15. Evaluación del Sist. Inmunológico (01-Oct-2013)

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15. Evaluación del Sist. Inmunológico (01-Oct-2013)

  1. 1. EVALUACION DEL SISTEMA INMUNOLOGICO Castro Lugo Omar Alonso Arrieta Madrid José Luis Dr. Jorge Velázquez Gálvez
  2. 2.  En laboratorios clínicos se dispone de numerosas técnicas para determinar fallas en los mecanismos de respuesta inmune  En lab de investigación se puede:  Evaluar el funcionamiento de una cel en un sistema.  La ausencia o alteración en la expresión de una citoquina o enzima.  Detectar anormalidades de algún mecanismo específico mediante biología molecular
  3. 3. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD INNATA  Se deben cuantificar y evaluar las células del sistema inmune y algunas proteínas  Cels del sistema inmune: Es posible cuantificar el numero, las subpoblaciones, el fenotipo y sus funciones de respuesta a la quimiotaxis, fagocitosis y participación en la inflamación.  Proteínas: Se deben estudiar las de la fase aguda como la CRP, interferones, citoquinas, quimioquinas y factores del sist de complemento
  4. 4.  Recuento diferencial y morfología de las diferentes células: La evaluación de un leucograma o un extendido de sangre permiten detectar anormalidades y tener una idea de la morfología y num de plaquetas.  Evaluación de la quimiotaxis: La migración de PMN frente a un estímulo quimiotactico se mide con el empleo de la Cámara de Boyden.  Prueba de la agarosa:  Ventana cutánea de Rebuck: Prueba que establece si la llegada de PMN y MØ ocurre en cantidad y frecuencia adecuada.
  5. 5.  Evaluación de la fagocitosis: Cuantifica en num de PMN y de MØ y su funcionalidad.  Recuento de los glóbulos blancos:La presencia de un num adecuado de neutrófilos no es garantía de defensa. La quimioluminicencia es una técnica que se basa en la medición de la radiación electromagnética que emiten los PMN luego de la ingestión de microorganismos.
  6. 6.  Evaluación del sist de complemento  Dosificación individual de factores: En lab de investigación se pueden medir cada uno de los 20 componentes diferentes del sistema. Su dosificación se hace por la técnica de inmunodifusión radial  Evaluación de la inflamación:  Eritrosedimentación: Índice inespecífico de la existencia de inflamación, un valor normal descarta una infección bacteriana  Dosificación de la CRP: Mide la concentración de la proteína C reactiva, cuyos niveles incrementan notoriamente durante la inflamación aguda.  Prueba de liberación de histamina: Evalúa la degranulación de los mastocitos y basófilos.
  7. 7. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR ADQUIRIDA  Evaluación de los L:  Extendido de sangre: Permite establecer la ausencia, disminución o incremento de los L, asi como alteraciones en su morfología.  Recuento total de L en sangre periférica: Menos de 1000 L uL indica deficiencia, más de la cifra indica infección  Estudio de subpoblaciones de L: Es necesario los sig pasos - La separación de los L de las demas cels sanguíneas se logra por medio de centrifugación por densidad diferencial para lo cual se emplean concentraciones variables de Ficoll-hipaque
  8. 8. -Marcar las diferentes subpoblaciones por medio de AcMc conjugados con fluorocromos contra las diferentes moléculas CD que caracterizan las dif subpoblaciones de L. -Citometría de flujo es una técnica de análisis celular que se basa en pasar una suspensión de cels por delante de un láser focalizado, el impacto produce señales ópticas que corresponden a diferentes parámetros celulares y que son captadas por distintos detectores, éstos convierten a dichas señales en electrónicas que posteriormente se digitalizan para permitir cuantificar el num de L.
  9. 9.  Clasificación del grado de desarrollo de los L: Con AcMc que reconozcan los diferentes CD presentes en la membrana de los L y los MØ es posible determinar el grado de madurez de las diferentes cels.  Evaluación de las cels NK: Para cuantificarlas se pueden separar de otras cels mononucleares por gradientes de Ficoll-hipaque y por medio de AcMc contra CD16, CD56 y CD57.  Estudio de las citoquinas:  Deteccion de citoquinas y su cuantificación: Existen juegos de reactivos para detectar y cuantificar c/u de las citoquinas.
  10. 10. EVALUACION DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Existen distintos métodos para cuantificar las Ig o evaluar las reacciones Ag-Ac.  El 20% de las proteínas plasmáticas son Ig.  Medición de las diferentes clases de Ig: Se hace por medio de electroforesis que permite evidenciar diferencias muy marcadas de ellas  Inmunoelectroforesis: Técnica que pone en evidencia la falta de alguna clase de Ig.  Dosificacion individual de la Ig G, A y M: La cuantificación de la IgM específica contra Ag bacterianos sirve para detectar infección aguda, su presencia en el cordón umbilical indica que hubo infección en VIU
  11. 11.  Dosificación de la IgE: Sus concentraciones plasmáticas son pequeñas y no dosificables por la inmunodifusión radial por lo cual se acude a la nefelometría, procedimiento que se basa en la dispersión de una radiación que atraviesa las partículas
