Biologia do desenvolvimento, 5ª edição, gilbert
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Esta é a 5ª edição da extensa obra de Gilbert, um clássico da biologia. O livro é dividido em 5 Partes e 23 capítulos. ...

Esta é a 5ª edição da extensa obra de Gilbert, um clássico da biologia. O livro é dividido em 5 Partes e 23 capítulos.
Como aborda um aspecto muito amplo do desenvolvimento biológico, vou citar apenas as 5 Partes, que são bem genéricas, porque seu eu fosse me ater aos capítulos e temas, essa postagem ficaria muito longa. Mas já garanto que é um importante livro para se ter sempre à mão. E não se preocupe, pois neste único download a versão é completa.

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  • Biologia do DesenvolvimentoQ U I N T A E D I Ç Ã O
  • Biologia do DesenvolvimentoQ U I N T A E D I Ç Ã O Scott F. Gilbert Swarthmore College Tradução e Revisão Adolfo Max Rothschild Zuleika Rothschild Francisco A. de Moura Duarte Maria Helena Corrêa Marques
  • A capa FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento Fibroblástico pode ser detectado pela hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado quimicamente que é complementar a essa mensagem. No embrião de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8 é encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no limite entre o cérebro posterior e o cérebro intermediário, nos somitos, nos arcos branquiais do pescoço e na cauda em desenvolvimento. O FGF8 é importante para diversos processos desenvolvimentais e desempenha papéis críticos no crescimento dos membros e na padronização do desenvolvimento do cérebro. Capítulos 3, 7 e 18. (Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.) FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrião de pinto de 20-21 dias nos estágios de “pipping” (bicando a casca internamente) e pré-eclosão. Note o revestimento peridérmico proeminente na extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradiça, como uma conseqüência da utilização de minerais pelo embrião para seu crescimento esquelético. Esse estágio desenvolvimental marca a transição do embrião em um pinto que respira ar. Capítulos 1 e 5. (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.) As páginas de título PÁGINAESQUERDA: Aexpressão gênica gera limites nos discos imagi- nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nes- se estágio, a proteína Apterous (vermelho) é expressa somente nos compartimentos dorsais; a proteína Cubitus interruptus (azul) mar- ca os compartimentos anteriores (mas não os posteriores) (uma linha formando esse limite pode ser observada). A coloração verde (origi- nária da proteína Vestigial) no interior demarca o limite entre o mem- bro livre e a articulação ligando-o à parede torácica. Capítulo 19. (Fo- tografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.) PÁGINA DIREITA: Expressão do gene paraxis no embrião de pinto no estágio de 6 somitos. Hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado com “digoxygenin” complementar a uma porção da mensagem paraxis do pinto mostra a expressão desse gene durante a formação do somito. A proteína Paraxis é importante no estabeleci- mento da estrutura desses grupos mesodérmicos. Capítulos 2 e 9. (Montagem fotográfica cortesia de R. Tuan.) Do original: Developmental biology, Fifth Edition Copyrigth ® 1997 by Sinauer Associates, Inc. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do livro, SP, Brasil) _____________________________________ Gilbert, Scott F., 1949- Biologia do desenvolvimento / Scott F. Gilbert. -- 5. ed. -- Ribeirão Preto, SP : FUNPEC Editora, 2003. Título original : Developmental biology Vários tradutores e revisores. Bibliografia. ISBN 85-87528-61-0 1. Biologia do desenvolvimento I. Título. 03-4459 CDD-571.8 _____________________________________ Índices para catálogo sitemático: 1. Bilogia do Desenvolvimento: Ciências da vida 571.8 Direitos para a língua portuguesa cedidos pela Sinauer Associates, Inc. para a Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto que se reserva a propriedade desta tradução. Proibida a reprodução dos textos originais, mesmo parcial e por qualquer processo, sem autorização da editora.
  • Para Daniel, Sarah, e David
  • Tabela de Conteúdos Introdução ao desenvolvimento animal 1 O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Os estágios do desenvolvimento animal 3 Nossa herança eucariótica 5 Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6 Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária 6 Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria 10 As Origens da Reprodução Sexual 12 Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação 16 As Volvocaceanas 16 Informações adicionais & Especulações Sexo e Individualidade em Volvox 18 Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium 21 Informações adicionais & Especulações Evidência e Anticorpos 25 Informações adicionais & Especulações Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima 27 Padrões desenvolvimentais entre metazoários 28 Os Poríferos 29 Protostomatas e Deuterostomatas 30 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35 As origens embriológicas da teoria dos genes 35 Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? 35 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento 37 A cisão entre a embriologia e a genética 38 Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento 39 Evidência para a equivalência genômica 40 Metaplasia 40 Clonagem de Anfibios: A Restrição da Potência Nuclear 42 Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas 43 Informações adicionais & Especulações Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro 45 Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon 47 Síntese diferencial de RNA 49 Hibridização de ácido nucléico 54 Clonagem de DNA genômico 55 Hibridização de DNA: entre e intra espécies 58 Seqüenciamento de DNA 59 Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA 61 Técnicas de localização de RNA 63 Hibridização In Situ 63 Transferências Northern 64 2
  • Tabela dos Conteúdos vii Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia 66 Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos 69 Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula 69 Camundongos quiméricos 70 Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) 70 Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense 73 Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos 73 Uma conclusão e um alerta 75 Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 79 Afinidade celular diferencial 80 O modelo termodinâmico de interações celulares 84 Informações adicionais & Especulações Evidência para o modelo termodinâmico 87 A base molecular das adesões célula-célula 88 As classes de moléculas de adesão celular 88 Informações adicionais & Especulações Anticorpos monoclonais e genética reversa 89 Moléculas de adesão celular 92 Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento 92 Caderinas 92 CAMs da superfamília de imunoglobulinas 95 Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda 97 A base molecular da afinidade célula-substrato 99 Afinidade diferencial a substrato 99 A matriz extracelular 99 Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular 104 Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla 106 Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais 107 A via JAK-STAT 107 A via RTK-Ras 108 Informações adicionais & Especulações Mutações negativas dominantes em receptores 110 A via do inositol fosfato 111 Cruzamentos entre vias 112 A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento 112 Interações recíprocas na superfície celular 113 3 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Fertilização: Iniciando um novo organismo 121 Estrutura dos gametas 121 Espermatozóide 121 O óvulo 125 Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância 128 Atração do Espermatozóide 128 Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar 129 Informações adicionais & Especulações Ação à Distância: Gametas de Mamíferos 131 Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas 132 Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços- do-Mar 132 Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos 135 Fusão de gametas e a prevenção da polispermia 139 Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide 139 Prevenção da Polispermia 140 Informações adicionais & Especulações A Ativação do Metabolismo dos Gametas 147 Ativação do metabolismo do óvulo 149 Respostas precoces 149 Respostas tardias 151 Fusão do material genético 152 Informações adicionais & Especulações A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos 154 Rearranjo do citoplasma do óvulo 156 Preparação para a Clivagem 158 Clivagem: Criando multicelularidade 167 PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA 168 Clivagem holoblástica radial 169 A holotúria, Synapta 169 Ouriço-do-Mar 170 Anfíbios 173 Clivagem holoblástica espiral 175 4 5
  • viii Tabela dos Conteúdos Informações adicionais & Especulações Adaptação pela modificação da clivagem embrionária 178 Clivagem Holoblástica Bilateral 179 Clivagem holoblástica rotacional 180 Compactação 181 Informações adicionais & Especulações A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação 184 Formação da massa celular interna 185 Fuga da Zona Pelúcida 185 Informações adicionais & Especulações Gêmeos e células embrionárias precursoras 186 Clivagem Meroblástica 188 Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192 Informações adicionais & Especulações Exceções, Generalizações, e Clivagem Parasítica da Vespa 195 MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem 196 Fator promotor de maturação 197 Informações adicionais & Especulações MPF e Seus Reguladores 198 O mecanismo citoesquelético da mitose 201 A formação de novas membranas 203 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 209 Gastrulação em ouriço-do-mar 210 Ingresso do Mesênquima Primário 210 Primeiro estágio da invaginação do arquêntero 215 Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero 217 Gastrulação em peixes 218 A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular 218 Formação das camadas germinais 220 Gastrulação de anfíbios 221 Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios 221 Posicionando o blastóporo 224 Movimentos celulares e a construção do arquêntero 226 Migração do mesoderma involutivo 229 Informações adicionais & Especulações Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica 230 Epibolia do ectoderma 232 Gastrulação em aves 233 Generalidades sobre gastrulação em aves 233 6 Mecanismos de gastrulação em aves 238 Gastrulação em mamíferos 242 Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo 242 Formação de membranas extra-embrionárias 245 Iníciododesenvolvimentovertebrado: Neurulação e ectoderma 253 FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL 254 Neurulação: aspectos gerais 254 Neurulação primária 255 A mecânica da neurulação primária 257 A formação da placa neural 257 Formação do assoalho da placa neural 258 A modelagem e dobramento da placa neural 259 Fechamento do tubo neural 260 Informações adicionais & Especulações A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264 Neurulação secundária 264 Diferenciação do tubo neural 265 Formação das regiões do cérebro 265 Informações adicionais & Especulações Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio 268 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270 Organização do cerebelo 272 Organização cerebral 274 Tipos de neurônios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados 279 Dinâmica do desenvolvimento ótico 279 Diferenciação da retina neural 280 Informações adicionais & Especulações Porque os bebês não enxergam bem 282 Diferenciação do cristalino e da córnea 283 A CRISTA NEURAL 284 A crista neural e seus derivados 284 A crista neural do tronco 285 Vias de migração das células da crista neural do tronco 285 A matriz extracelular e a migração da crista neural do tronco 287 Informações adicionais & Especulações Análise das mutações que afetam o desenvolvi- mento das células da crista neural 290 A potência do desenvolvimento das células da crista neural do tronco 291 Diferenciação final das células da crista neural 292 A crista neural cefálica 293 Vias migratórias das células da crista neural cefálica 293 Potência de desenvolvimento das células da crista neural cefálica 295 7
  • Tabela dos Conteúdos ix A crista neural cardíaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTÂNEAS 297 A origem das células epidérmicas 297 Apêndices cutâneos 299 Conclusões 300 Especificidade axônica 307 A geração da diversidade neuronial 307 Especificação do Neurônio Motor de Vertebrado 308 Especificação dos Neurônios Motores em Drosophila 310 Formação de padrões no sistema nervoso 312 Seleção de trajetórias: Orientação pela matriz extracelular 313 Orientação pelo Terreno Físico: Orientação por Contato 313 Orientação para Gradientes de Adesão: Haptotaxia 314 Condução por Sinais Migratórios específicos do Axônio: A Hipótese das Trajetórias Marcadas 315 Orientação pela Repulsão Específica de Cones de Crescimento 317 Informações adicionais & Especulações Sexo,Odor e Adesão Específica 319 Seleção de trajetória: Orientação por moléculas difusíveis 320 Sinais para condução múltipla 323 Neurônios Motores Vertebrados 323 Axônios da Retina 325 Seleções de alvos 326 Especificidades Adesivas em Diferentes Regiões do Tectum 328 Seleção de endereço: Desenvolvimento dependente de atividade 331 Sobrevivência diferencial após a inervação: Fatores neurotróficos 331 Informações adicionais & Especulações Neurônios Fetais em Hospedeiros Adultos 334 O desenvolvimento de comportamentos: constância e plasticidade 334 8 Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341 MESODERMA 341 Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos somitos 341 Mesoderma Paraxial 341 Somitômeros e a Iniciação da Formação do Somito 343 Geração de Tipos de Células Somíticas 344 Miogênese: Diferenciação do Músculo Esquelético 347 Informações adicionais & Especulações Construção Muscular e a Família MyoD de Reguladores Transcricionais 349 Osteogênese: O Desenvolvimento dos Ossos 351 Informações adicionais & Especulações Controle da Condrogênese na Placa de Crescimento 357 Mesoderma da Placa Lateral 358 Formação das Membranas Extra-Embrionárias 359 O Coração 361 Formação dos vasos sangüíneos 366 Informações adicionais & Especulações Redirecionando o Fluxo Sangüíneo no Mamífero Recém-nascido 372 O Desenvolvimento de células sangüíneas 373 O Conceito de Célula-tronco 373 Células-tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoéticos 374 Desenvolvimento Osteoclástico 377 Locais de Hematopoiese 378 ENDODERMA 380 Faringe 380 O tubo digestivo e seus derivados 382 Fígado, Pâncreas e Vesícula Biliar 382 O Tubo Respiratório 383 9
  • x Tabela dos Conteúdos Regulação transcricional da expressão gênica: Fatores de transcrição e a ativação de promotores específicos 391 Éxons e Íntrons 392 Estrutura e função do promotor 394 Estrutura do promotor 396 Função do promotor 397 Informações adicionais & Especulações RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor 399 Estrutura e função dos intensificadores 402 Necessidade de intensificadores 402 Função do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrição 403 Fatores de transcrição: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores 404 Proteínas de homeodomínio 405 Os fatores de transcrição POU 406 Informações adicionais & Especulações Regulação da transcrição dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas 409 Fatores de transcrição básicos do tipo hélice-alça- hélice 415 Informações adicionais & Especulações Regulando as proteínas bHLH miogênicas: Governando a troca entre proliferação e diferenciação de células musculares 416 Fatores de transcrição do zíper básico da leucina 416 Informações adicionais & Especulações Armadilhas do intensificador: natural e experimental 418 Fatores de Transcrição Dedo de Zinco 420 Receptores Nucleares de Hormônios e Seus Elementos Responsivos a Hormônios 420 Proteínas que dobram o DNA 423 Ativação dependente de contexto ou silenciamento 423 Regulação da atividade do fator de transcrição 425 Regulação transcricional da expressão gênica: A ativação da cromatina 431 Nucleossomos e a ativação da cromatina reprimida 431 Acessibilidade a fatores trans-reguladores 432 Sítios hipersensíveis à DNAase I 434 PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular 10 Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura 436 Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel da competição de histonas 437 Regiões de controle de loco: transcrição do gene da globina 437 Informações adicionais & Especulações Trocas no gene de globina 440 Metilação de DNA e atividade gênica 442 Correlações entre metilação do promotor e inatividade gênica 442 Metilação e a manutenção dos padrões de transcrição 443 Informações adicionais & Especulações Metilação e impressão gênica 444 Compensação de dosagem do cromossomo X de mamíferos 446 Informações adicionais & Especulações O mecanismo de inativação do cromossomo X 449 Associação do DNA ativo com a matriz nuclear 451 Ligação da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451 Topoisomerases e a transcrição gênica 453 Isoladores e domínios 454 Resumo 455 Controle do desenvolvimento pelo processamento e tradução diferencial do RNA 461 CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA 461 Controle do desenvolvimento precoce pela seleção de RNA nuclear 462 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465 Emenda alternativa do RNA: Criando proteínas alternativas a partir do mesmo gene 466 Um gene, Muitas Proteínas Relacionadas 466 Processamento Alternativo de RNA e Determinação Sexual em Drosophila 468 Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expressão Gênica 471 REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS 471 Mecanismos da tradução eucariótica 472 Controle da síntese protéica pela longevidade diferencial do mRNA 474 Degradação Seletiva de mRNAs 475 Controle da tradução de mensagens do oócito 476 11 12
  • Tabela dos Conteúdos xi Caracterização de RNAs Mensageiros Armazenados em Oócitos 477 Informações adicionais & Especulações Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Oócito 480 Mecanismos para a regulação da tradução das mensagens dos oócitos 481 A Hipótese da Mensagem Materna Mascarada 482 A Hipótese da Cauda Poli(A) 483 A Hipótese da Eficiência da Tradução 486 Outros sistemas de ativação do mRNA: Mensagens sem “Cap” e Mensagens Seqüestradas 486 Informações adicionais & Especulações A Ativação do Genoma Embrionário 488 Regulação dos genes da tradução em larvas e adultos 490 Determinação de Gametas em C. elegans 490 RNA Antisenso Natural 491 “Disjuntores” do Controle da Tradução 492 Editoração do RNA 493 Controle da tradução e síntese protéica coordenada: Produção de Hemoglobina 494 Epílogo: Regulação Pós-tradução 497 Especificação celular autônoma por determinantes citoplasmáticos 505 Comprometimento celular e diferenciação 505 Pré-formação e epigênese 507 Os Teratologistas Franceses 509 Especificações autônomas em embriões de tunicados 510 O determinante formador de músculos do crescente amarelo 511 Especificação citoplasmática das linhagens endodérmicas e epidérmicas e o eixo ântero- posterior 514 Localização citoplasmática em embriões de moluscos 515 O lóbulo polar 517 Especificação celular no nematódeo Caenorhabditis elegans 521 Controle maternal da identidade do blastômero: O controle genético das células progenitoras faríngeas de C. elegans 524 Regulação em C. elegans 527 Informações adicionais & Especulações “Ser ou Não Ser: Esse é o Fenótipo” 529 Divisões celulares assimétricas no desenvolvimento tardio 530 Localização citoplasmática de determinantes de células germinativas 531 Determinação de células germinativas em nematódeos 531 Determinação da célula germinativa em insetos 532 Componentes do plasma polar da Drosophila 534 Determinação de células germinativas em anfíbios 536 Resumo 538 PARTE IV Especificação do Destino Celular e os Eixos Embrionários 13 A genética da especificação axial em Drosophila 543 Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543 AS ORIGENS DA POLARIDADE ÂNTERO-POSTERIOR 545 Visão Panorâmica 545 Os genes de efeito materno 546 Evidência Embriológica da Regulação da Polaridade pelo Citoplasma do Oócito 546 O Modelo Molecular: Gradientes Protéicos no Embrião Precoce 547 Informações adicionais & Especulações Modelos de Gradientes da Informação Posicional 551 Evidência que o Gradiente da Proteína Bicoid Constitui o Centro de Organização Anterior 552 O Centro de Organização Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos 556 O Grupo Gene Terminal 557 Os genes da segmentação 559 Uma Visão Panorâmica 559 Os Genes de gap 561 Os Genes pair-rule 563 Os Genes de Polaridade Segmentar 565 Os genes de Seleção homeótica 569 Padrões de Expressão dos Genes Homeóticos 569 Iniciando os Padrões da Expressão dos genes Homeóticos 572 Mantendo os Padrões de Expressão dos genes Homeóticos 572 Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax 574 14
  • xii Tabela dos Conteúdos Informações adicionais & Especulações Regulação Molecular do Desenvolvimento: As Proteínas do Homeodomínio 576 A GERAÇÃO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA 577 A proteína Dorsal: Morfógeno para a polaridade dorsoventral 577 Translocação da Proteína Dorsal 577 Provendo o sinal assimétrico para a translocação da proteína Dorsal 578 Sinal do Núcleo do Oócito para as Células Foliculares 578 Sinalização das Células Foliculares para o Citoplasma do Oócito 580 O Estabelecimento do Gradiente da Proteína Dorsal 581 PRIMÓRDIOS DE ÓRGÃOS E EIXOS 585 O modelo de coordenadas cartesianas e a especificação dos primórdios dos órgãos 585 Resumo: Alguns princípios do desenvolvimento da Drosophila 586 Especificação do destino celular por interações célula-célula progressivas 591 Desenvolvimento regulativo 591 Testando a teoria do plasma germinativo 592 August Weismann: A teoria do plasma germinativo 592 Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Sven Hörstadius: Potência e gradientes em oócitos 597 Formação de um organismo integrado: Restringindo a potência das células vizinhas 598 Regulação durante o desenvolvimento de anfíbios 600 Hans Spemann: Determinação progressiva das células embrionárias 600 Hans Spemann e Hilde Mangold: Indução embrionária primária 603 O centro de Nieuwkoop 606 A formação do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodérmica 606 A especificação da polaridade dorsoventral na fertilização 607 A base molecular da indução mesodérmica 609 Estabelecendo a regionalização dorsal: o possível papel da β-catenina 609 O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funções para Vg1 e Noggin 610 Indução de especificidade mesodérmica ventral e lateral 612 A criação da atividade do organizador 613 Proteínas secretadas do organizador 613 Informações adicionais & Especulações BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616 Fatores de transcrição induzidos no organizador 619 Informações adicionais & Especulações Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma? 621 A especificidade regional de indução 621 A determinação das diferenças regionais 621 O modelo do duplo gradiente 623 Correlatos moleculares da caudalização neural 624 Informações adicionais & Especulações Sinais verticais e horizontais do organizador 626 Genes homeobox na especificação neural 628 Competência e cascatas indutivas 628 Estabelecimento dos eixos corporais em mamíferos e aves 635 Iniciando o eixo ântero-posterior 635 Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635 Expressão Gênica em Tecidos Organizadores 636 Especificando o eixo ântero-posterior de mamífero: A hipótese do código Hox 637 Homologia dos Complexos de Genes Homeóticos entre Drosophila e Mamíferos 637 Expressão de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados 638 Análise Experimental de um Código Hox: Gene Alvo 640 Transformação Parcial de Segmentos por Eliminação de Genes Hox Expressos no Tronco 642 Análise Experimental do Código Hox: Teratogênese do Ácido Retinóico 643 Evidência para um Código Hox da Anatomia Comparada 645 Informações adicionais & Especulações Animais como Variações sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental 646 Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamíferos e aves 647 15 16
  • Tabela dos Conteúdos xiii Interações proximais de tecidos: Indução secundária 655 Interações instrutivas e permissivas 655 Competência e receptores 656 Fatores parácrinos 657 Os Fatores de Crescimento Fibroblástico 658 A família hedgehog 659 A família Wnt 660 A superfamília TGF-ß 661 Sinalização Justácrina 662 Interações epitélio-mesênquima 663 Especificidade Regional da Indução 663 Especificidade Genética da Indução 666 Cascatas de indução embrionária: Indução do cristalino 667 Os Fenômenos da Indução do Cristalino 667 A Base Celular da Indução do Cristalino 668 Formação da Córnea 672 Formação de órgãos parenquimatosos 672 Morfogênese do Rim de Mamífero 673 Os Mecanismos da Organogênese Renal 676 Informações adicionais & Especulações Diferenciação Coordenada e Morfogênese no Dente 682 Mecanismos de ramificação na formação de órgãos parenquimatosos 683 A Matriz Extracelular como um Elemento Crítico na Ramificação 684 Fatores Parácrinos Efetuando Padrões de Ramificação 686 Indução ao nível de uma única célula 687 Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis elegans 690 Informações adicionais & Especulações Interações Célula-Célula e Possibilidade na Determinação de Tipos Celulares 692 Desenvolvimento do membro de tetrápode 701 Padronização no membro 701 Formação do broto do membro 702 O campo do membro 702 Especificação dos campos do membro: Genes Hox e ácido retinóico 703 Crescimento do broto de membro precoce: fatores de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro 704 Indução da crista ectodérmica apical 704 Produção do eixo próximo-distal dos membros 706 A crista ectodérmica apical: O componente ectodérmico 706 A zona progressiva: O componente mesodérmico 708 Genes Hox e a especificação do eixo próximo- distal do membro 709 Interações entre a AER e a zona progressiva 711 Mutações nas interações entre a zona progressiva e a AER 711 Informações adicionais & Especulações A regeneração dos membros da salamandra e a retenção do eixo próximo-distal 714 Especificação do eixo ântero-posterior dos membros 716 A zona de atividade polarizante 716 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717 Interações entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padrão 718 Especificando a ZPA 721 A produção do eixo dorsoventral 721 Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722 Informações adicionais & Especulações Lições de limbless 724 Morte celular e a formação de dígitos 724 Informações adicionais & Especulações Evolução do membro tetrápode 726 Interações celulares à distância: Hormônios como mediadores do desenvolvimento 733 Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento 733 Metamorfose anfíbia 734 Controle hormonal da metamorfose de anfíbios 735 Respostas Moleculares aos Hormônios da Tireóide Durante a Metamorfose 740 Informações adicionais & Especulações Heterocronia 743 Metamorfose em insetos 746 Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais 746 Informações adicionais & Especulações A determinação dos discos imaginais da perna e da asa 750 Remodelação do sistema nervoso 753 PARTE V Interações Celulares Durante a Formação do Órgão 17 18 19
  • xiv Tabela dos Conteúdos Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos 754 A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona 757 Informações adicionais & Especulações Controle ambiental sobre a forma e a função da larva 761 Interações hormonais múltiplas no desenvolvimento da glândula mamária 762 Estágio embrionário 762 Adolescência 765 Gravidez e lactação 765 Determinação do sexo 773 Determinação cromossômica do sexo em mamíferos 774 Determinação Sexual Primária 774 Determinação Secundária do Sexo 774 As Gônadas em Desenvolvimento 775 Determinação sexual primária dos mamíferos: Genes cromossômicos Y para a determinação dos testículos 777 SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778 Determinação sexual primária em mamíferos: Genes autossômicos na determinação de testículos 780 SOX9: Reversão Autossômica na Displasia Campomélica 780 SF1: A Ligação Entre SRY e as Trajetórias Desenvolvimentais Masculinas 780 Determinação sexual primária em mamíferos: Desenvolvimento ovariano 781 DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovário no Cromossomo X 781 Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de Ovário em um Autossomo 781 Determinação sexual secundária em mamíferos 782 Regulação Hormonal do Fenótipo Sexual 782 Testosterona e Diidrotestosterona 783 Hormônio Anti-Mülleriano 784 O Sistema Nervoso Central 785 Informações adicionais & Especulações O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais 787 Determinação sexual cromossômica em Drosophila 788 A Via do Desenvolvimento Sexual 788 O Gene Sex-lethal como o Pivô para a Determinação do Sexo 790 Os Genes transformer 793 doublesex: O Gene Comutador da Determinação Sexual 793 Genes-alvo para a Cascata de Determinação Sexual 794 Hermafroditismo 795 Hermafroditismo no Nematóide C. elegans 795 Hermafroditismo em Peixes 797 Determinação ambiental do sexo 798 Determinação Sexual Dependente de Temperatura em Reptéis 798 Determinação Sexual Dependente da Localização em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799 Resumo 800 Regulação ambiental do desenvolvimento animal 805 REGULAÇÃO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL 806 Sugestões ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos 806 A colonização larval 806 Refeições de sangue 808 Simbiose no desenvolvimento 808 Diferenças ambientais previsíveis como sugestões para o desenvolvimento 810 Sazonalidade e sexo: Afídios e Volvox 810 Diapausa 812 Plasticidade fenotípica: Polifenismo e regras de reação 813 Polifenismo sazonal em borboletas 814 Polifenismo nutricional 816 Determinação sexual dependente do ambiente 817 Fatores ambientais imprevisíveis controlando o desenvolvimento animal 818 Defesas induzíveis contra a predação 819 Plasticidade fenotípica e mudanças no ambiente 820 Informações adicionais & Especulações Assimilação Genética 821 A contínua plasticidade do desenvolvimento 822 O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822 Aprendizado: Um sistema nervoso adaptável ao ambiente 823 DISTÚRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL 827 Malformações e distúrbios 827 Agentes teratogênicos 828 Ácido retinóico como um teratogênico 829 Talidomida como um teratogênico 830 Álcool como um teratogênico 833 Outros agentes teratogênicos 835 Informações adicionais & Especulações Estrógenos Ambientais 836 Interações genética-ambiental 837 Resumo 837 20 21
  • Tabela dos Conteúdos xv A saga da linhagem germinativa 843 Migração das células germinativas 843 Migração das Células Germinativas em Anfíbios 843 Migração das Células Germinativas em Mamíferos 844 Informações adicionais & Especulações Teratocarcinomas e Células-Tronco Embrionárias 847 Migração de Células Germinativas em Aves e Répteis 848 Migração de Células Germinativas Primordiais em Drosophila 849 Meiose 850 Informações adicionais & Especulações Grandes Decisões: Mitose ou Meiose? Espermatozóide ou Óvulo? 853 Espermatogênese 855 Espermiogênese 857 Informações adicionais & Especulações Expressão Gênica Durante o Desenvolvimento do Espermatozóide 858 Oogênese 860 Meiose oogênica 860 Maturação do Oócito em Anfibios 861 Conclusão da meiose: Progesterona e Fecundação 864 Transcrição Gênica em Oócitos 865 Oogênese Meroística em Insetos 867 Informações adicionais & Especulações A Origem dos Eixos Embrionários de Drosophila Durante a Oogênese 869 Oogênese em Mamíferos 870 Informações adicionais & Especulações O Reinício da Meiose nos Oócitos de Mamíferos 875 Mecanismos desenvolvimentais da mudança evolucionária 883 “Unidade de Tipo” e “Condições de Existência” 883 A Síntese de Charles Darwin 883 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885 A evolução do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum 885 A emergência dos embriões 885 Formação de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento 887 Modularidade: O pré-requisito para mudança evolutiva através do desenvolvimento 891 Modularidade 891 Dissociação: Heterocronia e Alometria 891 Duplicação e Divergência 893 Co-opção 894 Progressão correlacionada 896 Restrições ao desenvolvimento 898 Restrições Físicas 898 Restrições Morfogenéticas 898 Restrições Filéticas 899 Evolução Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo 901 O mecanismo genético do desenvolvimento da mudança evolucionária: Genes reguladores homólogos 902 Pax6 e o desenvolvimento do olho 902 BMP4 e a Morfogênese dos Membros 904 Genes Hox e a Evolução dos Vertebrados 905 Genes Hox e a Evolução dos Artrópodes 907 Caminhos homólogos do desenvolvimento 909 Criando novos tipos de células: O mistério evolucionário básico 911 Uma nova síntese evolucionária 912 Fontes Para as Citações das Aberturas dos Capítulos C-1 Índice de Autores IA-1 Índice de Assuntos IA-2 Índice de Abreviaturas IA-3 22 23
  • s últimos anos do século 20 encontram a biologia do desenvolvi- mento retornando à posição que ela ocupou no início do século: a disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evolução e fisiologia. Em 1896, a primeira edição de B. Wilson do The Cell in Development and Inheritance anunciou “a verdade maravilhosa que uma única célula pode conter em seu interior sua extensão microscópica da soma-total da herança das espécies.” Hoje, a biologia do desenvolvimento está na vanguarda desse estudo de nossa herança natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a química física na sua investigação dos mecanismos bioquímicos pelos quais proteínas diferentes são produzidas em células diferentes do mesmo geno- ma. Ela também está na liderança dos estudos evolucionários que procuram entender como mudanças macroevolucionárias ocorreram. Ela abriu recen- temente uma área nova da biologia do desenvolvimento ecológico, onde mu- danças ambientais são vistas criando alterações no desenvolvimento do organismo. Durante os últimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento tam- bém expandiu para a medicina, fundindo-se com a genética clínica para criar uma ciência revitalizada da embriologia humana, uma ciência que já se tornou importante na explanação das malformações congênitas. A quinta edição do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita para refletir essas revoluções que estão acontecendo. Aconteceram quatro mudanças importantes na estrutura do livro desde sua última edição. Pri- meiro, tornou-se impossível discutir os princípios fundamentais da em- briologia sem o conhecimento da atividade gênica ou vias da transdução de sinais. Portanto, essa informação foi trazida dentro da seção introdutória do livro de modo que interações celulares, tais como fertilização e indução, podem ser apreciadas tanto no âmbito molecular quanto no morfológico. Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento normal e anormal conduziu a um novo capítulo. O Capítulo 21, “Regulação Ambiental do Desenvolvimento Animal,” diz respeito às vias pelas quais o meio ambiente afeta o fenótipo do organismo. Interesse na proteção ambiental e em controvérsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratogênicos forçaram uma nova percepção das influências que o meio ambiente repre- senta no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se à frente dos movimen- tos da conservação ecológica. As primeiras quatro edições deste livro bus- caram integrar abordagens molecular, celular e orgânica à biologia do de- senvolvimento; esta edição adiciona a dimensão ecológica. Terceiro, esta edição introduz novas ênfases nos papéis dos fatores parácrinos no desenvolvimento. Não somente os estudos da transdução de sinais estão colocados na seção introdutória deste livro, como a Parte V O Prefácio
  • Prefácio xvii da Quinta Edição inicia com uma visão geral das famílias do fator de cres- cimento fibroblástico, TGF-β, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento e diferenciação. Quarto, este livro está conectado a um website onde estudantes e pro- fessores podem encontrar mais material em muitos tópicos selecionados. Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que são extremamente especializados para serem colocados no texto, (2) informação histórica so- bre áreas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades envolvidas, (3) implicações médicas de fenômenos particulares do desen- volvimento, (4) debates ou comentários em questões relevantes para o cam- po, e (5) atualizações do material do texto nessa área da biologia de cresci- mento cada vez mais rápido. Filmes e entrevistas gravadas estão incluídas e esses artigos de destaque poderão ser expandidos à medida que a tecnologia os tornar mais fáceis para serem usados. Esse website está conectado tam- bém a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de alguém sobre o que está acontecendo no desenvolvimento animal. A presen- ça de um website nos permite manter o direcionamento deste livro às pesso- as para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos últimos anos da graduação e do início da pós-graduação. Ele também me ajudou a não deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel. A visão de Roux foi que a biologia do desenvolvimento “algum dia cons- tituiria a base de todas as outras disciplinas biológicas e, em continuada simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas soluções dos problemas da vida.” Essas foram palavras audaciosas, até mes- mo arrogantes há cem anos atrás; hoje, elas expressam uma aceitação ampla- mente sustentada. O desenvolvimento integra todas as áreas da biologia e desempenha um papel crucial em relacionar o genótipo ao fenótipo. O desen- volvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer nível de organização, de moléculas a filos. À medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma palavra de advertência é requerida: a biologia do desenvolvimento não pode ser aprendida ou ensinada em um único semestre. Este texto é uma tentati- va para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um instrutor não necessita se sentir culpado por não determinar todos os capí- tulos, e os estudantes não necessitam se sentir privados se eles não lerem todos os capítulos. Isto é o começo do caminho, não sua conclusão. Como usar o website Qualquer pessoa pode entrar no website através de sua homepage [http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou através da sua lista de ar- quivos de capítulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html]. Alternativamente, nós colocamos acessos específicos endereçados em todo o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publica- ção. Todos esses endereços começam com [http://zygote.swarthmore.edu/] e são seguidos por um código dado no livro texto. Assim, a localização especificada na página 20 do livro é: http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html Mais localizações estão sendo adicionadas no website, e essas podem ser acessadas entrando nos arquivos do capítulo. Em adição, clicando no botão “Outros Arquivos” abaixo de cada capítulo, as conexões para outros websites serão facilitadas. Divirta-se.
