Università degli Studi di Bari DIPARTIMENTO DI SCIENZE MEDICHE DI BASE NUOVO COMPLESSO DELLE SCIENZE BIOMEDICHE  CORSO DI ...
INDICE  1. ANALISI CHIMICA DEI COSTITUENTI MINORI DEGLI OLI EXTRAVERGINE DI OLIVA                   pag 1   1.1 Composizio...
5.1 Raccolta delle olive                                                                                                  ...
11. ANALISI CHIMICA DEI COSTITUENTI MINORI DEGLI OLI EXTRAVERGINE DI OLIVA  1.1 Composizione chimica dell’olio extra‐vergi...
2importante sia dal punto di vista nutrizionale‐salutistico che organolettico; essi rappresentano anche un prezioso riferi...
3Metilsteroli  Obtusifoliolo, gramisterolo, citrostadienolo, isocitrostadienolo. Presenti in quantità molto basse (circa 1...
4da  glucosidi  complessi  presenti  nel  frutto  dell’oliva  tra  i  quali  emergono  l’oleuropeina  e  la dimetiloleurop...
5 Tabella 2. Composti fenolici dell’olio extra‐vergine di oliva. Acidi fenolici  e derivati Acido vanillico  Acido siringi...
6L’idrossitirosolo è il componente fenolico più importante ed esclusivo degli oli vergini ed extravergini di oliva che, ol...
70% al 40%. In alcuni casi prima di procedere con l’estrazione LLE viene aggiunto all’olio di oliva un solvente  lipofilic...
8Ciocalteau  sull’estratto  fenolico  ottenuto  dall’olio  di  oliva.  Questo  metodo  si  basa  sull’ossidazione chimica ...
9Nell’analisi UV dell’olio si usa esprimere lassorbanza specifica con la lettera K. Ad esempio K268 indica lassorbanza spe...
10fase mobile che fluisce attraverso essa. La fase stazionaria è impaccata in una colonna chiusa con materiali  con  granu...
11Nell’HPLC  il  campione  da  analizzare  viene  caricato  all’inizio  della  colonna  cromatografica  e  viene spinto at...
12servono a trattenere il materiale in essa contenuto. I setti devono essere omogenei per consentire un flusso uniforme di...
13I rivelatori più ampiamente usati per l’HPLC si basano sulla misura dell’assorbimento della luce UV o visibile da parte ...
14Il rivelatore a serie di diodi risulta essere molto versatile (è possibile selezionare λ che vanno da 190 a 800 nm), mol...
15Il principio di funzionamento del detector a fluorescenza è il seguente: la luce UV proveniente da una lampada  (filtrat...
16una  polarità  e  lo  spettro  consisterà  o  di  soli  ioni  positivi  o  di  soli  ioni  negativi.  Le  molecole  non ...
17Questo processo continua fino a che le gocce non sono abbastanza piccole da permettere allo ione dell’analita il passagg...
18le due tecniche sono necessarie opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi devono consentire anche la vaporizzazi...
192. VALUTAZIONE  BIOCHIMICA  E  BIOLOGICO  MOLECOLARE  DEL  VALORE  ANTIOSSIDANTE  DEI     COSTITUENTI MINORI E DELL’IMPA...
20A questi composti fenolici, sono stati attribuiti effetti rilevanti nella prevenzione primaria e secondaria di alcuni im...
21dell’angiotensina, protein  chinasi, di interagire con le vie di trasduzione  del segnale, con i recettori cellulari,  c...
22l’omeostasi  redox,  aumentando  l’eliminazione  dei  radicali  o  bloccandone  la  produzione.  Essi comprendono  difes...
23dell’espressione  di  geni  che  codificano  enzimi  coinvolti  nella  biosintesi  del  glutatione  (GSH),  in particola...
24radiazioni  UV  a  carico  dell’epidermide  (Ichihashi  et  al.,  2003),  e  risulta  essere  un  fattore  di prevenzion...
25trattamento  con  idrossitirosolo  riduce  drasticamente  la  produzione  di  NO  e  la  formazione  di  ROS indotta da ...
26contribuire ad una minore incidenza di cancro al seno nelle popolazioni che consumano olio di oliva vergine per la sua a...
27(Tfam).  Inoltre,  l’HT  incrementa  il  mtDNA;  promuove  l’espressione  di  proteine  del  complesso mitocondriale  I,...
28fisiologici  cellulari  di  base.  Infatti,  se  da  un  lato,  come  antiossidanti,  possono  migliorare  la sopravvive...
29Inoltre, è stato recentemente dimostrato che 3,4‐DHPEA è in grado di inibire la proliferazione indotta dall’estradiolo i...
30diabetici. In tali ratti si osserva una diminuzione delle attività antiossidanti, in particolare nella SOD e CAT e un in...
31benefici  sulle  performance  fisiche  e  potrebbe  avere,  quindi,  effetti  rilevanti  su  varie  patologie correlate ...
32Benzie IFF. Antioxidants: observational epidemiology. In: Sadler MJ, Strain JJ, Cabellero B (Ed.). The Encyclopedia of h...
33Fabiani R et al. Production of hydrogen peroxide is responsible for the induction of apoptosis on HL60 cells. Mol Nutr F...
34Kobayashi  M,  and  Yamamoto  M.  Molecular  mechanisms  activating  the  Nrf2‐Keap1  pathway  of antioxidant gene regul...
35Powers  SK  and  Jackson  MJ.  Exercise‐induced  oxidative  stress:  cellular  mechanisms  and  impact  on muscle force ...
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari

1,054

Published on

Tesina a cura della dott.ssa Raffaella trentadue - Corso di formazione "valore nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari” - Università degli studi di Bari luglio 2012

Published in: Health & Medicine
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
1,054
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
12
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Raffaella Trentadue - Valutazione nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari

  1. 1. Università degli Studi di Bari DIPARTIMENTO DI SCIENZE MEDICHE DI BASE NUOVO COMPLESSO DELLE SCIENZE BIOMEDICHE  CORSO DI FORMAZIONE SU “VALUTAZIONE NUTRIZIONALE E SALUTISTICA DI PRODOTTI AGROALIMENTARI”  PROGETTO STRATEGICO CIP_PS101   Relazione finale             Responsabile Scientifico: Chiar.mo Prof. Sergio Papa                      Formanda: dott.ssa Raffaella Trentadue 
  2. 2. INDICE  1. ANALISI CHIMICA DEI COSTITUENTI MINORI DEGLI OLI EXTRAVERGINE DI OLIVA                   pag 1   1.1 Composizione chimica dell’olio extra‐vergine di oliva                                                                               pag 1 1.2 La componente antiossidante dell’olio extra‐vergine di oliva: i composti a struttura fenolica        pag 3 1.3 Estrazione e separazione delle sostanze fenoliche dalla matrice oleosa e  valutazione del contenuto fenolico totale                                                                                                                                                           pag 6 1.4 Analisi spettrofotometrica della componente fenolica dell’olio di oliva                                               pag 7 1.5 Separazione e valutazione delle frazioni contenute nell’estratto fenolico dell’olio extravergine  di oliva                                                                                                                                                                             pag 9  2. VALUTAZIONE BIOCHIMICA E BIOLOGICO MOLECOLARE DEL VALORE ANTIOSSIDANTE DEI     COSTITUENTI MINORI E DELL’IMPATTO SULLA BIOENERGETICA CELLULARE                              pag 19 3. VALUTAZIONE CLINICA DEL POTERE SALUTISTICO DELL’OLIO EXTRAVERGINE DI OLIVA          pag 37  3.1 Lolio extravergine di oliva e le patologie cardiovascolari                                                                       pag 44 3.2 Lazione salutistica dei biofenoli dellolio da olive                                                                                    pag 45  4. VALUTAZIONE  ORGANOLETTICA  SENSORIALE:  PREGI  E  DIFETTI  DELL’OLIO  EXTRAVERGINE  DI OLIVA                                                                                                                                                           pag 51 4.1 Esame olfattivo                                                                                                                                          pag 62 4.2 Esame gustativo                                                                                                                                        pag 62 4.3 Colore degli oli                                                                                                                                           pag 63 4.4 Fluidità degli oli                                                                                                                                         pag 63 4.5 Aspetto degli oli                                                                                                                                         pag 63 4.6 Attributi positivi di un olio                                                                                                                      pag 64 4.7 Attributi negativi di un olio                                                                                                                     pag 65 4.8 I difetti dell’olio                                                                                                                                         pag 72                        4.9 Cattiva qualità delle olive                                                                                                                        pag 72                        5.  PROCEDURE PER LA PRODUZIONE DELL’OLIO EXTRAVERGINE DI OLIVA                                     pag 74                        
  3. 3. 5.1 Raccolta delle olive                                                                                                                                  pag 77                         5.2 Trasporto al frantoio e stoccaggio delle olive                                                                                    pag  79                        5.3 Molitura e frangitura                                                                                                                               pag  82                        5.4  Gramolazione della pasta delle olive                                                                                                  pag 84                         5.5  Estrazione dell’olio                                                                                                                                  pag 85                         5.6  Stoccaggio dell’olio prodotto                                                                                                                pag 91                                       
  4. 4. 11. ANALISI CHIMICA DEI COSTITUENTI MINORI DEGLI OLI EXTRAVERGINE DI OLIVA  1.1 Composizione chimica dell’olio extra‐vergine di oliva  L’olio extravergine di oliva è una delle principali fonti di grassi nella cosiddetta dieta mediterranea ed ha una composizione chimica del tutto peculiare ed una qualità nutrizionale notevolmente superiore rispetto agli altri oli ottenuti da semi. Si ottiene unicamente per estrazione meccanica e può essere consumato  direttamente  senza  alcun  ulteriore  trattamento  fisico‐chimico  di  raffinazione  e rettificazione. Come la maggior parte dei grassi vegetali, l’olio extravergine di oliva è costituito per il 98‐99% da una miscela di gliceridi (esteri del glicerolo con acidi grassi) detta anche frazione saponificabile e, per il rimanente 1‐2%, da un insieme di costituenti secondari che rappresentano la frazione di natura non gliceridica cioè insaponificabile.  Mentre i componenti della prima frazione sono pressocchè uguali in tutti  gli  oli  di  oliva,  quelli  della  seconda,  subiscono  variazioni  qualititative  e  quantitative  tali  da comportare una netta differenziazione (organolettica, nutrizionale, dietetica e merceologica). I  costituenti  principali  della  frazione  saponificabile  sono  i  trigliceridi,  solitamente  in  percentuale superiore  al  95%;  in  origine  si  trovano  quasi  esclusivamente  nella  polpa  delle  olive,  sono  fonte  di energia  per  l’organismo  umano,  infatti  apportano  acidi  grassi  essenziali  cioè  non  riproducibili dall’organismo, favoriscono l’assorbimento di vitamine liposolubili, hanno un’azione protettiva (quelli insaturi) per l’azione verso i radicali liberi e il colesterolo nell’organismo; in piccola percentuale sono presenti anche digliceridi, monogliceridi ed acidi grassi liberi.  Gli acidi grassi presenti nei gliceridi dell’olio extravergine di oliva sono in prevalenza monoinsaturi (con un solo doppio legame lungo la catena alifatica) e, in minori concentrazioni, saturi (senza doppi legami) e polinsaturi (con 2 o 3 doppi legami).  Gli  acidi  grassi  più  rappresentativi  sono  i  saturi  palmitico  (C16:0)  e  stearico  (C18:0);  i  monoinsaturi palmitoleico (C16:1) ed oleico (C18:1) ed i polinsaturi linoleico (C18:2) e linolenico (C18:3). Questi ultimi sono acidi grassi essenziali (AGE), rispettivamente precursori degli acidi grassi ω‐6 ed ω‐3, che devono essere introdotti con l’alimentazione in quanto l’organismo umano non è in grado di sintetizzarli. I  composti  minori  dell’olio  extravergine  di  oliva  pur  essendo  presenti  in  modeste  quantità costituiscono  un  numeroso  gruppo  di  sostanze  chimiche  (più  di  230)  che  svolgono  un  ruolo 
  5. 5. 2importante sia dal punto di vista nutrizionale‐salutistico che organolettico; essi rappresentano anche un prezioso riferimento analitico per il controllo di genuinità del prodotto. I costituenti secondari dell’olio extravergine di oliva appartengono a diverse classi e possono essere distinti  in  composti  saponificabili  (fosfolipidi,  cere  e  sfingolipidi)  ed  insaponificabili  (idrocarburi, tocoferoli,  alcoli  alifatici  superiori,  steroli,  metilsteroli,  alcoli  diterpenici  e  triterpenici,  vitamine, pigmenti ed ubichinoni) (Tabella 1).    Tabella 1. Costituenti minori presenti nell’olio extra‐vergine di oliva. a) Composti saponificabili   Fosfolipidi   Fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina. Chimicamente sono dei derivati dell’acido glicerofosforico, presenti in quantità variabili ma mai elevate.  Cere  Miscele complesse di esteri di acidi grassi a lunga catena con alcoli superiori. Costituiscono il rivestimento protettivo della drupa.  Sfingolipidi  Ammidi di acidi grassi con basi a lunga catena.  b) Composti insaponificabili   Idrocarburi  Costituiscono oltre il 50% della frazione insaponificabile nell’olio extra‐vergine di oliva.  Tra gli idrocarburi saturi il nonacosano è il predominante, tra gli insaturi il componente più presente è lo squalene (precursore biosintetico di tutti gli steroli).  Tocoferoli   α‐, β‐ e γ‐tocoferolo. Sono responsabili della stabilità ossidativa dell’olio.  Alcoli alifatici superiori  Docosanolo, tetracosanolo, esacosanolo.Si  trovano  prevalentemente  esterificati  con  acidi  grassi  e  formano  le  cere  che  ricoprono  il frutto.  Steroli  β‐sitosterolo si oppone all’assorbimento intestinale del colesterolo. Campesterolo, stigmasterolo, ∆ 5‐avenasterolo.  