  12. 12. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Evaluación de las reacciones antígeno-anticuerpo: los métodos in vitro buscan, en primer lugar identificar Ac, y en segundo lugar cuantificarlo. Se puede detectar por medio de pruebas:  Reacciones de precipitación: son las que ocurren entre moléculas de un Ag soluble y el Ac correspondiente.  inmunodifusion doble (Oschterlony): permite la detección de Ac-Ag específicos y la evaluación de su reacción cruzada. Por el uso de tres diferentes patrones: identidad, no identidad e identidad parcial.
  13. 13. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Inmunodifusion radial simple (SRID, Manzini): se usa para cuantificar Ac. El suero que se cree que los contiene se deposita en los pozos y se usa el gel que contiene Ag.  Aglutinación: este proceso ocurre cuando los Ac están dirigidos a Ag que están en las superficies de células o formando parte de membranas de microorganismos y el Ac produce una agregación de diferentes células.  Prueba de coombs: es una prueba de hemaglutinación que detecta Ac contra los glóbulos rojos.
  14. 14. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Detección de Ag y de Ac: los Ag son identificados por los Ac permitiéndose su detección y su cuantificación sin importar que la muestra este en muy pequeñas cantidades que se dificulte por medios químicos.  Prueba de citotoxinas: técnica que permite la detección e identificación de Ac específicos por la lisis de células blanco en presencia del complemento.  Radioinmunoensayo (RIA): se usa para detectar Ag o Ac usando reactivos radiomarcados. Es una prueba muy sensible pero contaminante del medio ambiente.
  15. 15. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Ensayo inmunoenzimatico (ELISA): es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo. Sirve para detectar el VIH/SIDA.
  16. 16. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Anticuerpos fluorescentes: se acude a esta técnica cuando el Ac no se puede evidenciar por los sistemas directos de precipitación, aglutinación o fijación del complemento. Es la mas sensible y detecta pequeñas cantidades de Ac que se haya fijado a células o tejido o que este en solución.
  17. 17. EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL ADQUIRIDA  Fijación del complemento: muchas reacciones Ag-Ac tienen la característica de activar el complemento, y este lesiona y destruye la célula o microorganismo que obra como Ag. Las reacciones Ag-Ac que activan el complemento no muestran ninguna manifestación. Se necesita un indicador que consiste en glóbulos rojos de carnero y Ac contra ellos. Si en la reacción Ag-Ac activa o se fija el complemento, se consumirá en la primera fase y no habrá lisis. Pero si al estudiarlo no hay reacción por falta de Ac, no habrá fijación del complemento y quedara disponible para ser activado por la reacción Ag-Ac del sistema indicador y habrá lisis de los glóbulos rojos de carnero. Esta prueba de fijación de complemento era importante en la prueba de Wassermann, antes empleada en el diagnostico de la sífilis.
  18. 18. EVALUACIÓN DEL ESTADO ALÉRGICO  Dosificación de IgE: las Ig se mide por nefelometría.  Dosificación de IgE especifica: juegos de reactivos comerciales permiten, por radioinmunoensayo, dosificar Ac de la clase IgE específicos contra diferentes alérgenos.  Recuento de eosinófilos: se puede hacer en sangre, en secreción nasal, en esputo o por medio de coloraciones especiales en tejidos.  Intradermorreacciones: Reacción inflamatoria cutánea que se produce cuando en la dermis se inyecta una sustancia que se comporta como antígeno; se utiliza para conocer el grado de receptividad o la inmunidad del paciente hacia la toxina inyectada y para determinar la naturaleza alérgica de una enfermedad
  19. 19. IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS DEL MHC  Reacción en cadena de polimerasa, PCR: método utilizado en la actualidad para tipificar antígenos clase II.
  20. 20. EVALUACIÓN DE PROBLEMAS AUTOINMUNES  La evaluación de un proceso autoinmune demanda un amplio soporte de laboratorio. Es necesario evaluar mediante los procesos de inflamación, del sistema de complemento e identificar por inmunoflourecencia la presencia de Ac contra determinados Ag.  Determinación de Ac antinucleares  Dosificación de complejos inmunes: los complejos inmunes pueden estar libres en el plasma o adheridos a GR. El método que mas se aproxima para medirlos es evaluarlos indirectamente por el C1q del complemento, a la cual le tienen gran afinidad, mide luego la cantidad de IgG.
  21. 21. EVALUACIÓN GENÉTICAS Y EPIGENICAS  Por distintos métodos como:  Cariotipos: permite identificar todos los genes para ver si hay carencias, anormalidades individuales o trasposiciones.  Microarreglos: por el genoma humano permite preparar microarreglos, con los cuales se puede establecer la carencia o anormalidad de los genes que participan en la respuesta inmune.  Detección de RNA  Modificaciones de histonas y acetilación del DNA: estas técnicas permiten identificar alteraciones en la cromatina y en las histonas y así establecer si partículas pequeñas de RNA se han unido al DNA para activar o reprimir la expresión de un gen determinado.

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