  • xviii Prefácio Agradecimentos Esta edição, como suas precursoras, deve muito às sugestões e críticas dos estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e genética do desenvolvimento. O grupo de funcionários e docentes extremamente corporativo da Universidade Swarthmore também desempenharam pa- péis importantes na produção deste livro, e os bibliotecários da área de ciência E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escre- vendo o livro. Os cientistas que revisaram estes capítulos forneceram enor- me ajuda tanto na precisão técnica dos capítulos quanto nas sugestões para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. Cebra- Thomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald, D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D. Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S. Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu também quero agradecer aos muitos cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edição melhor lendo porções específicas dos capítulos. Eles incluem: M. Bronner- Fraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola, I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei alguém fora, por favor me desculpem. É desnecessário dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas que não somente me aconselhou em certos capítulos mas quem deu exce- lente ajuda durante meu período sabático permitindo-me terminar este livro. Agradecimentos também aos cientistas e filósofos, especialmente: C. van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F. Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biolo- gia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a História, Filo- sofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores críticas cons- trutivas deste livro-texto vieram dessas pessoas. Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraor- dinárias pessoas neste projeto, e foi um privilégio trabalhar com eles. Meus agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador de produção Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis são extremamente re- conhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha família por mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro nunca poderia ter sido completado se não fosse pelo encorajamento de mi- nha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prá- tico da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocês. SCOTT F. GILBERT 1 DE MARÇO DE 1997
  • 1 Introdução ao desenvolvimento animal 1 2 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35 3 Base celular da morfogênese:Afinidade celular diferencial 79 I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 1 O 1 A natureza parece nunca mudar, ainda que sua aparência esteja sempre mudando. É nosso dever como artistas transmitir junta- mente com todos os seus elementos a emo- ção dessa permanente transformação. Paul Cezanne (ca. 1900) Feliz é a pessoa que consegue discernir as causas das coisas. Virgílio (37 A.C.) 1 CONCEITO DE EMBRIÃO é assombroso, e a formação de um embrião é a tarefa mais árdua que alguém haverá de realizar. Para se tornar um embrião, você teve que construir a si mesmo a partir de uma única célula. Teve que respirar antes que tivesse pulmões, digerir alimentos antes que seus órgãos estives- sem formados, construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurônios antes mesmo de adquirir a capacidade de pensar. Uma diferença marcante entre você e a máquina é que a máquina nunca é requisitada para uma função antes que esteja terminada. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constrói. O objetivo da biologia do desenvolvimento Para plantas e animais, o único caminho para o desenvolvimento a partir de uma célula, é desenvolvendo um embrião. O embrião é o intermediário entre o genótipo e o fenótipo, ou seja, entre os genes herdados e o organismo adulto. Enquanto a maior parte da biologia estuda a estrutura adulta e função, a biologia do desenvolvimento encontra maior interesse nos estágios mais transitórios. Biologia do desenvolvimento é a ciên- cia do vir a ser, a ciência do processo. Dizer que um inseto efêmero vive apenas um dia não significa nada para um biologista do desenvolvimento, porque o inseto pode ser adulto apenas por um dia, mas passou outros 364 dias como um embrião e larva. As questões levantadas por um biologista do desenvolvimento são freqüente- mente questões mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito. Dizer que mamíferos XX são geralmente fêmeas e mamíferos XY são geralmente machos, não explica a determinação sexual para um biologista do desenvolvimento. Esse quer sa- ber como o genótipo XX produz um ser feminino e como o genótipo XY produz um ser masculino. Da mesma maneira, um geneticista gostaria de saber como os genes globina são transmitidos de uma geração à outra, e um fisiologista pode fazer perguntas sobre a função da globina no corpo. Porém, o biologista do desenvolvimento pergunta porque os genes globina se expressam somente nas hemácias e como essas se tornam ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda não sabemos as respostas). Biologia do desenvolvimento é uma ciência excelente para pessoas que querem integrar diferentes níveis da biologia. Diante de um problema, podemos estudá-lo a Introdução ao desenvolvimento animal
  • 2 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento níveis molecular e químico (p. ex., Como os genes globina são transcritos, e como os fatores que ativam sua transcrição interagem uns com os outros e com o DNA?), a níveis celular e tissular (p. ex., Quais são as células capazes de produzir globina, e como o mRNA da globina deixa o núcleo?), a nível de órgãos ou sistema de órgãos (p. ex., Como vasos capilares são formados em cada tecido, e como são instruídos a se conectarem e ramificarem?)e,atémesmo,aníveisecológicoseevolucionários(p.ex.,Comodiferenças na ativação do gene globina permitem o fluxo de oxigênio da mãe para o feto, e como fatores ambientais acionam a diferenciação de mais hemácias?). Biologistas do desen- volvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de célula. Biologia do desenvolvimento é um dos campos que mais tem crescido e também um dos mais emocionantes da biologia. Parte dessa emoção vem dos assuntos estu- dados, porque estamos apenas começando a entender o mecanismo molecular do desenvolvimento animal. Outra parte da emoção vem do papel unificador que a biolo- gia do desenvolvimento assume nas ciências biológicas. A biologia do desenvolvi- mento está criando uma estrutura que integra a biologia molecular, fisiologia, biologia celular, anatomia, pesquisa do câncer, neurobiologia, imunologia, ecologia, e biologia evolucionária. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão de qualquer área da biologia. Os problemas da biologia do desenvolvimento O desenvolvimento é realizado por duas funções principais: gera diversidade e ordem celular dentro de cada geração, o que assegura a continuidade da vida que passa de uma geração à outra. Assim, existem duas questões fundamentais para a biologia do desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto, e como esse ser adulto produz um outro ser? Cada espécie tem suas próprias respostas, mas algumas generalizações podem ser feitas. Tradicionalmente, essas questões têm sido subdivi- didas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento: • O problema da diferenciação. Uma única célula, o ovo fertilizado, se desen- volve e gera centenas de células de diferentes tipos - células musculares, células epidérmicas, neurônios, linfócitos, células do sangue, células gorduro- sas, e assim por diante. Essa geração de diversidade celular é chamada diferen- ciação. Desde que cada célula do corpo contém o mesmo conjunto de genes, precisamos entender como esse mesmo conjunto de instruções genéticas pode produzir diferentes tipos de células. • O problema da morfogênese. Nossas células diferenciadas não são distribuí- das aleatoriamente; pelo contrário, são organizadas em intrincados tecidos e órgãos. Esses órgãos estão dispostos de tal maneira que: dedos estão nas pontas e não no meio de nossas mãos, os olhos estão na nossa cabeça e não nos pés ou intestinos. Essa criação de forma ordenada, é chamada morfogêne- se. Como as células se auto-organizam e formam um arranjo correto? • O problema do crescimento. Somos maiores do que um ovo, mas como as células sabem quando devem parar de se dividir? Se cada célula de nossa face realizasse mais uma divisão celular, seríamos considerados horrivelmente mal formados. Se cada célula de nossos braços tivesse realizado apenas mais uma série de divisões, poderíamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar. • O problema da reprodução. O espermatozóide e o óvulo são células muito especializadas. Somente eles podem transmitir instruções para produzir um organismo de uma geração para outra. Como essas células são separadas para formar a próxima geração, e quais as informações no núcleo e no citoplasma que permitem tal funcionamento? Recentemente, tem-se dado grande ênfase a um quinto problema: • O problema da evolução. A evolução envolve mudanças herdadas durante o desenvolvimento. Quando dizemos que o cavalo de um dedo só de hoje, teve um ancestral de cinco dedos, estamos dizendo que mudanças no desenvolvi-
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 3 mento da cartilagem e dos músculos ocorreram ao longo de muitas gerações de embriões nos ancestrais do cavalo. Como mudanças no desenvolvimento cri- am novas formas de corpo? Quais modificações hereditárias são possíveis, dadas as restrições impostas pela necessidade do organismo sobreviver en- quanto se desenvolve? Os estágios do desenvolvimento animal De acordo com Aristóteles, o primeiro grande embriologista da história, a ciência começa com a curiosidade: “é graças a curiosidade que as pessoas começaram a filosofar, e a curiosidade permanece desde o início do conhecimento.” O desenvolvi- mento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admiração através da história da humanidade. O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu período de incubação de três semanas proporciona uma notável experiência quando se observa desde uma fina camada de células até o total desenvolvimento da ave. Aristóteles realizou esse procedimento e observou a formação dos principais órgãos. Qualquer um pode se admirar com esse fenômeno, ainda que ordinário, mas cientistas são os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. E ainda mais do que dissipar essa admiração, novo conhecimento só faz aumentá-la. Organismos pluricelulares não se formam de imediato, ao contrário, são formados por um processo relativamente lento de mudança progressiva, o qual chamamos de desenvolvimento. Em quase todos os casos, o desenvolvimento de um organismo pluricelular começa com uma única célula - ovo fertilizado ou zigoto, que dividido através da mitose, produz todas as células do corpo. O estudo do desenvolvimento animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia, se referindo ao fato de que entre a fertilização e o nascimento, o organismo em desenvolvimento é conhecido como embrião. Mas o desenvolvimento não cessa no nascimento, ou mesmo na vida adulta, porque a maioria dos organismos nunca pára de se desenvolver.Acada dia nós repomos mais de um grama de células de pele (fazendo com que as células mais velhas se desprendam assim que nos movemos), e nossa medula óssea sustenta o desenvol- vimento de milhões de novos eritrócitos a cada minuto de nossas vidas. Portanto, nos últimosanostemsidocomumsefalarembiologiadodesenvolvimento,comoadiscipli- na que estuda processos embrionários e outros do desenvolvimento. As principais características do desenvolvimento animal estão ilustrados na Figu- ra 1.1.Avida de um novo indivíduo é iniciada pela fusão do material genético de dois gametas, o espermatozóide e o óvulo. Essa fusão, chamada fertilização, estimula o ovo a iniciar o desenvolvimento. Os estágios subseqüentes do desenvolvimento são coletivamente chamados de embriogênese. Por todo reino animal existe uma incrível variedade de tipos embrionários, mas a maioria dos padrões de embriogênese compre- ende variações em quatro temas: 1. Ocorrência de clivagem imediatamente após a fertilização. Clivagem é uma série de divisões mitóticas extremamente rápidas, onde o enorme volume cito- plasmático do zigoto é dividido em numerosas células menores. Essas células são chamadas blastômeros e, ao fim da clivagem, eles geralmente formam uma esfera conhecida como blástula. 2. Após a redução na taxa de divisão mitótica, os blastômeros passam por mudanças dramáticas quanto às suas posições, um em relação ao outro. Essa série de redistribuição de células é chamada de gastrulação. Como resultado da gastrulação, o embrião típico contém três regiões celulares chamadas camadas germinativas*. O ectoderma, a camada exterior, produz as células da epiderme e do sistema nervoso; o endoderma, camada interior, produz o *Do Latim germen, significa “broto” ou “rebento” (a mesma raiz da palavra germinação). Os nomes das três camadas germinativas são do Grego: ectoderma de ektos (“fora”) mais derma (“pele”); mesoderma de mesos (“meio”) e endoderma de endon (“dentro”).
  • 4 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Mórula Blástula Local das células embrionárias Blastocele Blastóporo Ectoderma Mesoderma Endoderma INCUBAÇÃO (NASCIMENTO) Estágios larvais imaturos Gônada Esperma- tozóide (gameta masculino) Oócito (gameta feminino) GAMETOGÊNESE Adulto sexualmente maduro Esperma- tozóide Oócito Célula germinativa (“Germ plasm”) revestimento do tubo digestivo e órgãos associados (pâncreas, fígado, pul- mões, etc.); e o mesoderma, camada do meio, dá origem a diversos órgãos (coração, rins, gônadas), tecidos conjuntivos (ossos, músculos, tendões, va- sos sangüíneos) e células sangüíneas. 3. Uma vez que as três camadas embrionárias estão estabelecidas, as células interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e órgãos. Esse processo é chamado organogênese. (Nos vertebrados, a organogênese é iniciada quando uma série de interações celulares induzem as células ectodér- micas da porção mediana do dorso a formar o tubo neural. Esse tubo originará o cérebro e a coluna vertebral). Muitos órgãos contêm células de mais de uma camada embrionária, e não é incomum o exterior de um órgão ser derivado de uma determinada camada e o interior de outra. Também durante a organogênese, Figura 1.1Figura 1.1Figura 1.1Figura 1.1Figura 1.1 Histórico do desenvolvimento de um repre- sentante animal, um sapo. Estágios que vão da fertilização até o nascimento são coletiva- mente conhecidos como embriogênese. As regiões responsáveis por produzir células em- brionárias são mostradas em cores. Gameto- gênese, que é completa no adulto sexualmen- te maduro, começa em épocas diferentes, de- pendendo da espécie.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 5 algumas células sofrem longas migrações do seu lugar de origem até sua loca- lização final. Essas células migrantes incluem os precursores das células san- güíneas, células linfáticas, células pigmentadas e gametas. A maior parte dos ossos de nossa face são provenientes de células que migraram ventralmente da região dorsal da nossa cabeça. 4. Como observado na Figura 1.1, em muitas espécies, uma parte especializada do citoplasma do ovo dá origem às células que são precursoras dos gametas. Essas células são chamadas de células germinativas, sendo destinadas à função reprodutiva. Todas as outras células do corpo são chamadas células somáticas. Essa separação entre células somáticas (que dão origem a um corpo individual) e células germinativas (que contribuem para a formação de uma nova geração) é freqüentemente uma das primeiras diferenciações que ocorrem durante o desenvolvimento animal. As células germinativas final- mente migram para as gônadas, onde se diferenciam em gametas. O desen- volvimento de gametas, chamado de gametogênese, normalmente não é com- pletado até que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. Na matu- ridade, os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilização dando início a um novo embrião. O organismo adulto finalmente sofre envelheci- mento e morre. Nossa herança eucariótica Os organismos estão divididos em dois grupos principais, dependendo apenas se as células possuem um envoltório nuclear ou não. Os procariotos (do grego karion, significa “núcleo”), onde estão incluídas as arqueobactérias e as eubactérias, não possuem um núcleo verdadeiro. Os eucariotos que incluem os protistas, animais, plantas e fungos, possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os seus cromossomos. Essa diferença fundamental entre os eucariotos e procariotos influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material genético. Em ambos os grupos, a informação herdada necessária para o seu desenvolvimento e metabolismo se encontra codificada nas sequências de ácido desoxirribonucléico (DNA) dos cromossomos. Os cromossomos procarióticos normalmente são hélices duplas de DNA, pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milhão de pares de bases. As células eucarióticas geralmente possuem diversos cromosso- mos, e um simples protista eucariótico possui 10 vezes, ou mais, a quantidade de DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos. Além disso, a estrutura de um gene eucariótico é mais complexa do que a de um gene procariótico.Aseqüência de aminoácidos de uma proteína procariótica é a reflexão direta da seqüência de DNA do cromossomo. O DNA de um gene eucariótico que codifica uma proteína, geralmente, é dividido de tal forma que a seqüência completa de aminoácidos da proteína é derivada de segmentos descontínuos de DNA (Figura 1.2). O DNA entre os segmentos freqüentemente contém seqüências que estão envolvidas na regulação do momento e lugar em que o gene é ativado. Cromossomos eucarióticos também são muito diferentes dos cromossomos procarióticos. O DNA eucariótico reveste complexos protéicos específicos, chamados nucleossomos, compostos por proteínas histonas. Os nucleossomos organizam o DNA em estruturas compactas e são importantes na designação de qual gene irá se expressar em qual célula. Nas bactérias não existem histonas. Mais ainda, células eucarióticas sofrem mitose, na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos replicados são igualmente divididos entre as células filhas (Figura 1.3). Nos procariotos, a divisão celular não é mitótica; não se desenvolve o fuso mitótico e, também, não existe tegumento celular para se partir.Ao invés disso, os cromossomos filhos perma- necem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. Esses pontos de ligação são separados entre si pelo crescimento da membrana celular, e finalmente colocam os cromossomos em diferentes células filhas.
  • 6 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) CÉLULA PROCARIÓTICA (B) CÉLULA EUCARIÓTICA Envoltório nuclear Gene Íntron Íntron DNA 1 2 Éxon Éxon Éxon 1 2 3 Núcleo Transcrição Transcrição RNA nuclear Processamento de RNA mRNA mRNA Tradução Citoplasma Tradução mRNA Proteína Proteína mRNA Procariotos e eucariotos têm mecanismos diferentes de regulação do gene. Em ambos, o DNA é transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir RNA. Quando o RNA mensageiro (mRNA) é produzido nos procariotos, ele é imedia- tamente traduzido em uma proteína enquanto o seu outro terminal está sendo transcri- to do DNA (Figura 1.4). Sendo assim, nos procariotos, transcrição e tradução são eventos simultâneos e coordenados. Mas a existência de envoltório nuclear em eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulação celular total- mente novo. Os ribossomos, que são responsáveis pela tradução, estão de um lado do envoltório nuclear, e o DNAe a RNApolimerase necessária para a transcrição estão do outro. Entre a transcrição e a tradução, o RNA transcrito deve ser processado para que possa passar através do envoltório nuclear. A regulação pela qual o mRNA pode passar para o citoplasma, torna a célula capaz de selecionar quais das mensagens recém-sintetizadas serão traduzidas.Assim, um novo nível de complexidade foi adici- onado, que é extremamente importante para o organismo em desenvolvimento. Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares Todos os organismos eucarióticos pluricelulares se desenvolveram de protistas uni- celulares. É nesses protistas que as características básicas do desenvolvimento apa- receram primeiro. Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfogênese direcionada pelo núcleo, o uso da superfície da célula para mediar cooperação entre células individuais e as primeiras ocorrências de reprodução sexual. Controle da Morfogênese no Desenvolvimento emControle da Morfogênese no Desenvolvimento emControle da Morfogênese no Desenvolvimento emControle da Morfogênese no Desenvolvimento emControle da Morfogênese no Desenvolvimento em AcetabuláriaAcetabuláriaAcetabuláriaAcetabuláriaAcetabulária Há um século, ainda não havia sido provado se o núcleo continha alguma informação hereditária ou de desenvolvimento.Algumas das melhores evidências para essa teoria vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaços Figura 1.2Figura 1.2Figura 1.2Figura 1.2Figura 1.2 Resumo dos passos pelos quais as proteínas são sintetizadas a partir do DNA. (A) Ex- pressão procariótica (bacteriana) do gene. Regiões codificadoras do DNA são colineares com o produto protéico. (B) Expressão de genes eucarióticos. Os genes são descontínuos e um envoltório nuclear separa o DNA do citoplasma.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 7 Cromatídeos do cromossomo Núcleo Cromatina Nucléolo Região do centrômero Centríolos Fuso em desenvolvimento Envoltório nuclear Áster Envoltório nuclear rompeNucléolo Cromossomos filhos Interfase: DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. Telófase: Os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Anáfase: Os cromossomos duplicados (chamados cromatídeos) são separados. Metáfase: Os cromossomos se alinham no equador da célula. Prometáfase: Os cromossomos se ligam às fibras dos fusos. Prófase: O envoltório nuclear quebra e um fuso se forma entre dois centríolos. nucleados e anucleados (revisão por Wilson, 1986). Quando vários protistas foram fragmentados, quase todas as partes morreram. No entanto, os fragmentos que conti- nham núcleo foram capazes de sobreviver, regenerando todo a complexa estrutura celular (Figura 1.5) O controle nuclear da morfogênese celular e a interação do núcleo e citoplasma estão muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulária. Essa enorme célula individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de três partes: o disco reprodutivo, o pedúnculo e o rizóide (Figura 1.6A). O rizóide está localizado na base da célula onde essa é presa ao substrato. O núcleo individual da célula se localiza dentro do rizóide. O tamanho da Acetabulária e a localização do seu núcleo permitiram que pesquisadores Figura 1.3Figura 1.3Figura 1.3Figura 1.3Figura 1.3 Diagrama de mitose em células animais. Du- rante a interfase o DNA é duplicado em pre- paração para a divisão celular. Durante a prófase, o envoltório nuclear quebra e for- ma-se um fuso entre os dois centríolos. Na metáfase, os cromosssomos se alinham no equador da célula e se inicia a anáfase, os cromossomos duplicados (cada duplicata de cromossomo é um cromatídeo) são separa- dos. Na telófase os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Cada pólo contém o mesmo núme- ro e tipos de cromossomos que continha a célula antes da divisão.
  • 8 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Corte Núcleo Corte Fragmento anucleado morre Fragmento nucleado se regenera Fragmento anucleado morre DNA Ribossomos RNA removessem o núcleo de uma célula e o substituísse por outro, de outra célula. Nos anos 30, J. Hämmerling tirou proveito dessa singular característica e trocou núcleos entre duas espécies morfologicamente distintas, A. mediterranea e A. crenulata. Como é mostrado na fotografia, essas duas espécies têm discos reprodutivos muito diferen- tes. Hämmerling descobriu que quando um núcleo de uma determinada espécie era transplantado para o pedúnculo de outra, o novo disco em formação finalmente assu- mia a forma associada com o núcleo do doador (Figura 1.6B).Assim, foi considerado que o núcleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulária. A formação de um disco reprodutivo é um evento morfogênico complexo, envol- vendo a síntese de um grande número de proteínas, que devem ser acumuladas em certa porção da célula e então organizadas em estruturas complexas específicas da espécie. O núcleo transplantado da célula realmente direciona a síntese de seu disco reprodutivo espécie-específico, mas é uma tarefa que pode levar semanas para ser realizada. Além disso, se o núcleo for removido da célula de Acetabulária em estágio inicial do desenvolvimento, antes de formar o disco reprodutivo, um disco normal se formará semanas depois, ainda que o organismo irá morrer. Esses estudos sugerem que (1) o núcleo contém informação específica sobre o tipo de disco reprodutivo produzido (isto é, contém informação genética que especifica as proteínas necessári- as para a produção de um certo tipo de disco reprodutivo), e (2) o material contendo essa informação entra no citoplasma muito antes dessa produção ocorrer. A informa- ção no citoplasma não será usada por várias semanas. Figura 1.4Figura 1.4Figura 1.4Figura 1.4Figura 1.4 Transcrição e tradução simultânea em procariotos. Uma porção de DNA de Escherichia coli se estende horizontalmente por essa microfotografia eletrônica. Transcrições de RNA mensageiro podem ser vistas dos dois lados. Ribossomos se juntaram ao mRNA e estão sintetizando proteínas (que não podem ser vistas). O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho, da esquerda para a direita, indicando a direção da transcrição. (Cortesia de O. L. Miller, Jr.) Figura 1.5Figura 1.5Figura 1.5Figura 1.5Figura 1.5 Regeneração do fragmento nucleado do protista unicelular Stylonychia. Os fragmentos anucleados sobrevivem por al- gum tempo, mas finalmente morrem.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 9 (A) (B) Pedúnculo Pedúnculo Rizóide Rizóide 1 cm 1 cm A. crenulata A. mediterranea Núcleos transplantados Núcleo Núcleo Rizóide A estrutura do disco reprodutivo é a do núcleo doador Disco reprodutivo Disco reprodutivo Umahipóteseatual,propostaparaexplicaressasobservações,équeonúcleosintetiza um mRNA estável, posicionado em estado dormente no citoplasma até a formação do discoreprodutivo.EssahipóteseéamparadaporumaobservaçãopublicadaporHämmerling em1934.HämmerlingfracionouumaAcetabuláriajovememdiversaspartes(Figura1.7).A porção com o núcleo finalmente formou um novo disco, conforme esperado; da mesma formaofezaextremidadeapicaldopedúnculo.Noentanto,aparteintermediáriadopedún- culonãoformouodiscoreprodutivo.Porisso,Hämmerlingpostulou(aproximadamente30 anos antes de sabermos da existência do mRNA), que as instruções para a formação do disco reprodutivo se originavam no núcleo, sendo de alguma forma guardadas dormen- tes próximo à extremidade do pedúnculo. Muitos anos mais tarde, Kloppstech e Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do núcleo se acumula nessa região. Ribonuclease, uma enzima que cliva RNA, inibe completamente a formação do disco reprodutivo quando adicionada à água marinha na qual cresce aAcetabulária. Em células anucleadas, esse efeito é permanente; uma vez que o RNA é destruído, não pode mais haver a formação do disco reprodutivo. Em células nucleadas, no entanto, um novo disco pode ser formado após a eliminação da ribonuclease, presumivelmente porque um novomRNAéentãoproduzidopelonúcleo.GarciaeDazy(1986)tambémdemonstraram que a síntese da proteína é especialmente ativa no ápice da Acetabulária. Fica claro pela discussão anterior, que a transcrição nuclear tem um papel impor- tante na formação do disco reprodutivo da Acetabulária. Mas deve ser notado que o Figura 1.6Figura 1.6Figura 1.6Figura 1.6Figura 1.6 (A) Acetabulária mediterranea (esquerda) e A. crenulata (direita). Cada unidade é uma célula singu- lar. O rizóide contém o núcleo. (B) Efeitos da troca de núcleos entre duas espécies de Acetabulária. Núcleos foram transplantados para fragmentos de rizóides anucleados. Estruturas de A. crenulata estão sombre- adas; estruturas de A. mediterranea não estão som- breadas. (Fotografias cortesia de H. Harris.)
  • 10 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Extremidade apical do pedúnculo Disco reprodutivo e pedúnculo regenerados Porção central do pedúnculo Sem regeneração Rizóide e núcleo Regeneração total citoplasma também cumpre uma parte essencial na formação desse disco. O mRNA não é traduzido durante semanas, mesmo estando no citoplasma.Algo no citoplasma controla quando as mensagens devem ou não ser utilizadas. Portanto, a expressão do disco reprodutivo é controlada não somente pela transcrição nuclear como também pelo controle de tradução do RNA citoplasmático. Nesse organismo unicelular, o “desenvolvimento” é controlado em ambos estágios de transcrição e de tradução. Diferenciação em AmeboflageladosDiferenciação em AmeboflageladosDiferenciação em AmeboflageladosDiferenciação em AmeboflageladosDiferenciação em Ameboflagelados NaegleriaNaegleriaNaegleriaNaegleriaNaegleria Um dos casos mais marcantes de “diferenciação” em protistas, é aquele de Naegleria gruberi. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode mudar sua forma, de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1.8). Durante a maior parte do seu ciclo de vida, a N. gruberi é uma ameba típica, alimentando-se de bacté- rias do solo e dividindo-se por cisão. No entanto, quando as bactérias são diluídas (tanto pela água da chuva quanto pela água nos experimentos), cada N. gruberi desenvolve rapidamente uma forma aerodinâmica e dois longos flagelos anteriores, que são usados para encontrar regiões mais abundantes em bactérias. Nessas condi- ções, ao invés de existirem diversos tipos de células diferenciadas em um único orga- nismo, essa célula única tem estruturas celular e bioquímica diferentes nos diferentes estágios de sua vida. Diferenciação para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora (Figura 1.9). Durante esse período, a ameba tem que criar centríolos para servir como corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtúbulos), assim como criar o próprio flagelo. Os corpos basais e os flagelos são compostos de diversas proteínas, das quais a mais abundante é a tubulina.As moléculas de tubulina são organizadas em microtúbulos; esses são posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar. Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria não existe Figura 1.7Figura 1.7Figura 1.7Figura 1.7Figura 1.7 Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. mediterranea
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 11 (A) (B) (C) (D) em seu estágio de ameba. É produzida de novo (“desde o começo”), começando com uma nova transcrição no núcleo. Para mostrar isso, os pesquisadores manipularam transcrições em vários estágios com actinomicina D, uma droga antibiótica que seleti- vamente inibe a síntese do RNA. Quando adicionada anteriormente à diluição do alimento, esse antibiótico previne a síntese da tubulina. No entanto, se a actinomicina D é adicionada 20 minutos após a diluição, a tubulina ainda é produzida em tempo normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). Portanto, parece que o mRNA para a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos após a diluição e usado logo em seguida. Essa interpretação foi confirmada quando foi demonstrado que o mRNA extraído da ameba não continha mensagem alguma, detectável para tubulina flagelar, ao passo que mRNAextraído de células diferenciadas continha muitas mensa- gens desse tipo (Walsh, 1984). Então, temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um proces- so de desenvolvimento: O núcleo da Naegleria responde a mudanças ambientais sintetizando o mRNApara tubulina flagelar. Notamos também um outro processo que permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais e plantas, que é o agrupamento de moléculas de tubulina para a produção do flagelo. Esse arranjo, pelo qual a tubulina é polimerizada em microtúbulos, e esses por sua vez agrupados de forma ordenada, é visto em toda a natureza. Em mamíferos, está evidente no flagelo do espermatozóide e nos cílios da medula espinhal e do trato respiratório. Mais ainda, não é somente a tubulina que produz o flagelo. Existem em torno de 300 outras proteínas em cada flagelo, e o movimento flagelar depende da orientação ade- quada dessas proteínas uma em relação a outra. Até mesmo processos celulares têm a sua própria “morfogênese” baseada em interações moleculares entre os fragmentos de proteína. Tal controle pós-tradução, onde uma proteína não é funcional até que esteja ligada a outras moléculas, será discutido melhor mais tarde. Vimos então, que o desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estágios de transcrição, tradução e pós-tradução. Figura 1.8Figura 1.8Figura 1.8Figura 1.8Figura 1.8 Transformação de Naegleria gruberi da forma amebóide ao estado flagelado. Linha superior corada com Iodo/Lugol; linha inferior corada com um anticorpo fluorescente à proteína tu- bulina dos microtúbulos. A transformação é iniciada pela eliminação do alimento (bactéri- as) da colônia de Naegleria. (A) 0 minutos; (B) 25 minutos, mostrando síntese de nova tubulina; (C) 70 minutos, emergência de flagelos visíveis (D) 120 minutos, mostrando flagelos maduros e forma aerodinâmica do cor- po (de Walsh, 1984, cortesia de C. Walsh.)