  6. 6. 3Metilsteroli  Obtusifoliolo, gramisterolo, citrostadienolo, isocitrostadienolo. Presenti in quantità molto basse (circa 150 ppm).  Alcoli terpenici   Alcoli diterpenici, triterpenici, dialcoli triterpenici.Il  cicloartenolo  (alcool  triterpenico)  favorisce  l’eliminazione  del  colesterolo  in  seguito all’aumento della secrezione degli acidi biliari.  Eritrodiolo ed uvaolo (dialcoli triterpenici) provengono dalla buccia.  Vitamine  Liposolubili (A, D, PP, H). Pigmenti  Carotenoidi (β‐carotene, luteina) responsabili delle tonalità gialle dell’olio. Clorofille (clorofilla, feofitine) responsabili delle tonalità verdi.  Ubichinoni  Coenzima Q10 presente in quantità variabili da 0 a 40 ppm.Chimicamente  costituiti  da  un  nucleo  2,3‐dimetossi‐5‐metilbenzochinone  con  una  catena laterale (in posizione 6) formata da 6 a 10 unità isopreniche.   1.2 La componente antiossidante dell’olio extra‐vergine di oliva: i composti a struttura fenolica  Nella  frazione  insaponificabile  dell’olio  extravergine  di  oliva  si  ritrovano  i  cosiddetti  antiossidanti naturali  rappresentati  da  caroteni,  tocoferoli  e  sostanze  fenoliche  idrofiliche.  Questi  antiossidanti sono le molecole maggiormente correlate con le proprietà salutistiche dell’olio extravergine di oliva, però bisogna sottolineare che mentre i tocoferoli ed i carotenoidi si possono ritrovare anche in altri grassi  vegetali  o  animali,  le  sostanze  fenoliche  idrofiliche  sono  presenti  esclusivamente  nell’olio vergine ed extravergine di oliva. Queste sostanze chimiche appartengono a diverse classi come alcoli alifatici  e  terpenici,  steroli,  cere,  idrocarburi,  carotenoidi,  pigmenti,  vitamine,  composti  volatili  e sostanze  fenoliche.  I  carotenoidi  e  le  clorofille  caratterizzano  il  colore  dell’olio,  le  clorofilla conferiscono all’olio il colore verde, mentre i carotenoidi sono responsabili del colore giallo. Mediamente la quantità di sostanze fenoliche presenti nell’olio extravergine di oliva oscilla tra 60 e 400 mg/Kg. Questi composti sono quelli maggiormente correlati con le proprietà salutistiche dell’olio. I  composti  fenolici  dell’olio  extravergine  di  oliva  si  originano  durante  il  processo  di  estrazione meccanica  dell’olio  (principalmente  durante  la  frangitura  e  la  gramolatura)  a  partire  da  alcuni composti presenti nel frutto dell’oliva in seguito all’azione di enzimi idrolitici (β‐glucosidasi) a partire 
  7. 7. 4da  glucosidi  complessi  presenti  nel  frutto  dell’oliva  tra  i  quali  emergono  l’oleuropeina  e  la dimetiloleuropeina;  questi  composti  glucosidici  sono  anche  i  responsabili  del  sapore  amaro  delle olive.     La composizione qualitativa e quantitativa delle sostanze fenoliche dell’olio vergine ed extravergine di oliva dipende da molteplici fattori quali cultivar, metodo di coltivazione, grado di maturazione della drupa, tecnologia di estrazione utilizzata, nonché modalità di conservazione dell’olio. I  composti  fenolici  e  polifenolici  dell’olio  extra‐vergine  di  oliva,  detti  anche  biofenoli,  sono  stati individuati più di 100 anni fa da un chimico italiano, Canzonieri (1906)(1); da allora, e soprattutto negli ultimi 50 anni, le ricerche in questo campo sono aumentate ed hanno portato alla conoscenza delle principali strutture chimiche dei composti che costituiscono tale frazione (2,3). Attualmente i biofenoli dell’olio extravergine di oliva vengono distinti in cinque classi principali (Tabella 2).  Tra i composti a struttura più semplice si considerano i fenil‐alcoli (i cui rappresentanti peculiari sono l’idrossitirosolo  ed  il  tirosolo)  ed  i fenil‐acidi  che  derivano  dall’acido benzoico  e cinnamico;  tra  le molecole  a  struttura  più  complessa  vi  sono  i  flavonoidi  (luteolina  ed  apigenina),  i  secoiridoidi  (in particolare gli agliconi dell’oleuropeina e del ligstroside con le relative forme dialdeidiche) ed i lignani (pinoresinolo e acetossipinoresinolo).    
  8. 8. 5 Tabella 2. Composti fenolici dell’olio extra‐vergine di oliva. Acidi fenolici  e derivati Acido vanillico  Acido siringico Acido p‐cumarico Acido o‐cumarico Acido gallico  Acido caffeicoAcido p‐idrossibenzoico Acido ferulico Acido cinnamico Acido benzoico Alcoli fenolici  Idrossitirosolo (3,4‐DHPEA)Tirosolo (p‐HPEA) 3,4‐diidrossifeniletanolo glucoside  Secoiridoidi  Forma dialdeidica del decarbossimetil oleuropeina aglicone (3,4‐DHPEA‐EDA) Forma dialdeidica dell’oleuropeina aglicone Forma dialdeidica del decarbossimetil ligstroside aglicone (p‐HPEA‐EDA) Forma dialdeidica del ligstroside aglicone Oleuropeina aglicone (3,4‐DHPEA‐EA) Ligstroside aglicone (p‐HPEA‐EA) Ligstroside  Oleuropeina  Lignani  (+)‐1‐Acetossipinoresinolo(+)‐Pinoresinolo (+)‐Idrossipinoresinolo  Flavonoidi  Apigenina Luteolina   Non tutte le molecole fenoliche presenti nell’olio extravergine di oliva detengono lo stesso potere antiossidante; sperimentalmente è stato dimostrato che il 3,4‐diidrossifeniletanolo (idrossitirosolo) o molecole che nella loro struttura presentano gruppi ossidrilici in posizione 3 e 4 dell’anello benzenico hanno una capacità antiossidante superiore. 
