est choisie. Ces ions piégés vont ensuite se fragmenter par collision (acquisition d'énergie interne, excitation vibrationnelle) à l'aide d'une tension RF (radiofréquence) correspondant à leur fréquence de résonance, et les ions produits formés sont à leur tour piégés. Une éjection sélective en masse des ions produits (fragments) peut alors être réalisée en vue de leur analyse. L'obtention d'ions de générations supérieures est possible par simple renouvellement du processus (sélection d'un ion produit, fragmentation, sélection d'un ion produit de 2e génération, fragmentation, etc...). Cette séquence est appelée MSn , n étant le nombre de générations d'ions. Ainsi la MS2 est la MS-MS et ainsi de suite... Hybride [] Associer plusieurs types d'analyseur dans un spectromètre de masse en tandem permet de combiner les points forts des deux types d'analyseurs.  Quadripôle/temps de vol : Ces appareils appelés Q-TOF sont constitués d'un double quadripôle (1er analyseur + cellule de collision) et d'un analyseur à temps de vol comme second analyseur. Le quadripôle procure ainsi une grande efficacité au processus MS/MS, tandis que le TOF apporte son excellente sensibilité, sa grande rapidité d'analyse et ses résolution et précision en masse bien meilleure sur les ions produits, par rapport à une configuration triple quadripôle. Cependant ces instruments sont limités par la faible gamme dynamique du TOF.
    • 50  Quadripôle/trappe d'ions : Cette combinaison permet d'éviter les problèmes de charge d'espace associés à la trappe d'ions. La trappe apporte une meilleure sensibilité et une vitesse d'analyse plus rapide. En outre, par rapport à une trappe simple, cette combinaison autorise tous les modes d'acquisition MS/MS du triple quadripôle (perte de neutre et mode ascendant).  Trappe/temps de vol : L'association d'une trappe d'ions et d'un TOF permet d'accéder à une analyse structurale très poussée par MSn grâce à la trappe, mais présente aussi une grande précision en masse sur les ions précurseurs et produits pour détermination des formules brutes, complétant ainsi l'identification. Cet appareil hybride est ainsi principalement dédié à l'identification et à l'analyse structurale.  Trappe/FT-ICR ou Trappe/Orbitrap : Le but de ce genre de couplage est d'obtenir une précision en masse et une résolution, qui soient encore meilleures qu'avec un TOF comme deuxième analyseur, et permettent l'établissement de formules brutes sans ambiguités et donc une identification facilitée. Ces appareils représentent cependant un investissement bien supérieur, comparés à un trappe/temps de vol.