  • 12 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Porcentagemdapopulaçãocomflagelo Síntese da tubulina flagelar com eça A grupam ento de corpos basais, células se arredondam Flagelos visíveis Form ação de corpo com form a flagelar Flagelos alcançam com prim ento total Tempo após suspensão (minutos) Células de corpo com forma flagelar 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 10080 As Origens da Reprodução SexualAs Origens da Reprodução SexualAs Origens da Reprodução SexualAs Origens da Reprodução SexualAs Origens da Reprodução Sexual A reprodução sexual é outra invenção dos protistas que teve um profundo efeito em organismos mais complexos. Deve-se notar que sexo e reprodução são dois proces- sos separáveis e distintos. A reprodução envolve a criação de novos indivíduos. Sexo envolve a combinação de genes de dois indivíduos distintos em um novo arranjo. Reprodução na ausência de sexo é uma característica de organismos que se reproduzem por cisão; não há discriminação nos genes quando uma ameba se divide ou quando uma hidra brota células para formar uma nova colônia. Sexo sem reprodu- ção também é comum entre os organismos unicelulares.As bactérias são capazes de transmitir genes de um indivíduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura 1.10). Essa transmissão é independente da reprodução. Protistas são também capa- zes de reorganizar genes sem reprodução. Os paramécios, por exemplo, se reprodu- zem por cisão, mas o sexo é realizado através de conjugação. Quando dois paramécios se juntam, eles se unem através de seus aparelhos orais formando uma conexão citoplasmática através da qual podem trocar material genético (Figura 1.11). Cada macronúcleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o micronúcleo passa por meiose para produzir oito micronúcleos haplóides, dos quais todos, exceto um, degeneram. O micronúcleo remanescente divide-se mais uma vez para formar um micronúcleo estacionário e um micronúcleo migratório. Cada micronúcleo migratório atravessa a ponte citoplasmática e se funde com o micronúcleo estacionário (“fertilizante”), criando um novo núcleo diplóide em cada célula. Esse núcleo diplóide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo micronúcleo e um novo macronúcleo quando os dois parceiros se separam. Ainda que não tenha ocorrido reprodução, houve sexo. Figura 1.9Figura 1.9Figura 1.9Figura 1.9Figura 1.9 Diferenciação do fenótipo flagelado em Naegleria. Amebas que vinham crescendo em um meio enriquecido com bactéria são lavadas afim de se eliminar as bactérias no tempo 0. Aos 80 minutos, praticamente toda a população desenvolveu flagelo. (Segundo Fulton, 1977.) Figura 1.10Figura 1.10Figura 1.10Figura 1.10Figura 1.10 Sexo em bactérias.Algumas células de bactéri- as estão cobertas de numerosos apêndices (pilos) sendo capazes de transmitir genes para uma célula recipiente (sem pilos) através de um pilus sexual. Nessa figura, o pilus sexual está realçado por partículas virais que se ligam especificamente àquele estrutura. (Cortesia de C. C. Brinton, Jr. e J. Carnahan.)
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 13 Micronúcleo Fuso meiótico Macronúcleo Ponte citoplasmática Dois paramécios formam ponte citoplasmática Micronúcleos passam por meiose, formando 8 núcleos haplóides por célula; macronúcleos degeneram Todos menos um dos micronúcleos de cada parceiro degeneram Micronúcleo estacionário Micronúcleo migratório Núcleo diplóide se forma e sofre divisões mitóticas para gerar um novo macronúcleo e dois micronúcleos quando os paramécios se separam Micronúcleo restante se divide para formar um micronúcleo estacionário e um migratório Micronúcleos migratórios atravessam a ponte citoplasmática e fertilizam os micronúcleos estacionários do parceiro A união desses dois processos distintos, sexo e reprodução, em reprodução sexual, é visto em eucariotos unicelulares. A Figura 1.12 mostra o ciclo de vida da Chlamydomonas. Esse organismo é geralmente haplóide, portando apenas uma cópia de cada cromossomo (como os gametas dos mamíferos). Os indivíduos de cada espécie, no entanto, estão divididos em dois grupos de parceiros: mais e menos. Quando se encontram, juntam-se os citoplasmas e seus núcleos se fundem para formar um zigoto diplóide. Esse zigoto é a única célula diplóide do ciclo de vida e passará por meiose para formar quatro novas células de Chlamydomonas. Aqui está uma reprodução sexual, pois cromossomos são realinhados durante as divi- sões meióticas onde mais indivíduos são formados. Note que nesse tipo de reprodu- ção sexual protista, os gametas são morfologicamente idênticos e a distinção entre espermatozóide e óvulo ainda não aconteceu. Com a evolução da reprodução sexual, dois importantes avanços foram alcança- dos. O primeiro é o mecanismo da meiose (Figura 1.13), pelo qual o complemento diplóide dos cromossomos é reduzido ao estado haplóide (discutido em detalhe no Capítulo 22). O outro avanço é o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos diferentes se reconhecem um ao outro. Em Chlamydomonas, o reconhecimento ocorre primeiro nas membranas flagelares (Figura 1.14; Bergman et al., 1975; Goodenough e Weiss, 1975).Aaglutinação dos flagelos permite que regiões específicas das membra- nas celulares se juntem. Esses setores especializados contêm componentes reprodutivos específicos que permitem a fusão dos citoplasmas. Seguindo-se à aglutinação, os indivíduos mais iniciam a fusão estendendo um tubo de fertilização. Figura 1.11Figura 1.11Figura 1.11Figura 1.11Figura 1.11 União de paramécios através da ponte citoplasmática, onde dois paramécios podem trocar material genético, deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o processo. (Strickberger, 1985.)
  • 14 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Reprodução assexual (mitótica) Parceiro tipo mais (haplóide) Parceiro tipo menos (haplóide) Reprodução sexual Acasalamento Fusão citoplasmática Zigoto (diplóide) Maturação (meiose) Germinação Dois parceiros tipo mais e tipo menos Figura 1.12Figura 1.12Figura 1.12Figura 1.12Figura 1.12 Reprodução sexual em Chlamydomonas. Duas linhagens, ambas haplóides, podem se repro- duzir assexuadamente quando separadas. Res- peitando certas condições, os dois cordões podem se unir para produzir uma célula diplóide que pode sofrer meiose para formar quatro novos organismos haplóides. (Segundo Strickberger, 1985.) Figura 1.13Figura 1.13Figura 1.13Figura 1.13Figura 1.13 Sumário da meiose. O DNA e as proteínas associadas replicam durante a interfase. Durante a prófase, o envoltório nuclear se rompe e os cromossomos homólogos (cada cromossomo é duplicado, com os cromatídeos juntos no centrômero) se alinham em pares. Reagrupamentos cromossômicos podem ocorrer entre quatro cromatídeos homólogos nesse estágio. Após a primeira metáfase, os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células dife- rentes. Durante a segunda divisão, o centrômero se divide, deixando cada nova célula com uma cópia de cada cromossomo. Envoltório nuclear Cromatina Cromossomos homólogos Cromatídeos homólogos Núcleo Interfase Prófase I precoce Meia prófase I Prófase I tardia Metáfase I MEIOSE I O envoltório nuclear se rompe e cromossomos homólogos (cada cromossomo sendo duplo, com os cromatídeos ligados no centrômero) se alinham aos pares. Rearranjos cromossômicos podem ocorrer entre os quatro cromatídeos homólo- gos neste momento.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 15 Microfilamentos (B)(A) Esse tubo conecta e se funde com um local específico no indivíduo menos. É interes- sante que o mecanismo usado para estender esse tubo - polimerização da proteína actina - também é usado para estender processos do espermatozóide e óvulo do ouriço-do-mar. No Capítulo 4, veremos que o reconhecimento e fusão de espermato- zóide e óvulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas. Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos básicos do processo de desen- volvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a síntese celular é con- trolada pela regulação transcricional, por tradução e pós-tradução; existe um mecanis- mo para processar o RNA através da membrana nuclear; as estruturas de genes indi- viduais e cromossomos são como serão através da evolução eucariótica; mitose e meiose são aperfeiçoadas; e a reprodução sexual existe, envolvendo a cooperação entre células individuais.Tal cooperação intercelular se torna ainda mais importante com a evolução de organismos multicelulares. Figura 1.14Figura 1.14Figura 1.14Figura 1.14Figura 1.14 Duas etapas do reconhecimento no acasala- mento de Chlamydomonas. (A) Varredura por micrografia eletrônica (7000x) de par em aca- salamento. Os flagelos que interagem, torcem- se um em torno do outro, aderindo nas pontas (flexas). (B) Microfotografia eletrônica de transmissão (20.000x) de uma ponte citoplas- mática conectando os dois organismos. Os microfilamentos se estendem da célula doado- ra (abaixo) para a célula recipiente (acima). (de Goodenough e Weiss, 1975 e Bergman et al., 1975; com permissão de U. Goodenough.) Anáfase I Telófase I Metáfase II Anáfase II Telófase II Os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes O centrômero se divide Cada nova célula tem uma cópia de cada cromossomo MEIOSE II
  • 16 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (C)(B) (D) (E) (F) Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação Um dos mais importantes experimentos da evolução foi a criação de organismos pluricelulares. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma única célula evo- luiu para uma disposição pluricelular; discutiremos apenas dois deles (veja o Capítulo 23 para uma discussão mais completa). O primeiro caminho envolve a divisão ordena- da da célula reprodutiva e a subseqüente diferenciação da sua progênie em diferentes tipos de células. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notável série de organismos pluricelulares, coletivamente referidos como a família das Volvocaceas ou volvocaceanas. AsVolvocaceanas Os organismos mais simples entre as volvocaceanas são reuniões ordenadas de nu- merosas células, cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Um único organismo de volvocacea do gênero Gonium (Figura 1.15), por exemplo, consiste de uma placa plana contendo de 4 a 16 células, cada uma com seu próprio flagelo. Em um gênero relacionado, Pandorina, 16 células formam uma esfera; e no Eudorina, a esfe- ra contém 32 ou 64 células organizadas em um padrão regular. Nesses organismos, um princípio muito importante tem-se desenvolvido: a divisão ordenada de uma célula para gerar um número de células que são organizadas de uma maneira previsível. Como ocorre na maioria dos embriões animais, as divisões celulares pelo qual uma única célula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 células ocorrem em uma seqüência muito rápida e com ausência de crescimento celular. Os dois próximos gêneros da série volvocacea exibem um outro princípio impor- tante do desenvolvimento: a diferenciação de tipos celulares em organismo indivi- dual. As células reprodutivas se diferenciam das células somáticas. Em todos os gêneros já mencionados, toda a célula pode, e normalmente o faz, produzir um organis- mo novo completo por mitose (Figura 1.16 A,B). Nos gêneros Pleodorina e Volvox, porém, relativamente poucas células podem se reproduzir. Na Pleodorina californica, as células da região anterior são restritas à uma função somática; somente aquelas Figura 1.15Figura 1.15Figura 1.15Figura 1.15Figura 1.15 Representante da ordem dos Volvocales. (A) o protista unicelular Chlamydomonas rei- nhardtii. (B) Gonium pectorale com oito cé- lulas Chlamydomonas-símiles em um disco convexo. (C) Pandorina morum. (D) Eudo- rina elegans. (E) Pleodorina californica.Aqui todas as 64 células são originalmente simila- res, mas as posteriores desdiferenciam e redi- ferenciam como células assexuadas reprodu- tivas chamadas gonídios, enquanto as células anteriores permanecem pequenas e biflagela- das, como o Chlamydomonas. (F) Volvox carteri. Aqui, células destinadas a se torna- rem gonídios são separadas no começo do desenvolvimento e nunca desenvolvem carac- terísticas somáticas. As células menores, somáticas, lembram Chlamydomonas. Todas, menos o Chlamydomonas, são membros da família das Volvocaceas.Acomplexidade au- menta do Chlamydomonas unicelular ao Volvox pluricelular. Barra emA é de 5µm; B- D, 25µm; E, F, 50µm (Cortesia de D. Kirk.)
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 17 (A) (C)(B) células do lado posterior podem se reproduzir. Em P. californica, a colônia normalmen- te tem 128 ou 64 células, e a relação do número de células somáticas para o número de células reprodutivas é normalmente 3:5. Dessa maneira, uma típica colônia de 128 células tem 48 células somáticas e uma colônia de 64 células tem 24 células somáticas. Nos Volvox, quase todas células são somáticas, e muito poucas células são capa- zes de produzir novos indivíduos. Em algumas espécies de Volvox, células reproduti- vas como as da Pleodorina, são derivadas de células que originalmente parecem e funcionam como células somáticas antes de crescer e se dividir para formarem uma nova progênie. No entanto, em outros membros do gênero, como o V. carteri, existe uma divisão do trabalho completa: as células reprodutivas que vão criar a nova gera- ção são colocadas de lado durante a divisão das células reprodutivas que estão formando um novo indivíduo.As células reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funções somáticas do indiví- duo; são inteiramente especializadas para reprodução. Ainda que as volvocaceas mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada célula é capaz de existência independente e perpetuação da espécie), no V. carteri temos um organismo verdadeiramente celular com dois tipos de células independentes e distintos (somático e reprodutivo), ambos requeridos para a perpetuação da espécie (Figura 1.16C). Embo- ra nem todos os animais separem suas células reprodutivas das células somáticas (e as plantas raramente o fazem), essa separação de células germinativas das células somáticas no início do desenvolvimento é característica de muitos filos animais e será discutida em maior detalhe no Capítulo 13. Embora todas as volvocaceas, incluindo seu parente unicelular Chlamydomo- nas, se reproduzam predominantemente por meios assexuados, também são capazes de reprodução sexual. Isso envolve a produção e fusão de gametas haplóides. Em muitas espécies de Chlamydomonas, incluindo a ilustrada na Figura 1.12, a reprodu- ção sexual é isogâmica, já que os gametas haplóides que se encontram são similares em tamanho, estrutura e motilidade. No entanto, em outras espécies de Chlamydo- monas - assim como as várias espécies de volvocaceas coloniais - gametas nadado- res de diversos tamanhos são produzidos por parceiros de acasalamentos diferen- tes. Isso é chamado heterogamia. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma forma especializada de heterogamia, chamada oogamia, que envolve a produção de óvulos grandes e relativamente imóveis por um parceiro do acasalamento e esper- matozóides pequenos e móveis pelo outro parceiro (veja Visões Colaterais & Espe- culações).Aqui vemos um gameta especializado para retenção de recursos nutricionais e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de núcleos. Assim, as volvocaceas incluem os organismos mais simples que têm macho e fêmea distinguíveis, e possuem caminhos diferentes para desenvolver o óvulo ou o es- permatozóide. Em todas as volvocaceas, a reação da fertilização se assemelha à do Chlamydomonas porque resulta na produção de um zigoto diplóide dormente, ina- tivo, capaz de sobreviver a condições ambientais severas. Quando as condições permitem aos zigotos germinar, eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros haplóides dos dois parceiros em números iguais. [other.html#intro1] Figura 1.16Figura 1.16Figura 1.16Figura 1.16Figura 1.16 Reprodução assexuada nas volvocaceanas. (A) Colônia madura de Eudorina elegans. (B) Cada uma das células de E. elegans se divide e pro- duz uma nova colônia. (C) Volvox carteri ma- duro.Amaioria das células são incapazes de se reproduzir. Células germinativas (gonídia) co- meçaram a se dividir em novos organismos. (A e B segundo Hartmann,1921; C de Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.)
  • 18 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Maturação dos gonídios Adulto com gonídios maduros Embriogênese Adulto com juvenis Expansão de adultos e juvenis Expansão continuada da matriz extracelular Morte de células somáticas - progenitores Expansão continuada de juvenis Liberação de juvenis Sexo e Individulidade em Volvox Simples como é, o Volvox comparti- lha muitos traços que caracterizam o ciclo de vida e histórico de desen- volvimento de organismos muito mais com- plexos, incluindo nós mesmos. Como já foi mencionado, o Volvox está entre os orga- nismos mais simples a exibir a divisão de trabalho entre dois tipos de células dife- rentes. Como conseqüência disso, está en- tre os organismos mais simples a incluir a morte como uma parte regular, geneticamen- te programada, da sua história de vida. Morte e DiferenciaçãoMorte e DiferenciaçãoMorte e DiferenciaçãoMorte e DiferenciaçãoMorte e Diferenciação Organismos unicelulares que se reprodu- zem através de uma simples divisão celu- lar, tais como as amebas, são potencial- mente imortais. A ameba que vemos sob um microscópio não tem ancestrais mor- tos! Quando uma ameba se divide, nenhu- ma das duas células resultantes pode ser considerada ancestral ou progênie; elas são parentes. A morte chega para uma ameba apenas se ela é ingerida ou sofre um acidente fatal; quando isso acontece, a célula morta não deixa prole. Porém, a morte se torna uma parte es- sencial da vida para qualquer organismo pluricelular que estabelece divisão de tra- balho entre células somáticas e células germinativas (reprodutivas). Considere o histórico de vida do Volvox carteri quan- do se reproduz assexuadamente (Figura 1.17). Cada adulto assexuado é um esferóide contendo aproximadamente 2000 pequenas células somáticas biflage- ladas ao longo de sua periferia e por volta de 16 grandes células reprodutivas assexuadas, chamadas gonídios, dispos- tas em umas das extremidades do interior. Quando maduro, cada gonídio divide-se rapidamente 11 ou 12 vezes. Parte dessa divisão é assimétrica e produz as 16 célu- las grandes que irão se tornar um novo conjunto de gonídios. No fim da clivagem, todas as células que estarão presentes no adulto, foram produzidas de cada um dos gonídios. Mas o embrião está “virado de dentro para fora”: seus gonídios estão do lado de fora e os flagelos de suas células somáticas estão apontando para o interi- or da esfera oca de células. Essa condição adversa é corrigida por um processo cha- mado inversão, pelo qual o embrião se vira com o lado certo para fora através de movimentos celulares que fazem lembrar movimentos de gastrulação no embrião animal (Figura 1.18). Um agrupamento de Figura 1.17Figura 1.17Figura 1.17Figura 1.17Figura 1.17 Reprodução assexual em V. carteri. Quando as células reprodutivas (gonídios) estão maduras, entram em um estado semelhante à clivagem do desenvolvimento embrionário para produzir se- res juvenis dentro do adulto. Através de uma série de movimentos celulares semelhantes à gastrulação, o volvox embrionário se inverte e é finalmente liberado do progenitor. As células somáticas do progenitor, sem gonídios, passam por senescência e morrem, enquanto a colônia juvenilamadurece.Ociclosexualtotalduradois dias. (Segundo Kirk, 1988.) Informações adicionais Especulações &
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 19 (A) (J) (I) (H) (G) (F) (E) (D) (C) (B) O que acontece às células somáticas do “progenitor” Volvox agora que as jo- vens “deixaram o lar”? Tendo produzido uma cria e sendo incapazes de uma nova reprodução, essas células somáticas mor- rem. Para ser mais exato, elas cometem suicídio, sintetizando um conjunto de pro- teínas que causam a morte e a dissolução das células que as produzem (Pommerville e Kochert, 1982).Além do mais, nessa mor- te, as células liberam para o uso de ou- tras, incluindo sua própria cria, todo o nu- triente acumulado durante toda a vida. “Dessa maneira emerge”, como assinala David Kirk, “um dos grandes temas da vida no planeta Terra: Alguns morrem para que outros possam viver”. Em V. carteri, foi identificado um gene* específico que tem um papel importante re- gulando a morte das células (Kirk, 1988). Em linhagens laboratoriais possuindo mu- tações desse gene, as células somáticas abandonam suas tendências suicidas, ganham a habilidade de se reproduzirem células em forma de garrafa abre um bura- co em um dos lados do embrião produzin- do tensão sobre a camada de células in- terconectadas (Figura 1.19). O embrião se utiliza desse buraco para fazer a inversão e depois o fecha. Posteriormente, as colô- nias juvenis são enzimaticamente soltas do progenitor e nadam livres. Figura 1.18Figura 1.18Figura 1.18Figura 1.18Figura 1.18 Inversão dos embriões V. carteri produzidos assexuadamente.A-E são micrografias eletrô- nicas de varredura de embriões completos. F- J são cortes sagitais através do centro do em- brião, visualizado por microscopia diferencial de interferência.Antes da inversão, o embrião é uma esfera côncava de células conectadas. Quando as células mudam a sua forma, um buraco (o fialoporo) abre-se no topo do em- brião (A,B,F,G). As células se curvam e se reúnem em um dos pólos (C-E, H-J). (Kirk et al., 1982, cortesia de D. Kirk.) * Esse gene (regA) foi clonado e mostrou codificar uma proteína que age para reprimir (direta ou indiretamente) todos os genes cujos produtos são requeridos pela célula para se de- senvolver como gonídio. Mutações de perda da função impedirão a proteína de agir, e as células serão capazes de se tornarem gonídios (D. Kirk, comunicação pessoal). Figura 1.19Figura 1.19Figura 1.19Figura 1.19Figura 1.19 “Células garrafas” próxi- mas à abertura do fialoporo. Essas células permanecem estreitamente conectadas atra- vés de pontes citoplasmáticas próximas a seus ápices alongados, desse modo criando a tensão que causa a curvatura da lâmina ce- lular interconectada. ( Kirk et al., 1982, cor- tesia de D. Kirk.)
  • 20 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Meiose e germinação Pacotes de esperma- tozóideDesenvolvimento sexual de gonídios Indutor sexual Espermatozóide Macho assexuado Macho sexuadoDesenvolvimento embrionário modificado dos gonídios resultando em produção de gametas Gonídio Óvulo Fêmea assexuada Indutor sexual Fêmea sexuada Óvulos Zigotos (A) (B) assexuadamente e se tornam potencialmen- te imortais (Figura 1.20). O fato desses mu- tantes nunca terem sido encontrados na natureza, indica que a morte das células tem um papel importante na sobrevivência do V. carteri sob condições naturais. [intro2.html] Entra o sexoEntra o sexoEntra o sexoEntra o sexoEntra o sexo Mesmo o V. carteri se reproduzindo as- sexuadamente a maior parte do tempo, na natureza se reproduzem sexualmente uma vez por ano. Quando o faz, uma geração de indivíduos morre, e uma nova geração geneticamente diferente é produzida. O naturalista Joseph Wood Krutch (1956) colocou isso de uma forma mais poética: A ameba e o paramécio são potencial- mente imortais...Mas para o Volvox a morte parece inevitável, assim como o é para um camundongo ou o homem. Volvox deve morrer, como Leeuwenko- ek observou, porque teve filhos e não é mais necessário. Quando sua hora chegar, tomba em silêncio, vai para o fundo juntar-se a seus ancestrais. Como Hegner, o zoologista de Johns Hopkins, escreveu, “Esse é o primeiro advento da inevitável morte natural no reino animal, e tudo em nome do sexo. ”E pergunta: “Vale a pena?” Para Volvox carteri, certamente que sim. V. carteri vive em pequenas poças rasas que temporariamente se enchem com as águas das chuvas da primavera e secam no calor do verão. Durante a maior parte desse tempo, V. carteri nada livremente, reprodu- zindo-se assexuadamente. Esses volvox morreriam em minutos se a poça secasse, mas o V. carteri é capaz de sobreviver se tornando sexual pouco antes da secagem das poças, produzindo zigotos inativos que sobrevivem ao calor e à seca do alto verão e ao frio do inverno. Quando a chuva enche esses pequenos reservatórios na primave- ra, os zigotos interrompem a sua dormência e criam uma nova geração para reproduzi- rem-se assexuadamente até que as águas ameacem secar novamente. Como esses or- ganismos tão simples prevêem a chegada de condições adversas com acuidade sufi- ciente para produzir uma geração sexual no tempo certo, ano após ano? O estímulo para mudança do modo assexual para o modo sexual de reprodu- ção em V. carteri é devido a uma proteína Figura 1.20Figura 1.20Figura 1.20Figura 1.20Figura 1.20 Mutação de um único gene (chamado regene- rador somático A) elimina a programação de morte em células V. carteri. Volvox recém- eclodido carregando essa mutação (A) é indistinguível do esferóide tipo-selvagem. No entanto, momentos antes das células somáti- cas do esferóide tipo-selvagem começarem a morrer, as células somáticas desse mutante se rediferenciam como gonídios (B). Finalmente, cada célula do mutante irá se dividir para for- mar ( regenerar) um novo esferóide que irá re- petir esse ciclo do desenvolvimento potenci- almente imortal. Figura 1.21Figura 1.21Figura 1.21Figura 1.21Figura 1.21 Reprodução sexual em V. carteri. Machos e fêmeas são indistiguíveis na sua fase assexuada. Quando a proteína indutora sexual está presente, os gonídios de ambos parceiros passam por uma embriogênese modificada que leva à formação de óvulos nas fêmeas e espermatozóides nos machos. Quando os gametas estão maduros, pacotes de espermatozóide (contendo 64 ou 128 espermatozóides cada), são liberados e nadam para as fêmeas. Ao alcançar a fêmea o pacote se rompe em espermatozóides individuais, que podem fertilizar os óvulos. O zigoto resultante tem paredes duras que podem resistir à seca, calor e frio. Quando as chuvas da primavera fazem o zigoto germinar, sofrendo meiose para produzir machos e fêmeas haplóides que se reproduzem assexuadamente até o calor induzir novamente o ciclo sexual.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 21 sexual indutiva de 30-kDa. Essa proteína é tão poderosa que concentrações meno- res que 6x10-17 fazem com que os gonídios sofram um padrão modificado de desen- volvimento embrionário que resulta na produção de óvulos ou espermatozóides, dependendo do sexo genético do indiví- duo (Sumper et al.,1993). Os espermato- zóides são liberados para nadar para a fê- mea onde fertilizam os óvulos para pro- duzir zigotos dormentes (Figura 1.21). Qual é a fonte dessa proteína indutora sexual? Kirk e Kirk (1986), descobriram que o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen- tando placas com V. carteri à temperaturas que poderiam ser encontradas em um reser- vatório raso durante o fim do verão. Quan- do isso era feito, as células somáticas dos volvox assexuados produziam a proteína sexual indutora. Sendo a quantidade da pro- teína secretada por um indivíduo suficiente para iniciar o desenvolvimento sexual em mais de 500 milhões de volvox assexuados, um único volvox indutor pode converter um reservatório inteiro para a sexualidade. Essa descoberta explica uma observação feita há quase 90 anos, de que “na intensa radiação solar do verão de Nebraska, Volvox é capaz de aparecer, multiplicar-se, realizando uma orgia sexual reprodutiva em poças de água da chuva de apenas duas semanas” (Powers,1908).Aindaquereservatóriostem- porários formados pela água das chuvas se- quem sob o calor do verão, Volvox encon- trou um meio de sobrevivência: usa o calor para induzir a formação de indivíduos sexu- ados cujo acasalamento produz zigotos ca- pazes de sobreviver sob condições que ma- tam o organismo adulto. Observamos, tam- bém, que o desenvolvimento está critica- mente ligado ao ecossistema ao qual o or- ganismo se adaptou para sobreviver. Diferenciação e Morfogênese em DictyosteliumDiferenciação e Morfogênese em DictyosteliumDiferenciação e Morfogênese em DictyosteliumDiferenciação e Morfogênese em DictyosteliumDiferenciação e Morfogênese em Dictyostelium OCICLODEVIDADO DICTYOSTELIUM.Umoutrotipodeorganizaçãomulticelular derivada de organismos unicelulares é encontrada no Dictyostelium discoideum.* O ciclo de vida desse organismo fascinante é ilustrado na Figura 1.22. Em seu ciclo vegetativo, uma solitária ameba haplóide (chamada myxamoebae ou “ameba social” para distingui-las de espécies de amebas que sempre permanecem solitárias) vive em troncos caídos, se alimentando de bactérias e se reproduz por cisão binária. Quando tiver esgotado seu suprimento de comida, dezenas de milhares dessas amebas se juntam para formar um fluxo corrente de células que convergem em um ponto central.Aqui se amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou justo. Subseqüentemente, uma ponta surge no topo desse monte, que se dobra forman- do uma lesma migratória (com a ponta na frente). A lesma (geralmente lhe é dado um título mais dignificado de pseudoplasmódio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de comprimento e é envolvida por uma bainha viscosa. O grex começa a migrar (se o ambiente está escuro e úmido) com sua ponta anterior um pouco levantada; quando atinge uma área iluminada, a migração cessa, e o grex se diferencia em um corpo de frutificação composto de células esporos e pedúnculo.As células anteriores, represen- tando 15 a 20 porcento de toda população celular, formam o pedúnculo tubular. O pedúnculo começa na parte centro-anterior da célula, enquanto as células pré- pedunculares começam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo através do grex. À medida que as células pré-pedunculares se diferenciam, formam vacúolos e aumentam de tamanho levando a massa de células pré-pedúnculo que havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams, 1991). As células do pedúnculo morrem, mas as células posteriores, elevadas acima do pedún- culo, transformam-se em células-esporo. Essas se dispersam, cada uma tornando-se uma nova mixameba. Em adição a esse ciclo sexual, existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium. Duas amebas podem fundir-se para criar uma célula gigante, que digere todas as outra células do agregado. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos, se enquista em uma parede grossa e sofre divisões meiótica e mitótica; e por fim, novas mixamebas são liberadas. Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologis- tas do desenvolvimento, porque células inicialmente iguais são diferenciadas em dois tipos alternativos de células, esporo e pedúnculo. É também um organismo onde células individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por tipos de células diferenciadas, parecido com a formação de tecidos em organismos * Embora chamado coloquialmente um “fungo celular pegajoso”, Dictyostelium não é um fungo (como Neurospora), nem é consistentemente pegajoso. É melhor considerá-lo como uma ameba social.
  • 22 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento mais complexos. A agregação de milhares de amebas em um único organismo é um feito incrível de organização e convida à experimentação para resolver perguntas sobre os mecanismos envolvidos. AGREGAÇÃO DE CÉLULAS DE DICTYOSTELIUM. Aprimeira pergunta é: O que induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaçamento temporal mostrou que não ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas após carência nutricional. Durante as 5 horas seguintes, porém, as células são vistas mover-se por aproximadamente 20µm / min durante 100 segundos. Esse movimento cessa após aproximadamente 4 minutos, e em seguida recomeça. Embora o movimento seja direcionado para um ponto central, não é um simples movimento radial. Antes, as células se juntam umas às outras para formar correntes; essas convergem em corren- tes maiores, e finalmente todas se juntam no centro. Bonner (1947) e Shaffer (1953) mostraram que esse movimento é devido à quimiotaxia: as células são guiadas para os centros de agregação por uma substância solúvel. Essa substância foi posteriormente identificada como adenosina 3’,5’ monofosfato cíclico (cAMP) (Konijn et al., 1967; Bonner et al., 1969), cuja estrutura química está mostrada na Figura 1.23A. Aagregação é iniciada à medida que cada célula começa a sintetizar o cAMP. Não há células “dominantes” que começam a secreção ou controlam as outras. Antes, os locais de agregação são determinados pela distribuição das amebas (Keller e Segal, 1970; Tyson e Murray, 1989). Células vizinhas respondem ao cAMPde duas maneiras: ou iniciando sua movimentação de acordo com as pulsações de cAMP, ou acompa- nhando a liberação de seu cAMP próprio (Robertson et al., 1972; Shaffer, 1975). Em seguida, a células não respondem mais aos pulsos de cAMP por vários minutos. O Figura 1.22Figura 1.22Figura 1.22Figura 1.22Figura 1.22 Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. Esporos haplóides originam mixamebas, que podem reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplóides. A medida que diminui o suprimento alimentar, ocorre agregação em pontos centrais, e forma-se um agregado de pseudoplasmódio. Finalmente, esse pára de se movimentar e forma um corpo de frutificação que libera mais esporos. Os números referem-se às horas decorridas desde que a diluição nutricional iniciou a seqüência desenvolvimental. Fluxos celulares maduro Lesma (Pseudoplasmódio; grex) 14 h 15 h 16 h 17 h 20 h MIGRAÇÃO CULMINAÇÃO 12 h 10 h 23 h Esporos 9 h AGREGAÇÃO Mixamebas Corpo de frutificação 6 h 24h
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 23 (A) (B) (C) (D) Adenina resultado é uma onda giratória em espiral de cAMP, que se propaga através da população de células (Figura 1.23B-D). À medida que chega cada onda, as células dão mais um passo para o centro.* A diferenciação de amebas individuais em células pedunculares (somáticas) ou esporos (reprodutivas) é uma questão complexa. Raper (1940) e Bonner (1957) de- monstraram que as células anteriores normalmente formam pedúnculo, enquanto as células remanescentes, posteriores, em geral estão destinadas a formar esporos. No entanto, a remoção cirúrgica da parte anterior da lesma não elimina a capacidade do grex formar um pedúnculo. Em vez disso, as células que agora se encontram no final anterior após a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos), agora formam o pedúnculo (Raper, 1940). De alguma maneira, é tomada uma decisão de modo tal, que células anteriores virem células pedunculares e células posteriores virem esporos. Essa habilidade de células mudarem seus destinos desenvolvimentais, * A bioquímica dessa reação envolve um receptor que liga o cAMP. Quando essa ligação ocorre, realiza-se transcrição específica de genes, é iniciada movimentação em direção à fonte de cAMP, e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) são ativadas. O cAMP recém-formado ativa seus receptores próprios, assim como aqueles de seus vizinhos.As células na área permanecem insensíveis às novas ondas de cAMP até que o cAMP ligado seja removido dos receptores por outra enzima da superfície celular, a fosfodiesterase (Johnson et al., 1989). A matemática de tais reações de oscilação prevê que a difusão de cAMP seria inicialmente circular. Porém, à medida que o cAMPinterage com as células que recebem e propagam o sinal, as células que recebem a parte frontal da onda começam a migrar com uma velocidade diferente daquela das células atrás delas. O resultado é a espiral rotatória de cAMP e a migração vistas na Figura 1.23. É interessante que as mesmas fórmulas matemáticas predizem o comportamento de certas reações químicas e a formação de novas estrelas em galáxias espirais rotatórias (Tyson e Murray, 1989). Figura 1.23Figura 1.23Figura 1.23Figura 1.23Figura 1.23 Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium de- vida à ondas espirais de cAMP. (A) estrutura química do cAMP. (B) Visualização de várias “ondas” de cAMP no meio. Células centrais secretam cAMP em intervalos regulares, e cada secreção difunde para fora como um onda concêntrica.As ondas são mapeadas saturan- do-se papel de filtro com cAMP radioativo e colocando-o sobre uma colônia em agregação. O cAMP das células secretoras dilui o cAMP radiativo. Quando a radioatividade no papel é registada (colocando-o sobre filme de raios- X), as regiões de alta concentração de cAMP na cultura aparecem mais claras que aquelas de baixa concentração de cAMP. (C,D) On- das espirais de amebas movendo-se em dire- ção à fonte inicial de cAMP. (C) Essa microfotografia em campo escuro processa- da digitalmente mostra cerca de 107 células. Como células móveis e imóveis dispersam a luz diferentemente, a fotografia reflete movi- mento celular. As bandas claras são compos- tas de células migratórias alongadas; as ban- das escuras são células que pararam de se mover e se arredondaram. (D) As células for- mam correntes, a espiral de movimento ainda pode ser vista movendo-se em direção ao cen- tro. (B de Tomchick e Devreotes, 1981, cor- tesia de P. Devreotes; C e D de Siegert eWeijer, 1989, cortesia de F. Siegert.)