  9. 9. 6L’idrossitirosolo è il componente fenolico più importante ed esclusivo degli oli vergini ed extravergini di oliva che, oltre ad aumentare la stabilità ossidativa degli oli in fase di conservazione, manifesta una serie di proprietà salutistiche di grande interesse.           RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1. F. Canzonieri. Gazz. Chim. Ital. 1906, 36, 372. 2. C. Cantarelli. Sui polifenoli presenti nella drupa e nell’olio di oliva. Riv. Ital. Sost. Grasse. 1961, 38: 69‐72. 3. G.F. Montedoro, C. Cantarelli. Indagine sulle sostanze fenoliche presenti nell’olio di oliva. Riv. Ital. Sost. Grasse. 1969, 46, 115‐124.     1.3 Estrazione e separazione delle sostanze fenoliche dalla matrice oleosa e  valutazione del contenuto fenolico totale  Per estrarre le sostanze fenoliche dall’olio di oliva vengono utilizzate sostanzialmente due tecniche: estrazione liquido‐liquido (LLE) con l’impiego di differenti miscele di solventi ed estrazione su fase solida (SPE) con varie fasi stazionarie e miscele eluenti. Tutte le tecniche LLE riportate in letteratura prevedono l’utilizzo di una miscela di metanolo ed acqua; l’unica differenza tra questi metodi, riguarda la quantità di acqua presente nella miscela che va dallo Idrossitirosolo(3,4 diidrossifeniletanolo)Idrossitirosolo(3,4 diidrossifeniletanolo)
  10. 10. 70% al 40%. In alcuni casi prima di procedere con l’estrazione LLE viene aggiunto all’olio di oliva un solvente  lipofilico  che  può  essere  l’esano  (nella  maggior  parte  dei casi)  o  l’etere  di  petrolio  o  il cloroformio; tale aggiunta viene effettuata al fine di migliorare la capacità di recupero delle sostanze fenoliche. Attualmente  la  maggior  parte  dei  protocolli  di  LLE  prevedono  che  l’aliquota  di  olio  di  oliva  venga disciolta in esano e poi venga aggiunta la soluzione metanolo/acqua. La miscela ottenuta viene agitata su vortex per un minuto ed in seguito centrifugata a 3000 g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione viene recuperata la fase idroalcolica nella quale sono presenti le sostanze fenoliche (l’estrazione viene ripetuta per 2 volte). La frazione fenolica estratta viene concentrata sotto vuoto a 35 oC mediante evaporatore rotante (es. ROTAVAPOR); questa apparecchiatura viene utilizzata comunemente per allontanare i solventi da una soluzione di un composto di interesse tramite evaporazione a bassa pressione. L’estratto fenolico, dopo essere stato risospeso in una soluzione metanolo/acqua, viene filtrato (con filtro da 0,45 µm) e conservato a ‐20 oC.  L’estrazione  delle  sostanze  fenoliche  dalla  matrice  oleosa  condotta  su  fase  solida  viene  effettuata utilizzando come fase adsorbente delle cartucce C18 (Octadecil‐silano) e come solvente di eluizione il metanolo o l’acetonitrile. Dal confronto tra i due metodi utilizzati per estrarre i composti fenolici dall’olio extra‐vergine di oliva sono emersi risultati contrastanti. Infatti alcuni autori (Servili et al., 1999) (1) hanno dimostrato che l’estrazione  in  fase  liquida  condotta  con  metanolo/acqua  è  molto  più  efficiente  nel  recupero  dei derivati dei secoiridoidi, mentre lo è molto meno per i fenoli semplici dell’olio extra‐vergine di oliva. L’estrazione in fase solida presenta un comportamento opposto alla LLE. Tuttavia è stato osservato che  sostituendo  il  solvente  di  estrazione  sia  in  fase  liquida  che  solida  con  acetonitrile  i  risultati cambiano  nel  senso  che  tra  i  due  metodi  non  c’è  alcuna  differenza  in  termini  di  recupero  delle sostanze fenoliche presenti nella matrice oleosa. 1.4 Analisi spettrofotometrica della componente fenolica dell’olio di oliva  La  concentrazione  fenolica  totale  presente  nell’olio  extravergine  di  oliva  può  essere  determinata spettrofotometricamente  con  il  metodo  colorimetrico  che  prevede  l’utilizzo  del  reattivo  di  Folin‐
  11. 11. 8Ciocalteau  sull’estratto  fenolico  ottenuto  dall’olio  di  oliva.  Questo  metodo  si  basa  sull’ossidazione chimica  dei  composti  fenolici  da  parte  di  una  miscela  ossidante  costituita  da  acido  fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolibdico (H3PMo12O40) che, riducendosi, forma una miscela di ossidi (W8O23 e Mo12O40) colorata di azzurro che presenta un massimo assorbimento a 750 nm. Prima  della  lettura  allo  spettrofotometro  si  costruisce  una  curva  di  calibrazione  in  funzione dell’assorbanza a 750 nm di diverse soluzioni a concentrazioni crescenti di acido gallico. Il  valore  di  concentrazione  dell’estratto  fenolico  dell’olio  extravergine  di  oliva  viene  calcolato mediante interpolazione dalla retta di calibrazione (Fig 1). Questo tipo di analisi è espresso mediante dei  coefficienti  "K"  che  rappresentano  lassorbimento  da  parte  dellolio  allesposizione  di  luce ultravioletta  in  particolari  condizioni.  Il  coefficiente  di  estinzione  molare  alla  lunghezza  donda, rispettivamente di 230 nm e di 270 nm, indica lo stato ossidativo dellolio, poiché si possono formare dieni e trieni coniugati durante lossidazione del prodotto. Tale metodica di analisi è in grado quindi di stabilire la presenza di tagli ad oli extravergini, ed in primis stabilisce se si tratta di un olio di oliva extravergine oppure di un qualsiasi altro olio di oliva. Lesame UV viene condotto sullolio disciolto in opportuno solvente (cicloesano o isoottano) nellintervallo compreso tra 220 e 280 nm. Le lunghezze donda più significative sono 232, 262, 268 e 274 nm. I valori di assorbimento vengono espressi come assorbanza  specifica  o  coefficiente  di  estinzione  molare,  intendendo  con  questa  espressione lassorbanza ad una certa lunghezza donda di una soluzione all1 % dellolio in esame nel solvente prescelto, osservata in una cella dello spessore di 1 cm. Per quanto riguarda il solvente, il Metodo Ufficiale indica lisoottano, mentre in passato era usato generalmente il cicloesano.          Fig 1 : Analisi spettrofotometrica dell’olio extravergine di oliva 
  12. 12. 9Nell’analisi UV dell’olio si usa esprimere lassorbanza specifica con la lettera K. Ad esempio K268 indica lassorbanza specifica dellolio in esame alla lunghezza donda di 268 nm.  K268 = A (1 cm/1%(268 nm)) = A268/ C *b  dove A268 è il valore dellassorbanza a 268 nm della soluzione dellolio in esame, C la concentrazione della  soluzione  espressa  in  g/100  ml  e  b  lo  spessore  in  cm  della  cella  di  quarzo  nella  quale  viene esaminata la soluzione dellolio in esame.   1.5  Separazione e valutazione delle frazioni contenute nell’estratto fenolico dell’olio extravergine  di oliva  High Performance Liquid Chromatography (HPLC) In letteratura sono riportati diversi metodi per la determinazione delle sostanze fenoliche presenti nell’olio  extravergine  di  oliva;  le  principali  differenze  tra  i  metodi  proposti  sono  riconducibili  a differenti procedure per la separazione dei composti fenolici dalla matrice oleosa ed a diversi sistemi di rivelazione per la valutazione qualitativa/quantitativa. L’analisi  della  componete  fenolica  dell’olio  extravergine  di  oliva  viene  effettuata  essenzialmente attraverso  tecniche  cromatografiche,  di  queste  la  più  usata  è  la  High  Performance  Liquid Chromatography  (HPLC)  (Fig.  2)  La  cromatografia  è  un  metodo  chimico‐fisico  di  separazione  che sfrutta  la  tendenza  delle  varie  sostanze  a  distribuirsi,  secondo  determinati  rapporti  tra  due  fasi distinte e separate di cui una è mantenuta fissa e l’altra è mobile.  L’analisi  HPLC  consente  la  separazione  dei  singoli  composti  fenolici  sulla  base  del  diverso  peso molecolare e della differente polarità. I risultati quantitativi che si ottengono con questa tecnica non sono  direttamente  confrontabili  con  quelli  ottenuti  mediante  il  metodo  colorimetrico  che  fornisce invece informazioni relative alla componente fenolica totale. Il  metodo  strumentale  dell’HPLC  è  il  frutto  dell’evoluzione  tecnologica  che  la  cromatografia  su colonna in fase liquida ha subito in tempi recenti e che ha trasformato la semplice colonna di vetro contenente la fase fissa in apparecchi elettronici complessi.  In  questa  tecnica  cromatografica  i  composti  presenti  in  un  solvente  vengono  separati  sfruttando l’equilibrio di affinità tra una fase stazionaria posta all’interno della colonna cromatografica ed una 
  13. 13. 10fase mobile che fluisce attraverso essa. La fase stazionaria è impaccata in una colonna chiusa con materiali  con  granulometria  molto  fine  (5‐10mm),  in  tal  modo  viene  aumentata  la  superficie  di contatto  tra  fase  mobile  e  fase  stazionaria  e  l’impaccamento  diventa  più  omogeneo.  Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente diventa molto lento. Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di 50‐150 atm, si possono ottenere flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi brevi. Le fasi stazionarie utilizzate per la separazione dei composti fenolici lavorano in fase inversa cioè sono meno polari delle fasi mobili. Le sostanze più affini alla fase stazionaria rispetto alla fase mobile impiegano un tempo maggiore per percorrere la colonna cromatografica (tempo di ritenzione) rispetto a quelle con bassa affinità per la fase stazionaria ed alta per la fase mobile.                 Fig 2: Schema generale di un apparecchio HPLC. 
  14. 14. 11Nell’HPLC  il  campione  da  analizzare  viene  caricato  all’inizio  della  colonna  cromatografica  e  viene spinto attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile applicando pressioni dell’ordine delle centinaia di atmosfere mediante una pompa.  In un metodo di caricamento del campione si utilizza una microsiringa in grado di sostenere pressioni elevate. Il campione viene iniettato attraverso un foro d’iniezione direttamente nella colonna o in uno strato  di  materiale  inerte  immediatamente  precedente  la  colonna.  Questa  operazione  può  essere compiuta mentre il sistema è sotto alta pressione oppure si spegne la pompa prima dell’iniezione e quando la pressione è scesa al valore di quella atmosferica si inietta il campione e si riaccende la pompa. Quest’ultimo metodo viene chiamato iniezione a flusso interrotto. Un altro metodo per introduzione del campione (il più usato in HPLC) è quello che utilizza un iniettore a spirale costituito da un occhiello metallico inserito lungo il capillare che alimenta la colonna. In esso viene introdotto il campione quindi, tramite una valvola, l’eluente viene incanalato nell’occhiello e cosi  il  campione  si  trova  ad  essere  spinto  nella  colonna  dall’eluente  stesso,  senza  che  il  flusso  di solvente  si  interrompa.  La  caratteristica  principale  del  sistema  di  iniezione  tramite  loop  è  l’alta riproducibilità dei volumi iniettati (Fig. 3)  Fig. 3:  Sistema di iniezione con loop La fase stazionaria e mobile in HPLC Le colonne per HPLC sono di solito costruite in acciaio, ma esistono anche quelle in vetro borosilicato che  vengono  impiegate  soprattutto  quando  si  lavora  a  pressioni  non  troppo  elevate.  Alle  due estremità  delle  colonne  sono  presenti  dei  setti  perforati  di  acciaio  inossidabile,  o  di  teflon,  che 
  15. 15. 12servono a trattenere il materiale in essa contenuto. I setti devono essere omogenei per consentire un flusso uniforme di solvente. La lunghezza delle colonne è di solito compresa tra 10 e 30 cm, ma è possibile disporre di colonne più lunghe per particolari esigenze. Il diametro interno delle colonne è compreso tra 4 e 10 mm; quello delle particelle del riempimento varia tra 3,5 e 10 µm. Esistono anche modelli di colonne, di recente progettazione, più corte e sottili che permettono tempi di ridurre il tempo di analisi ed il consumo di solvente. Le  colonne  HPLC  hanno  una  maggiore  risoluzione  dovuta  all’impiego  di  fasi  stazionarie  suddivise molto finemente allo scopo di aumentare la superficie di contatto tra fase mobile e fase stazionaria ed avere un migliore impaccamento. Per ottenere un’elevata efficienza nella separazione è necessario che le dimensioni delle particelle del riempimento siano molto ridotte, per questo motivo è indispensabile applicare un’elevata pressione se  si  vuole  mantenere  una  ragionevole  velocità  di  flusso  dell’eluente  e  quindi  un  tempo  di  analisi adeguato. Le fasi stazionarie utilizzate per la separazione dei composti fenolici contenuti nell’olio extra‐vergine di oliva lavorano in fase inversa (RP‐HPLC) ovvero sono meno polari della fase mobile. Le fasi stazionarie inverse sono in genere formate da silice su cui sono legati dei gruppi non polari; tra questi quelli più spesso legati alla superficie del supporto sono i gruppi organici: ‐CH3, ‐C8H17, ‐C18H37. Di questi il gruppo a 18 atomi di carbonio (gruppo ottadecil) è il più frequente. I nomi comunemente usati per questo tipo di fase stazionaria sono ODS e C18. Con questo tipo di fase stazionaria non polare di solito l’eluizione viene condotta con fase  mobile polare, che è quasi sempre costituita da una miscela di un solvente polare e di uno non polare, in modo da poterne variare la forza mediante la composizione (eluizione in gradiente di polarità). In questo caso le sostanze polari presenti nel campione verranno eluite per prime dalla fase mobile.  I sistemi di rivelazione  La  valutazione  qualitativa  e  quantitativa  delle  separazioni  cromatografiche  si  può  ricavare sottoponendo gli eluiti ad ulteriori misurazioni che possono essere eseguite in continuo. Queste si possono  ottenere  facendo  passare  l’eluito  attraverso  un  rivelatore  strumentale  che  registra  la variazione di una determinata proprietà dell’eluito mentre questo lo attraversa.  
  16. 16. 13I rivelatori più ampiamente usati per l’HPLC si basano sulla misura dell’assorbimento della luce UV o visibile da parte del campione da analizzare. La variazione di una proprietà nel tempo può essere registrata su carta oppure immagazzinata in un file  di  un  computer; il grafico che si  ottiene è  formato da  una serie di  picchi  e prende  il  nome  di cromatogramma.           L’analisi dei picchi cromatografici ci permette di individuare la presenza di uno specifico componente (analisi qualitativa) e di quantificare le sostanze presenti nella miscela (analisi quantitativa). L’analisi quantitativa può essere effettuata in base al fatto che il segnale prodotto dal rivelatore è, ad ogni istante, proporzionale al flusso delle molecole eluite (cioè massa nell’unità di tempo, s = dm/dt); si deduce che la quantità totale di sostanza eluita sarà data dall’integrale m = ∫s dt cioè dall’area della curva sottesa al picco cromatografico.  Le tecniche HPLC adottate nella separazione e valutazione dei composti fenolici presenti nell’estratto fenolico dell’olio extra‐vergine di oliva differiscono tra loro per il metodo di rivelazione applicato. Il  sistema  di  rivelazione  più  usato  per  l’identificazione  delle  sostanze  fenoliche  è  quello  ad assorbimento a serie di diodi. Nel rivelatore a serie di diodi (DAD) la luce UV proveniente da una lampada a deuterio passa attraverso una cella a flusso prima che venga scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa ad ogni lunghezza d’onda viene misurata simultaneamente attraverso un sistema di alcune centinaia di fotodiodi. Un computer può processare, registrare e mostrare gli spettri di assorbimento in continuo durante l’analisi; inoltre si possono registrare i cromatogrammi a ciascuna λ.  
  17. 17. 14Il rivelatore a serie di diodi risulta essere molto versatile (è possibile selezionare λ che vanno da 190 a 800 nm), molto sensibile (si può scegliere la λ ottimale per un analita) e piuttosto selettivo (quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la λ in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti). Alcuni autori (Mannino et al. 1993) (2) hanno utilizzato un rivelatore elettrochimico (EC) per l’analisi delle  sostanze  fenoliche  (Fig.4).  Questo  rivelatore  permette  l’analisi  di  composti  elettroattivi  che possono essere ossidati o ridotti. I fenoli fanno parte di quei composti che possono essere ossidati elettrochimicamente. Un potenziale costante viene mantenuto tra l’elettrodo di lavoro e quello di riferimento; la corrente prodotta dalla reazione di ossidazione o riduzione dell’analita viene misurata tra  l’elettrodo  di  lavoro  ed  il  controelettrodo  ed  è  proporzionale  alla  concentrazione  di  analita presente nel campione.  La comparazione tra il detector UV a serie di diodi e quello EC ha mostrato che quest’ultimo è molto sensibile ed è capace di rivelare quantità minime di sostanze fenoliche (Tsimidou et al., 1996 e Brenes et al, 2000) (3, 4).   Fig. 4: Rivelatore elettrochimico Negli ultimi anni alcuni ricercatori (Cartoni et al, 2000) (5) hanno proposto l’utilizzo di un detector fluorimetrico per la valutazione delle sostanze fenoliche (Fig. 5). 
  18. 18. 15Il principio di funzionamento del detector a fluorescenza è il seguente: la luce UV proveniente da una lampada  (filtrata  alla  opportuna  λ)  o  da  un  laser  passa  attraverso  la  cella  a  flusso;  quando  un campione  fluorescente  passa  attraverso  la  cella,  assorbe  la  radiazione,  viene  eccitato  e  quindi emetterà  la  radiazione  di  fluorescenza  ad  una  maggiore  λ.  L’intensità  della  luce  emessa  viene misurata attraverso un fotomoltiplicatore posto a 90o rispetto al fascio incidente. L’utilizzo del rivelatore a fluorescenza  si è dimostrato molto efficace per la valutazione dei composti fenolici rispetto agli altri tipi di detectors (in particolare per i lignani) (Brenes et al. 2000) (4).    Fig. 5:  Schema rappresentativo di un detector fluorimetrico.  Un  altro  tipo  di  rivelatore  utilizzato  per  l’identificazione  delle  sostanze  fenoliche  presenti  nell’olio extra‐vergine di oliva è lo spettrometro di massa applicato all’HPLC (HPLC‐MS). Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica (m/z) degli ioni che vengono prodotti dal campione. Per  ottenere  uno  spettro  di  massa  le  molecole,  portate  in  fase  gassosa,  vengono  ionizzate  in  una sorgente di ionizzazione. Una delle sorgenti più comuni è quella ad impatto elettronico (EI) (Fig. 5) nella quale le molecole vengono bombardate con un fascio di elettroni ad alta energia. Quando gli elettroni ad alta energia interagiscono con una molecola, non solo si ha la sua ionizzazione, ma alcuni legami  si  rompono  e  si  formano  cosi  anche  dei  frammenti  che  sono  comunque  molto  utili  per l’identificazione  delle  specie  molecolari  che  entrano  nello  spettrometro  di  massa.  Anche  se  nella sorgente ionica vengono prodotti contemporaneamente sia ioni positivi che negativi, viene scelta solo 
  19. 19. 16una  polarità  e  lo  spettro  consisterà  o  di  soli  ioni  positivi  o  di  soli  ioni  negativi.  Le  molecole  non ionizzate ed i frammenti neutri vengono allontanati dal sistema di pompaggio dello strumento. Gli spettri di massa di ioni positivi sono quelli più comunemente misurati con la tecnica EI, dato che il numero  di  ioni  negativi  generati  è decisamente  minore  rispetto  a  quello  degli  ioni  positivi.  Questi ultimi  vengono  guidati  nell’analizzatore  mantenendo  la  sorgente  ionica  ad  un  potenziale  positivo rispetto  a  quello  dell’analizzatore  e  focalizzando  il  fascio  ionico  mediante  opportuni  potenziali applicati ad un sistema di lenti situate tra la sorgente e l’analizzatore. Il ruolo dell’elettrodo repulsore, al  quale  viene  applicato  un  potenziale  positivo,  è  quello  di  provocare  l’espulsione  degli  ioni  dalla sorgente ionica. Gli ioni negativi e gli elettroni vengono attratti sull’elettrodo collettore degli elettroni carico positivamente. Fig. 5 Ionizzazione ad impatto elettronico.Un’altra tecnica di ionizzazione largamente usata in HPLC (più soft rispetto all’impatto elettronico) è l’Elettrospray Ionization (ESI) (Fig. 6) nella quale le frazioni in uscita dall’HPLC passano attraverso un capillare a pressione atmosferica mantenuto ad alto voltaggio. L’alto voltaggio disperde il flusso del liquido  e  lo  trasforma  in  tante  piccole  goccioline  altamente  caricate  e  del  diametro  di  alcuni  µm. L’evaporazione  del  solvente  causa  un’ulteriore  riduzione  del  diametro  delle  gocce  e  quindi  un aumento della densità di carica. L’aumento delle cariche sulla superficie delle gocce induce una forza repulsiva che culmina con una esplosione coulombiana, che riduce ulteriormente il diametro delle gocce.  
  20. 20. 17Questo processo continua fino a che le gocce non sono abbastanza piccole da permettere allo ione dell’analita il passaggio alla fase gassosa. Per facilitare la formazione delle gocce in uscita dal capillare può  essere  aggiunto  un  flusso  nebulizzato  di  azoto.  In  alcuni  casi,  per  facilitare  il  processo  di evaporazione del solvente, all’ingresso del capillare viene applicato un flusso di azoto anidro. Fig. 6:  Elettrospray ionization Il  campione,  ionizzato  mediante  esplosione  coulombiana,  viene  posto  nelle  condizioni  ottimali  per essere analizzato.  L’analizzatore di massa separa gli ioni sulla base dei loro valori m/z. I più comuni analizzatori sono il filtro di massa a quadrupolo e la trappola ionica, dove avviene l’immagazzinamento degli ioni nello spazio compreso tra l’elettrodo anulare e l’elettrodo di chiusura terminale.  Il campo elettrico oscillante espelle sequenzialmente gli ioni con valori m/z crescenti. L’accoppiamento HPLC‐MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60) ma soltanto dalla metà degli anni ’70 sono apparse le prime pubblicazioni scientifiche. Le  difficoltà  di  tutti  i  metodi  HPLC‐MS  derivano  dal  fatto  che  in  HPLC  si  utilizzano  solventi  molto diversi, in funzione del tipo di analisi (es. acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi di solvente in HPLC sono molto più elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Per accoppiare 
  21. 21. 18le due tecniche sono necessarie opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi devono consentire anche la vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.  Anche se l’HPLC‐MS permette di ottenere ottimi risultati viene poco utilizzata per compiere analisi di tipo routinario sui composti fenolici presenti nell’olio extra‐vergine di oliva, questo perché si tratta di apparecchi molto costosi e di difficile gestione.  Per tale motivo si preferisce impiegare l’HPLC accoppiata al rivelatore UV visto che questo sistema ha una facile gestione e consente di ottenere buoni risultati a bassi costi.   RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI  1. Servili M., Baldioli M., Mariotti F. Montedoro G.F. Phenolic composition of olive fruit and virgin olive  oil:  distribution  in  the  costitutive  parts  of  fruit  and  evolution  during  oil  mechanical extraction process. Acta Horticulturae 474 (1999) 609‐619. 2. Mannino S., Cosio M.S., Bertuccioli M. High performance liquid chromatography of phenolic compounds in virgin olive oil using amperometryc detector. Ital. J. Food Sci. 4 (1993) 363‐370. 3. Tsimidou M., Lytridou  M.,  Boskou D  et  al.  On  the  determination  of  minor  phenolicacids  of virgin olive oil by RP‐HPLC. Grasas y Aceites 47 (1996) 151‐157 4. Brenes M., Garcia A., Garcia P. et al. Rapid and complete extraction of phenols from olive oil and determination by means of a coulorimetric electrode array system. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5178‐5183. 5. Cartoni  G.P.,  Coccioli  F.  et  al.  HPLC  analysis  of  the  benzoic  and  cinnamic  acids  in  edible vegetable oils. Ital. J. Food Sci. 2000, 12, 163‐173.       