  • 24 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento de acordo com sua localização dentro do organismo inteiro, e assim compensar por partes faltantes, é chamada regulação. Veremos esse fenômeno em muitos embriões, inclusive naqueles dos mamiferos. MOLÉCULAS DEADESÃO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. Como essas células individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este é o mesmo proble- ma que enfrentam as células embrionárias, e a solução que evoluiu para os protistas é a mesma que aquela usada pelos embriões: moléculas de adesão celular reguladas pelo desenvolvimento. Enquanto estão crescendo mitoticamente em bactérias, células de Dictyostelium não aderem umas às outras. Porém, uma vez que a divisão celular cessa, as células se tornam progressivamente mais adesivas, alcançando um patamar de coesividade má- xima aproximadamente após 8 horas de inanição.Aadesão célula-célula é mediada por uma glicoproteína de 24.0000 Da (24-kDa) que está ausente em células em crescimento mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1.24; Knecht et al., 1987; Loomis, 1988). Essa proteína é sintetizada a partir de mRNA recém-transcrito e fica localizada nas membranas celulares das mixamebas. Se essas células são tratadas com anticor- pos que se ligam a essa proteína e a mascaram, as células não irão aderir umas às outras e todo desenvolvimento subseqüente cessa. Uma vez que essa agregação inicial tiver ocorrido, é estabilizada por uma segunda molécula de adesão celular. Essa glicoproteína de 80-kDa também é sintetizada duran- te a fase de agregação. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas células, lesmas pequenas se formarão, e seus corpos de frutificação só atingirão aproximadamente um terço de seu tamanho normal. Assim, o segundo sistema de adesão celular, parece ser necessário para a retenção de um número de células suficientemente grande para a formação de grandes corpos de frutificação (Müller e Gerisch, 1978; Loomis, 1988). Um terceiro sistema de adesão é ativado tardiamente no desenvolvimento, quando a les- ma estiver migrando.Aproteína ou grupo de proteínas que intervem no terceiro siste- ma pode existir somente em células pré-esporo e pode ser responsável pela separação de células pré-esporo de células pré-pedúnculo (Loomis, comunicação pessoal). As- sim, Dictyostelium evoluiu para três sistemas de adesão célula-célula regulados pelo desenvolvimento, e que são necessários para a morfogênese de células individuais para formar um organismo coerente. Como veremos em capítulos subseqüentes, célu- las de metazoários também usam moléculas de adesão celular para formar os tecidos e órgãos do embrião. Dictyostelium é um “organismo multicelular em tempo parcial” que não forma muitos tipos de células (Kay et al., 1989), e os organismos multicelulares mais comple- xos não se formam pela agregação de células anteriormente independentes. No entan- to, muitos dos princípios do desenvolvimento demonstrados por esse “simples” or- Figura 1.24Figura 1.24Figura 1.24Figura 1.24Figura 1.24 Células de Dictyostelium sintetizam um adesivo, glicoproteína 24-kDa, pouco após a inanição nutricional. Células de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga à glicoproteína 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta. Essa proteína não foi vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. No entanto, como mostrado aqui – 10 horas após o fim da divisão celular – amebas individuais são vistas apresentando essa proteína em suas membranas celulares e são capazes de aderir umas às outras.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 25 ganismo também aparecem em embriões de filos mais complexos. A habilidade de células individuais sentir um gradiente químico (como a resposta da ameba ao cAMP) é muito importante para a migração celular e morfogênese durante o desenvolvimento animal. Ainda mais, o papel das proteínas da superfície celular para a coesividade celular pode ser visto através do reino animal, e moléculas indutoras da diferenciação estão agora começando a ser isoladas de organismos metazoários. teínas de membrana em geral). Nesse caso, bloquear a glicoproteína também causaria a inibição da agregação celu- lar. Assim, a evidência perda-de–função precisa ser amparada por muitos con- troles demonstrando que agentes cau- sadores de perda de função derrubam especificamente aquela função em par- ticular, e nada mais. O tipo mais forte de evidência é evi- dência-de-ganho-de-função. Aqui, o iní- cio do primeiro evento estimula um segun- do e mesmo em situações onde nenhum desses eventos ocorre usualmente. Recen- temente, da Silva e Klein (1990) e Faix e colaboradores (1990) obtiveram tal evidên- cia para mostrar que a glicoproteína 80-kDa é uma molécula adesiva. Isolaram o gene para essa proteína e o modificaram de uma maneira a motivá-lo ser expresso continu- amente. Em seguida, recolocaram-no em mixameba bem-alimentada, crescendo ve- getativamente, que usualmente não expres- sa essa proteína e não tem capacidade de adesão. A presença dessa proteína na mem- brana celular dessas células em divisão foi confirmada por marcação com anticorpos. Tais células agora aderiram umas às outras mesmo nos estados vegetativos, o que nor- malmente não fazem. Assim, elas tinham ganho uma função adesiva somente por expressar essa glicoproteína em particular nas suas superfícies celulares. Essa evi- dência de ganho-de-função é mais convin- cente que outros tipos de análise. Experi- mentos semelhantes foram recentemente realizados em células de mamíferos (veja capítulo 3), para demonstrar a presença de determinadas moléculas adesivas celula- res no embrião em desenvolvimento. Evidência e Anticorpos Como então ir para além da mera cor- relação? No estudo da adesão celular em Dictyostelium, o próximo passo foi usar aqueles mesmos anticorpos para bloque- ar a adesão de mixamebas. Usando uma técnica introduzida pelo laboratório de Gerisch (Beug et al., 1970), Knecht e cola- boradores (1987) tomaram os anticorpos que ligam essa glicoproteína 24-kDa e iso- laram seus sítios ligantes de antígeno (as partes da molécula do anticorpo que re- conhecem o antígeno). Isso foi necessá- rio porque o todo da molécula de anticor- po contém dois sítios ligantes de antígeno que iriam ligar-se artificialmente de manei- ra cruzada e aglutinar as mixamebas. Quan- do esses fragmentos ligantes de antígeno (chamados Fragmentos Fab) foram adici- onados às células competentes para agre- gação, as células não puderam se agre- gar. Os fragmentos de anticorpo impedi- ram as células de aderir entre si, presu– mivelmente por ligar–se a glicoproteína 24-kDa, bloqueando sua função. Esse tipo de evidência é chamado evidência-de- perda-de-função. Se bem que mais forte que a evidência correlativa, ela ainda não exclui outras inferências. Por exemplo, é possível que os anticorpos tenham mata- do a célula (o que poderia acontecer se a glicoproteína 24-kDa for um crítico canal de transporte). Isso também impediria a adesão celular. Ou talvez, a glicoproteína 24-kDa nada tinha a ver com a adesão pro- priamente, mas é necessária para o funci- onamento da verdadeira molécula adesi- va (como através da estabilização de pro- * Em uma carta irônica, caçoando de tais inferências correlativas, Sies (1988) demonstrou uma notável boa correlação entre o número de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 até 1980 e o número de bebês nascidos durante esses mesmos anos. ABiologia, tal como qualquer outra ciência, não trata de fatos; antes, trata de evidências. Vários tipos de evidência serão apresentados neste li- vro; não são todos de equivalente vigor. Como exemplo, vamos usar a análise da adesão celular em Dictyostelium. O primei- ro e mais fraco tipo de evidência é a evi- dência correlativa. Aqui, são feitas corre- lações entre dois ou mais eventos, e infe- re-se que um evento estimule o outro. Como vimos, anticorpos marcados com flu- orescência para uma certa glicoproteína de 24 kDa, não marcam células vegetativas em divisão; porém, esses mesmos anticorpos acham a proteína em membranas celulares de mixameba logo que as células param de se dividir e tornam-se competentes para agregar(veja Figura1.24).Assim,existeuma correlação entre a presença dessa glico- proteína da membrana celular e a capaci- dade de agregação. Evidência correlativa dá um ponto de partida para investigações, mas não se pode afirmar com certeza que um evento estimula outro somente baseado em cor- relações. Embora se possa inferir que a síntese dessa proteína causa a adesão das células, é também possível que adesão ce- lular leve as células a sintetizar essa nova glicoproteína, ou que a adesão celular e a síntese da glicoproteína 24-kDa sejam eventos separados, iniciados pela mesma causa subjacente. A ocorrência simultâ- nea dos dois eventos pode mesmo ser co- incidência e os eventos não terem relação um com o outro.* Informações adicionais Especulações &
  • 26 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) (C) DIFERENCIAÇÃO EM DICTYOSTELIUM.Adiferenciação em uma célula-pedúncu- lo ou em uma célula-esporo reflete um dos principais fenômenos da embriogênese: a seleção pela célula de uma trajetória desenvolvimental. As células freqüentemente selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas estão dis- poníveis. Uma determinada célula num embrião de vertebrado por exemplo, pode tor- nar-se uma célula da epiderme ou um neurônio. Em Dictyostelium, vemos uma decisão dicotômica simples, porque somente dois tipos celulares são possíveis. Como uma célula torna-se uma célula de pedúnculo ou uma célula de esporo? Embora os detalhes não sejam totalmente conhecidos o destino de uma célula parece ser regulado por certas moléculas difusivas. Os dois principais candidatos são o fator indutor de dife- renciação (DIF) e o cAMP. DIF parece ser necessário para a diferenciação da célula peduncular. Esse fator, tal como o fator indutor de sexo em Volvox, é eficaz em concen- trações muito baixas (10-10 M); e, como a proteína de Volvox, parece induzir a diferen- ciação de um determinado tipo de célula. Quando adicionado às amebas isoladas ou mesmo às células pré-esporo (posteriores), induz a formação de células pedunculares. A síntese desse lipídeo de baixo peso molecular é regulada geneticamente, pois há cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de células-esporo e não de células pedunculares. Quando DIF é adicionado a essas culturas de mutantes, células penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn, 1983; Morris et al., 1987), e novos mRNAs específicos pré-pedúnculo são encontrados no citoplasma celular (Williams et al., 1987). O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das células do plasmódio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda é controverso (veja Early et al., 1995). DIF pode agir através da liberação de íons de cálcio de compartimen- tos intracelulares no interior da célula (Schaulsky e Loomis, 1995). [other.html#intro3] Embora DIF estimule amebas a tornarem-se células pré-pedúnculo, a diferencia- ção de células pré-esporo é mais provavelmente controlada por pulsos contínuos de cAMP. Altas concentrações de cAMP iniciam a expressão de mRNA pré-esporo específico, em amebas agregadas.Além disso, quando lesmas são colocadas em um meio contendo uma enzima que destrói cAMP extracelular, as células pré-esporo perdem suas características de diferenciação (Figura 1.25; Schaap e van Driel, 1985; Wang et al., 1988a,b). Figura 1.25Figura 1.25Figura 1.25Figura 1.25Figura 1.25 Substâncias químicas que controlam a diferenciação em Dictyostelium. (A) e (B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio contendo enzimas que destroem cAMP extracelular. (A) Grex (pseudoplas- módio) corado para presença de uma proteína pré-esporo específica (regiões claras). (B) Grex semelhante corado após tratamento com enzimas que de- gradam cAMP. Não é visto produto pré-esporo específico. (C) Amplifica- ção maior de uma lesma tratada com DIF (na ausência de amônia). O corante usado liga-se à parede de celulose das células pedunculares. Todas as células do grex tornaram-se células pedunculares. (Ae B de Wang et al., 1988a; C de Wang e Schaap, 1989; cortesia dos autores.)
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 27 Células pré-pedúnculo A Células pré-pedúnculo B Células pré-pedúnculo AB Direção do movimento celular Células pré-esporo Cálice superior Células pré-esporo Cálice Inferior Pré-pedúnculo ABPré-pedúnculo AB Agregado Grex Culminante precoce Culminante médio Culminante tardio Pré-pedúnculo B Pré-pedúnculo A Pré-pedúnculo AB Pré-pedúnculo B Guarda da retaguarda Pré-pedúnculo B Disco basal interior Disco basal exterior Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima da estão emanando da ponta apical do agregado. Esses pulsos são quimiotácti- cos para células pré-pedúnculo, mas não para células pré-esporo, de modo que atra- em as células pré-pedúnculo para a ponta da agregado (Matsukuma e Durston, 1979; Mee et al., 1986; Siegert e Weijer, 1991; Takeuchi, 1991).Portanto, o AMP cíclico parece ter várias funções no desenvolvi- mento de Dictyostelium. Agrega as célu- las umas às outras, induz diferenciação de células pré-esporo e dirige a migração de células pré-pedúnculo para a parte anteri- or do agregado. Uma vez completo, o agregado tomba sobre um dos lados e forma o grex migra- tório. A maioria das células pré-pedúncu- lo estão nos 20 porcento anteriores do grex, porém, há também algumas células pré-pedúnculo espalhadas através da par- te posterior. Células pré-pedúnculo podem ser distinguidas pela sua secreção de pro- teína A da matriz extracelular para espa- ços intercelulares. No centro da porção anterior do grex, um outro grupo de célu- las pré-pedúnculo começa a secretar uma segunda nova proteína (proteína B), para sua matriz extracelular. Essas células são chamadas células pré-pedúnculo B (pstB), enquanto a maioria das células pré-pedún- culo são conhecidas como células pré- pedúnculo A (pstA) (Figura 1.26). Outro grupo de células pré-pedúnculo, as célu- las pstO, estão espalhadas de maneira esparsa através das células pré-esporo, e migram mais lentamente em direção ao anterior. Quando o grex se encontra na luz solar, cessa de migrar e sofre a diferen- ciação final em esporos e pedúnculo. Du- rante esse processo (chamado culmina- ção), o grex se apóia em um dos terminais fazendo com que as células traseiras se tornem sua base. Algumas células pstA migram para o tubo central de células pstB, e quando entram em contato com o tubo central, diferenciam-se em células pstB, sin- tetizando componentes de uma nova matriz extracelular. As células novas são adiciona- das à região anterior do tubo, forçando-o mais para dentro da estrutura culminativa. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pe- dúnculo. Ao mesmo tempo, as células pstA que tinham ficado na região posterior do E TODAS AS AMEBAS do grex começarem no mesmo nível, como podem células nos quatro-quintosSposteriores da lesma se diferenciar em cé- lulas-esporo, enquanto células equivalen- tes do quinto anterior se tornam células pedunculares? A resposta pode estar na observação de que as células originais não são todas iguais. Amebas sujeitas à ina- nição durante a parte precoce de seu ci- clo celular tendem a se mover para a por- ção anterior do pseudoplasmódio, en- quanto amebas expostas à inanição du- rante o fim do ciclo, tendem a permanecer na porção posterior (McDonald e Durs- ton, 1984; Weijer et al., 1984). Esse traba- lho foi confirmado e ampliado por Ohmori e Maeda (1987), que mostraram que célu- las não-alimentadas durante a parte tar- dia do ciclo celular, respondem de manei- ra diferente ao cAMP e mostram adesivi- dade muito mais alta que células jejuadas imediatamente após a mitose. Williams e colaboradores (1989) acharam que célu- las pré-esporo e pré-pedúnculo podem ser diferenciadas em agregados precoces e que estão distribuídas de modo aleatório através desses montes hemisféricos. As- sim, as tendências para certos destinos foram estabelecidas até mesmo antes do grex começar a migrar. Dentro de cada agre- gado, a maioria das células pré-pedúncu- lo, migram ativamente para o anterior, en- quanto células pré-esporo permanecem no que se tornará a região posterior do grex. Essa migração provavelmente é de- vida a repetidos pulsos de cAMP que ain- Figura 1.26Figura 1.26Figura 1.26Figura 1.26Figura 1.26 Regulação da diferenciação de células pedun- culares durante a fase de culminação do cresci- mento de Dictyostelium. Representação esquemática mostrando que células pré-esporo e pré-pedúnculo estão em geral misturadas no estágio precoce da agregação, mas se separam de modo que a maioria das células pré- pedúnculo se encontrem na parte anterior do grex. As células pré-pedúnculo A constituem a maior parte do anterior do grex, com alguma células similares no posterior. Células pré- pedúnculo B são vistas na parte central da porção anterior do grex. Nos estágios preco- ces da culminação, as células pré-pedúnculo do posterior migram para formar o disco basal e os cálices do saco de esporos; as células pré- pedúnculoA do anterior migram para o centro e se tornam células pré-pedúnculo B. Isso es- tende o pedúnculo até que esse eleve a caixa de esporos acima da superfície. (Segundo Harwood et al., 1992). Informações adicionais Especulações &
  • 28 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Amônia cAMP Repressor ativo da diferenciação e de genes de migração peduncular Migração continuada do grex Luz solar PKA inativa cAMP PKA ativa Repressor inativo (fosforilado) Transcrição do gene da proteína B da matriz extracelular; migração de células pré-pedúnculo; diferenciação e culminação peduncular grex migram para as bordas da região pré- esporo e diferenciam-se no invólucro dos esporos e disco basal (Williams e Jermyn, 1991; Harwood et al., 1992). Finalmente, os esporos são levantados 2 mm acima do solo, de onde podem ser dispersos pelo vento ou um animal que passa. O gatilho para a culminação parece ser a luz solar ou a baixa umidade. Experimen- tos recentes sugerem que esses dois fa- tores causam a difusão de amônia da les- ma. A amônia é produzida copiosamente por lesmas migratórias e reprime a culmi- nação. Sempre que a amônia estiver exau- rida (quer naturalmente ou experimental- mente), a culminação começa (Schindler e Sussman, 1977; Newell e Ross, 1982; Bonner et al., 1985). A amônia inibe a con- versão de células pstA em pstB e proíbe a continuação da formação do pedúnculo (Gross et al., 1983; Wang et al., 1990). Bonner e colaboradores (1985), sugeriram que como a luz causa difusão mais rápida da amônia, remove o inibidor permitindo assim, o progresso da culminação. A amônia parece inibir a produção do pedúnculo pelos menos de duas manei- ras. Inibe a ação de DIF (Wang e Schaap, 1989), e inibe a produção de cAMP nas células pré-pedúnculo (Schindler e Sus- sman, 1977; Harwood et al., 1992). Esse cAMP é necessário para ativar a proteína quinase cAMP-dependente (PKA). Célu- las pré-pedúnculo contendo PKA não- funcional, não fosforilam certas proteínas. Essas células não migram para a região central anterior, nem se diferenciam em células do pedúnculo (Firtel e Chapman, 1990; Harwood et al., 1992). Os dados sugerem que quando PKA é ativada, passa a fosforilar um repressor que esta- va inibindo a expressão dos genes de di- ferenciação do pedúnculo. No estado fos- forilado, o inibidor é inativo. Portanto, uma vez que os níveis de cAMP se elevam (pela remoção da amônia), a PKA pode inativar o inibidor dos genes formadores do pe- dúnculo (Figura 1.27). [intro.4html] Figura 1.27Figura 1.27Figura 1.27Figura 1.27Figura 1.27 Uma hipótese para a iniciação coordenada da culminação e diferenciação de células pedunculares em Dictyostelium. A luz solar dissipa a amônia na parte anterior do grex, permitindo maior produção de cAMP nas cé- lulas pré-pedúnculo.Aconcentração mais alta de cAMP ativa a PKA, que fosforila um inibidor da expressão gênica do pedúnculo. O inibidor fosforilado não pode mais inibir os genes pedúnculo-específicos.Aseqüência pela qual a formação de esporos é inibida, não está clara. (Baseado em modelos de Bonner et al., 1985, e Harwood et al., 1992) Padrões desenvolvimentais entre metazoários Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazoários - animais multicelulares que atravessam estágios embrionários de desenvolvimento - apre- sentaremos um visão panorâmica dos seus padrões desenvolvimentais.* A Figura 1.28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazoário. A ob- servação mais impressionante é que a vida não evoluiu segundo uma linha reta; apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. Podemos ver que a maioria das espécies de metazoários pertence a um de dois principais ramos de animais: protostomatas e deuterostomatas. *Plantas passam por padrões igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embri- onário e pós-embrionário. No entanto, o desenvolvimento das plantas difere significativamente daquele dos animais; a inclusão de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado a extensão deste livro. Por isso, foi tomada a decisão de enfocar neste texto, o desenvolvimento dos animais. Para uma revisão, veja Singer, 1997.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 29 BILATERIA RADIATA PARAZOA DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS Ascídios (Tunicados)Vertebrados Equinodermos Moluscos Artrópodos Platel- mintos Cnidários (Celenterados) Poríferos (Esponjas)Anelídeos Nematelmintos Segmentados Não-segmentados Larva trocófora Larva dipleura (tornária) Clivagem em espiral gastrulação protostosomal Linhagem esquizocelomada Clivagem radial gastrulação deuterostomal Linhagem pseudocelom ada SIMETRIA BILATERAL Protistas flagelados Platelmintos primitivos (acelomados) Linhagem acelom ada Larvas planulóides SIMETRIA RADIAL Protozoários coloniais primitivos Os PoríferosOs PoríferosOs PoríferosOs PoríferosOs Poríferos Considera-se que os protistas coloniais deram origem, ao menos, a dois grupos de metazoários, ambos passando por estágios embrionários. Um desses grupos é o Porífero (esponjas). Esses animais desenvolvem-se de um modo tão diferente daquele de qual- quer outro grupo de animais, que alguns taxonomistas sequer consideram-nos metazoários (chamando-os, “parazoários”). Uma esponja tem três tipos principais de células somáticas, mas um deles, o arqueócito, pode se diferenciar em todos os outros Figura 1.28Figura 1.28Figura 1.28Figura 1.28Figura 1.28 Principiais divergências evolucionárias em animais existentes. (Outros modelos são possíveis, porém, os esquemas em geral são todos semelhantes ao mostrado aqui.)
  • 30 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento tipos. As células de uma esponja quando passadas por uma peneira, podem regenerar novas esponjas a partir de células individuais. Ainda mais, em alguns casos, tal re- agregação é espécie-específica: se células individuais de esponja de duas espécies diferentes forem misturadas, cada uma que se re-forma contém somente células de uma espécie (Wilson, 1907). Nesses casos, admite-se que os arqueócitos móveis cole- cionam células de sua espécie, mas não das outras (Turner, 1978). Esponjas não con- tém mesoderma, não havendo portanto verdadeiros sistemas de órgãos em Porífero; esses seres não têm tubo digestivo, sistema circulatório, nervos ou músculos. Assim, apesar de passarem por estágios embrionários e larvais, esponjas são muito pouco parecidos com a maioria dos metazoários (veja Fell, 1997). Protostomatas e DeuterostomatasProtostomatas e DeuterostomatasProtostomatas e DeuterostomatasProtostomatas e DeuterostomatasProtostomatas e Deuterostomatas O outro grupo de metazoários emergindo dos protistas coloniais é caracterizado pela presença de três camadas germinativas durante o desenvolvimento. Alguns membros do grupo constituem os Radiatas, assim chamados porque têm simetria radial tal como um tubo ou uma roda. Os Radiatas incluem os cnidários (medusas, corais e hidras) e ctenóforos (medusas de crista). Nesses animais, o mesoderma é rudimentar, consistin- do de células escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Porém, a maioria dos metazoários tem simetria bilateral, constituindo assim, os Bilaterias. Esses filos bilaterais são classificados como platelmintos, protostomatas ou deuterostomatas. Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. Esses platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora não tivessem ficado ocos para formar uma cavidade corpórea), e foram considerados parecidos com as larvas de certos celenterados contemporâneos. Enquanto os platelmintos são des- providos de celoma (cavidade corpórea), os nematelmintos (e rotiferas) têm uma cavi- dade corpórea diferente daquela de todos os outros animais, por ser desprovida de revestimento mesodérmico. A maioria dos filos são celomados, isto é, possuem uma cavidade corporal revestida por mesoderma. As diferenças entre as duas divisões de Bilateria estão ilustradas na Figura 1.29. Protostomatas (do Grego, “boca primeiro”), incluem os filos dos moluscos, artrópodos e vermes; são assim chamados porque a boca é formada em primeiro lugar, junto ou próximo da abertura intestinal, produzida durante a gastrulação. O ânus se forma mais tarde em outro local. A cavidade corpórea desses animais se forma a partir de uma previamente sólida corda de células mesodérmicas, tornadas ocas. A outra grande divisão dos Bilateria é a linhagem dos deuterostomatas. Os filos nessa divisão incluem os chordatas e os equinodermos. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ouriços-do-mar, alguns traços embriológicos acentuam esse parentesco. Em primeiro lugar, nos deuterostomatas (do Grego signifi- cando “boca depois”), a abertura bucal é formada depois da abertura anal. Também, enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpóreas tornando oco um bloco sólido de mesoderma (formação esquizelóide), a maioria dos deuterostomatas formam suas cavidades corpóreas a partir de bolsas mesodérmicas estendendo-se do intestino (formação enterocélica). Porém, deve-se mencionar que há muitas exceções a essas generalizações. Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual são clivados. Na maioria dos deuterostomatas, os blastômeros são perpendiculares ou paralelos uns aos outros. Isso é chamado clivagem radial. Protostomatas ao contrário, têm uma extensa variedade de tipos de clivagem. Muitas espécies formam blástulas compostas por célu- las que estão em ângulos agudos relativamente ao eixo polar do embrião. São por isso consideradossofrerclivagemespiral.Alémdisso,osblastômerosemestágiodeclivagem, na maioria dos deuterostomatas, têm maior capacidade de regular seu desenvolvimento do que os prostostomatas. Se um único blastômero é removido de um embrião quadricelular de ouriço-do-mar ou camundongo, tal blastômero irá desenvolver-se em um organismo inteiro, e os três-quartos restantes do embrião também irão se desenvolver
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 31 Duas larvas normais se desenvolvem (A) PROTOSTOMATAS (B) DEUTEROSTOMATAS 1. Clivagem espiral 1. Clivagem radial 2. Desenvolvimento esquizocélico 2. Desenvolvimento enterocélico Celoma Celoma Blastocele Blastocele Bolsa Intestinal Mesoderma se divide Bolsas se destacam Mesoderma Mesoderma Intestino Intestino Intestino Intestino 3. Tendência a não regulação 3. Tendência à regulação Embrião de de 4 células Um blastômero excluído Desenvolvimento interrompido Embrião de de 4 células Um blastômero excluído normalmente.Porém,seamesmaoperaçãofosserealizadaemumembriãodelesmaoude verme, tanto o blastômero isolado como os restantes se desenvolveriam em embriões parciais – cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros. A evolução dos organismos depende de alterações herdadas em seu desenvolvi- mento. Um dos maiores avanços evolucionários – o ovo amniótico – ocorreu entre os deuterostomatas. Esse tipo de ovo, exemplificado pelo da galinha (Figura 1.30), é considerado ter-se originado dos ancestrais anfíbios dos répteis, há cerca de 255 milhões de anos. O ovo amniótico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de suprimentos de água existentes. Ao passo que a maioria dos anfíbios é obrigada a voltar para a água para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos, o ovo amniótico carrega seu próprio suprimento de água e nutrientes. O ovo é fertilizado internamente e contém a gema para nutrir o embrião em desenvolvimento. Ainda, contém quatro bolsas: o saco vitelínico, que armazena proteínas nutrientes, o âmnio, que contém fluido banhando o embrião, a alantóide, na qual restos do metabolismo embrionário são coletados, e o cório, que interage com o ambiente externo, seletiva- mente permitindo materiais chegar ao embrião. O todo dessa estrutura está contido em uma casca que permite a difusão de oxigênio, ao mesmo tempo sendo suficientemente dura para proteger o embrião de agressões ambientais. Desenvolvimento semelhante de proteções do ovo permitiram aos artrópodes serem os primeiros invertebrados sobre a terra. Assim, a travessia final dos limites entre água e terra ocorreu com a modificação do estágio mais precoce do desenvolvimento – o ovo. Figura 1.29Figura 1.29Figura 1.29Figura 1.29Figura 1.29 Tendências principais dos prostostomatas e deuterostomatas. Exceções à todas essas ten- dências gerais evoluíram secundariamente em certos membros de cada grupo. (A maioria dos vertebrados por exemplo, não tem uma forma- ção estritamente enterocélica da cavidade cor- poral; e os embriões de certos deuterostomatas, como os tunicados, não sofrem regulação se os blastômeros são deles removidos.)
  • 32 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (B) Embrião Âmnio Cavidade amniótica Alantóide Cório Gema Saco vitelino Alantóide (A) Intestino A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes problemas e animais. No presente livro, encontraremos apenas uma pequeníssima amostra deles, servindo para ilustrar os princípios mais importantes do desenvolvi- mento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento animal através dos filos, veja Gilbert e Raunio,1997). Estamos apenas observando o conjunto das marés ao nosso alcance, enquanto todo o oceano do desenvolvimento se estende à nossa frente. Após uma breve visão dos princípios genéticos e celulares relevantes para a biologia do desenvolvimento, investigaremos os estágios precoces da embriogênese animal: fertilização, clivagem, gastrulação e construção do plano do corpo vertebrado. Capítulos posteriores se concentrarão nos mecanismos genéticos e celulares pelos quais ele é elaborado. Embora uma tentativa de cobrir as variações importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita, um certo chauvinismo deuterostossômico pode ter ficado aparente. Figura 1.30Figura 1.30Figura 1.30Figura 1.30Figura 1.30 Diagrama do ovo amniótico do pinto, mos- trando o desenvolvimento das membranas en- volvendooembrião.(A)Incubaçãodetrêsdias. O mesoderma extra-embrionário se estende do embrião para prover vasos sangüíneos para e de várias regiões fora do embrião. (B) Incuba- ção de sete dias.Aorigem das membranas será detalhada no capítulo 9.Agema será finalmen- te rodeada pelo saco vitelínico que permite a entrada de nutrientes nos vasos sangüíneos. O cório é derivado em parte do ectoderma e es- tende-se do embrião até a casca (onde irá tro- car oxigênio e gás carbônico e obter cálcio da casca). O âmnio prove o meio fluido no qual cresce o embrião, e a alantóide coleta resíduos nitrogenados que seriam perigosos para o em- brião. Finalmente, o endoderma se transforma no intestino e envolve a gema. A evolução do âmnio e das outras membranas extra-embrio- nárias constituiu uma grande linha divisória entre aqueles vertebrados cuja reprodução está ligada à água (anamniotas) e aqueles que po- dem se reproduzir em áreas secas (amniotas). LITERATURA CITADA Bergman, K., Goodenough, U. W., Coodenough, D. A., Jawitz, J. and Martin, H. 1975. Gametic differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. II. Flagellar membranes and the agglutination reaction. J. Cell Biol. 67: 606-622. Beug, H., Gerisch, G., Kempff, S., Riedel, V. and Cremer, G. 1970. Specific inhibition of cell contact formation in Dictyostelium by univalent antibodies. Exp. Cell Res. 63: 147-158. Bonner, J. T. 1947. Evidence for the formation of cell aggregates by chemotaxis in the develop- ment of the slime mold Dictyostelium discoi- deum. J. Exp. Zool. 106: 1-26. Bonner, J. T. 1957. A theory of the control of differentiation in the cellular slime molds. Q. Rev. Biol. 32: 232-246. Bonner, J. T., Berkley, D. S., Hall, E. M., Konijn, T. M., Mason, J. W., O’Keefe, G. and Wolfe, P. B. 1969. Acrasin, acrasinase and the sensitivity to acrasin in Dictyostelium discoi- deum. Dev. Biol. 20: 72-87. Bonner, J., Hay, A. and John, D. 1985. pH affects fruiting and slug orientation in Dictyos- telium discoideum. J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 207-213. da Silva,A. M. and Klein, C. 1990. Cell adhesion transformed D. discoideum cells: Expression of gp80 and its biochemical characterization. Dev. Biol. 140: 139-148. Early,A.,Abe,T. and Williams, J. 1995. Evidence for positional differentiation of prestalk celIs and for a morphogenetic gradient in Dictyoste- lium. Cell 83: 91-99. Faix, J., Gerisch, G. and Noegel, A. A. 1990. Constitutive overexpression of the contact A glycoprotein enables growth-phase celIs of Dic- tyostelium discoideum to aggregate. EMBO J. 9: 2709-2716. Fell, P. 1997. Porifera, the sponges. In S. F. Gilbert and A. M. Raunio (eds.), Embryology: Constructing the Organism. SinauerAssociates, Sunderland, MA. Firtel, R. A. and Chapman, A. L. 1990. A role for cAMP-dependent protein kinase A in early Dictyostelium development. Genes Dev. 4:18-28. Fulton, C. 1977. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu. Rev. Microbiol. 31: 597-629. Fulton, C. and Walsh, C. 1980. Cell differentia- tion and flagellar elongation in Naegleria gruberi: Dependence on transcription and translation. J. Cell Biol. 85: 346-360. Garcia, E. and Dazy, A.-C. 1986. Spatial distribution of poly(A)+ RNA and protein synthesis in Acetabularia mediterranea. Biol. Cell 58: 23-29. Gilbert, S. F. aned Raunio,A. M. 1997. Embryo- logy: Constructing the Organism. Sinauer Associates, Sunderland, MA. Goodenough, U. W. and Weiss, R. L. 1975, Gametic differentiation in ChIamydomonas rei- nhardtii. III. Cell wall lysis and microfilament associated mating structure activation in wild-type and mutant strains. I. Cell Biol. 67: 623-637.
  • CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 33 Cross, J., Bradbury, J, Kay, R. and Peacey, M. 1983. Intracellular pH and the control of cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Nature 303: 244-245. Hämmerling, J. 1934. Über formbildended Substanzen bei Acetabularia mediterranea, ihre rãumliche und zeitfiche Verteilung und ihre Herkunft. Wílhelm Roux Arch. Entwicklungs- mech. Org. 131: 1-81. Hartmann, M. 1921. Die dauernd agame Zucht von Eudorina elegans, experimentelle Beiträge zum Be–fruchtungs-und Todproblem. Arch. Protistk. 43: 223-286. Harwood, A. J., Hopper, N. A., Simon, M.-N., Driscoll, D. M., Veron, M. and Williams, J. G. 1992. Culmination in Dictyostelium is regulated by the cAMP-dependent protein kinase. Cell 69: 615-624. Jermyn, K.A. and Williams, J. 1991.An analysis of culmination in Dictyostelium using prestalk and stalk-specific cell autonomous markers. De- velopment 111: 779-787. Johnson, R. L., Gundersen, R., Lilly, P., Pitt, G. 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  • 34 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento discoideum is correlated with the expression of cyclic AMP production, detection and degrada- tion. Involvement of cAMP signalling in cell sorting. Dev. Biol. 125:410-416. Wang, M., Roelfsema, J. H., Williams, J. G. and Schaap, P. 1990. Cytoplasmic acidification facilitates but does not mediate DIF-induced prestalk gene expression in Dictyostelium dis- coideum. Dev. Biol. 140: 182-188. Weijer, C. J., DuschI, G. and David, C. N. 1984. Dependence of cell-type proportioning and sorting on cell cycle phase in Dictyostelium dis- coideum. Exp. Cell Res. 70: 133-145. Williams, J. G. and Jermyn, K. A. 1991. Cell sorting and positional differentiation during Dic- tyostelium morphogenesis. In J. Gerhart (ed.), Ce11-Cell Interactions in Early Development. Wiley-Liss, New York, pp. 261-272. Williams, J. C., Ceccarelli, A., McRobbie, S., Mahbubani, H., Kay, R. R., Early, A., Berks, M. and Jermyn, K. A. 1987. Direct induction of Dictyostelium pre-staIk gene expression. of DIF provides evidence that DIF is a morphogen. Cell 49: 185-192. Williams, J. G., Duffy, K. T., Lane, D. P., McRobbie, S. J., Harwood, A. J., Traynor, D., Kay, R. R. and Jermyn, K. A. 1989. Origins of the prestalk-prespore pattern in Dictyostelium development. Cell 59: 1157-1163. Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development and Inheritance. Macmillian, New York. Wilson, H. V. 1907. On some phenomena of coalescence and regeneration. in sponges. J. Exp. Zool. 5: 245-258.
  • “E 35 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria, e os genes postulados, aos quais os caracteres se referem, está todo o cam- po do desenvolvimento embrionário”.AquiThomas Hunt Morgan (1926) O que gostaríamos de saber é se a estrutura é determinada diretamente pela informação codificada no DNA, gravada no ovo... na extensão em que estrutura pode ser ex- pressa por informação. JONATHAN BARD (1990) Os segredos que me enlaçam e cativam são em geral segredos da hereditariedade: como uma semente de pêra vira uma pereira em vez de um urso polar. CYNTHIA OZICK (1989) estava verificando que o único caminho de genótipo para fenótipo, passava através de processos desenvolvimentais. No começo do século vinte, embriologia e genética não eram consideradas ciências separadas. Divergiram na década de 1920, quando Morgan redefiniu a genética como a ciência que estuda a transmissão dos traços em oposição à embriologia, a ciência que estuda a expressão desses traços. Durante a última década, porém, as técnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximação entre embriologia e genética. Na realidade, os dois campos se ligaram novamente a tal ponto que se torna necessário uma discussão prévia da genética molecular neste texto. Questões do desenvolvimento animal que não poderiam ser consideradas há uma década, estão sendo agora resolvidas por um conjunto de técnicas envolvendo síntese de ácidos nucléico e hibridização. Este capítulo procura situar essas novas técnicas dentro do contexto do diálogo, ora em curso, entre genética e embriologia. As origens embriológicas da teoria dos genes Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade?Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade?Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade?Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade?Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? Mendel chamou-os Formbildungelementen, elementos construtores de formas; nós os chamamos de genes. Porém, é na terminologia de Mendel que vemos como no século dezenove os conceitos de herança e desenvolvimento estavam intimamente entrelaça- dos. Entretanto, as observações de Mendel não indicaram onde na célula ficavam esses elementos hereditários, nem como eram levados a se expressarem. A teoria dos genes, que viria a ser a pedra angular da genética moderna, teve origem em uma controvérsia no campo da embriologia. Em fins século XIX, um grupo de cientistas começou a estudar, por seu valor intrínseco, como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos. Doisjovensembriologistasamericanos,EdmundBeecherWilsoneThomasHuntMorgan (Figura 2.1), tornaram-se parte desse grupo de “embriologistas fisiológicos”, cada um tornando-se partidário na controvérsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo fertilizado - o núcleo ou o citoplasma - controla a herança. 2
  • 36 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate, a disputa já estava bem ativa. Uma escola associada a Oskar Hertwig, Wilhelm Roux e Theodor Boveri, propunha que os cromossomos do núcleo continham os elementos construtores de formas. Esse grupo era desafiado por Eduard Pflüger, T. L. W. Bischoff, Wilhelm His e seus colegas, que acreditavam que estruturas pré-formadas não poderiam causar tão enor- mes mudanças durante o desenvolvimento; ao contrário, eles acreditavam que os padrões herdados de desenvolvimento eram causados pela criação de novas molécu- las do gameta interativo, citoplasmas. Morgan aliou-se a esse último grupo e obteve dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmático da he- rança. Em seu experimento mais crucial, ele removeu citoplasma do récem-fertilizado ovo ctenóforo (geléia de crista). Em 1897 Morgan relatou: Aqui, embora todo o núcleo de segmentação esteja presente, devido à perda de parte do citoplasma, produz-se embriões com defeito... Parece não haver escape da conclusão que no citoplasma, e não no núcleo, está o poder de diferenciação dos estágios precoces do desenvolvimento. Figura 2.1Figura 2.1Figura 2.1Figura 2.1Figura 2.1 (A) E. B. Wilson (1856-1939; mostrado aqui em aproximadamente 1899), um embriologista cujo trabalho, na fase precoce da embriologia e da de- terminação sexual, muito avançou as hipóteses cromossômicas do desenvolvimento. (Wilson era também reconhecido como um dos melhores vio- loncelistas amadores do país.) (B) Thomas Hunt Morgan (1866-1945), que desenvolveu a teoria dos genes a partir da embriologia. Essa fotografia - tomada em 1915, quando os elementos básicos da teoria dos genes estavam se encontrando – mostra Morgan usando uma lente manual para identificarmoscas.(A)cortesiadeW.N.Timmins; (B) cortesia de G. Allen.)
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 37 Wilson, nesse ínterim, tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. Defendeu vigorosamente essa idéia em seu livro A Célula no Desenvolvimento e na Herança (1896), salientando a necessidade da presença do núcleo para regeneração dos protozoários (veja capítulo 1): Esse fato presume que o núcleo é, se não o local da formação de energia, ao menos, o fator controlador dessa energia e, por isso, o fator controlador da herança. Essa conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da matu- ração (meiose), fertilização e divisão celular. Todos convergem em direção da conclusão de que a cromatina é o elemento essencial para o desenvolvimento. Wilson (1895) não se esquivou das conseqüências dessa conclusão* Agora, a cromatina é sabida ser intimamente semelhante, se não idêntica, à substância conhecida como nucleína...que a análise demonstra ser um compos- to químico toleravelmente bem definido, composto de ácido nucléico (um com- plexo ácido orgânico rico em fósforo) e albumina. E assim, chegamos à notável conclusão que a herança pode, talvez, ser efetuada pela transmissão física de um dado composto químico do progenitor para a descendência. Wilson pensou que o material formador de órgãos que Morgan havia removido do citoplasma de ovos de ctenóforo, já havia sido para ali secretado pelos cromossomos nucleares (Wilson, 1894, 1904). ParaWilson (1905) “Os materiais citoplasmáticos pare- cem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciação, e ainda procu- ramos sua determinação primária nas causas que residem mais profundamente.” Parte do maior apoio para a hipótese cromossômica da herança estava vindo dos estudos embriológicos de Theodor Boveri (Figura 2.2A), um pesquisador na Estação Biológica de Nápoles. Boveri fertilizou óvulos de ouriço-do-mar com altas concentra- ções de seu espermatozóide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois espermatozóides. Na primeira clivagem, esses ovos formaram quatro pólos mitóticos e dividiram o ovo em quatro, em vez de duas células (veja capítulo 4). Boveri então separou os blastômeros e demonstrou que cada célula se desenvolvia anormalmente e de maneiras diferentes por ter cada célula diferentes tipos de cromossomos. Assim, Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de diferentes processos vitais. O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e DesenvolvimentoO Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e DesenvolvimentoO Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e DesenvolvimentoO Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e DesenvolvimentoO Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento Em adição à evidência de Boveri, E. B. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a,b) de- monstraram uma correlação crítica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento organizacional. Stevens (Figura 2.2B), uma ex- estudante de Morgan, mostrou que em 92 espécies de insetos (e um cordato primitivo), as fêmeas tinham dois cromossomos sexo-específicos em cada núcleo (XX), enquanto machos tinham somente um cromos- somo X (XY ou XO). Parecia que uma estrutura nuclear, o cromossomo X, estava controlando o desenvolvimento sexual** . Morgan discordou da interpretação de que Figura 2.2Figura 2.2Figura 2.2Figura 2.2Figura 2.2 O caráter singular do cromossomo foi mostra- do por Boveri e Stevens. (A) Theodor Boveri (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) co- mentou: “conseguiu a verdadeira fusão de citologia, embriologia e genética – um feito bi- ológico que... não fica atrás de qualquer outro de nosso tempo.” Fotografia tirada em 1908, quando os estudos cromossômicos e embrio- lógicos de Boveri estavam no seu apogeu. (B) Nettie M. Stevens (1861-1912), que treinou tanto com Boveri como com Morgan, vista aqui em 1904 quando era estudante de pós- doutorado, realizando a pesquisa que correla- cionou o número de cromossomos X com o desenvolvimento sexual. [(A) cortesia de Baltzer, 1967; (B) cortesia do Instituto Carnegie de Washington.] (A) (B) *Note-se que Wilson está escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina em 1896 – antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos genes. Para uma análise mais detalhada das interações entre Morgan e Wilson que levaram à teoria dos genes, veja Gilbert (1978, 1987) e Allen (1986). ** Wilson era um dos amigos mais íntimos de Morgan, que considerava Stevens sua melhor estudante de pós-graduação. Ambos estavam contra Morgan nessa questão. Mesmo assim, Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa, confirmando suas qualidades como as melhores possíveis. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendação, apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush, 1978).
  • 38 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento os cromossomos determinavam o sexo. Ao contrário, ele considerou o conjunto de cromossomos como uma característica sexual secundária, controlada por alguma subs- tância citoplasmática determinadora do sexo. A “conversão” de Morgan para a hipótese cromossômica ocorreu depois de obter dados contrários às suas teorias (veja Allen, 1978; Gilbert, 1978; Lederman, 1989). Enquanto criava Drosophila para uma série de experimentos sobre evolu- ção, Morgan começou a obter várias mutações correlacionadas com o sexo. (Como ele logo iria mostrar, mutações ligadas ao X apareciam antes de mutações em outros cromossomos, porque defeitos no cromossomo X não são mascarados pelo cromossomo homólogo no macho.) Em 1910, Morgan mostrou que os traços para ambos sexos e cor branca dos olhos estão correlacionados de alguma manei- ra com a presença de um dado cromossomo X; entretanto, evitou considerá-los ligados fisicamente. Porém, em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos olhos, cor do corpo, forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cro- mossomo X, o que o levou a começar a visualizar os genes como fisicamente ligados um ao outro no cromossomo. O embriologista Morgan tinha demonstra- do que cromossomos nucleares eram responsáveis pelo desenvolvimento de caracteres herdados. [gene1.html] A cisão entre a embriologia e a genética A evidência de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. A genética havia sido, em geral, uma ciência empírica sobre procriação de animais e plantas; Morgan deu-lhe um fundamento científico. Movida pelo desejo de progre- dir no conhecimento da reprodução de animais e plantas (e seres humanos), e na capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matemati- camente verificáveis, a genética logo se tornou a ciência biológica predominante nos Estados Unidos (veja Allen, 1986; Sapp, 1987; Paul e Kimmelman, 1988). Na década de 1930, tornou-se disciplina autônoma, desenvolvendo seu vocabulário próprio, revistas, sociedades, organismos favorecidos, professorados e regras de evidência. Hostilidade entre embriologia e genética também emergiu. Os geneticis- tas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expressão gênica. Conforme proclamado por Richard Goldschmidt (1938), “O desenvolvimento, obviamente, é a produção ordenada de um padrão e assim, em última análise, os genes controlam o padrão”. Se os embriologistas não olharem para a embriogênese em termos da ativi- dade dos genes, os geneticistas o farão. Reciprocamente, os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes e mal-informados. Embriologistas como Frank Lillie (1927), Ross Granville Harrison (1937), Hans Spemann (1938) e Ernest E. Just (1939) (Figura 2.3), argumentaram que não poderia haver uma teoria genética do desenvolvimento até que ao menos três principais desafios fossem resolvidos: 1. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos – que eram considera- dos idênticos em cada célula do organismo – direcionam tipos diferentes e variáveis de citoplasmas celulares. 2. Quase todos genes conhecidos na época afetavam a modelagem das etapas finais (cor dos olhos, forma das cerdas, vascularização alar). Os geneticistas teriam que produzir evidência que os genes controlam os estágios precoces da embriogênese. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison, 1937), os embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu dorso e não no número de cerdas no seu dorso. 3. Os geneticistas teriam que explicar fenômenos como a determinação do sexo em certos invertebrados (e vertebrados, como répteis), nos quais o ambiente determina o fenótipo sexual.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 39 (A) (B) (C) O debate tornou-se deveras veemente. Numa retórica, refletindo as ansiedades políticas do fim da década de 1930, Harrison (1937) alertou: Agora que a necessidade de relacionar os dados da genética com a embriologia está sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas começa a impeli-los em nossa direção, não pareceria impróprio apontar para um perigo dessa ameaçada invasão. O prestígio do sucesso desfrutado pela teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstáculo para a compreensão do desenvolvimento, por dirigir nossa atenção exclusivamente para o genoma, enquanto movimentos celulares, diferenciação e todos os processos desenvolvi- mentais são de fato realizados pelo citoplasma. Já temos teorias que referem os processos do desenvolvimento à ação dos genes e consideram toda performance como nada mais que a consecução dos potenciais dos genes. Tais teorias são totais e demasiadamente unilaterais. Até que os geneticistas puderam demonstrar a existência de variantes herdadas du- rante a fase precoce do desenvolvimento e até que os geneticistas tiveram uma bem- documentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes tipos de células, os embriologistas em geral não sentiram a necessidade de basear sua embriologia na ação dos genes. [gene2.html] Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento Porém, alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a genética estavam completas uma sem a outra. Várias tentativas foram feitas para sintetizar as duas disciplinas, mas sua primeira integração bem-sucedida veio no fim da década de Figura 2.3Figura 2.3Figura 2.3Figura 2.3Figura 2.3 Embriologistas tentaram impedir a genética de “conquistar” seu território na década de 1930. (A) Frank Lillie encabeçou o Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um líder na pesquisa sobre fertilização e endocrinologia reprodutiva. (B) Hans Spemann (à esquerda) e Ross Harrison (à direita) aperfeiçoaram operações de transplante para descobrir quando eram determinados os eixos do corpo e dos membros. Argumentaram que os geneticistas não possu- íam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares diferentes durante o desenvolvimento. (C) Ernest E. Just fez descobertas cruciais sobre fertili- zação. Rejeitou a genética e enfatizou o papel da membrana celular na determinação dos destinos das células. (Acortesia de V. Hamburger; B cortesia de T. Horder; C cortesia do Laboratório de Biologia Marinha, Woods Hole.)
  • 40 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1930, por parte de dois embriologistas, Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora S. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington.Ambos haviam sido treinados em embriologia na Europa e tinham aprendido genética nos Estados Unidos com estudantes de Morgan. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington, tentaram achar mutações que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por es- ses genes. Gluecksohn-Schoenheimer (1938, 1940) mostrou que mutações nos genes de Brachyury do camundongo, causavam desenvolvimento aberrante da porção posterior do embrião, e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal.* Além disso, Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camun- dongos não era possível fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar fazendo - alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais eram as conseqüências dessa operação. Em vez disso, um novo tipo de cientista era necessário, o geneticista do desenvolvimento: Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em seguida estuda seus resultados, o geneticista do desenvolvimento tem que estu- dar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto é, os resultados da pertur- bação do desenvolvimento) para depois, às vezes, chegar a conclusões sobre a natureza do “experimento” realizado pelo gene. Ao mesmo tempo, Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam mal- formações alares na mosca das frutas, Drosophila. Também analisava como esses genes podiam afetar os primórdios que dão origem a essas estruturas.Aasa da Droso- phila, conforme proclamou corretamente, “parecia favorável para pesquisas sobre a ação desenvolvimental dos genes”. Assim, uma das principais objeções ao modelo genético do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas - que os genes atuam somente sobre a modelagem final do embrião e não sobre seus principais esquemas de construção – foi contrariada. [gene3.html] Evidência para a equivalência genômica Ainda permanecia uma outra grande objeção para uma embriologia baseada na genéti- ca: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os mesmos em cada tipo celular? Essa equivalência genômica não estava provada mas era assumida (porque cada célula é o descendente mitótico do ovo fertilizado) e um dos primeiros problemas da genética do desenvolvimento era o de determinar se cada célula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra. MetaplasiaMetaplasiaMetaplasiaMetaplasiaMetaplasia A primeira evidência para equivalência genômica veio após a 2a Guerra Mundial, por parte de embriologistas que estavam estudando a regeneração de tecidos excisados. O estudo da regeneração do olho da salamandra demonstrou que mesmo células adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares. Portanto, os genes para os produtos desses outros tipos de células devem ainda estar presentes, embora normalmente não expressos. Na salamandra, a remoção da retina *As observações de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas através da hibridização do DNA. No entanto, quando o gene do T-locus foi clonado e sua expressão detectada pela técnica da hibridização in situ (discutida mais adiante neste capítulo), Wilkinson e colaboradores (1990) acharam que “a expressão do gene T tem um papel direto nos eventos precoces da formação do mesoderma e na morfogênese da notocorda”. Embora uma história completa do desenvolvimento precoce da genética do desenvolvimento ainda permaneça por ser escrita, mais informações sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer, 1981; Sander, 1986; Gilbert, 1988, 1991, 1996; Burian et al., 1991; Harwood, 1993; Keller, 1995; e Morange, 1996.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 41 (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) Retina pigmentada Retina neural Íris dorsal Lente Íris ventral neural promove sua regeneração a partir da retina pigmentada, e uma nova lente pode ser formada a partir das células da íris dorsal.Aregeneração do tecido lenticular da íris (a assim chamada regeneração Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou em 1894) foi intensamente estudada.Yamada e seus colegas (Yamada, 1966, Dumont e Yamada, 1972) acharam que após a remoção de uma lente, uma série de acontecimentos leva à produção de uma nova lente a partir da íris (Figura 2.4). Os núcleos do lado dorsal da íris começam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos, seu DNA se replica, e divisões mitóticas se sucedem.As células da íris pigmentada começam, em seguida, a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grânulos pigmentados que dão ao olho a sua cor; esses melanossomos são ingeridos por macrófagos que entram no local da ferida). A íris dorsal continua a se dividir, formando um globo de tecido desdiferenciado na região da lente removida. Essas células começam então a sintetizar os produtos diferenciados de células lenticulares, as proteínas do cristali- no. Essas proteínas são fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal da lente. Uma vez formada uma nova lente, as células do lado dorsal da íris cessam sua atividade mitótica. Esses eventos não são a via normal pela qual a lente dos vertebrados é formada. Como será visto em detalhe mais tarde, a lente normalmente se desenvolve a partir de uma camada de células epiteliais da cabeça, induzida pelas células retinais precursoras subjacentes.Aformação da lente por células diferenciadas da íris representa metaplasia (ou transdiferenciação), a transformação de um tipo celular diferenciado em outro (Okada, 1991).Aíris da salamandra, portanto, não havia perdido gene algum daqueles usados na diferenciação das células da lente. Figura 2.4Figura 2.4Figura 2.4Figura 2.4Figura 2.4 Regeneração Wolffiana da lente da salamandra a partir da margem dorsal da íris. (A) Olho normal, não-operado no estágio larval da sala- mandra Notophtalmus viridiscens. (B-G) Re- generação da lente, vista respectivamente nos dias 5, 7, 9, 16, 18 e 30. A nova lente estará completa no dia 30. (de Reyer, 1954, cortesia de R. W. Reyer.)
  • 42 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Pólo animal Agulha de vidro Fuso meiótico isolado Micropipeta Membrana cicatriza Fuso meiótico Remoção dos cromossomos e do fuso da célula Ovo ativado enucleado Núcleo doador inserido na célula enucleada Grânulos pigmentados Extração e lise da célula doadora Clonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência NuclearClonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência NuclearClonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência NuclearClonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência NuclearClonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência Nuclear O teste definitivo sobre se, ou não, o núcleo de uma célula diferenciada sofreu qual- quer restrição funcional irreversível, seria o de conseguir que esse núcleo gerasse todo outro tipo de célula diferenciada no organismo. Se cada núcleo fosse idêntico ao núcleo do zigoto, o núcleo de cada célula deveria ser capaz de direcionar todo o desenvolvimento do organismo, quando transplantado para um ovo ativado enucleado. Porém, antes que tal experimento pudesse ser feito, três técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas: (1) um método para enuclear ovos do hospedeiro sem destruí-los; (2) um método para isolar núcleos doadores intactos; (3) um método para transferir tais núcleos para dentro do ovo sem danificar o núcleo ou o oócito. Essas técnicas foram desenvolvidas na década de 1950, em primeiro lugar por Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleação com a ativação do ovo. Quando um oócito de rã-leopardo (Rana pipiens) é perfurado com uma agulha limpa de vidro, o ovo sofre todas as mudanças citológicas e bioquímicas associadas à fertilização. Ocorre rearranjo citoplasmático interno e a finalização da meiose perto do pólo animal da célula. Esse fuso meiótico pode ser facilmente localizado quando empurra os grânulos pigmentados do pólo animal; a punção do oócito nesse local induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2.5). O ovo hospe- deiro é agora considerado estar ativado (as reações de fertilização necessárias para iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. A passagem de um nú- cleo para o ovo é conseguida pela ruptura de uma célula doadora e transferência do núcleo liberado para o oócito por meio de uma micropipeta.Algum citoplasma acom- panha o núcleo para seu novo lar, mas a razão do citoplasma doador para o receptor é somente de 1:105 , e o citoplasma do doador não parece afetar o resultado dos experimentos. Em 1952, Briggs e King demonstraram que núcleos da célula da blás- tula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferi- dos para o citoplasma do oócito. O que acontece quando núcleos de estágios mais avançados são transferidos para oócitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) estão delineados na Figura 2.6. Enquanto a maioria dos núcleos da blástula podiam produzir girinos completos, houve um dramático decréscimo da capacidade dos núcleos deri- vados de estágios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto até o estágio de Figura 2.5Figura 2.5Figura 2.5Figura 2.5Figura 2.5 Procedimento para o transplante de núcleos da blástula para ovos ativados enucleados de Rana pipiens.Asdimensõesrelativasdofusomeiótico foram exageradas para demonstrar a técnica.A bela R. pipiens na fotografia foi derivada dessa maneira.(SegundoKing,1966;fotografiacorte- sia de M. DiBerardino e N. Hoffner.)
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 43 Estágio desenvolvimental dos embriões e girinos dos quais foram retirados os núcleos Porcentagemdeembriõesdetransplantes nuclearesquesedesenvolvemnormalmente Horas a 18o C Blástula tardia G ástrula precoce G ástrula tardia N êurula G irinos com broto caudal G irinos com batim ento cardíaco Girinos (Rana pipiens) nadando normalmente girino. Quando núcleos de células somáticas de girinos no estágio de broto caudal foram usados como doadores, não ocorreu desenvolvimento normal. Porém, núcle- os de células germinativas de girinos do estágio de broto caudal (que irão finalmen- te dar origem a um organismo completo após a fertilização), foram capazes de direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blástulas que se desen- volveram (Smith, 1956).Assim, células somáticas parecem perder sua capacidade de direcionar desenvolvimento completo à medida que se tornam definidas e diferenci- adas, e a progressiva restrição da potência nuclear durante o desenvolvimento parece ser uma regra geral. Porém, é possível que alguns núcleos celulares diferen- ciados sejam diferentes de outros. Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células SomáticasClonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células SomáticasClonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células SomáticasClonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células SomáticasClonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas John Gurdon e seus colegas, usando métodos ligeiramente diferentes de transplante nuclear na rã Xenopus, obtiveram resultados sugerindo que os núcleos de algumas células diferenciadas podem permanecer totipotentes. Gurdon também achou uma progressiva perda de potência no decorrer do desenvolvimento, embora células de Xenopus tenham retido suas potências por um período de desenvolvimento mais longo (Prancha 1).As exceções a essa regra mostraram ser muito interessantes. Gurdon havia transferido núcleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimen- tavam, para ovos ativados enucleados. Esses núcleos doadores continham um marcador genético (um nucléolo por célula, em lugar dos dois usuais), que os distin- guia dos núcleos do hospedeiro. Entre 276 núcleos transferidos, somente 10 (1.4 porcento) promoveram o desenvolvimento até o estágio do girino que se alimentava. Transplantes seriados (que requeriam colocar um núcleo intestinal em um ovo e quan- do o ovo tinha se transformado em blástula, transferia-se o núcleo da blástula para vários outros ovos), aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon, 1962). Em alguns casos, núcleos das células intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas linhagens de células – neurônios, células do sangue, nervos e assim por diante – de um girino vivente. Além disso, sete desses girinos (de dois núcleos originais) se metamorfosearam em rãs adultas férteis (Gurdon e Uehlinger, 1966); esses núcleos eram totipotentes (Figura 2.7). King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) não havi- am sido tomadas suficientes precauções para ter certeza que células germinativas primordiais, que podem migrar até o intestino, não foram usadas como fontes de núcleos, e (2) as células intestinais de um girino tão jovem poderiam não se qualificarem Figura 2.6Figura 2.6Figura 2.6Figura 2.6Figura 2.6 Gráfico de transplantes nucleares bem sucedidos, em fun- ção da idade do desenvolvimento nuclear.Aabscissa repre- senta o estágio no qual o núcleo doador (de R. pipiens) foi isolado e inserido no oócito ativado e enucleado.Aordena- da mostra a porcentagem desses transplantes capazes de produzir blástulas que podiam em seguida direcionar o de- senvolvimento para o estágio do girino nadador (Segundo McKinnell, 1978.)
  • 44 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento EXPERIMENTO Ovo não-fertilizado (cepa 2 – nu) Girino (cepa 1 – nu) Irradiação UV destrói comossomos do ovo Núcleo intestinal epitelial é inserido no ovo irradiado Micropipeta Ovo receptor irradiado Núcleo intestinal RESULTADOS Blástula Blástula Blástula Sem divisão Girino Girino (morre) Embrião anormal Rã adulta (Cepa 1 – nu) como um tipo de célula verdadeiramente diferenciada porque células de girinos que se alimentam ainda contêm plaquetas de gema (DiBerardino e King, 1967; McKinnell, 1978; Briggs, 1979). Para responder a essas críticas, Gurdon e seus colegas cultivaram células epiteliais da membrana natatória de rãs adultas. Essas células mostraram estar diferenciadas; cada uma continha queratina, a proteína característica de células adul- tas da pele. Quando núcleos dessas células foram transferidos para oócitos ativados e enucleados de Xenopus, nenhum dos transferidos de primeira geração progrediu além da formação do tubo neural, pouco após a gastrulação. Por transplantes seria- dos, porém, numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al., 1975). Embora esses girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar, um único núcleo celular diferenciado ainda retinha potências incríveis. Um único núcleo derivado de uma hemácia de uma rã adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de 100 divisões após ser transplantado para um oócito ativado e, ainda, reter a habilidade Figura 2.7Figura 2.7Figura 2.7Figura 2.7Figura 2.7 Procedimento empregado para obter rãs ma- duras de núcleos intestinais de girinos de Xe- nopus. O ovo de tipo selvagem (2 nucléolos por núcleo; 2-nu) é irradiado para destruir os cromossomos maternos, e um núcleo intesti- nal de um girino marcado (1-nu) é inserido. Em alguns casos não ocorre divisão; em alguns ca- sos o desenvolvimento do embrião é sustado; porém, em outros casos, uma rã inteiramente nova é formada tendo um genótipo 1-nu. (Se- gundo Gurdon, 1968, 1977.)