  22. 22. 192. VALUTAZIONE  BIOCHIMICA  E  BIOLOGICO  MOLECOLARE  DEL  VALORE  ANTIOSSIDANTE  DEI     COSTITUENTI MINORI E DELL’IMPATTO SULLA BIOENERGETICA CELLULARE   I  fenoli  (tirosolo  e  idrossitirosolo)  sono  un  gruppo  diversificato  di  composti  contenenti  un  anello aromatico con uno più sostituenti ossidrilici. Il gruppo funzionale caratteristico dei composti fenolici è un  ossidrile  (–OH)  legato  direttamente  a  un  carbonio  di  un  anello  benzenico  (Fig  1).Tale  struttura influenza le proprietà di questi composti poiché il gruppo ossidrilico attiva le reazioni di sostituzione elettrofila nell’anello aromatico in quanto vi è la presenza di elettroni “mobili” o “disponibili”. Le molecole con attività caratteristiche della struttura o‐diidrossi, sono caratterizzate da un elevata attività antiossidante dovuta alla formazione di legami idrogeno intramolecolari durante la reazione con  i  radicali  liberi.  La  capacità  di  donatore  idrogeno  e  l’inibizione  dell’ossidazione  cresce  con l’aumentare dei gruppi idrossido nei fenoli, conferendo alla presenza di un singolo gruppo idrossido una limitata attività antiossidante, e tra i diversi composti è stata individuata una maggiore attività antiossidante per quelli dotati di due ossidrili in posizione orto, in virtù di una maggiore capacità di delocalizzazione  della  forma  radicalica. Molte  sostanze  presenti  in  natura  nei  vegetali  hanno  la capacità di reagire con i radicali liberi. Alcune di  esse interrompono le reazioni a catena che portano  alla  formazione  di  ulteriori  radicali,  impedendo  così  la  propagazione  del  danno  cellulare;  altre svolgono  una  funzione  di  scavenger  dei  ROS,  ossidandosi  a  loro  volta  e  richiedendo  di  essere rigenerate per riacquistare  la loro funzione.              Fig 1: composti chimici del tirosolo e idrossitirosolo 
  23. 23. 20A questi composti fenolici, sono stati attribuiti effetti rilevanti nella prevenzione primaria e secondaria di alcuni importanti patologie cardiovascolari, oncologiche, invecchiamento precoce, degenerative del sistema nervoso, e più recentemente anche nella spermatogenesi, tutte patologie legate alla presenza eccessiva  di  “radicali  liberi”  e  proossidanti  non  radicalici  ed  ai  loro  effetti  degenerativi. La  dieta mediterranea è associata ad una più bassa incidenza di diverse tipologie tumorali (prostata, polmone, laringe,  ovaio,  seno,  colon)  ma  non  solo,  anche  di  malattie  cardiovascolari  e  neurodegenerative, invecchiamento precoce, tutte condizioni associate a stress ossidativo (Visioli et al 1998; Owen et al 2000; Hodge et al 2004; Fortes et al 2003;  Bosetti et al 2002 a,  b; Trichopoulou et al 1995; Stoneham et al 2000). Tra  i  differenti  composti  fenolici  presenti  nell’olio  di  oliva  l’idrossitirosolo  è  quello  maggiormente studiato ed è stato dimostrato possedere proprietà antiaterogeniche. L’aumento  del consumo di polifenoli, si associa una riduzione del  rischio di malattie cardiovascolari, di tumori, di disordini neurodegenerativi, dell’aterosclerosi, suggerendo che gli effetti benefici siano da  attribuirsi,  soprattutto,  alla  capacità  dei    polifenoli  di  combattere  lo  stress  ossidativo  che caratterizza e accomuna queste patologie. Il loro potere antiossidante dipende dal numero di anelli fenolici, dal numero e posizione di gruppi idrossilici e di doppi legami presenti nella molecola ed è determinato  in  particolare    dalla  presenza  di  un  anello‐B  diidrossilato  (gruppo  catecolico),  di un’insaturazione in posizione 2,3 associata ad una funzione  4‐carbonilica nell’anello ‐C e di gruppi funzionali capaci di chelare i metalli di transizione. Le proprietà antiossidanti sono state considerate per molto tempo la principale funzione dei polifenoli, ma, alla luce di nuovi dati  sperimentali, questo sembra essere un modo troppo semplice e riduttivo di considerare la loro attività. Nei sistemi biologici complessi, i polifenoli possono  avere una serie di effetti non ascrivibili alla sola attività antiossidante. Questa  argomentazione  è  sostenuta  per  lo  meno  da  due  osservazioni.  Innanzitutto  essi  vengono metabolizzati in vivo originando spesso sostanze che perdono il potenziale antiossidante originale.  Inoltre le loro concentrazioni e quelle dei loro metaboliti, nel plasma o nei tessuti, sono molto basse rispetto  a quelle di altri antiossidanti, come l’acido ascorbico e  l’α‐tocoferolo, rendendo improbabile che i polifenoli possano competere con essi. Viceversa tali concentrazioni potrebbero consentire loro di avere attività  farmacologiche e di modulare varie funzioni cellulari.  È stato infatti dimostrato che i polifenoli  sono  in  grado  di  modulare  l’espressione  e/o  l’attività  di  enzimi  come  telomerasi, ciclossigenasi,  lipossigenasi,  xantina  ossidasi,  metalloproteinasi,  enzima  di  conversione 
  24. 24. 21dell’angiotensina, protein  chinasi, di interagire con le vie di trasduzione  del segnale, con i recettori cellulari,  con  le  vie  apoptotiche  caspasi‐dipendenti,  con  la  regolazione  del  ciclo  cellulare  e  con l’induzione  di  enzimi  detossificanti.  Essi  inoltre  sono  in  grado  di  aumentare  la  produzione  di vasodilatatori,  come    l’ossido  nitrico,  influenzare  la  funzione  delle  piastrine  e  competere  con  il glucosio  nel  trasporto  attraverso  la  membrana. Effetti  dei  polifenoli  sulle  attività  enzimatiche correlate al glutatione, in particolare sulla glutatione perossidasi, sono stati dimostrati anche in studi in vivo, sia in modelli animali che nell’uomo. Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono responsabili delle reazioni da stress ossidativo coinvolte in tutte  le  forme  patologiche  prima  elencate.    Le  principali  fonti  delle  specie  reattive  dell’ossigeno nell’organismo sono tutte le reazioni conseguenti alla catena respiratoria, alla fagocitosi, alla sintesi delle  prostaglandine,  al  sistema  del  citocromo  P450;  in  tutte  queste  reazioni  una  piccola  parte dell’ossigeno sfugge alla normale utilizzazione portando così alla formazione di composti instabili ed altamente reattivi. È noto che a livello cellulare circa il 5% del metabolismo dell’ossigeno si svolge attraverso  reazioni  di  riduzione  implicanti  il  trasferimento  di  un  solo  elettrone  e  la  formazione  a cascata  di  diverse  forme  radicaliche  endogene  (ROO●, ●O2‐, ●OH)  ed  esogene  (NO●, ●ONO‐2),  che principalmente si situano intorno alla struttura mitocondriale ma possono distribuirsi anche in vari distretti  cellulari  (Davies  1993;  Nohl  et  al  2005)  in  relazione  alla  loro  polarità  (neutra  nel  caso  di radicale  ossidrilico,  polare  come  anione  superossido).  Queste  sostanze  reagiscono  con  molecole organiche creando così uno stato di “proossidazione” all’interno della cellula e soprattutto nei suoi diversi compartimenti vitali: tra questi composti la struttura più reattiva è il radicale ossidrilico la cui semivita  è  stata  valutata  in  circa  10‐9sec.  La  conseguenza  di  tale  fenomeno  è  che  tali  composti funzionali divengono essi stessi dei radicali. Come già ricordato i substrati maggiormente interessati, con effetti e conseguenze patologiche, sono proteine e lipidi ma anche amminoacidi, acidi nucleici e nucleotidi. I prodotti di ossidazione delle sostanze lipidiche (idroperossidi ed aldeidi) interagiscono con il DNA ed alcuni carboidrati. I danni provocati toccano diversi aspetti della funzionalità primaria e secondaria cellulare (mutagenesi ed incremento del turnover, decremento delle attività enzimatiche, danni alle membrane, alterazione delle LDL e delle lipoproteine in generale, alterazione dei recettori‐trasmettitori ed infine riduzione della viscosità dei fluidi). Per far fronte ad un eccesso di produzione di  radicali  liberi,  l’organismo  umano  ha  sviluppato  sofisticati  meccanismi  allo  scopo  di  mantenere 
  25. 25. 22l’omeostasi  redox,  aumentando  l’eliminazione  dei  radicali  o  bloccandone  la  produzione.  Essi comprendono  difese  antiossidanti  endogene,  enzimatiche  e  non,  alle  quali  si  affiancano  difese esogene, per lo più rappresentate da antiossidanti assunti con la dieta (Benzie 1999; Yao et al 2004; Porrini et al 2005). Tra questi ultimi, i polifenoli naturali sono stati largamente oggetto di studio, non solo  per  le  loro  forti  capacità  antiossidanti  ma  anche,  recentemente,  per  altre  proprietà  che conferiscono loro la capacità di modulare diverse attività cellulari. Il  diverso  potenziale  antiossidante  delle  numerose  molecole  (poli)fenoliche  dipende  in  parte  dalla stessa struttura molecolare, dalla loro interazione con altre strutture antiossidanti (effetto sinergico), dalla  partizione  tra  la  fase  acquosa  e  quella  lipidica  in  sistemi  complessi  come  il  cibo,  ma,  più direttamente, dalla presenza di gruppi metossilici (●OCH3), di due o più ossidrili in posizione vicinale (incremento della stabilità dei radicali ossidrilici per formazione di legami idrogeno intramolecolari).  I polifenoli agiscono principalmente donando radicali idrogeni a radicali perossidi (ROO•) formatisi durante lo step iniziale di ossidazione lipidica e successivamente formando un radicale stabile (A•) attraverso la reazione:     ROO• + AH →ROOH + A•  (Fig 2) Le  cellule  rispondono  allo stress  ossidativo  attivando  la  trascrizione  di  geni  coinvolti  nella  risposta antiossidante. L’espressione della maggior parte di questi geni è regolata dal fattore trascrizionale Nrf2  (nuclear  related  factors  2).  Nrf2  in  condizioni  basali  è  sequestrato  nel  citoplasma  da  Keap1 (Kelch‐like ECH‐associated protein 1),  una  proteina  del  citoscheletro  che  possiede  alcuni  residui  di cisteina  con  funzione  di  “sensori”  (Itoh  et  al  1999).  Lo  stress  ossidativo,  modificando  tali  cisteine, induce il distacco di Nrf2 che può così migrare nel nucleo (Dinkova‐Kostova et al 2002) e legarsi agli elementi  di  risposta  antiossidante  o  antioxidant  responsive  elements  (ARE),  sequenze  geniche localizzate nel sito del promotore di alcuni geni indotti da stress ossidativo e chimico. Nrf2 svolge un ruolo critico nella regolazione dell’espressione dei geni che codificano per la famiglia delle GST (enzimi di fase 2), per l’NAD(P)H chinone ossidoreduttasi (Kobayashi and Yamamoto 2005), per altri enzimi della fase 2 (l’UDP glucoronil‐trasferasi 1A6 e l’aldeide reduttasi) e per proteine antiossidanti quali l’emeossigenasi  1  (HO‐1),  la  superossido  dismutasi,  la  catalasi,  la  glutatione  perossidasi,  la tioredossina (Kobayashi and Yamamoto 2005). Inoltre Nrf2 controlla sia l’induzione che il livello basale 