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 45 de gerar girinos natatórios (Orr et al., 1986; DiBerardino, 1989). Embora DiBerardino (1987) tenha observado que “até o presente, núcleo algum de uma célula documentadamente especializada, nem de uma célula adulta tenha mostrado ser totipotente”, tal núcleo pode no entanto instruir a formação de todos os órgãos do girino natatório. Algumas das diferenças entre os resultados dos laboratórios de Briggs e de Gurdon, podem envolver diferenças na fisiologia do desenvolvimento das rãs Rana e Xenopus. Quando se transfere um núcleo de uma célula diferenciada para o citoplasma do oócito, se está pedindo ao núcleo para reverter para condições fisiológicas às quais ele não está acostumado. Os núcleos da clivagem das rãs dividem-se rapidamente, enquanto alguns núcleos de células diferenciadas dividem-se raramente, se tanto. Falhas em replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossômicas: tais anormalidades foram vistas em muitas células de girinos clonados. Sally Hennen (1970) mostrou que o sucesso desenvolvimental de núcleos doadores pode ser ampliado tratando-se esses núcleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao núcleo de se adaptar ao citoplasma do ovo. Acredita-se que a espermina remova histonas da cromatina podendo “re-acertar” a atividade dos núcleos. Quando núcleos do endoderma de girinos de Rana pipiens, no estágio de broto caudal, foram tratados dessa maneira, 62 porcento daqueles núcleos que iniciaram desenvolvimento normal, prosseguiram até a geração de girinos normais. Em animais controle, nenhum dos núcleos conse- guiu gerar tais girinos. Assim, os genes para o desenvolvimento do girino completo não pareceram ter sido perdidos pelas células do endoderma. Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfíbios de duas manei- ras. Primeiro, reconhecer uma restrição geral de potência concomitante ao desenvolvi- mento. Segundo, facilmente ver que o genoma da célula diferenciada é notavelmente potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfíbio. Em outras palavras, mesmo existindo um debate sobre a totipotência de tais núcleos, existe pouca dúvida de que eles são extremamente pluripotentes. Certamente, muitos genes não usados na pele ou em células sangüíneas, podem ser reativados para produzir os nervos, o estômago, ou o coração de um girino natatório. Assim, cada núcleo no corpo contém a maioria (se não todos) dos mesmos genes. Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro dessem ser geradas de núcleos diferencia- dos, essa habilidade não poderia ser extrapolada para células humanas. Além das dificuldades éticas e técnicas do tra- balho com o organismo humano, o cito- plasma do oócito humano pode não res- ponder a sinais emitidos por um núcleo de uma célula em estágio avançado. Trans- plante nuclear foi conseguido em camun- dongos, pela remoção de pronúcleos (haplóides) de espermatozóide e óvulo de um zigoto, e substituição por pronúcleos de outro (Figura 2.8; McGrath e Solter, 1983). Esses zigotos reconstruídos come- çam a se dividir e são então implantados no útero. Os camundongos resultantes exi- bem o fenótipo do núcleo doador. Enquan- to mais de 90 porcento dos zigotos enucle- ados do camundongo, recebendo pronú- cleos de outros zigotos, se desenvolvem até o blastócito (blástula), nem um único embrião (de 81), desenvolveu-se até esse estágio quando núcleos de embriões de 4 células foram transferidos para zigotos enucleados (McGrath e Solter, 1984). Simi- larmente, núcleos de embriões de 8 células CLONAR SERES HUMANOS a partir de células previamente di- ferenciadas parece ser o objeti- vo de editores de jornais e novelistas. Deve ter ficado óbvio da discussão pre- cedente que clonar um indivíduo total- mente desenvolvido, a partir de células diferenciadas, é uma formidável tarefa. Mesmo em anfíbios, os núcleos das célu- las diferenciadas não foram capazes de gerar animais adultos quando colocados em células ativadas e enucleadas. Além disso, mesmo se rãs adultas pu- Informações adicionais Especulações &
  • 46 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Planta de cenoura madura no agar Células livre do calo continuam a se desenvolver em suspensão Floema de raiz Planta de cenoura madura Corte transversal da raiz Proliferação de massa celular (calo) em meio de cultura de leite de coco Planta embrionária transferida para meio de cultura de agar Planta jovem (A) (B) (C) (D) e massa celular interna (os blastômeros que formam o embrião, mas não a placenta*) também não puderam apoiar o desenvolvi- mento. Em contraste com núcleos de ouri- ços-do-mar ou anfíbios, os núcleos dos blastômeros precoces do camundongo (cujas células são totipotentes) não dão suporte para o desenvolvimento total. Tais experimentos provavelmente fracassam porque núcleos de blastômeros não funci- onam de maneira normal no citoplasma zigótico. Por isso, a clonagem de Elvis Presley a partir de células diferenciadas não é algo com que possamos contar. Nem todos blastômeros mamíferos são os mesmos, todavia, as espécies mamíferas diferem muito em termos de tem- po de ativação e implantação uterina. Usan- do modificações técnicas, Willadsen (1986) produziu carneiros de termo completo a partir de núcleos transplantados de blas- tômeros do estágio de 8 células; núcleos de embriões pré-implantados de gado, por- cos e coelhos foram capazes de direcionar o desenvolvimento completo quando transplantados para oócitos ativados e enucleados (Prather et al., 1987; Stice e Robl, 1988; Prather et al., 1989; Willadsen, 1989). Porém, em todos esses casos, os nú- cleos vieram de embriões pré-implantados. Recentemente, Wilmut e colaboradores (1997) mostraram que é possível clonar um carneiro a partir de um núcleo de célula de glândula mamária adulta. Esse resultado poderá ter importantes conseqüências agrí- colas e legais (Prather, 1991). [gene4.html] Clonagem de PlantasClonagem de PlantasClonagem de PlantasClonagem de PlantasClonagem de Plantas Somente nas plantas os núcleos de célu- las diferenciadas de organismos adultos podem ser facilmente vistos como capa- zes de direcionar o desenvolvimento de outro organismo adulto. Essa habilidade foi dramaticamente demonstrada em célu- las de cenouras ou tabaco. Em 1958, F. C. Steward e seus colegas estabeleceram um processo pelo qual os tecidos diferencia- dos de raízes de cenouras podiam dar ori- gem a toda uma nova planta (Figura 2.9). Pequenos pedaços de floema são isola- dos da cenoura e rodados em grandes frascos contendo leite de coco. Esse flui- do (é realmente o endosperma da semen- te do coco) contém os fatores e nutrien- tes necessários para o crescimento da planta e os hormônios exigidos para a diferenciação. Sob essas condições, os tecidos proliferam e formam uma massa Figura 2.8Figura 2.8Figura 2.8Figura 2.8Figura 2.8 Procedimento para transferir núcleos para o ovo ativado enucleado de mamifero. Um embrião de célula única, incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesquele- to, é seguro com uma pipeta de sucção. Os núcleos haplóides derivados do espermatozóide e do óvulo, não se juntaram ainda. A pipeta de enucleação perfura a zona pelúcida (a proteína que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a área da célula contendo os pronúcleos. (A) A pipeta de enucleação é retirada e o citoplasma contendo os pronúcleos é removido do ovo.Amembrana celular não está rompida; a continuidade do citoplasma limita- do pela membrana está indicada pela flexa. (B) A membrana celular forma uma vesícula ao redor dos pronúcleos no interior da pipeta de enucleação. (C) Essa vesícula é misturada com vírus Sendai (que induz a fusão de membranas nucleares) e é inserida no espaço entre a zona pelúcida e o outro ovo enucleado. (D) O vírus Sendai proporciona a fusão do ovo enucleado e os pronúcleos envoltos pela membrana, permitindo que os pronúcleos (flexa) penetrem na célula. (Segundo McGrath e Solter, 1983; cortesia dos autores.) *Cada blastômero da massa celular interna é totipotente no sentido de reter sua capacida- de de formar células de qualquer tipo no orga- nismo. Essa capacidade permite o aparecimen- to de gêmeos. Figura 2.9Figura 2.9Figura 2.9Figura 2.9Figura 2.9 Experimento de Steward demonstrando a totipotência de células do floema da cenoura.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 47 desorganizada chamada calo. A continu- ação da rotação leva ao desbastamento de células individuais do calo para o meio de suspensão. Essas células dão origem a nódulos celulares semelhantes a raízes que continuam a crescer enquanto per- manecem em suspensão. A partir desses nódulos, colocados em um meio solidifi- cado com agar, o resto da planta é capaz de se desenvolver, formando uma planta de cenoura completa e fértil (Steward et al., 1964; Steward, 1970). Porém, plantas e animais se desen- volvem de maneira diferente; a propa- gação vegetativa de plantas por corte (i.e, porções de plantas que quando nu- tridas, regeneram as partes faltantes) é uma prática agrícola comum. Além dis- so, em contraste com anfíbios e mamífe- ros (nos quais as células germinativas são destacadas como uma linhagem dis- tinta de células no início do desenvol- vimento), as plantas normalmente deri- vam seus gametas de células somáticas. Portanto, não é tão surpreendente que uma única célula de uma planta possa se diferenciar em outros tipos de célu- las e formar um clone geneticamente idêntico (clone, do grego klon, signifi- cando “ramo”). Sobre E. coli e elefantes: O modelo operon Na maioria dos casos estudados, o genoma é o mesmo de célula para célula no orga- nismo. Os genes para a proteína globina podem ser encontrados em células da pele, e os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurônios cerebrais. Porém, isso ainda deixa sem resposta outra grande questão levantada pelos embriologistas: Se o núcleo de cada célula no organismo tem os mesmos genes, como podem esses genes fazer com que essas células se tornem diferentes? *Pouco tempo após a 2a Guerra Mundial, muitos biologistas concordaram que: a maior lacuna, ainda para ser preenchida, entre dois campos da pesquisa em biologia é provavelmente aquela entre a genética e a embriologia. É o problema repetidas vezes declarado, porém, até agora não resolvido, de como células com genomas idênticos podem se tornar diferenciadas, adquirir a propriedade de confeccionar moléculas com novos, ou no mínimo, diferentes padrões ou confi- gurações específicos. Curiosamente, essa citação vem de Jacques Monod (1947), um geneticista microbiano trabalhando na síntese de enzimas adaptativas, que são proteínas que embora não sejam usualmente sintetizadas por bactérias ou levedos, serão sinte- tizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. Por exemplo, a bactéria Escherichia coli só sintetiza β-galactosidase e outras enzimas digestoras de lactose, quando encontram a lactose. Se a lactose está ausente do citoplasma, essas enzimas não são sintetizadas. Mas, com a introdução de lactose no citoplasma, esse grupo de novas enzimas aparecem. Em micróbios, ao menos, o mesmo genoma pode produzir dois estados citoplasmáticos funcionalmente diferentes, depen- dendo da presença ou não de determinado composto (no caso, a lactose). Monod lançou a hipótese que o fenômeno da adaptação enzimática podia oferecer a solu- ção para o problema de como genomas idênticos podem sintetizar diferentes mo- léculas “específicas”. *A grande exceção a essa regra da constância dos genes – os genes das imunoglobulinas – é discutida no Capítulo 10. Cada célula tem todas as subunidades gênicas das imunoglobulinas, mas em linfócitos, algumas dessas subunidades estão rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. O terceiro desafio - a explicação de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento – foi prontamente compreendida, uma vez que a explicação geral para a expressão diferencial da expres- são gênica foi estabelecida. Conforme veremos, o modelo do operon demonstrou como uma substância do ambiente podia efetuar a expresão gênica diferenciada.
  • 48 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Monod não foi o único cientista a achar que micróbios unicelulares poderiam explicar a diferenciação multicelular. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou que a embriologia estava sendo prejudicada por sua própria terminologia. O problema da diferenciação não podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos teci- dos, mas passar a ser considerado uma propriedade bioquímica de células individuais. A diferenciação deveria ser vista não em termos anatômicos, mas como “produção controlada de padrões enzimáticos únicos”. Essa redefinição focaliza a atenção para a relação entre os genes do núcleo e as propriedades do citoplasma. Além disso, a síntese de uma enzima adaptativa em presença do seu substrato deveria ser discutida como uma “indução”. Esse é o termo técnico usado em embriologia para descrever a habilidade de uma célula produzir uma substância capaz de influenciar a diferenciação de outra. O agente molecular responsável deveria ser chamado “o indutor”. Spiegelman via uma semelhança fundamental entre a indução de novos tipos celulares no embrião e a indução de novas enzimas em microorganismos. [gene5.html] No fim da década de 1950, um grupo de pesquisadores acreditava que micróbios eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciação embrionária. Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a concei- tos embriológicos. Julgavam ser válida a extrapolação, e apelaram para a unidade da natureza e, em última análise, as regras simples que esperavam encontrar. Como suge- rido por Monod (veja Judson, 1979), se alguém entender a bactéria, entenderá o ele- fante. Muitos embriologistas, porém, permaneceram cépticos a respeito da extrapolação de bactérias a embriões, enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversi- dade da performance embriológica. Em 1961, Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a indução da β-galactosidase levando à construção do modelo do operon. Esse modelo postula que a pequena molécula do indutor causava a transcrição de diferentes genes em E. coli (Figura 2.10). Em sistemas indutivos, uma proteína repressora codificada por genes liga-se ao sítio operador adjacente aos genes estruturais, impedindo a ligação da RNA polimerase ao sítio promotor que inciaria a transcrição. Estando presente, o indutor liga-se à proteína repressora alterando sua conformação de forma a impedir a ligação ao operador. Com isso, o gene torna-se capaz de transcrever mRNA, que pode ser traduzido formando proteína. Dessa maneira, o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas, depen- dendo da presença ou não do respectivo indutor. Em um importante trabalho de 1961, Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-símile pode ser parte da regulação gênica universal. Eles conectaram seus resultados ao “problema fundamental da embriologia química que é a compreensão do porquê células dos tecidos não expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma”. O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por cientistas que procuravam a síntese da genética com a embriologia. O livro de Waddington (1962), Novos Padrões na Genética e no Desenvolvimento, começa com um capítulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da expressão gênica no desenvovimento dos anfíbios. Waddington aprovou especial- mente esse modelo porque significava que os genes não são apenas ativos, mas reativos, respondendo às mudanças no citoplasma. Waddington considerou genes e citoplasma como mutuamente interativos. Essa perspectiva foi também salientada em Hereditariedade e Desenvolvimento (1963), síntese de embriologia com genética por John Moore, que conclui: Na geração anterior, poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto que a síntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possível por estu- dos com a bactéria Escherichia coli. No entanto, essa criatura microscópica, sem embrião próprio, mostrou um caminho. Na próxima década, poderá ser difícil perceber a diferença entre um geneticista e um embriologista, à medida que eles avançam em sua ciência para além daquilo que cada um poderia ter conseguido isoladamente.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 49 O gene i do tipo selvagem pode produzir repressor para ambos cromossomos que se ligam a o na ausência de lactose (A) O operon lac Gene indutor Promotor Operador Genes estruturais para utilização da lactose (B) Quando não há lactose disponível Genes estruturais Proteína repressora produzidas por i liga-se a o Não há transcrição de genes estruturais (C ) Quando a lactose está disponível Genes estruturais Lactose mRNA RNA polimerase β-galactosidase mRNA é transcrito Lactose combinando com o repressor, previne ligação a o (D) O repressor da lactose é solúvel Genes estruturais Genes estruturais Síntese diferencial de RNA A desejada unificação não ocorreu tão rapidamente como esperado por Moore. Po- rém, baseado na evidência embriológica a favor da equivalência genômica e do mode- lo do operon de E. coli, emergiu na década de 1960 um consenso de que as células regulam seu desenvolvimento através da expressão gênica diferencial. Como bactéri- as eram os modelos para tal atividade, expressão em geral significava transcrição de mRNA. Os três postulados da expressão gênica diferencial eram os seguintes: Figura 2.10Figura 2.10Figura 2.10Figura 2.10Figura 2.10 Regulação diferencial de genes em E. coli. (A-C) No estado induzível de tipo-selvagem, não há transcrição de RNA de β-galactosidase a não ser que a lactose esteja presente. (B) Quando a lactose não está disponível, uma proteína repressora produzida pelo gene i liga-se ao sítio repressor (o), inibindo a transcrição pela RNA polimerase do promotor (p). (C) Quando o indutor lactose está presente, combina com a proteína repres- sora, alterando sua forma, o que faz com que a proteína não possa mais se ligar ao DNAoperador , fazendo começar a transcrição. (D)Asolubi- lidade dessa proteína é demonstrada em estudos com o mutante de E. coli. Quando células bacterianas haplóides com um gene indutor não- funcional (i-) são tornadas parcialmente diplóides com o gene tipo- selvagem (i+), forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutível o gene original da β-galactosidase.
  • 50 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1. Cada núcleo celular contém o genoma completo estabelecido no ovo fertiliza- do. Em termos moleculares, os DNAs de todas as células diferenciadas são idênticos. 2. Os genes não-usados das células diferenciadas não são destruídos ou mutados, retendo o potencial de serem expressos. 3. Só uma pequena porcentagem do genoma está sendo expressa em cada célula, e uma porção do RNA sintetizado é específica para aquele tipo de célula. Os dois primeiros postulados já foram discutidos. O terceiro – que só uma pequena parte do genoma está ativo produzindo produtos específicos dos tecidos – foi primei- ro testado em larvas de insetos. Após a eclosão, uma larva de inseto tem duas popu- lações celulares diferentes, formadas por cerca de 10.000 células. A maior parte tem cromossomos politênicos. Tais cromossomos sofrem replicação de DNAna ausência de mitose, contendo portanto 512 (29 ), 1024 (210 ), ou mesmo mais hélices duplas para- lelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2.11; Prancha 31). Essas células não sofrem mitose, e crescem expandindo seu volume até 150 vezes. Durante a metamorfo- se, tais células morrem sendo substituídas por células diplóides não politênicas agru- padas em certas regiões da larva (veja Capítulo 19). Beermann (1952) mostrou que o padrão de distribuição das bandas de cromossomos politênicos era idêntico ao longo da larva e que não se notavam perdas ou adições de qualquer região cromossômica quando diferentes tipos de células eram comparados (Figura 2.12). Porém, Beermann estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila, acharam regiões cromossômicas que estavam “estufadas”. Esses tufos apareciam em lugares diferentes nos cromossomos em cada tecido; seu aparecimento mudava com o de- senvolvimento dessas células (Figura 2.13). Ainda mais, alguns tufos podiam ser Figura 2.11Figura 2.11Figura 2.11Figura 2.11Figura 2.11 Cromossomos politênicos. (A) Cromossomos politênicos de células da glândula salivar de Drosophila melanogaster. Os quatro cromossomos estão conectados em seus centrômeros, formando um denso cromocentro. Os genes estruturais para a álcool desidrogenase (ADH), aldeído oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posições designa- das nesses cromossomos. (B) Fotografia ao microscópio eletrônico de uma pequena região de um cromossomo politênico de Drosophila. As bandas escuras estão altamente condensadas comparadas com as regiões interbandas. (A de Ursprung et al., 1968, cortesia de H. Ursprung; B de Burkholder, 1976, cortesia de G. D. Burkholder.) Aldox
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 51 estimulados ou inibidos por certas mudanças fisiológicas causadas pelo calor ou por hormônios (Clever, 1966;Ashburner, 1972;Ashburner e Berondes, 1978). Beermann (1961) apresentou evidências que esses tufos representam um afrouxa- mento localizado de cromossomos politênicos (Figura 2.14) e que são sítios de síntese ativa de RNA. Duas espécies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encon- tradas: uma produzindo grande quantidade de proteína salivar e a outra não (Figura 2.15). Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda; esse tufo não existia nos não-produtores. O cruzamento de produtor com não-produ- tor resultou em larvas produzindo quantias intermediárias de proteína salivar. Cruzan- do duas moscas híbridas, a capacidade de produzir proteína salivar segregou-se de forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermediários:1 não-produtor.Altos produtores tinham dois tufos (um em cada cromossomo homólogo), produtores intermediários tinham apenas um, e não-produtores nenhum tufo. Beermann concluiu que a informa- ção genética necessária para a síntese dessa proteína salivar está presente nessa banda distal do cromossomo e que sua produção dependia de transformação em uma região estufada. Intestino Figura 2.12Figura 2.12Figura 2.12Figura 2.12Figura 2.12 Identidade genômica em cromossomos politênicos. (A) Uma região do conjunto cromossômico da mosca Chiromonus tentans. Notar a constân- cia do número de bandas nos diferentes tecidos. (B) Hibridização do RNA de uma proteína da gema com um cromossomo da glândula salivar larval de Drosophila. Os grãos escuros (flexa) mostram onde a mensagem da proteína radioativa da gema se ligou aos cromossomos. Notar que o gene para a proteína está presente no cromossomo da glândula salivar, apesar da proteína não ser aí sintetizada. (A) Segundo Beermann, 1952; (B) De Barnett et al., 1980; fotografia cortesia de P. C. Wensink. (A) (B) Glândula salivar Túbulos de Malpighi Tecido retal
  • 52 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (C)(B) (D) (E) (A) (B) Prova adicional de que tufos cromossômicos produzem mRNA vem de estudos sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. O BR2 pode ser isolado por microdissecção devido seu tamanho excepcional, e seus produtos po- dem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt, 1975). AFigura 2.16A, B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. tentans. Transcrição de BR2 foi demonstrada incubando glândulas salivares isoladas com precursores de RNA Figura 2.13Figura 2.13Figura 2.13Figura 2.13Figura 2.13 Seqüência de estufamentos de uma porção do cro- mossomo 3 da glândula salivar de Drosophila mela- nogaster. (A,B) larva de 110 horas; (C) larva de 115 horas; (D,E) estágio pré-pupa (após 4 horas). Notar o estufamento e a regressão das bandas 74EF e 75B. Outras bandas (71DE, 78D) estufam mais tarde, po- rém, a maioria não estufa de modo algum durante o período. (Cortesia de M. Ashburner.) Figura 2.14Figura 2.14Figura 2.14Figura 2.14Figura 2.14 Terminação proximal do cromossomo 4 da glândula sali- var de Chiromonus pallidivitatus, mostrando o enorme tufo BR2. (A) Fotomicrografia em contraste de fase, de preparações coradas, mostrando o extenso tufo no cro- mossomo politênico. (B) Diagrama da região passando por estufamento. (A de Grossbach, 1973, cortesia de U. Grossbach; B segundo Beermann, 1963)
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 53 BR4(SZ) (A) (C)(B) BR2 BR1 BR3 Alto produtor Não-produtor Todos produtos intermediários Produtores Intermediários Alto produtor Não-produtor radioativos. O RNA radioativo pôde, em seguida, ser extraído da porção BR2 do cromossomo dissecado (Lambert, 1972). Esse RNA era excepcionalmente grande – cerca de 50.000 bases. O grande segmento de RNA radioativo, especificamente hibridizado para a região BR2 do cromossomo, mostrou que o DNA estufado (Puff de DNA) - e nenhum outro local - tinha-o transcrito ativamente (Figura 2.16C). Esse mesmo RNA pôde ser isolado de polissomos sintetizadores de proteínas, indicando que é ativo na síntese protéica (Wieslander e Daneholt, 1977). Assim, um RNA transcrito de uma banda específica de DNA, que estufa na glândula salivar larval, pode posteriormente ser visto produzindo proteínas em ribossomos citoplasmáticos. Figura 2.15Figura 2.15Figura 2.15Figura 2.15Figura 2.15 Correlaçãodepadrõesdeestufamentocomfun- ções especializadas nas células das glândulas salivares de Chironomus pallidivitatus. (A) Cromossomo de uma célula produzindo uma secreção granular e mostrando um anel de Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (B) Cromosso- mo 4 de uma célula salivar, mostrando somen- te anéis de Balbiani 1, 2 e 3 (BR1, BR2, BR3). (C) Evidência genética que a síntese de uma importante proteína salivar depende da for- mação de tufos BR4(SZ). Larvas com altos níveis de secreções granulares têm células sali- vares glandulares com tufos BR4(SZ) em am- bos cromossomos 4 (coloridos), enquanto lar- vas sem essas secreções não têm tais tufos. Produtores intermediários têm somente um cromossomo 4 com uma região estufada BR4(SZ) em cada célula salivar realizando a secreção. (A e B segundo Beermann, 1961, cor- tesia de W. Beermann.) (A) (C) (B) BR 2 Figura 2.16Figura 2.16Figura 2.16Figura 2.16Figura 2.16 (A,B) Isolamento da região BR2 de Chirono- mus tentans por micromanipulação. O cromos- somo intacto 4 pode ser dividido em três regi- ões, uma contendo BR2. (C) Transcrição da região BR2 mostrado por uma auto-radiogra- fia in situ após hibridização do BR2 RNA com a preparação cromossômica. (A e B de Lambert e Daneholt, 1975; C de Lambert, 1972; foto- grafias cortesia de B. Lambert.)
  • 54 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento RNA hibridiza com uma fita de DNA (A) (B) Condições de desnaturação (calor, álcali) Condições de re-anelamento Desnaturar; adicionar RNA (em grande quantidade em comparação com DNA) RNA Portanto, os tufos nos cromossomos salivares estão produzindo mRNA ativamen- te. Em células que sintetizam essa proteína, o gene está ativado; em células que não usam essa proteína, o gene permanece reprimido. Hibridização de ácido nucléico Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politênicos de Chiromonus. E embora esses genes dos tufos eram ativos em células que já se haviam diferenciado (como aquelas da glândula salivar), não eram os genes cau- sadores da diferenciação celular. Para encontrar e analisar os genes que são res- ponsáveis pelo desenvolvimento embrionário, novas técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas. Amaioria das técnicas para análise de genes eucariotos baseia-se na hibridização de ácidos nucléicos. Essa técnica envolve fortalecimento de pedaços de fitas simples de RNA e DNA, para permitir a formação de híbridos de fitas duplas. Por exemplo, se o DNA é cortado em pequenos pedaços e cada pedaço dissociado em duas fitas simples – desnaturado – cada fita na solução deverá achar e reunir-se com seu parcei- ro complementar, quando lhe é dado tempo suficiente para isso. As condições de renaturação devem ser tais que ligação específica entre fitas complementares seja mantida e combinações não específicas sejam dissociadas. Isso é, em geral, consegui- do variando a temperatura ou as condições iônicas da solução em que ocorre a renaturação (Wetmur e Davidson, 1968). De maneira semelhante, RNA sintetizado a partir de uma região particular do DNA poderia ser esperado ligar-se à fita do qual foi transcrito (Figura 2.17). Assim, RNA pode ser esperado hibridizar especificamente com o gene que o codifica. Para medir essa hibridização, uma das fitas de ácido nucléico (a sonda) é em geral marcada pela incorporação de nucleotídeos radioativos. Um problema técnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridização de ácidos nucléicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioati- vidade na molécula de RNA. Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo uma cópia complementar de DNA (cDNA) na presença de precursores radiativos. Isso pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA, uma extensão curta de DNA (chamado de iniciador ou primer), precursores radioativos de DNA e a enzima viral transcriptase reversa. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura 2.18). O DNA é sintetizado in vitro, não sendo necessário preocupar-se com a diluição Figura 2.17Figura 2.17Figura 2.17Figura 2.17Figura 2.17 Hibridização de ácidos nucléicos. (A) Se a hé- lice de DNA for separada em duas fitas, essas devem se re-anelar sob condições adequadas de força iônica e tempo. De maneira semelhan- te, se o DNA for separado em suas duas fitas, o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes que o codificam. Se presente em quantidades suficientemente grandes em comparação com o DNA, o RNA irá substituir uma das fitas de DNA nessa região.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 55 mRNA Anelar iniciador mRNA Transcriptase reversa mRNA cDNA cDNA Álcali dos precursores radiativos. Além disso, o DNA pode hibridizar tanto com o gene que produziu o RNA (embora a outra fita) e com o próprio RNA, tornando-o extremamente útil para a detecção de pequenas quantidades de RNAs específicos.[other.html#gene6] Clonagem de DNA genômico Já em 1904 Theodor Boveri desesperava-se, considerando que as técnicas de sua época nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embri- ões. Havia necessidade de uma técnica especial de amplificação gênica: Porque não é somente o núcleo, nem mesmo cromossomos individuais, mas cer- tas partes de certos cromossomos de certas células que precisam ser isolados e coletados em quantidades enormes para análise; essa seria uma pré-condição para colocar o químico em uma posição a qual lhe permitiria analisar (o mate- rial hereditário) com mais minúcias que o morfologista. Entretanto, desde a década de 1970 a hibridização de ácido nucléico permitiu aos biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar regiões específicas do cromossomo.Atécnica principal para isolar e amplificar genes individuais é chamada clonagem de genes.Aprimeira fase desse processo consiste no corte de DNA nuclear em pedaços distintos, por incubação de DNA com uma endonuclease de restrição (geralmente chamada de enzima de restrição). De modo geral, essas endonucleases são enzimas bacterianas que reconhecem seqüências es- pecíficas do DNA e o clivam nesses sítios (Tabela 2.1; Nathans e Smith, 1975). Por exemplo, quando DNA humano é incubado com a enzima BamHI (de Bacillus amyloliquifaciens, cepa H), o DNA é clivado em cada sítio onde aparece a seqüência GGATCC. Os produtos são fragmentos de DNAde vários tamanhos, todos terminan- do com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2.19). Esses pedaços são freqüentemente chamados de fragmentos de restrição. * Todos os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição têm um centro de simetria. A seqüência de dupla fita lida em uma direção é idêntica à seqüência lida da frente para trás na outra direção. Figura 2.18Figura 2.18Figura 2.18Figura 2.18Figura 2.18 Método para preparar DNA complementar (cDNA). A maioria dos mRNA possui uma longa cadeia de resíduos de adenosina (AAAn) no terminal 3’ da mensagem (a ser discutida no Capítulo 12); por isso, o pesquisador anela um iniciador consistindo de 15 resíduos de de- soxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem. Transcriptase reversa em seguida, transcreve uma fita de DNA complementar, começando no iniciador dT15. O cDNA pode ser separado aumentando o pH da solução, dessa maneira, desnaturando o híbrido de dupla fita e clivan- do o RNA. TTTTTabela 2.1abela 2.1abela 2.1abela 2.1abela 2.1 Enzimas de restrição comumente usadas Sítio Derivação Reconhecimento e clivagem enzimático* EcoRI Escherichia coli G AATT C C T TAA G BamHi Bacillus amyloliquifaciens G GATC C C C TAG G HindIII Haemophilus influenzae A A G C T T T T C G A A SalI Streptomyces albus G TC GAC CAG CT G SmaI Serratia marcescens CCC GGG GGG CCC HhaI Haemophilus haemolyticus GCG C C GCG HaeIII Haemophilus aegyptius GG CC CC GG AluI Arthrobacter luteus A G C T T C GA
  • 56 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento O próximo procedimento na clonagem do gene é incorporar esses fragmentos de restrição em vetores de clonagem. Usualmente esses vetores são moléculas circulares de DNA, replicadas em células bacterianas, independentemente do cromossomo bacteriano. São usados plasmídeos resistentes a drogas ou vírus especialmente modi- ficados (que são muito úteis na clonagem de grandes fragmentos de DNA). Por exem- plo, um vetor pode ser construído contendo apenas um sítio sensível à BamHI. Esse vetor pode ser aberto por incubação com essa enzima de restrição. Após a abertura, ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano, produzidos também por BamHI. Em muitos casos, os pedaços do DNA cortado serão incorporados a esses vetores (porque seus terminais são complementares aos terminais abertos do vetor) e ligados covalentemente, colocando-os em uma solução contendo a enzima DNA ligase. O processo total fornece plasmídeos bacterianos, cada um contendo um único pedaço de DNA humano. Esses são chamados plasmídeos recombinantes ou, geralmente, DNA recombinante (Cohen et al.,1973; Blattner et al., 1978). O plasmídeo ilustrado na Figura 2.19 é pUC18, um vetor freqüentemente usado por biologistas moleculares (Vierra e Messing,1982). Ele contém (1) um gene resistente a drogas, AmpR , que torna a bactéria imune à ampicilina e permite ao pesquisador sele- cionar aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo; (2) uma origem para a replicação de DNA, permitindo ao plasmídeo replicar centenas de vezes em cada bactéria; e (3) um poli-ligante, um pedaço curto de DNA artificial que contém os sítios enzimáticos de restrição para várias dessas endonucleases. O poli-ligante se situa dentro de um gene lacZ que codifica a ß-galactosidase de E. coli. O poli-ligante é suficientemente curto (e tem o número correto de pares de bases) de modo a não interferir com a atividade enzimática da β-galactosidase. O processo de clonagem começa quando os fragmentos de restrição do DNA nuclear são misturados aos plasmídeos abertos pUC18 e a eles são ligados, ocasionando o fechamento do plasmídeo. Os plasmídeos recombinantes putativos assim formados são então incu- bados com células de E. coli sensíveis à ampicilina e sem o gene da β-galactosidase. Mesmo que as bactérias e os plasmídeos sejam misturados em condições que encora- jam as bactérias a incorporar os plasmídeos, nem todas as bactérias incorporam um plasmídeo. Para evidenciar aquelas bactérias que incorporaram plasmídeos, as células tratadas de E. coli são cultivadas em ágar contendo ampicilina. Somente aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo (com seu gene dominante, ampicilina-resis- tente) sobrevivem. Mas nem todos plasmídeos incorporaram um gene estranho, porque é possível que os “terminais adesivos” do sítio da enzima de restrição sofram uma renaturação entre si mesmos. Para distinguir entre colônias bacterianas que incorporaram DNA estranho e aquelas que não o fizeram, o ágar também contém um corante chamado X- gal. Esse composto é incolor, mas quando transformado pela β-galactosidase forma um precipitado azul* .Assim, se um plasmídeo não incorporou um fragmento de restri- ção ao sítio de enzima de restrição no poli-ligante, o gene da β-galactosidase (lacZ) está funcional e a β-galactosidase resultante torna o corante azul. O resultado é o aparecimento de “colônias azuis”. Entretanto, se o plasmídeo incorporou um fragmen- to de DNA, o gene da β-galactosidase é destruído pela inserção. Essas bactérias não vão produzir a cor azul do corante; produzem colônias incolores no ágar. Colônias incolores são então selecionadas quanto a presença de um gene especí- fico. Células de cada uma dessas colônias são colocadas em um finíssimo filtro de nitrocelulose ou nylon. Quando essas células são lisadas, seu DNA adere aos filtros. Em seguida, as fitas de DNA são separadas por aquecimento, e os filtros incubados em uma solução contendo o RNA radioativo (ou sua cópia de cDNA) do gene que se *O corante é 5-bromo-4-cloroindol, e é azul a não ser quando está complexado com uma molécula como galactose. A ß-galactosidase codificada pelo gene do plasmídeo cliva a galactose do corante permitindo que adquira a conformação azul.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 57 Sítio Eco RISítio Hind III Sítio BamHI Poli-ligante Plasmídeo cortado no gene lacZ Quebra endonucleolítica por BamHI Fragmentos de gene humano incubados e ligados em um plasmídeo Plasmídeo recombinante com gene lacZ interrompido DNA humano Quebra endonucleolítica por BamHI “Colônias incolores” Meio contendo ampicilina “Colônias azuis” Aplicação das colônias “incolores” nos círculos do papel de filtro; lisar para expor o DNA mRNA radioativo Papel de filtro incubado com mRNA radioativo do gene a ser clonado Preparação de auto-radiografia para indicar os clones bacterianos com fragmento de DNA que formou um híbrido com o DNA radioativo Mistura com bactérias (lacZ– , sensível à amp.) quer clonar. Em alguns casos, a seqüência do mRNA ou gene não é conhecida, devendo-se então estimar a seqüência a partir da seqüência de aminoácidos da proteína). Se o plasmídeo contém aquele gene, seu DNA deve estar no filtro, e somente aquele DNA deverá ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de cDNA. Portanto, somente aquelas áreas serão radioativas. A radioatividade nessas regiões é determinada por auto-radiografia. Filme sensível a raios-X é colocado sobre o papel tratado. Os elétrons de alta energia, emitidos pelo RNA radioativo, sensibilizam os grãos de prata no filme, tornando-os escuros quando o filme é reve- lado. Finalmente, uma mancha escura é produzida sobre cada colônia contendo o plasmídeo recombinante que carrega o gene específico (veja Figura 2.19). Essa colô- nia é então isolada e cultivada, produzindo bilhões de bactérias, cada uma contendo centenas de plasmídeos recombinantes idênticos. Os plasmídeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. coli por centrifugação, e incubando o DNA do plasmídeo com BamHI libera-se o fragmento de DNA extranho que contém o gene. Esse fragmento pode ser separado do DNA plasmídico, permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqüências de DNA purificado contendo o gene específico. Apesar desse procedimento parecer muito lógico e fácil, freqüentemente o número de colônias a serem selecionadas é astronômi- co. O número de fragmentos aleatórios que devem ser clonados para a obtenção do gene desejado, aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*. Para detectar um gene específico de um genoma de mamífero, milhões de clones indi- viduais devem ser selecionados. Figura 2.19Figura 2.19Figura 2.19Figura 2.19Figura 2.19 Um protocolo geral para clonar DNA, usando como exemplo a inserção de uma se- qüência de DNA humano em um plasmídeo com um sítio sensível à BamHI. *Complexidade se refere ao número de diferentes tipos de genes no núcleo. Apesar que milhões de clones precisam ser selecionados, aproximadamente 100.000 colônias podem, agora, ser selecionadas em uma única placa. Outra maneira comum de selecionar os clones é usar um plasmídeo que tem seu sítio da enzima de restrição próximo a um vigoroso promotor bacteriano (tal como aquele para ß-galactosidase). As bactérias transcreverão o cDNA e o traduzirão em proteína. Após a lise das colônias bacterianas no papel de filtro, as proteínas aderem ao papel e podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra àquela proteína. Isso é chamado clonagem de expressão, e os plasmídeos referidos como vetores de expressão.
  • 58 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Digestão com restrição e eletroforese em gel de agarose Desnaturar fragmentos de DNA à fitas simples em álcali Espaçadores Suporte Filtro de nitrocelulose ou nylon Colocar filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon sobre gel: colocar papel-toalha e peso Colocar gel no papel de filtro úmido entre 2 espaçadores Gel Contatos de papel de filtro Papel-toalha Peso Cuba com solução tampão Hibridização de DNA: entre e intra espécies Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotídeos radioativos. Portanto, os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs radioativos derivados do mRNA de outras espécies. Uma das descobertas mais exci- tantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para processos específicos de desenvolvimento em um organismo, podem ser usados para processos similares em outro organismo. Drosophila teve uma importância crítica na descoberta desses genes. Iniciando com Morgan, esses genes foram mapeados e, nos anos 60, E. B. Lewis confirmou que alguns desses genes são responsáveis pela forma- ção de partes básicas do corpo (veja Capítulo 14). Um deles, Antennapedia, é um gene cujo produto protéico é essencial para inibir a formação de estruturas da cabeça no tórax. Se o gene não está presente, antenas crescem onde deveriam estar as pernas. Se o gene é expresso na cabeça (como sucede em um mutante específico), a mosca desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura 14.28). Poderia tal gene existir em vertebrados? Evidências desses genes em vertebrados apareceram em transferências de DNA, algumas vezes chamadas de transferências Southern devido a seu inventor, E. M. Southern (1975). DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados, foram tratados com uma enzima de restrição, e os fragmentos de DNA resultantes foram separados em uma eletroforese em gel.As misturas de fragmentos foram colocadas em fendas em um dos lados do gel, que foi em seguida submetido à uma corrente elétrica. Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direção ao pólo posi- tivo, os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. * Como a hibridização não pode ser feita dentro do gel; o DNA deve ser colocado em uma superfície plana, e isso é feito por transferência.Após a desnaturação das fitas de DNA em álcali, os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o colocaram sobre um papel de filtro úmido suportado por uma estrutura de plástico (Figura 2.20; Mc Ginnis et al., 1984; Holland e Hogan, 1986). Papel de nitrocelulose (capaz de ligar DNA de fita única) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com múltiplas camadas de papel-toalha secas. O papel de filtro abaixo do gel estava em comunicação com o interior de uma cuba contendo tampão de alta força iônica. O tampão caminhou para cima através do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas de papel. O DNA também foi levado por esse fluxo de tampão, mas foi detido pelo filtro de nitrocelulose; assim, o DNAfoi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. Após fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles *Considerando a mesma relação carga/massa, fragmentos menores adquirem uma maior veloci- dade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. Isso é uma função da equação de energia cinética, E=1/2 mv2 . Resolvendo para velocidade, encontramos que ela é inversamente proporcional à raiz quadrada da massa. Figura 2.20Figura 2.20Figura 2.20Figura 2.20Figura 2.20 Transferência Southern. DNA é tratado com enzimas de restrição e os fragmentos resul- tantes são colocados em um gel e separados por eletroforese. Após a separação, o DNA é desnaturado em fitas únicas. O gel é, em se- guida, colocado sobre um papel de filtro saturado com tampão de alta força iônica. Pa- pel de nitrocelulose ou um filtro de nylon é colocado sobre o gel e o conjunto coberto com toalhas de papel. O tampão de transfe- rência atravessa o gel, o papel de nitrocelulo- se e as toalhas por ação capilar, levando jun- to o DNA. O DNA de fita única é retido pelo papel de nitrocelulose. As posições do DNA no papel diretamente refletem a posição dos fragmentos de DNA no gel.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 59 Drosophila melanogaster Besouro Galinha Camundongo Ubx ftz Antp 10 3 1 10 3 1 10 3 1 10 3 1 se desprenderiam), o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma porção do gene Antennapedia de Drosophila. Um autoradiograma do papel de nitrocelulose mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. Os resultados desses experimentos (Figura 2.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos, huma- nos e pintos) têm genes que hibridizam com essas seqüências. Essa secção radioativa do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genômica de clones de DNA derivados do genoma dessas diferentes espécies. Como veremos no Capítulo 16, pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o Antennapedia; esses genes se mostraram extremamente importantes na formação do eixo do corpo dos vertebrados. Seqüenciamento de DNA Dados de seqüência podem dar informações sobre a estrutura da proteína codifi- cada e podem identificar seqüências regulatórias de DNA que certos genes têm em comum.Asimplicidade da técnica de seqüenciamento “didesoxi” de Sanger (Sanger et al.,1977) tornou-a um procedimento padrão em muitos laboratórios de biologia molecular. No início, usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita única do DNA circular (Figura 2.22). Funde-se (anela-se) então um iniciador (primer) radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA do vetor imediatamente 3' ao gene clonado. (Porque essas seqüências dos vetores são conhecidas, iniciadores oligonucleotídicos podem ser facilmente sintetizados ou adquiridos comercialmente). O iniciador tem uma ponta 3' livre à qual mais nucleotídeos podem ser adicionados. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador junta- mente com todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos em quatro tubos de ensaio. Cada um dos tubos contém a subunidade polimerizante da DNA polime- rase e um diferente didesoxinucleosídeo trifosfato: um tubo contém didesoxi-G, outro didesoxi-A e assim por diante. As estruturas dos desoxinucleotídeos e dos didesoxinucleotídeos estão representadas na Figura 2.23. Enquanto o desoxirribonucleotídeo não tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu açúcar, o didesoxirribonucleotídeo não tem grupos hidroxila em ambos os carbo- nos, 2' e 3'. Assim, mesmo que um didesoxirribonucleotídeo possa ser ligado a uma crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase, ele interrompe o crescimento da cadeia por não ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotídeo. Assim, quando a DNA polimerase está sintetizando DNA do iniciador, o novo DNA será complementar ao gene clonado. No tubo com didesoxi-A, entretanto, sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente, existe a possibilidade de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. Se isso acontecer, a cadeia pára. Similarmente, no tubo com didesoxi-G, a cadeia tem o potencial de parar toda vez que um G é inserido. (O processo foi comparado à uma dança folclórica grega na qual uma pequena porcentagem dos dançarinos em potencial tem um braço em uma tipóia). Figura 2.21Figura 2.21Figura 2.21Figura 2.21Figura 2.21 Transferência Southern do DNA de vários organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster. Não se espera que as seqüências de espécies tão diversas sejam perfeitamente idênticas e por essa razão o rigor da hibridização é diminuído trocando as soluções salinas. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferên- cias ao longo dos filos é chamado “transferências de zoológico”, por razões óbvias).Auto- radiografia mostra que os genes de Drosophila contêm várias porções que são como as do gene Antennapedia em termos de estrutura; também, muitos organismos contêm vários genes que formarão híbridos com esse fragmento gênico radioativo, sugerindo que genes similares a Antennapedia existem nesses organismos. Os números ao lado das transferênci- as indicam os tamanhos das bandas, em quilobases. (de McGinnis et al.,1984, cortesia de W. McGinnis.)
  • 60 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Adenina Desoxiadenosina trifosfato (açúcar desoxirribose) (A) Adenina Adenina Base1 Base2 Didesoxiadenosina trifosfato (açúcar didesoxirribose) (B) Figura 2.22Figura 2.22Figura 2.22Figura 2.22Figura 2.22 O método didesoxi de seqüenciar DNA. A fotografia contém a região da auto-radiografia que mostra essa seqüência (Cortesia de G. Guild). Figura 2.23Figura 2.23Figura 2.23Figura 2.23Figura 2.23 Comparação entre desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos. (A) Estruturas dos dois tipos de nucleotídeos.Adiferença é evidenciada em cores. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou pela incorporação de um didesoxinucleotídeo não tem um grupo hidroxila 3' terminal para continuar a polimerização do DNA. Fita única desnaturada de DNA de plasmídeo recombinante Iniciador Subunidade polimerizante de DNA polimerase I de E. coli + dATP, dGTP, dCTP e dTTP Fragmentos maiores Seqüência da fita do iniciador Seqüência complementar Fragmentos menores
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 61 Em cada tubo estão sendo feitas milhões de cadeias e por essa razão eles conterão uma população de cadeias, algumas interrompidas no primeiro sítio possível, outras no último e algumas em sítios intermediários. O tubo com didesoxi-A, por exemplo, conterá cadeias com diferentes e distintos comprimentos, cada uma terminando com o resíduo A. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes serão separados por eletro- forese. O resultado é uma “escada” de fragmentos onde cada “degrau” é uma seqüên- cia de nucleotídeos de comprimento diferente. Lendo escada acima, obtem-se a se- qüência do DNA complementar àquela do gene clonado. Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA Agora podemos retornar à especificidade da transcrição de mRNA: É possível isolar populações de mRNA que caracterizam certos tipos de células e estão au- sentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs, podemos “clonar” os mRNA de diferentes tipos de células e compará-los. Como mostra a Figura 2.24A, isso é feito tomando os RNAs mensageiros de uma célula ou tecido e converten- do-os em fitas de DNA complementar. Levando esse procedimento um passo à frente (com o auxílio de DNA polimerase e S1 nuclease), podemos transformar essa população de cDNA de fita única em outra contendo pedaços de cDNA com fitas duplas. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmídeos, adicionan- do-lhes “finais” apropriados com DNA ligase. Acoplando um fragmento GATCC/ G aos terminais rombudos desse pedaço de DNA cria-se um corte artificial de restrição BamHI, o que permite a inserção em um vírus ou plasmídeo clivado por essa enzima (Figura 2.24B). Tais coleções de clones derivados de mRNAs são freqüentemente chamadas de bibliotecas.Assim, podemos ter uma biblioteca de fígado de embrião de camundongo de 16 dias, representando todos os genes ativos produzindo proteínas hepáticas embrionárias. Podemos ter também uma biblioteca de oócitos vegetais de Xenopus, representando mensagens presentes somente em uma parte específica daquela célula. Genes clonados dessa maneira são muito importantes porque eles não têm íntrons. Quando adicionados às células bacterianas, esses genes podem ser transcritos e em seguida traduzidos nas proteínas que codificam. Bibliotecas têm sido extremamente úteis no estudo de desenvolvimento como demonstram os esforços de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenças nos RNAs de diferentes partes do embrião, em gastrulação, do ouriço-do-mar. Para encon- trar mRNAs específicos do endoderma em ouriço-do-mar, Wessel e colaboradores prepararam uma biblioteca de cDNA de embriões gastrulantes. O mRNA dessas amos- tras (a maior parte do RNA de células eucarióticas é ribossômico) foi isolado por passagem em esferas com oligo-dT, as quais capturam as caudas de poli(A) das men- sagens (veja legenda da Figura 2.19).Apopulação de mRNAfoi, então, convertida em uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2.24A). Usando polimerase I de E. coli o cDNA de fita única foi transformado em fita dupla. No próximo passo, os cDNAs de fita dupla foram ligados a “finais” de EcoRI que estão disponíveis no comér- cio. Isso os tornou clonáveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrição EcoRI. O DNA foi misturado com os braços de um fago λ geneticamente modificado (veja Figura 2.24B). Esse fago é construído de tal maneira que ao ser cultivado em uma placa de Petri, os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruíram o gene da ß- galactosidase) produzem placas incolores (Figura 2.24C). Dessa forma, foram gerados aproximadamente 4 milhões de fagos recombinantes, cada um contendo um cDNA re- presentando uma molécula de mRNA. O próximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. Quais deles repre- sentariam mRNAs encontrados no endoderma e não em outras camadas celulares? Wessel e seus colegas isolaram populações de mRNAs do mesoderma, ectoderma e endoderma. Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populações de mRNA, usando precursores radioativos. Agora, possuíam três coleções de moléculas
  • 62 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Preparação de cDNA clonável Região codificadora Anela iniciador oligo (dT) Região codificadora Transcriptase reversa Hidrólise alcalina Região codificadora S1 nuclease Região codificadora Adicionar finais Bam HI (B) Inserção de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacteriófago λ) BamHI “Braço esquerdo” “Braço direito” Braços contêm todos os genes necessários para a replicação, mas muito pequeno para o empacotamento cDNA de dupla fita preparado como descrito em (A) cDNA do mRNA, agora clonado em vetores virais DNA de fago λ DNA polimerase I Não é necessário para a replicação do fago Inserir cDNA nos terminais do DNA do fago λ; ligar mRNA mRNA mRNA cDNA cDNA cDNA Fita dupla cDNA de cDNA radioativos, cada uma representando a população de mRNA de uma das três camadas germinativas. Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrião, em gastrulação, do ouriço-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colônias— cada uma contendo milhares de fagos— colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2.24D). O conjunto foi colocado em solução de álcali para a lise dos fagos e obtenção de DNA de fita única. Um desses papéis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a partir do mRNA total do endoderma; o outro papel incubado com sondas radioativas para ambos, mesoderma e ectoderma. Os filtros foram lavados para a remoção de cDNA radioativo não hibridizado, secos e expostos em filmes para raios-X. Se um mRNA estivesse presente no endoderma, mas não no ectoderma ou mesoderma, o DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do endoderma e não deveria encontrar um mRNAem qualquer outro lugar. Como resulta- do, aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma), mas o mesmo clone não deveria ser radioativo quando exposto a mRNA ectodérmico ou mesodérmico; isso foi confirma- do. Um fago recombinante, em particular, ligou somente cDNAradioativo produzido
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 63 (C) Preparação da biblioteca de clones do fago Fago híbrido Adicionar à camada de células de E. coli Infecção de E. coli pelo fago Lise Placa Camada de bactérias E. coli Zona de lise indicando clones do fago (D) Seleção da biblioteca de fagos clonados Transferir alguns fagos para filtros de nitrocelulose Tratar filtros com solução alcalina para lisar os fagos e desnaturar o DNA liberado Filtros de nitrocelulose Incubar com sonda radioativa para endoderma Incubar com sonda radioativa para mesoderma e ectoderma Sonda radioativa DNA de fago de fita única ligado ao filtro Preparação dos autoradiogramas Clone de DNA representando o mRNA encontrado no endoderma mas não no mesoderma ou ectoderma de mRNA do endoderma; portanto, representava um mRNA encontrado no endoderma e não no mesoderma ou ectoderma. O fago contendo esse gene pode agora ser culti- vado em grandes quantidades e caracterizado. Técnicas de localização de RNA Hibridização In Situ O processo de hibridização in situ, desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph Gall (1970), permite ao pesquisador visualizar as posições de ácidos nucléicos espe- cíficos dentro de células e tecidos. Se um clone específico é considerado interessan- te (por exemplo, o clone endoderma-específico que foi mencionado) ele é cultivado em Figura 2.24Figura 2.24Figura 2.24Figura 2.24Figura 2.24 Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA. (A) RNA mensageiro é isolado e feito seu cDNA, que é em segui- da transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos finais de restrição. (B) Os “genes” cDNA são inseridos em vetores especialmente modificados, nesse caso, bacteriófagos. (C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisarão E. coli formando placas. Técnicas bioquímicas podem distinguir pla- cas de fagos recombinantes daquelas que não têm o gene inse- rido. (D) As placas são transferidas para papel de nitrocelu- lose e tratadas com álcali para lisar os fagos e desnaturar DNA localmente. Esses filtros são então incubados com son- das radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. Para a seleção da biblioteca diferencial de cDNA, discutida no texto, a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radi- oativas de dois tecidos diferentes, permitindo ao pesquisador procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido mas não em outro.
  • 64 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento grandes quantidades, e o gene clonado é isolado tratando o vetor recombinante com enzimas de restrição. Esse é transformado em fita única e tornado radioativo. Quan- do o cDNA radioativo é adicionado às células fixadas apropriadamente em lâminas de microscópio, o cDNA radioativo se liga unicamente onde está presente o mRNA complementar. Após eliminação do cDNA não fixado, a lâmina é coberta com uma emulsão fotográfica transparente para auto-radiografia. As manchas resultantes, diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado, parecem escuras quando visualizadas diretamente, ou brancas quando vistas com iluminação em campo escuro. Assim, pode-se visualizar aquelas células (ou mesmo regiões dentro das células) que acumularam um tipo específico de mRNA. A Figura 2.25A,B mostra hibridização in situ usando o cDNA específico para células endodérmicas. O cDNA encontra mRNAs somente no endoderma da gástrula precoce do ouriço-do-mar. Continuando a gastrulação, o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma ainda mais precisa — entre a região do intestino posterior e o intestino médio no tubo endodérmico. Trabalhando com sondas radioativas e emulsões, torna-se necessário o uso de secções microscópicas extremamente finas. Uma técnica mais recente para hibridiza- ção in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Dessa maneira, cientistas podem observar órgãos inteiros (e organismos) sem seccioná-los, e com uma visão de amplas regiões de expressão gênica.A Figura 2.25C mostra uma hibridização in situ, realizada em montagem integral, em um embrião de camundongo com 10.5 dias. A sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na página 40), que sintetiza uma proteína necessária para a produção de células mesodérmicas na parte posterior do embrião de camundongo. Transferências NorthernTransferências NorthernTransferências NorthernTransferências NorthernTransferências Northern Podemos também determinar a expressão temporal e espacial de RNAs executando uma transferência de RNA (freqüentemente chamada transferência Northern). En- quanto transferências Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel, transferências Northern (nome não se relaciona com o inventor) transferem RNA entre os mesmos suportes e da mesma maneira. O pesquisador pode extrair RNAs mensageiros do embrião em vários estágios de desenvolvimento e submetê-los à eletroforese lado a lado, em um gel. Após transferência dos RNAs separados para o papel de nitrocelulose ou membrana de nylon, o conjunto é incubado em uma solu- ção contendo um fragmento radioativo, mono-fita, de DNA de um determinado gene. Esse DNA adere somente às regiões onde está localizado o RNA complementar. Assim, se o mRNA para aquele gene está presente em um determinado estágio embrionário, o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiogra- fia. Autoradiogramas desse tipo, onde vários estágios são comparados simultanea- mente, são denominados transferências Northern de desenvolvimento. A Figura 2.26A mostra uma transferência Northern de desenvolvimento para a expressão de um gene endoderma-específico durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar. Po- demos ver que o mRNA para essa proteína endodérmica é inicialmente sintetizado durante o estágio de blástula mesenquimatosa e continuamente durante todo o resto do desenvolvimento. A transferência Northern na Figura 2.26B mostra que a acumulação desse mRNA no estágio de prisma é restrita ao endoderma (Wessel et al.,1989). Hibridização in situ e transferências Northern fornecem as melhores evi- dências em favor da transcrição diferencial de RNA, no espaço e no tempo.Atrans- crição de certos genes pode ser específica para tecidos ou tempo. A distribuição temporal na transcrição de vários genes pode ser visualizada por transferência de mancha. Por exemplo, Sargent e Dawid (1983) isolaram da gástrula de Xenopus um mRNA que não estava presente no ovo. Para isso eles extraíram o mRNA da gástrula e fizeram cópias cDNA dessas mensagens. Os cDNAs da gástrula foram misturados com grandes quantidades de mRNA de oócitos. Se houvesse hibridização entre o mRNA dos oócitos e o cDNA da gástrula, significaria que o cDNA era derivado
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 65 Figura 2.25Figura 2.25Figura 2.25Figura 2.25Figura 2.25 Hibridação in situ. (A,B) Fotomicrografias, em fundo escuro, de hibridação in situ, mos- trando a localização de mRNA endoderma- específico em embrião de ouriço-do-mar. O cDNA radioativo usado como sonda foi pre- parado do gene clonado, feito a partir de mRNA endoderma-específico (veja Figura 2.24). Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA do endoderma da gástrula precoce do ouriço- do-mar (A) e ao endoderma do intestino mé- dio e posterior da gástrula tardia do ouriço- do-mar (B). (C) Hibridização in situ, em mon- tagem integral, de um embrião de camundon- go de 9.5-10.5 dias corado para mRNA de Brachyury. Essa mensagem é transcrita em células formando novo mesoderma, e nesse estágio é encontrada na porção posterior do embrião. Embriões fixados foram incubados em uma sonda para mRNA de Brachyury (a fita antisense complementar ao mRNA) que foi sintetizada usando uridina biotinilada. Após eliminar a parte da sonda que não se ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qual- quer atividade endógena de fosfatase alcalina do embrião), o embrião foi tratado com anti- corpos para biotina. Esses anticorpos foram ligados às enzimas do tipo fosfatase alcalina. Colorir para a presença de fosfatase alcalina permite que se determine a localização de um mRNA específico. Fotografias coloridas da hibridização in situ, em montagem integral, estão nas Pranchas 22, 23 e 25. (A e B de Wessel et al.,1989, cortesia de G. Wessel; C do laboratório do autor.) mRNA de Brachyury Sonda complementar a mRNA de Brachyury tendo resíduos de biotina em suas uridinas Biotina Anticorpo para biotina Enzima fosfatase alcalina (precipitado azul escuro) (incolor) Núcleo Corante Corante (C) (A) (B)
  • 66 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (B) Ectoderma / mesoderma Endoderma Ovo(A) Clivagem Blástula Blástula Mesenquimatosa Blástula precoce Blástula tardia Prisma Plúteo de um mRNA presente em ambos os estágios, oócito e gástrula. Essas moléculas híbridas com dupla fita foram removidas por filtração, deixando uma população de cDNAs gástrula-específico. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita (pela DNA polimerase) e inseridos em veículos de clonagem. Essa técnica é denomina- da de clonagem de subtração. Como a seleção dupla de bibliotecas de cDNA, a clonagem de subtração gera um conjunto de clones estágio-específicos cujo mRNA é encontrado em alguns estágios, mas não em outros, ou em alguns tecidos mas não em outros (Figura 2.27). Sargent e Dawid usaram embriões, dos estágios de zigoto a broto caudal do girino e, separadamente, isolaram seus RNAs. Os RNAs foram aplicados direta- mente (sem prévia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada filtro tinha RNAs de todos os estágios. Após a fixação (calor) dos RNAs no filtro, DNA de fita única derivado de um específico clone “gastrular”, foi marcado radi- oativamente e incubado com os filtros. Se um gene estava sendo transcrito em um determinado estágio, o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu comple- mento nos mRNAs daquele estágio, no filtro. Após eliminacão do cDNA não liga- do, a ligação do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. A transfe- rência de manchas na Figura 2.28 mostra o esquema temporal de expressão para 17 genes que são ativos em vários estágios da gastrulação. Nenhum deles é expresso antes da transição da blástula mediana em 7 horas. Alguns genes (DG64, DG39) são expressos imediatamente depois, enquanto outros (DG72, DG81) começam a ser transcritos na gástrula mediana, após aproximadamente 7 horas. Alguns genes (DG76, DG81) são mantidos após a ativação, enquanto a atividade de outros (DG56, DG21) é muito mais transitória. Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia A reação da polimerase em cadeia (PCR) é um método de clonagem in vitro que pode produzir enormes quantidades de um fragmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida (Saiki et al.,1985). Esse método pode ser usado para clonar um gene específico ou para determinar se um gene específico está ativamente transcrevendo RNA em um determinado órgão ou tipo de célula. O método padrão de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante. PCR, no entanto, pode amplificar uma única molécula de DNA por um fator de vários milhões em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio. Essa técnica tem sido extrema- mente útil em casos onde a quantidade de ácido nucléico para estudo é muito peque- na. Embriões de camundongos, por exemplo, na fase de pré-implantação têm muito pouco mRNA e não se pode obter milhões desses embriões para estudo. Se fosse necessário saber se o embrião de camundongo na fase de pré-implantação contém o mRNA para uma proteína determinada, seria muito difícil descobrir usando os méto- dos padrão de clonagem. Entretanto, a técnica do PCR permite encontrar essa mensa- gem com poucos embriões, por amplificar especificamente somente aquela mensagem, um milhão de vezes (Rappolee et al., 1988). O uso de PCR para encontrar mRNAs raros está ilustrado na Figura 2.29. Os mRNAs de um grupo de células são purificados e convertidos a cDNA por transcriptase reversa. Usando DNA polimerase e S1 nuclease, a população de DNAs de fita única é transformada em uma população de fita dupla. Em seguida, escolhe-se um DNA para ser amplificado. Para isso, separam-se as duplas hélices do DNA, às quais são adici- onados dois pequenos oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma porção da mensagem procurada. Se os oligonucleotídeos reconhecem seqüên- cias no DNA, então o mRNA estava presente originalmente. Os oligonucleotídeos foram preparados de forma a permitir uma hibridização com fitas opostas e lados opostos da seqüência alvo. (Se a tentativa é isolar o gene ou mRNA para uma proteína específica de seqüência conhecida, essas regiões laterais podem ser preparadas, Figura 2.26Figura 2.26Figura 2.26Figura 2.26Figura 2.26 Transferência Northern para um gene especí- fico no endoderma do ouriço-do-mar, Lytechi- nus variegatus. (A) Transferência Northern de desenvolvimento, mostrando acumulação de mRNA de acordo com o estágio específico desse gene. mRNA total (10 µg por estágio) foi submetido à eletroforese em gel de agarose. O gel foi transferido para papel tratado e os mRNAs aderidos ao papel, que foi em seguida incubado com cDNA radioativo de um clone endoderma-específico. Mostrou-se que esse mRNA é sintetizado durante o estágio de blás- tula do mesênquima e aumentado ao longo do desenvolvimento. (B) Transferência Northern no estágio de prisma, mostrando que o mRNA está presente no endoderma (com algum me- soderma aderido) mas não no ectoderma. RNA total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) próximo ao mRNA do resto do ouriço-do-mar (pista1). Ligação com cDNA radioativo detec- tou mRNAsomente no endoderma. (deWessel et al., 1989, cortesia de G. Wessel.)
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 67 Estágio Clone Blástula Gástrula Nêurula Broto de cauda Horas após a fertilização Plasmídeo recombi- nante contendo DNA para mRNA específico para gástrula Oócito mRNA total de oócito Hibridizar Extrair mRNA Gástrula mRNA total de gástrula cDNA de gástrula que encontra mensagem complementar em mRNA de oócito cDNA de gástrula Fazer cDNA de mRNA cDNA de gástrula sem seqüência complementar a mRNA de oócitos DNA polimerase S1 nuclease cDNA de dupla fita específico de gástrula Adicionar ligantes Colocar em veículo de clonagem Extrair mRNA Figura 2.27Figura 2.27Figura 2.27Figura 2.27Figura 2.27 Clonagem de subtração de genes de gástrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis. cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gástrula e hibridizado com mRNA de oócitos. Os cDNA de gástrula que não encontraram seqüências complementares nos mRNAs de oócitos, eram produtos de genes ativos na gástrula mas não nos oócitos. Esses genes foram clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua inserção em veículos de clonagem. Figura 2.28Figura 2.28Figura 2.28Figura 2.28Figura 2.28 Transferências de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus estão transcrevendo ativamente. Acumulação específica de mRNA no citoplasma é registrada embebendo mRNA total, de genes em estágios embrionários, em papel de nitrocelulose e incu- bando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA específico de gástrula. Justapondo essas tiras, obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes específicos. A linha r5 representa um controle de RNA ribossômico que deve estar sempre presente. (de Jamrich et al., 1985, cortesia de I. Dawid e M. Sargent.)