  26. 26. 23dell’espressione  di  geni  che  codificano  enzimi  coinvolti  nella  biosintesi  del  glutatione  (GSH),  in particolare  del  gene  della    γ‐glutamil  cisterna  sintasi  (γ‐GCS)  e  del  gene  x‐CT  che  codifica  per  una subunità del trasportatore proteico dimerico cistina/glutammato (Moll et al 2005). In pazienti ad elevato rischio di malattie cardiovascolari il consumo di olio doliva è associato a più alti livelli plasmatici di antiossidanti, riduzione della proteina C reattiva (hs‐CRP) e peso corporeo, fattori di rischio per tali malattie (Razquin et al 2009). Il meccanismo con cui lolio doliva aumenta lattività degli  enzimi  antiossidanti  sembra  essere  mediata  da  un  aumento  dellattività  di  Nrf2  (Travis  and  Rachakonda 2011). Topi knock‐out per Nrf2 esposti a irradiazione toracica simile a quella di pazienti con cancro, vivono 35 o più giorni in meno rispetto ai topi con una normale espressione genica di Nrf2.  Un  recente  studio  su  modelli  animali  ha  osservato  una  correlazione  tra  il  consumo  a  lungo termine di olio doliva (4,5 mesi), aumento dei livelli di Nrf2 e dei prodotti genici ad esso associati GST, γ‐GCS, NQO1 (Bayram et al 2012). Quindi la qualità dell’olio extravergine di oliva è strettamente legata all’attività antiossidante svolta dalle sostanze fenoliche idrofiliche in esso contenute. La produzione incontrollata dei radicali liberi dell’ossigeno può provocare gravi danni all’organismo umano il quale, però si difende, in parte con gli antiossidanti  di  natura  congenita  e  assunti  con  l’alimentazione.  Si  comprende  da  ciò  quanto importante sia migliorare il patrimonio antiossidante, ma non potendo noi influire sulla componente costituzionale, dovremmo cercare di incrementarne l’assunzione alimentare in modo da mantenere in costante equilibrio la bilancia ossidativa. Per questa ragione negli ultimi anni i cibi ricchi di composti antiossidanti, frutta, verdura e olio di oliva, hanno ricevuto particolare attenzione, in particolare un ruolo molto importante è stato attribuito all’olio extravergine di oliva. L’olio extravergine di oliva è un tipico  componente  della  dieta  mediterranea  e  ad  esso  sono  state  attribuite  diverse  proprietà antitumorali. Gli studi condotti da Martin Moero et al., 1994; Trichopoulou et al., 1995 e La Vecchia et al., 1995 dimostrano che l’aggiunta di olio di oliva nella dieta riduce il rischio di tumori al seno, il risultato  è  stato  poi  confermato  da  studi  condotti  da  altri  autori  Lipworth  et  al.,  1997  e  Kushi  e Giovannucci nel 2002. L’olio di oliva è risultato essere coinvolto anche nella prevenzione di altri tipi di tumori che si originano negli organi più disparati come  pancreas (Soler et al.,1998), cavità orale e esofago  (Bosetti  et  al.,  2003),  colon  retto  (Stoneham  et  al.,  2000),  prostata  (Tzonou  et  al.,  1999; Hodge et al., 2004) e polmoni (Fortes et al., 2003). Studi condotti su modelli animali hanno dimostrato che  la  somministrazione  dell’olio  di  oliva  è  in  grado  anche  di  contrastare  i  danni  provocati  dalle 
  27. 27. 24radiazioni  UV  a  carico  dell’epidermide  (Ichihashi  et  al.,  2003),  e  risulta  essere  un  fattore  di prevenzione per il cancro del colon nei ratti (Bartoli et al., 2000). L’effetto protettivo svolto dall’olio nei  confronti  di  queste  gravi  malattie  viene  attribuito  alle  sostanze  fenoliche,  in  particolare all’idrossitirosolo piuttosto che a agli acidi grassi insaturi in esso contenuto. L’azione protettiva svolta dalle sostanze fenoliche contenute nell’olio sono molteplici. I composti fenolici sono responsabili della riduzione  della  perossidazione  dei  fosfolipidi  liposomiali  (Aschbach  et  al.,  1994),  limitano  la  perossidazione  delle  LDL  (Grignaffini  et  al.,  1994;  Visioli  et  al.,  1995),  limitano  l’aggregazione piastrinica che conduce alla formazione delle placche aterosclerotiche,  fenomeno che viene attivato dalla liberazione del trombossano derivato dell’acido arachidonico per azione della ciclossigenasi, in particolare  il  3,4‐DHPEA  inibisce  l’enzima  ciclossigenasi  (azione  aspirina  simile),  limitando  così l’aggregazione  delle  piastrine  (Manna  et  al.,  1999;  Petroni  et  al.,  1995).  Inoltre  i  composti  fenolici impediscono l’ossidazione delle basi azotate del DNA causata dalla perossido nitrico (Dejana et al., 1999), la produzione dei radicali liberi nella matrice fecale (Owen et al., 2000), coinvolti nei tumori dell’intestino, inibiscono i processi infiammatori in modelli animali (Martinez‐Dominquez et al., 2001). Recentemente studi in vitro hanno aperto, interessanti prospettive sul ruolo svolto dal 3,4‐DHPEA nei confronti dell’inibizione della proliferazione cellulare incontrollata, infatti bloccano il ciclo cellulare in fase G0/G1 inducendo l’apoptosi nelle cellule (HL 60) tumorali (Fabiani et al., 2002). In  questo  senso  numerosi  studi  sono  stati  condotti  sulle  proprietà  antiossidanti  delle  sostanze fenoliche  presenti  nel  VOO,  da  questi  studi  è  emerso  che  la  concentrazione  totale  dei  composti fenolici,  espressa  come  polifenoli  totali,  è  strettamente  correlata  anche  con  lo  shelf‐life  dell’olio stesso.    Studi  in  vivo  hanno  indicato  che  la  somministrazione  di  HT  migliora  il  profilo  lipidico  nel sangue di antiossidanti e riduce lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche in un modello animale di aterosclerosi  indotta  (Granados‐Principal  et  al  2010).  L’idrossitirosolo  è  anche  molto  efficace  nel proteggere laorta dallo stress ossidativo mediato dalla NO (Rietjens et al 2007); inibisce l’espressione sulla  superficie  cellulare  di  molecole  di  adesione  pro‐aterogeniche  come  le  ICAM‐1,  VCAM‐1  e  E‐selectina  in  cellule  endoteliali  umane  da  cordone  ombelicale  (Dell’Agli  et  al  2006).  In  cellule endoteliali vascolari l’HT stimola efficientemente la proliferazione cellulare, promuove la riparazione delle  ferite,  protegge  le  cellule  dal  danno  indotto  da  ossidanti  attraverso  i  pathways  ERK1/2  e PI3K/Akt che portano all’attivazione di Nrf2 ed induzione di HO‐1 (Zrelli et al 2011). In cellule THP‐1 il 
  28. 28. 25trattamento  con  idrossitirosolo  riduce  drasticamente  la  produzione  di  NO  e  la  formazione  di  ROS indotta da LPS inducendo un aumento dei livelli di GSH in cellula (Zhang et al 2009). Assunto  con  la  dieta,  l’idrossitirosolo  viene  assorbito  e  in  parte  metabolizzato  a  livello  epatico  e intestinale,  in  glucuronide  coniugato  e  in  HVA,  alcol  omovanillico;  insieme  ai  suoi  metaboliti  si distribuisce nei vari organi, concentrandosi preferenzialmente a livello renale prima di essere escreto. In cellule renali (LLC‐PK1) l’idrossitirosolo e il suo metabolita HVA sono in grado di proteggere tali cellule dal danno ossidativo indotto dal H2O2 inibendo la perossidazione lipidica e modulando i segnali cellulari implicati nella risposta allo stress ossidativo. Il pretrattamento con idrossitirosolo protegge i lipidi di membrana dall’azione ossidante del H2O2, viene preservata la concentrazione di colesterolo, degli acidi grassi insaturi e dell’α‐tocoferolo e si produce una quantità significativamente minore di prodotti  di  ossidazione.  L’HVA  mostra  un’azione  meno  efficace  dell’idrossitirosolo  nel  conservare l’integrità della membrana, ma comunque significativa. Tra le varie proteine coinvolte nella risposta allo stress ossidativo sono particolarmente importanti le MAPK (come ERK e JNK) e la proteina chinasi B/Akt  (Akt/PKB),  i  cui  pathways  regolano  la  sopravvivenza  o  la  morte  cellulare;  l’H2O2  è  capace  di attivare o disattivare queste proteine, interferendo con le vie di segnalazione che queste controllano. I due fenoli proteggono la cellula dalla morte indotta dai radicali liberi e inibiscono il cambiamento di fosforilazione  indotto  dal  H2O2,  per  le  proteine  ERK1/2,  JNK  e  Akt/PKB;  anche  in  questo  caso l’idrossitirosolo  ha  un’attività  maggiore  dell’HVA.  È  molto  probabile  quindi  che  l’effetto  protettivo degli  antiossidanti  naturali,  così  come  quello  dell’idrossitirosolo  e  dell’HVA,  in  sistemi  biologici  più complessi e in vivo, sia il risultato di diversi meccanismi d’azione che contrastano in modo diretto o indiretto  l’azione  dell’agente  ossidante.  L’idrossitirosolo  ha  mostrato  un’elevata  azione  protettiva, l’HVA,  benché  meno  attivo,  ha  mostrato  comunque  un’attività  antiossidante  significativa  a concentrazioni biologicamente rilevanti.  Wartela et al dimostrano una differente attività antiossidante di HT e TY in cellule di mammella. L’ HT è  un  più  efficiente  scavenger  di  radicali  liberi  rispetto  al  tirosolo,  ma  entrambi  non  riescono  a influenzare la proliferazione cellulare, fasi del ciclo cellulare e apoptosi in cellule epiteliali mammarie umane (MCF10A) o cellule tumorali di mammella (MDA‐MB‐231 e MCF7).  L’HT riduce i livelli di ROS in cellule  MCF10A  ma  non  in  cellule  MCF7  e  MDA‐MB‐231  mentre  concentrazioni  molto  elevate  di tirosolo  sono  necessarie  per  diminuire  il  livello  di  ROS  in  cellule  MCF10A.  L’HT,  inoltre,  previene  i danni ossidativi del DNA in tutte le linee cellulari di mammella. Pertanto l’idrossitirosolo potrebbe 
  29. 29. 26contribuire ad una minore incidenza di cancro al seno nelle popolazioni che consumano olio di oliva vergine per la sua attività antiossidante e la sua protezione contro danno ossidativo al DNA in cellule mammarie (Wartela et al 2011).                 Fig 2: Ruolo dei polifenoli nei processi di perossidazione lipidica  L’HT,  a  lungo  considerato  soltanto  un  potente  antiossidante,  in  realtà  è  in  grado  di  agire  come nutriente a target mitocondriale fornendo un nuovo meccanismo di efficacia della dieta mediterranea nel ridurre il rischio di diverse malattie tra cui malattie cardiovascolari, cancro, diabete e obesità. E’ noto  che  la  malattia  cardiovascolare  è  la  complicanza  più  comune  e  più  grave  del  diabete  e dell’obesità. Poiché la respirazione mitocondriale svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo del glucosio, una disfunzione mitocondriale è associata al diabete e obesità (Bendini et al 2007; Fito et al 2007; Wahle et al 2004). È stato osservato che lespressione di fattori di regolazione per la biogenesi mitocondriale  sono  ridotti  nel  tessuto  adiposo  dei  soggetti  diabetici  ed  obesi  (Hammarstedt  et  al 2003;  Semple  et  al  2004). Hao  et  al  hanno  dimostrato,  in    adipociti  della  linea  3T3‐L1,  che  il trattamento con HT porta ad un miglioramento della funzione mitocondriale stimolando la biogenesi mitocondriale.  L’HT  promuove  l’espressione  della  proteina  PPARGC1α,  regolatore  chiave  della biogenesi mitocondriale e dei suoi bersagli a valle, Nrf1 Nrf2 e il fattore di trascrizione mitocondriale 
  30. 30. 27(Tfam).  Inoltre,  l’HT  incrementa  il  mtDNA;  promuove  l’espressione  di  proteine  del  complesso mitocondriale  I,  II,  III,  IV  e  V,  e  numero  e  massa  mitocondriale.  L’HT  up‐regola  lespressione  di proteine  e  di  geni  legati  all’ossidazione  degli  acidi  grassi  nello  specifico  Pparα,  Cpt1  e  Pparγ, adipogenesi e funzione mitocondriale, comprese le attività dei complessi mitocondriali I, II, III, IV e V, consumo di ossigeno, e riduce il contenuto in acidi grassi liberi (FFA).  HT attiva la fosforilazione della  proteina chinasi AMP dipendente (AMPK) e acetil‐CoA carbossilasi (ACC) (Hao et al 2010). La Dieta mediterranea, con un elevato apporto di idrossitirosolo, può stimolare la funzione (aumento dell’ossidazione di acidi grassi) e la biogenesi mitocondriale e, quindi, ridurre il rischio di obesità e diabete, con un ridotto rischio di malattie cardiovascolari.  Sembra  che  la  biogenesi  mitocondriale  e  il  sistema  antiossidante  di  Fase  II  siano  strettamente connessi  ed  accoppiati  perché  PPARGC1α  è  stato  dimostrato  sopprimere  i  ROS  e  la neurodegenerazione (St‐Pierre et al 2006). Pertanto, è possibile che HT, un potente antiossidante e attivatore degli enzimi di Fase II, possa aumentare la biogenesi mitocondriale e migliorare la funzione mitocondriale  sopprimendo  i  ROS  e  stimolando  il  sistema  di  Fase  II  per  rafforzare  le  difese antiossidanti della cellula, oltre al suo effetto diretto sull’assemblaggio mitocondriale.  In  cellule  di  epitelio  pigmentato  retinico  umano  (ARPE‐19)  l’HT  protegge  dal  danno  ossidativo  e disfunzione mitocondriale indotta dall’acroleina (Liu et al 2007). Due sono le vie attivate dall’HY per proteggere  tali  cellule  dal  danno  ossidativo:  1)  i  sistemi  antiossidanti  endogeni,  inclusi  enzimi detossificanti  di  fase  II,  antiossidanti  mitocondriali  e  catalasi,  2)  la  biogenesi  mitocondriale.  L’HT significativamente aumenta la traslocazione nucleare di Nrf2 promuovendo l’espressione e l’attività degli  enzimi  di  Fase  II  GCL,  NQO1  e  HO‐1  con  conseguente  miglioramento  del  sistema  di  difesa antiossidante. Quindi conferisce un’ulteriore protezione antiossidante oltre alle sue attività diretta di scavenger  di  radicali  liberi.  L’HT  promuove  la  biogenesi  mitocondriale:  up‐regola  AMPK  e  eNOS, stimola lespressione di PPARGC1α, il fattore chiave per la biogenesi mitocondriale, e l’espressione proteica di Tfam, un fattore di trascrizione chiave coinvolto nella biogenesi mitocondriale e del gene bersaglio PPARGC1α. Inoltre l’HT aumenta i livelli di proteina mitocondriale dei complessi I, II, III e V. L’HT up‐regola l’espressione del gene UCP2, anch’esso gene bersaglio di PPARGC1α coinvolto nella funzione mitocondriale (Zhu et al 2010). Oltre alla classica azione antiossidante sono state descritte anche  azioni  proossidanti  dei  polifenoli,  che  possono,  quindi,  avere  effetti  opposti  sui  processi 
  31. 31. 28fisiologici  cellulari  di  base.  Infatti,  se  da  un  lato,  come  antiossidanti,  possono  migliorare  la sopravvivenza  cellulare,  dall’altro,  come  proossidanti,  possono  indurre  apoptosi,  necrosi  o  arresto della proliferazione cellulare (Lambert et al 2005). E generalmente accettato che i composti fenolici dellolio di oliva possano esercitare la loro attività di prevenzione del cancro, agendo sia come composti anti‐iniziazione che anti‐promozione/progressione (Hashim  et  al  2005).  Uno  dei  possibili  meccanismi  anti‐promozione/progressione  è  rappresentato dalla capacità di fenoli dellolio di oliva di interferire con la proliferazione e lapoptosi delle cellule tumorali. Lidrossitirosolo  ortodifenolo  (3,4‐diidrossifeniletanolo  (3,4‐DHPEA)),  è  abbondantemente  presente nell’olio di oliva sia come composto libero che legato alla  forma dialdeidica dellacido elenolico legata al 3,4‐DHPEA (3,4‐DHPEA‐EDA), e come isomero dell’oleuropeina aglicone (3,4‐DHPEA‐EA) (Servili and Montedoro 2002). Il 3,4‐DHPEA inibisce la proliferazione ed induce apoptosi in diverse linee cellulari tumorali (Bernini et al 2011; Corona et al 2009; D’Angelo et al 2008; Fabiani et al 2002, Fabiani et al 2008; Hashim et al 2005). Tuttavia, i risultati ottenuti su cellule tumorali derivate da differenti organi sono in disaccordo. In  cellule  di  leucemia  promielocitica  (HL60)  il  trattamento  con  100  µM  di  3,4‐DHPEA  inibisce  la crescita ed induce  una massiccia apoptosi (Della Ragione et al 2000; Fabiani et al 2002). In cellule HL‐60,  il 3,4‐DHPEA altera la progressione del ciclo cellulare, inibendo la transizione di fase G1‐S e modifica lespressione  di proteine regolatrici del ciclo cellulare, riducendo l’espressione della chinasi ciclina‐dipendente 6 (CDK6) e aumentando l’espressione di inibitori delle CDK p21WAF1/Cip1 e p27 Kip1 (Fabiani et al 2008). Al contrario, un comportamento diverso è stato riportato per cellule di cancro al seno della linea MCF‐7 e SKBR3 che risultano resistenti al trattamento con 100 µM  di 3,4 ‐DHPEA  (Menendez  et  al  2007)  e  richiedono  alta  concentrazione  di  fenolo  (MCF‐7,  324  µM)  per osservare un effetto sullapoptosi e proliferazione (Han et al 2009). Altri autori riportano che cellule MCF‐7 sono resistenti all’azione  pro‐apoptotica di 3,4‐DHPEA (400 µM), effetto legato allassenza di caspasi‐3 in queste cellule (Guichard et al 2006).  In netto contrasto con i dati sopra riportati,  è lo studio di Goulas et al in cui è stato dimostrato che le cellule MCF‐7 sono molto sensibili all’attività antiproliferativa di 3,4‐DHPEA, dove il trattamento con 12,5 µM  riduce del 50% la crescita cellulare (Goulas et al 2009).  
  32. 32. 29Inoltre, è stato recentemente dimostrato che 3,4‐DHPEA è in grado di inibire la proliferazione indotta dall’estradiolo in cellule tumorali di seno MCF‐7 interferendo con l’attivazione di ERK 1/2 (Sirianni et al 2010). Risultati  contrastanti  sono  stati  ottenuti  anche  su  cellule  di  cancro  del  colon  HT‐29  che  risultano resistenti all’effetto antiproliferativo di 3,4‐DHPEA fino a concentrazione pari a 400 µM  (Obied et al 2009), ma in altri studi è stato riportato essere sensibili all’effetto pro‐apoptotico a concentrazioni tra 200‐400 µM (Bernini et al 2011, Guichard et al 2006). Inoltre, nella linea cellulare di tumore del colon Caco2, il trattamento con 3,4‐DHPEA (50‐100 µM) provoca una riduzione della crescita cellulare sia per laccumulo di cellule nella fase G2 del ciclo e linibizione della fosforilazione di ERK1/2 (Corona et al 2009).  Infine,  è  stato  riportato  che  cellule  di  melanoma  umano  M14  rispondono  al  trattamento  con  3,4‐DHPEA solo a concentrazioni superiori a 600‐800 µM (D’Angelo et al 2005).  In  questo  contesto,  occorre  notare  che  le  dosi  utilizzate  in  vitro  per  evidenziare  gli  effetti antiproliferativi e proapoptotici dell’idrossitirosolo sono ben superiori a quelli ottenuti nel plasma di individui che normalmente consumano olio doliva (Miro‐Casas et al 2003; Vissers et al 2004). Recentemente  è  stato  dimostrato  che  le  proprietà  anti‐proliferative  e  pro‐apoptotiche  di  questo fenolo su cellule HL60 sono mediate da un’attività pro‐ossidante che consiste nella generazione di perossido di idrogeno (H2O2) nel mezzo di coltura cellulare (Fabiani et al 2009). Il rilascio di H2O2 è stato descritto anche per altri composti fenolici di origine vegetale sia quando testati come miscele complesse, quali come quelli derivati da semi di uva (Cambon‐Roques et al 2002), mele (Lapidot et al 2002), tè e vino (Chai et al 2003), e se usati come composti purificati come l’acido gallico, quercetina (Lee  et  al  2005),  lascorbato  (Wee  et  al  2003),  e  l’epigallocatechina  gallato  (Long  et  al  2007).  È possibile che gli effetti esercitati da 3,4‐DHPEA sulle diverse linee cellulari possano essere mediati dalla sua capacità di rilasciare H2O2 nel mezzo di coltura, e quindi le diverse risposte osservate può dipendere dalla capacità delle cellule di eliminare H2O2 e quindi dagli specifici enzimi quali catalasi e glutatione perossidasi,  E’  ampiamente  descritto  in  letteratura  che  l’iperglicemia  porta  ad  una  over‐produzione  di  radicali liberi e ad una glicazione  non enzimatica delle proteine, che hanno un effetto deleterio su differenti organi. Oleuropeina e idrossitirosolo, hanno effetti ipoglicemici, ipolipidemici e antiossidanti  in ratti 
  33. 33. 30diabetici. In tali ratti si osserva una diminuzione delle attività antiossidanti, in particolare nella SOD e CAT e un innalzamento dei livelli di TBARS. La somministrazione di composti fenolici nei ratti diabetici ripristina, in modo dose‐dipendente, i sistemi antiossidanti e porta ad un abbassamento significativo dei livelli  di TBARS; in accordo con altri lavori che hanno dimostrato che il trattamento con  polifenoli esercita un aumento dell’espressione di SOD e CAT a livello trascrizionale (Jemay et al 2009).  Recentemente  è  stato  dimostrato  che  l’autofagia  sembra  essere  coinvolta  nella  progressione dell’atrofia muscolare, anche se il ruolo dell’autofagia nel muscolo scheletrico durante un esercizio molto intenso rimane ancora non chiaro. Alcuni studi mostrano che l’inibizione dell’autofagia induce atrofia  muscolare  e  miopatia,  d’altra  parte  l’eccessiva  attivazione  dell’autofagia  aggrava  la degradazione del muscolo, che deriva dalla degenerazione di porzioni del citoplasma, di proteine e organelli (Masiero et al 2009; 2010). Inoltre, è ormai ben accettato che il regolare esercizio aumenta il contenuto mitocondriale nel muscolo scheletrico mediante l’attivazione del fattore di PGC1α, con un aumento  della  capacità  di  tolleranza  allo  sforzo  con  una  maggiore  efficienza  nel  metabolismo energetico aerobio (Hood et al 2009). Ancora, c’è una diretta correlazione tra l’aumento del consumo di  ossigeno  durante  l’esercizio  e  la  produzione  di  radicali  dell’ossigeno.  Basse  e  fisiologiche concentrazioni di ROS sono richieste per la normale produzione di energia nel muscolo scheletrico, ma alti livelli di ROS (come ad esempio in seguito ad un esercizio eccessivo) promuovono disfunzioni nel  processo  di  contrazione,  con  conseguente  debolezza  muscolare  e  fatica  (Power  et  al  2009). Questo  accumulo  provoca  uno  stress  ossidativo  con  una  conseguente  attivazione  del  processo  di autofagia  nel  muscolo,  induzione  nella fissione  mitocondriale;  risultato  è  che  il  mitocondrio  ha  un ruolo  fondamentale  nella  regolazione  dell’autofagia  nel  muscolo  scheletrico  e  nei  processi  che portano ad atrofia muscolare (Romanello et al 2010). L’esercizio  eccessivo  (EXE)  attiva  l’autofagia  che  contribuisce  a  processi  di  atrofia  del  muscolo.  La capacità  di  tolleranza  allo  sforzo  eccessivo  è  significativamente  aumentata  in  ratti  con  una  dieta supplementata con HT, ma questo sembra non essere vero per  ratti sedentari. L’atrofia del muscolo indotta dall’autofagia e la fissione mitocondriale vengono anch’esse bloccate dalla supplementazione con  HT;  inoltre,  nei  ratti  sottoposti  a  EXE,  l’HT  induce  la  fusione  mitocondriale  aumenta  l’attività funzionale del complesso I e II, diminuendo gli effetti dannosi dell’EXE. Pertanto l’HT può avere effetti 
  34. 34. 31benefici  sulle  performance  fisiche  e  potrebbe  avere,  quindi,  effetti  rilevanti  su  varie  patologie correlate a disfunzioni mitocondriali (Feng et al 2011).  Studi epidemiologici hanno dimostrato che l’ alimentazione può costituire un importante fattore di protezione  ambientale  nei  confronti  delle  malattie  cardiovascolari  e  neoplastiche.  In  particolare,  risulta  importante  la  ricchezza  nella  dieta  di  prodotti  vegetali,  e  quindi  l’assunzione  di  quantità rilevanti di frutta, verdura, olio come è, ad esempio, tipico della Dieta Mediterranea.  Studi scientifici degli ultimi dieci anni hanno chiarito che i polifenoli presenti nell’olio extravergine di oliva, in primis l’idrossitirosolo, sono in grado di contrastare i radicali liberi attraverso due meccanismi principali: in primo luogo riescono a stabilizzare direttamente le molecole radicaliche attraverso la sottrazione  di  un  elettrone;  in  secondo  luogo  attivano  meccanismi  intracellulari  che  promuovono l’innalzamento  dei  livelli  degli  antiossidanti  già  fisiologicamente  presenti  nelle  cellule.  Un  aspetto nuovo della ricerca che sta emergendo dalle pubblicazioni degli ultimi anni è che i polifenoli agiscano anche nella prevenzione del danno mitocondriale, apportando notevoli miglioramenti in termini di vitalità dei mitocondri, resistenza a sostanze tossiche ed eventi lesivi. Da questi dati si evince come i prodotti  a  base  di  polifenoli  delle  olive,  oltre  che  contrastare  l’azione  dannosa  dei  radicali  liberi, possano  anche  riportare  energia  nel  nostro  organismo,  favorendo  la  risoluzione  di  situazioni  di stanchezza  intensa  dovuta  alla  compromissione  dell’equilibrio  ossidativo  e  alla  diminuzione dell’efficienza dei meccanismi di creazione dell’energia.   RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI  Bayram B et al. A diet rich in olive oil phenolics reduces oxidative stress in the heart of samp8 mice by induction of nrf2‐dependent gene expression. Rejuvenation Res, 2012; 15: 71‐81. Bendini A  et al. Phenolic molecules in virgin olive oils: a survey of their sensory properties, health effects, antioxidant activity andanalytical methods. An overview of the last decade. Molecules, 2007; 12:1679–1719. 
  35. 35. 32Benzie IFF. Antioxidants: observational epidemiology. In: Sadler MJ, Strain JJ, Cabellero B (Ed.). The Encyclopedia of human nutrition. New York: Academic Press; 1999. p. 106‐15. Bernini  R  et  al.  Synthesis  of  a  novel  ester  of  hydroxytyrosol  and  a‐lipoic  acid  exhibiting  an antiproliferative effect on human colon cancer HT‐29 cells. Eur J Med Chem, 2011; 46:439–446. Bosetti C et al. Food groups and laryngeal cancer risk: a case control study from Italy and Switzerland. Int J Cancer, 2002a; 100:355–360. Bosetti C et al. Olive oil, seed oils and other added fats in relation to ovarian cancer (Italy). Cancer Causes Control, 2002b; 13:465–470. Cambon‐Roques S et al. Hydrogen peroxide generation in Caco‐2 cell culture medium by addition of phenolic compounds: effect of ascorbic acid. Free Rad Res, 2002; 36:593–599. Chai  CP  et  al.  Contribution  of  hydrogen  peroxide  to  the  cytotoxicity  of  green  tea  and  red  wines. Biochem Biophys Res Comm, 2003; 304:650–654. Corona G et al. Hydroxytyrosol inhibit the proliferation of human colon adenocarcinoma cells through inhibition of ERK1/2 and cyclin D1. Mol Nutr Food Res, 2009; 53:897–903. D’Angelo  S  et  al.  Hydroxytyrosol,  a  natural  antioxidant  from  olive  oil,  prevents  protein  damage induced by long‐wave ultraviolet radiation in melanoma cells. Free Rad Biol Med, 2005; 38:908–919. Davies KJ. Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochem Soc Symp, 1993; 6:1‐31. Dell’Agli  M  et  al.  Minor  components  of  olive  oil  modulate  proatherogenic  adhesion  molecules involved in endothelial activation. J Agric Food Chem, 2006; 54:3259–3264. Della Ragione FD et al. Hydroxytyrosol, a natural molecule occurring in olive oil, induces cytochrome c‐dependent apoptosis. Biochem Biophys Res Comm, 2000; 278:733–739.  Dinkova‐Kostova AT et al. Direct evidence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensors regulating induction of phase 2 enzymes that protect against carcinogens and oxidants. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:11908‐11913. Fabiani  R  et  al.  Inhibition  of  cell  cycle  progression  by  hydroxytyrosol  is  associated  with  the  up‐regulation of CDK inhibitors p21WAF1/Cip1 and p27Kip1 and with the induction of differentiation in HL60 cells. J Nutr, 2008; 138:42–48. Fabiani R. Cancer chemoprevention by hydroxytyrosol isolated from virgin olive oil through G1 cell cycle arrest and apoptosis. Eur J Cancer Prev, 2002; 11:351–358. 
  36. 36. 33Fabiani R et al. Production of hydrogen peroxide is responsible for the induction of apoptosis on HL60 cells. Mol Nutr Food Res, 2009; 53:887–896. Feng  Z  et  al.  Mitochondrial  dynamic  remodeling  in  strenous  exercise‐induced  muscle  and mitochondrial  dysfuction:  regulatory  effects  of  hydroxytyrosol.  Free  radical  biol  &  med,  2011; 50:1437‐1446. Fito M et al. Olive oil and oxidative stress. Mol Nutr Food Res, 2007; 51:1215–1224. Fortes C et al. The protective effect of the Mediterranean diet on lung cancer. Nutr Cancer, 2003; 46:30–37. Goulas V et al. Phytochemicals in olive oil leaf extracts and the antiproliferative activity against cancer and endothelial cells. Mol Nutr Food Res, 2009; 53:600–608. Granados‐Principal S et al. Hydroxytyrosol: from laboratory investigations to future clinical trials. Nutr Rev, 2010; 68:191–206. Guichard C et al. Dihydroxyphenylethanol induces apoptosis by activating serine/ threonine protein phosphatase  PP2A  and  promotes  the  endoplasmic  reticulum  stress  response  in  human  colon carcinoma cells. Carcinogenesis, 2006; 27:1812–1827. Hammarstedt A et al. Reduced expression of PGC‐1 and insulin‐signaling molecules in adipose tissue is associated with insulin resistance. Biochem Biophys Res Commun, 2003; 301:578–582. Han J et al. Anti‐proliferative and apoptotic effects of oleuropein and hydroxytyrosol on human breast cancer MCF‐7 cells. Cytotechnology, 2009; 59:45–53. Hao et al. Hydroxytyrosol promotes mitochondrial biogenesis and mitochondrial function in 3T3‐L1 adipocytes. J Nutr Biochem, 2010; 21:634–644.  Hashim YZ et al. Components of olive oil and chemoprevention of colorectal cancer. Nutr Rev, 2005; 63:374–386. Hodge AM et al. Foods, nutrients and prostate cancer. Cancer Causes Control, 2004; 15:11–20. Hood DA. Mechanisms of exercise‐induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. Appl Physiol Nutr Metab, 2009; 34:465–472. Itoh K et al. Keap1 represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino‐terminal Neh2 domain. Genes Dev, 1999; 13: 76‐86. Jemay H et al. Antidiabetic and antioxidant effects of hydroxytyrosol and oleuropein from olive leale in alloxan diabetic rats J Agri Food Chem, 2009; 57:8798‐8804. 
  37. 37. 34Kobayashi  M,  and  Yamamoto  M.  Molecular  mechanisms  activating  the  Nrf2‐Keap1  pathway  of antioxidant gene regulation. Antioxid Redox Signal, 2005; 7:385–394. Lambert JD et al. Inhibition of carcinogenesis by polyphenols: evidence from laboratory investigations. Am J Clin Nutr, 2005; 81:284S‐91S. Lapidot T et al. Can apple antioxidants inhibit tumor cell proliferation? Generation of H2O2 during interaction of phenolic compounds with the cell culture media. J Agric Food Chem, 2002; 50:3156–3160. Lee WK, et al. Antiproliferative effects of dietary phenolic substances and hydrogen peroxide. J Agric Food Chem, 2005; 53:1990–1995. Liu Z et al. Hydroxytyrosol protects retinal pigment epithelial  cells from acrolein‐induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction. J Neurochem, 2007; 103:2690–2700. Long LH et al. Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocathechin gallate in various cell‐culture  media  due  to  variable  rates  of  its  oxidation  in  the  cell  culture  medium.  Mutat  Res,  2007;  634:177–183. Masiero  E  and  Sandri  M.  Autophagy  inhibition  induces  atrophy  and  myopathy  in  adult  skeletal muscles. Autophagy, 2010; 6:307–309. Masiero E et al. Autophagy is required to maintain muscle mass. Cell Metab, 2009; 10:507–515.  Menendez  JA  et  al.  Olive  oil’s  bitter  principle  reverses  acquired  autoresistance  to  trastuzumab (Herceptin) in HER2‐overexpressing breast cancer cells. BMC Cancer,  2007; 7:8030.  Miro‐Casas E et al. Hydroxytyrosol disposition in humans. Clin Chem, 2003; 49:945–952. Moll UM, et al. Transcription‐independent pro‐apoptotic functions of p53. Curr Opin Cell Biol, 2005; 17:631–636. Nohl H et al. Intracellular generation of reactive oxygen species by mitochondria. Biochem Pharmacol, 2005; 69:719‐723. Obied HK et al. Chemistry and bioactivity of olive biophenols in some antioxidant and antiproliferative in vitro bioassay. Chem Res Toxicol, 2009; 22:227–234. Owen RW et al. Olive‐oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Onc, 2000; 1:107–112. Porrini M et al. Daily intake of a formulated tomato drink affects carotenoid plasma and lymphocyte concentrations and improves cellular antioxidant protection. Br J Nutr, 2005; 93:93‐99. 
  38. 38. 35Powers  SK  and  Jackson  MJ.  Exercise‐induced  oxidative  stress:  cellular  mechanisms  and  impact  on muscle force production. Physiol Rev, 2008; 88:1243–1276.  Razquin C. A 3 years follow‐up of a Mediterranean diet rich in virgin olive oil is associated with high plasma antioxidant capacity and reduced body weight gain. European Journal of Clinical Nutrition, 2009; 63:1387‐1393. Rietjens  SJ  et  al.  The  olive  oil  antioxidant  hydroxytyrosol  efficiently  protects  against  the  oxidative stress‐induced impairment of the NO bullet response of isolated rat aorta. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007; 292:H1931–H1936. Romanell, Vet al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J, 2010; 29:1774–1785. Semple RK et al. Expression of the thermogenic nuclear hormone receptor coactivator PGC‐ 1alpha is reduced  in  the  adipose  tissue  of  morbidly  obese  subjects.  Int  J  Obes  Relat  Metab  Disord,  2004; 28:176–179. Servili M and Montedoro GF. Contribution of phenolic compounds to virgin olive oil quality. Eur J Lipid Sci Technol, 2002; 104:602–613. Sirianni  R  et  al.  Oleuropein  and  hydroxytyrosol  inhibit  MCF‐7  breast  cancer  cells  proliferation interfering with ERK1/2 activation. Mol Nutr Res, 2010; 54:833–840. Stoneham  M  et  al.  Olive  oil,  diet  and  colorectal  cancer:  an  ecological  study  and  a  hypothesis.  J Epidemiol Community Health, 2000; 54:56–76. St‐Pierre  J  et  al.  Suppression  of  reactive  oxygen  species  and  neurodegeneration  by  the  PGC‐1 transcriptional coactivators. Cell, 2006; 127:397–408. Travis  E  and  Rachakonda  G.  NRF2  deficiency  reduces  life  span  of  mice  administered  thoracic irradiation. Free Radic Biol Med, 2011; 51:1175–1183. Trichopoulou A et al. Consumption of olive oil and specific food groups in relation to breast cancer risk in Greece. J Natl Cancer Inst, 1995; 87:110–116. Visioli F and Galli C. Olive oil phenols and their potential effects on human health. J Agric Food Chem, 1998; 46:4292‐4296. Vissers MN et al. Bioavailability and antioxidant effects of olive oil phenols in humans: a review. Eur J Clin Nutr, 2004; 58:955–965. 

×