  • 68 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Finais da seqüência do polipeptídeo RNAs que codificam o amino terminal (iniciador 1) RNAs que codificam o carboxi terminal (iniciador 2) RNA iniciador 1 DNA alvo RNA iniciador 2 1 cópia Aquecer a 95o C para desnaturar DNA. Esfriar a 37o C para permitir hibridização dos iniciadores a DNA Primeirociclo Segundociclo 2 cópias Quando aquecido a 72o C, taq polimerase estende fitas complementares a partir dos iniciadores Primeiro ciclo de sínteses resulta em duas cópias da seqüência alvo de DNA Desnatura DNA Hibridiza iniciadores Estende novas fitas de DNA 4 cópias Segundo ciclo de sínteses resulta em quatro cópias da seqüência alvo de DNA sintetizando oligonucleotídeos que codificam o amino terminal da proteína e oligonucleotídeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da prote- ína). Os finais 3' desses iniciadores estão face a face de modo que a replicação é através do DNA alvo. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador, a DNA polimerase pode sintetizar uma nova fita. Figura 2.29Figura 2.29Figura 2.29Figura 2.29Figura 2.29 Protocolo para a reação de polimerase em cadeia (PCR). Para determinar se um tipo particular de mRNA está presente, todo mRNA é convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase reversa e DNA polimerase. Esse DNA é desnaturado e dois conjuntos de iniciadores são adicionados. Se a seqüência específica estiver presente, os iniciadores se hibridizarão aos seus terminais opostos. (Iniciadores específicos são produzidos com base na seqüência que se pro- cura. Se é conhecida apenas a seqüência da proteína codificada pela mensagem, prepara-se um conjunto de diferentes iniciadores, cada um possivelmente complementar ao DNA.) Usando DNA polimerase termoestável de T. aquaticus, cada fita de DNA sintetiza seu complemento. Essas fitas são, por sua vez, desnaturadas e os iniciadores são hibridizados a elas, iniciando o ciclo novamente. Dessa maneira, o número de fitas novas com a sequência entre os dois iniciadores aumenta exponencialmente.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 69 Ovário de rato Ovário de camundongo Rim de camundongo Rim de camundongo Salivares de camundongo Pâncreas de camundongo Pulmão de camundongo Sem adição de DNA AdultoEmbriãode14dias Essa enzima não é a DNA polimerase normal de E. coli; é uma polimerase de bactérias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. Essas bactérias vivem em fontes de água quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respi- radouros térmicos de submarinos, onde a temperatura atinge valores próximos de 900 C. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas próximas à ebulição e o PCR se utiliza dessa adaptação evolucionária. Uma vez sintetizada a segunda fita, ela é separada de seu complemento por desnaturação em alta temperatura. O segundo iniciador é adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Sucessivos ciclos de desnaturação e síntese amplificarão essa região do DNA de forma geométri- ca.Após vinte turnos, aquela região específica estará amplificada 220 vezes (um pouco mais de um milhão). Quando submetido à eletroforese esse fragmento amplificado é facilmente detectado. Isso mostra que o mRNA original com essa seqüência estava presente na amostra. (A confirmação poderia ser feita por transferência Southern, como na Figura 2.30).Além disso, pode-se usar essas cópias amplificadas para clona- gem, colocando-as em vetores de clonagem. Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos Técnicas de inserção de DNA novo em uma célulaTécnicas de inserção de DNA novo em uma célulaTécnicas de inserção de DNA novo em uma célulaTécnicas de inserção de DNA novo em uma célulaTécnicas de inserção de DNA novo em uma célula Apesar de ser importante conhecer a seqüência de um gene e seu esquema temporo- espacial de expressão, o que é realmente crucial é conhecer a função daquele gene no desenvolvimento. Técnicas recentes permitem estudar a função do gene, tirando e repondo certos genes de células embrionárias. Pedaços de DNA clonados podem ser modificados (se desejado), e colocados em células por vários meios. Uma técni- ca muito direta é a microinjeção, na qual uma solução contendo o gene clonado é cuidadosamente injetada no núcleo da célula (Capecchi, 1980). Essa é uma técnica especialmente útil para injetar genes em ovos recentemente fertilizados, pois os núcleo haplóides do espermatozóide e do óvulo são relativamente grandes (Figura 2.31). Em transfecção, o DNA é incorporado diretamente na célula por incubação em uma solução determinada onde a célula o incorpora. A probabilidade de incorpora- ção de tal fragmento de DNA no cromossomo é relativamente pequena, sendo ne- cessário misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivência das raras células que o incorporaram, em condições de cultura onde as outras células são destruídas (Perucho et al.,1980; Robins et al.,1981). Outra técnica é a eletroporação, onde pulsos de alta voltagem “empurram” o DNA para dentro da célula. Um método mais “natural” para introduzir genes na célula é colocar o gene clonado em um elemento transponível ou vetor retroviral. Esses são regiões móveis de DNA, de ocorrência natural, que podem ser integrados no genoma. Retrovírus são vírus contendo RNA. Dentro da célula hospedeira eles produzem uma cópia de seu DNA (usando sua própria transcriptase reversa); a cópia se transforma em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro.Aintegração é consuma- da devido às duas seqüências idênticas (longas repetições terminais) nos terminais do DNA retroviral. Vetores retrovirais são produzidos removendo os genes do empacotamento viral (necessários para a saída dos vírus da célula) do centro de um retrovírus de camundongo. Essa extração cria um sítio vazio onde outros genes po- dem ser colocados. Usando enzimas de restrição apropriadas, o pesquisador pode removergenesdeumfagoouplasmídeoclonadoereinserirogeneemvetoresretrovirais. Retrovetores virais infectam células de camundongo com eficiência próxima de 100%. Em Drosophila, novos genes podem ser introduzidos na mosca, via elementos P. Essas seqüências de DNA, são elementos transponíveis de ocorrência natural que podem ser integrados como vírus em qualquer região do genoma da Drosophila. Ainda mais, eles podem ser isolados, e genes clonados inseridos no centro do elemen- to P. Quando o elemento P recombinado é injetado em um oócito de Drosophila, ele pode se integrar ao DNA e prover o embrião de um novo gene (Spradling e Rubin, 1982). Figura 2.30Figura 2.30Figura 2.30Figura 2.30Figura 2.30 Evidência fornecida por PCR, para a síntese de um fator de crescimento, activina, de ór- gãos embrionários de camundongo. O mRNA desses órgãos foi convertido em DNA e am- plificado através de 20 ciclos de replicação. O DNA foi submetido sucessivamente à ele- troforese e transferência Southern usando uma sonda radioativa para uma parte do gene de activina. mRNA de activina foi encontrado no ovário do camundongo adulto (como es- perado) e também em vários órgãos embrio- nários. A possível função de activina nesses orgãos será discutida no Capítulo 17. (Corte- sia de O. Ritvos.)
  • 70 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Camundongos quiméricosCamundongos quiméricosCamundongos quiméricosCamundongos quiméricosCamundongos quiméricos As técnicas descritas têm sido usadas recentemente para transferir genes para to- das as células do embrião de camundongo (Figura 2.32). Durante o desenvolvimen- to do camundongo existe um estágio onde somente estão presentes dois tipos de células: as células externas, que formarão a porção fetal da placenta, e as células internas, que darão origem ao próprio embrião. Essas células internas são chamadas células embrionárias precursoras (células tronco), porque cada uma delas pode, se isolada, gerar todas as células do embrião (Gardner, 1968; Moustafa e Brinster, 1972). Essas células podem ser isoladas do embrião de um camundongo e cultiva- das. Uma vez em cultura, elas podem ser tratadas como descrito, de modo a incorpo- rar novo DNA. A nova célula embrionária precursora (não somente o DNA, mas a célula inteira) pode ser injetada em outro embrião de camundongo em fase precoce. Assim, a célula precursora tratada estará integrada no embrião do hospedeiro. O resultado é um camundongo quimérico*. Algumas de suas células são derivadas das células embrionárias precursoras do hospedeiro, mas outra porção de células é derivada também das células precursoras tratadas. Se as células tratadas se torna- ram parte da linha germinal do camundongo, alguns dos seus gametas serão deriva- dos da célula doadora. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem, alguns de seus descendentes levarão, portanto, uma cópia do gene inserido. Os descendentes heterozigotos, no acasalamento produzirão 25% de embriões carre- gando duas cópias do gene inserido em cada célula de seu corpo (Gossler et al.,1986). Assim, em três gerações — o camundongo quimérico, o camundongo heterozigoto e o camundongo homozigoto — um gene que foi clonado de um outro indivíduo, está agora presente em ambas as cópias dos cromossomos dentro do genoma do camundongo. Camundongos com genes estáveis de outros indivíduos são chama- dos camundongos transgênicos. Essas linhagens têm sido particularmente úteis na determinação das funções de regiões reguladoras que ladeiam os genes. Experimentos com genes com endereçamentoExperimentos com genes com endereçamentoExperimentos com genes com endereçamentoExperimentos com genes com endereçamentoExperimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout)(Gene targeting ou Knockout)(Gene targeting ou Knockout)(Gene targeting ou Knockout)(Gene targeting ou Knockout) A análise de embriões precoces de mamíferos foi durante muito tempo prejudicada pela dificuldade em criar e selecionar mutações que afetam a fase inicial do desen- volvimento embrionário. Esse problema foi superado pela técnica chamada de endereçamento de genes (às vezes, chamada de “Knockout”). As técnicas são simi- lares àquelas que produzem camundongos transgênicos, mas em lugar de adicionar genes, endereçar genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados. Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa técnica para estudar a função do gene Hoxa- 3 no desenvolvimento do camundongo. Hoxa-3 é semelhante a vários genes de Drosophila que são conhecidos como controladores da expressão gênica de seg- mentos específicos no embrião precoce; a proteína codificada por Hoxa-3 liga-se ao DNA, exatamente como sua correspondente na Drosophila. Seria possível que Hoxa- 3 de maneira similar estaria regulando a expressão gênica espaço-específica nos mamíferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3, cortaram-no com uma enzima de restrição e inseriram nesse sítio um gene para resistência à neomicina (Figura 2.33). Em outras palavras, eles mutaram o gene Hoxa-3 pela inserção de um grande pedaço de DNA que continha um gene resistente à neomicina, destruindo a habili- dade da proteína Hoxa-3 em se ligar a DNA. Esses genes mutantes Hoxa-3 foram eletroporados em células embrionárias precursoras que eram sensíveis à neomicina. * É crítico notar a diferença entre uma quimera e um híbrido. Um híbrido resulta da união de dois genomas diferentes dentro da mesma célula: o descendente de um genitor de genótipo AA e outro de genótipo aa é um híbrido Aa. Uma quimera resulta quando células de constituição genética diferente aparecem no mesmo organismo. O termo é apto: refere-se a um monstro mitológico com cabeça de leão, corpo de bode e cauda de serpente. Figura 2.31Figura 2.31Figura 2.31Figura 2.31Figura 2.31 Injeção de DNA (de genes clonados) em um núcleo (neste caso, um pronúcleo de um ovo de camundongo). (de Wagner et al.,1981, cor- tesia de T. E. Wagner.)
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 71 Células embrionárias precursoras Trofoblasto Cultura de células embrionárias precursoras Mistura de células embrionárias precursoras com o gene clonado Gene clonado no vetor Seleção de células embrionárias precursoras que incorporaram o transgene Microinjetar células precursoras transgênicas no embrião hospedeiro Integração das células no hospedeiro Injetar no útero Camundongos quiméricos Camundongos transgênicos heterozigotos Camundongos transgênicos homozigotos Uma vez dentro do núcleo dessas células, o gene Hoxa-3 mutado substituiu um alelo normal desse gene por um processo chamado recombinação homóloga. Aqui, as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicação incorporam o gene mutante em lugar da cópia normal. Esse é um evento raro, mas tais células podem ser selecionadas cultivando as células precursoras em neomicina.Amaioria das células morre com a droga, mas aquelas que adquiriram resistência pelo gene incorporado sobrevivem.As células resultantes têm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado. As células precursoras heterozigotas são microinjetadas em um blastócito de ca- mundongo e se integram nas células do embrião. O camundongo resultante é uma quimera composta de células do tipo selvagem do embrião hospedeiro e de células heterozigotas Hoxa-3, das células precursoras. As quimeras são acasaladas com camundongos do tipo selvagem e se algumas das células doadoras se integraram à linhagem das células germinativas, alguns dos descendentes serão heterozigotos Figura 2.32Figura 2.32Figura 2.32Figura 2.32Figura 2.32 Produção de camundongos transgênicos. Cé- lulas embrionárias precursoras de um camun- dongo são cultivadas e o genoma alterado pela adição de um gene clonado. As células transgênicas são selecionadas e injetadas em um embrião hospedeiro de camundongo na sua fase precoce. Aqui, as células embrionárias precursoras transgênicas se integram às celulas precursoras do hospedeiro. Esse embrião é colocado no útero de um camundongo fêmea grávida e se desenvolve em um camundongo quimérico. Se as células precursoras doadoras contribuíram para a linha germinativa, e o ca- mundongo quimérico é cruzado com um do tipo selvagem, parte dos descendentes serão heterozigotos ao alelo adicionado. Cruzando heterozigotos, pode ser gerada uma linhagem de camundongos que é homozigota ao alelo adicionado. Essa seria uma linhagem transgê- nica. O gene adicionado (o transgene) pode ser de qualquer fonte eucariótica.
  • 72 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Massa celular interna Blastócito Cultura de células embrionárias precursoras (ES) Eletroporação (B) gene Hoxa-3 Endonucleases de restrição gene neor gene Hoxa-3 mutado com o gene neor inserido Recombinação homóloga Célula precursora embrionária Hoxa-3 Seleção de células ES heterozigotas por sua resistência à neomicína Injeção de células ES heterozigotas no blastócito (C) Injeção dos blastócitos no útero Produção de camundongos quiméricos Cruzamento de quiméricos com tipo selvagem Cruzamento de camundongos heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3+ Homozigoto Hoxa-3¯/ Hoxa-3¯ Heterozigotos Heterozigotos neor para o gene Hoxa-3. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e apro- ximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cópias do gene mutado Hoxa-3. Esses camundongos mutantes homozigotos não possuem as glândulas tireóide, paratireóide e timo! Dessa maneira, endereçando genes pode-se analisar as funções de determinados genes durante o desenvolvimento de mamíferos. [gene7.html] Figura 2.33Figura 2.33Figura 2.33Figura 2.33Figura 2.33 Técnica de endereçamento de genes (gene targeting). Nesse caso o gene alvo é o Hoxa-3. (A) Células embrionárias precursoras (ES) são cultivadas a partir de uma massa celular interna. (B) Os genes Hoxa-3 clonados são cortados com uma enzima de restrição, e um gene neomicina-resistente é inserido na região que codifica o sítio de ligação da proteína ao DNA. Esses genes Hoxa-3 mutantes são eletroporados em células ES, onde recombinação homóloga troca o gene do tipo selvagem pela cópia mutada.As células são selecionadas pela sua resistência à neomicina. (C)As células ES heterozigotas selecionadas são inseridas na massa interna de células de um em- brião do tipo selvagem, e o blastócito é retornado ao útero. O camundongo resultante é uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo selvagem. Cruzando os animais quiméricos com camundongos do tipo selvagem produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as células ES contribuíram na linhagem germinativa. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si, e aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3.
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 73 (A) mRNA de consenso (sense) Krüppel mRNA antisense Krüppel T3 RNA polimeraseT 3 promotor T7 promotor T7RNA polimerase (B) Embrião mutante Krüppel Embrião normal Embrião normal infectado com RNA “antisense” Krüppel Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense Outro método para determinar a função de um gene é fazer cópias “antisense” de sua mensagem. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e fazendo sua reclonagem em reverso, próximo a um vigoroso promotor bacteriano, em outro vetor. O promotor bacteriano iniciará a transcrição da mensagem na “direção errada” quando for incubado com RNA polimerase e nucleosídeos trifosfato. Dessa maneira, é sintetizado um transcrito que é complementar aquele natural (Figura 2.34A). O transcrito complementar é chamado RNA antisense porque é o reverso da mensa- gem original. Quando grandes quantidades de RNA antisense são injetadas ou transfectadas em células contendo o mRNA normal desse gene, o RNA antisense se liga à mensagem normal; o ácido nucléico dupla-fita resultante é degradado (enzimas do citoplasma das células digerem ácidos nucléicos de fita dupla). Isso causa uma depleção funcional da mensagem, como se houvesse uma mutação eliminatória para aquele gene. Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir do gene Krüppel de Drosophila. Krüppel é crítico para a formação do tórax e do abdômen da mosca. Se esse gene está ausente, as larvas da mosca morrem pela falta dos segmentos torácico e abdominal anterior (Figura 2.34B); uma situação semelhante é criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krüppel são injetados em embriões precoces da mosca (Rosenberg et al.,1985). RNA antisense permite ao biologista do desenvolvimento determinar a função dos genes durante o desenvolvimento e analisar a ação dos genes em animais; de outra forma isso seria inacessível à análise genética. Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos A união da embriologia com a biologia molecular está permitindo ao biologista do desenvolvimento uma nova apreciação de como trabalham os genes na construção de um organismo. Estamos em meio à uma revolução nos nossos conhecimentos sobre desenvolvimento, e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e seqüenciamentos é a nova “anatomia” do gene eucarioto. Descreveremos a estrutura do gene com mais detalhe no Capítulo 10, mas é importante ressaltar que os genes eucariotos que codificam proteínas têm vários sítios regulatórios (Figura 2.35). Um sítio, o promotor, está localizado diretamente a montante do gene (antes do início) e é Figura 2.34Figura 2.34Figura 2.34Figura 2.34Figura 2.34 Producão de RNA antisense para examinar a função dos genes no desenvolvimento. (A) Produção da mensagem antisense (neste caso, ao gene Krüppel da Drosophila) colocando o fragmento de cDNA clonado para a mensagem Krüppel entre dois vigorosos promotores. Os promotores estão em orientação oposta com respeito ao cDNA do Krüppel. Nesse caso, o promotor T3 está em orientação normal e o promotor T7 está revertido. Os promotores reconhecem RNA polimerases diferentes (dos bacteriófagos T3 e T7, respectivamente). T3 polimerase permite a transcrição de mRNA de consenso, ao passo que T7 polimerase pro- duz transcritos antisense. (B) Resultado da injeção da mensagem Krüppel antisense em um embrião precoce (estágio blastodérmico sincicial) de Drosophila antes que a mensa- gem Krüppel seja produzida.Afigura central é um embrião do tipo selvagem pouco antes de eclodir. Acima está o mutante causado pela falta do genes Krüppel. Abaixo está o embrião do tipo selvagem, injetado com a mensagem Krüppel antisense no estágio embrionário pre- coce.Ambos os embriões, mutante e o tratado com antisense, não possuem os segmentos torácico e abdominal anterior. (B, de acordo com Rosenberg et al., 1985.)
  • 74 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento “a montante do gene” “a jusante” do gene Intensificador Intensificador Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon o sítio onde se liga a RNA polimerase. Localizada em algum lugar dentro do gene (a jusante ou a montante, ou ainda em um íntron dentro do gene), está uma segunda região chamada intensificadora. Fatores protéicos que se ligam ao intensificador per- mitem sua interação com o promotor e, conseqüentemente, com a transcrição do gene pela RNApolimerase.Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relaci- onados ao metabolismo geral da célula) não precisam ser ativados por intensificado- res, mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento são ativados em tempos e células específicos. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao intensificador e ao promotor. Como veremos no Capítulo 10, a ligação de diferentes fatores de transcrição aos promotores e intensificadores de genes específicos é um dos mecanismos que controlam a produção de proteínas diferentes a partir de genomas idênticos. Um exemplo é a ativação do gene para ZP3. Como detalharemos no Capítulo 4, ZP3 é a principal proteína ligante de espermato- zóide na superfície do óvulo de camundongo. É uma glicoproteína sintetisada pelo oócito durante sua maturação em óvulo (Roller et al.,1989). Uma transferência Northern mostra que o mRNA para essa proteína é sintetizado somente em oócitos em cresci- mento e não pode ser detectado em nenhum outro tipo de célula (Figura 2.36). O que permite a esse gene ser ativado somente nos oócitos? Lira e colaboradores (1990) isolaram o gene para ZP3, determinaram sua seqüência e encontraram um sítio promo- tor, 28 pares de bases a montante do sítio onde a transcrição do gene é iniciada. Como hipótese, consideraram que seqüências responsáveis por ativação oócito-específica podem existir até mais longe, a montante do gene. Eles usaram enzimas de restrição para isolar o DNA da região 5', a montante, (com 150 pares de bases) e o fundiram ao gene para a luciferinase de vaga-lume. (Não é necessário dizer que essa enzima produ- tora de luz não é encontrada em camundongos. Está sendo usada aqui como um “gene repórter” para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expressão.) O gene recém-construído, contendo a região a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutu- ral para luciferinase, foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais transgênicos, levando em cada núcleo o gene luciferinase com a região regulatória ZP3. Em camundongos transgênicos fêmeas, a hibridização in situ localizou mRNA de luciferinase em um único tipo de célula, o oócito (Figura 2.37).Assim, a seqüência de DNA com 150 pares de bases foi necessária e suficiente para ativar o gene (qualquer gene!) no oócito. Dentro dessa região de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqüência 5’-GATAA-3' que liga uma proteína chamada OSP-1. OSP-1 é encontrada somente em oócitos em maturação; ela ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequência de DNAno promotor. Parece, então, que ZP3 é sintetizado em oócitos porque eles têm a proteína OSP-1 que se liga a certas seqüências de DNA que são parte de seu promotor (Schickler et al.,1992). No momen- to, está sendo investigado como é regulado o gene codificador de OSP-1. Figura 2.35Figura 2.35Figura 2.35Figura 2.35Figura 2.35 Estrutura básica de um gene regulado pelo de- senvolvimento. O promotor da maioria dos genes codificadores de proteínas é encontrado no terminal 5' (a montante) do gene. O intensi- ficadorfreqüentementeestámaisacima,amon- tante, mas pode ser encontrado dentro de um íntron ou no terminal 3'. Proteínas que se li- gam ao promotor e aos intensificadores interagem para regular a transcrição do gene. (No exemplo ZP3, o sítio OSP-1, GATAA, está localizado no promotor, aproximadamen- te 95 pares de bases a montante do sítio de início da transcrição. Um sítio intensificador sensível a estrogênios é encontrado no primei- ro íntron do gene ZP3.) Intensificador
  • CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 75 Oócito Ovário Cérebro Embrião de 13 dias Coração Intestino Rim Fígado Músculo Testículos Útero Uma conclusão e um alerta Depois de quase um século, estamos começando a entender como as células regulam a expressão diferenciada de seus genes, permitindo que genes diferentes possam se tornar ativos em diferentes células. Esse conhecimento está ajudando a explicar como a informação herdada é utilizada para construir os planos básicos do corpo e os tipos específicos de células do organismo em desenvolvimento. Entretanto, uma palavra de alerta. Caso o tom celebratório deste capítulo deixou a impressão de que desenvolvimento é somente uma função da atividade gênica é necessário relembrar do Capítulo 1, que a distinção entre talo e esporo (Dictyoste- lium), estado amebóide e flagelado (Naegleria) e gonídios sexual e assexual (Volvox) é determinada pelo ambiente. Em capítulos posteriores (especialmente Capítulo 21), veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinação de sexo temperatura-dependente em répteis, desenvolvimento em insetos dependente da dieta, e a diferenciação, dependente de experiência, dos neurônios e linfócitos em mamíferos. Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais do ambiente, mas não é possível predizer o fenótipo a partir do genótipo. Figura 2.36Figura 2.36Figura 2.36Figura 2.36Figura 2.36 Transferência Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. RNA de vários tecidos (10µg por pista) e oócitos (125ng) foram submetidos à eletroforese e transferidos para papel de nitrocelulose. Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do mRNA.Amensagem ZP3 foi encontrada somente no ovário, especialmente dentro dos oócitos. (de Roller et al.,1989, cortesia de P. Wassarman). Figura 2.37Figura 2.37Figura 2.37Figura 2.37Figura 2.37 Hibridização in situ da expressão do gene repórter luciferinase, quando luciferinase foi ligado ao promotor do gene ZP3. A sonda radioativa era dirigida à mensagem luciferinase, a qual apareceu onde foi expressa sob a direção do promotor de ZP3. (A) Visão do ovário inteiro (60x). (B) Magnificação (160x) de dois folículos ovarianos contendo oócitos em maturação. (de Lira et al., 1990, cortesia de P. Wassarman.) (A) (B)
  • 76 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Allen, G. E. 1978. Thomas Hunt Morgan: The Man and His Science. Princeton University Press, Princeton, NJ. Allen, G. E. 1986. T. H. Morgan and the split between embryology and genetics, 1910-1935. In T. J. Horder, J.A. Witkowski and C. C. Wylie (eds.), A History of Embryology. Cambridge University Press, New York, pp. 113-146. Ashburner, M. 1972. Patterns of puffing activity in the salivary glands of Drosophila. VI. Induction by ecdysone in salivary glands of D. melanogaster cultured in vitro. Chromosoma 38: 255-281. Ashburner, M. and Berondes, H. D. 1978. Puffing of polytene chromosomes. In The Genetics and Biology of Drosophila, Vol. 2B.Academic Press, New York, pp. 316-395. Baltzer, F. 1967. Theodor Boveri: Life and Work of a Great Biologist. (Trans. D. Rudnick.) University of California Press, Berkeley. Barnett, T., Pachl, C., Gergen, J. P. and Wensink, P. C. 1980. 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  • 78 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Stevens N. M. 1905a. A study of the germ cells of Aphis rosae and Aphis oenotherae. J. Exp. Zool. 2: 371-405; 507-545. Stevens, N. M. 1905b. Studies in Spermato- genesis with Especial Reference to the “Accessory Chromosome.” Carnegie Institute of Washington, Washington, D.C. Steward,F. C. 1970. From cultured cells to whole plants: The induction and control of their growth and morphogenesis. Proc. R. Soc. Lond. [B] 175:1-30. Steward, F. C., Mapes, M. 0. and Smith, J. 1958. Growth and organized development of cultured cells. I. Growth and division of freely suspended cells. Am. J. Bot. 45: 693-703. Steward, F. C., Mapes, M. 0., Kent, A. E. and Holsten, R. D. 1964. Growth and development of cultured plant cells. Science 143: 20-27. Stice, S. J. and Robl, J. M. 1988. Nuclear re- programming in nuclear transplant rabbit embryos. Biol. Reprod. 39: 657-664. Ursprung, H., Smith, K. D., Sofer, W. H. and Sullivan, D. T 1968.Assay systems for the study of gene function. Science 160: 1075-1081. Vierra, J. and Messing, J. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259-268. Waddington, C. H. 1939. Preliminary notes on the development of wings in normal and mutant strains of Drosophila. Proc. NatI. Acad. Sci. USA 25:299-307. Waddington, C. H. 1962. New Patterns in Gene- tics and Development. Columbia University Press, New York, pp. 14-36. Wagner, T. E., Hoppe, P., Jollick, J. D., Scholl, D. R., Hodinka, R. L. and Gault, J. B. 1981. Microinjection of rabbit β-globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice and offspring. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376-6380. Wieslander, L. and Daneholt, B. 1977. Demons- tration of Balbiani ring RNA sequence in polysomes. J. Cell Biol. 73: 260-264. Wessel, G. M., Goldberg, L., Lennarz, W. J. and Klein, W. H. 1989. Gastrulation in the sea urchin is accompanied by the accumulation of an endoderm-specific mRNA. Dev. Biol. 136: 526-538. Wetmur, J. G. and Davidson, N. 1968 . Kinetics of renaturation of DNA. J. Mol. Biol. 31:349-370. Wilkinson, D. G., Bhatt, S. and Herrmann, B. G. 1990. Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation. Nature 343: 657-659. Willadsen, S. M. 1986. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320: 63-65. Willadsen, S. M. 1989. Cloning of sheep and cow embryos. Genome 31: 956-962. Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J. and Campbell, K. H. S. 1997. Viable offspring from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813. Wilson, E. B. 1894. The mosaic theory of de- velopment. Biol. Lect. Marine Biol. Lab. Woods Hole 2:1-14. Wilson, E. B. 1895. An Atlas of the Fertilization and Karyogenesis of the Ovum. Macmillan, New York. [p. 4] Wilson, E. B. 1896. The Cell in Development and Inheritance. Macmillan, New York. [p. 262] Wilson, E. B. 1904. Experimental studies on germinal localization. I. The germ regions in the egg of Dentalium. J. Exp. Zool. 1: 1-72. Wilson, E. B. 1905. The chromosomes in re- lation to the determination of sex in insects. Science 22: 500-502. Yamada, T. 1966. Control of tissue specificity: The pattern of cellular synthetic activities in tissue transformation. Am. Zool. 6:21-31.
  • U A base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 3 79 Mas a natureza não é atomizada. Sua pa- dronização é inerente e primária, e a ordem subjacente à beleza é nela demonstrada; mais ainda, a natureza só pode ser percebida pela mente humana, porque ela mesmo é parte integrante e majoritária daquela ordem. Paul Weiss (1960) Eu fui criado terrivelmente e maravilhosa- mente. Salmo 139 (ca. 500 a.c). m corpo não é meramente uma coleção de tipos de células distribuídas ao acaso. Desenvolvimento envolve não só a diferenciação celular, mas tam- bém sua morfogênese em arranjos multicelulares tais como tecidos e órgãos. Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural, vemos um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de células. Neste Capítulo, introduziremos as vias de mudança pelas quais as células do embrião em desenvolvi- mento criam órgãos funcionais do corpo. Existem quatro questões majoritárias partici- pando do arcabouço de discussões sobre morfogênese: • Como se formam tecidos a partir de células? De que modo células da retina neural aderem a outras células da retina neural e não se associam às celulas da retina pigmentada ou da íris que estão próximas a elas? De que modo, os vários tipos de células presentes na retina neural (as três camadas distintas de fotore- ceptores, neurônios bipolares e células ganglionares) estão organizados para permitir que a retina seja funcional? • Como são os órgãos construídos a partir de tecidos? As células retinais do olho estão situadas atrás da córnea e da lente a uma distância exata. A retina seria inútil se estivesse situada atrás de um osso ou outro lugar qualquer, onde a lente não pudesse nela focalizar os raios de luz.Além disso, os neurônios da retina devem penetrar no cérebro para inervar as regiões do córtex cerebral que analisam a informação visual. Todas essas conexões devem estar precisamente ordenadas. • Como células migrantes atingem seu destino, e como se formam órgãos em determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabeça, mas em nenhum ou- tro lugar. O que impede a formação de um olho em outras partes do corpo, se todas as células têm o mesmo potencial genético? Em alguns casos, como o de precursores de nossas células pigmentadas, células germinativas e glândula supra-renal, as células devem percorrer longas distâncias para alcançar seu destino final. Como as células são instruídas para percorrer certas rotas e parar quando atingem uma região específica do corpo? • Como crescem órgãos e suas células, e como é esse crescimento coordenado ao longo do desenvolvimento? As células do olho devem crescer juntas, e as células da retina raramente dividem-se após o nascimento. Nosso intestino, entretanto, está constantemente descartando células e regenerando outras, e
  • 80 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento ainda assim, sua velocidade mitótica é cuidadosamente controlada. Se mais células fossem regeneradas do que aquelas descartadas, seriam produzidos crescimentos cancerosos. Se o número de células regeneradas fosse menor, o intestino não poderia digerir o alimento. O que controla essas diferenças na velocidade de crescimento? Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular. Existem dois grupos principais de células no embrião: células epiteliais, fortemente ligadas umas às outras em camadas ou tubos, e as células mesenquimatosas, isoladas e funcionando como unidades individuais. A morfogênese nessas duas classes de célu- las se dá através de um limitado repertório de processos celulares: (1) direção e núme- ro de divisões celulares; (2) mudanças na forma das células; (3) movimento celular; (4) crescimento celular; (5) morte celular; e (6) mudanças na composição da membrana celular e da matriz extracelular. A maneira pela qual esses processos se completam pode diferenciar entre células epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3.1). Parecem existir duas vias principais pelas quais células se comunicam umas com as outras para que se efetue a morfogênese.Aprimeira é através de substâncias difusíveis que são sintetizadas por um tipo de célula e que mudam o comportamento de outros tipos celulares. Essas substâncias incluem hormônios, fatores de crescimento e morfógenos; cada um será detalhado em capítulos subseqüentes. O segundo método involve contato entre superfícies de células adjacentes. Células podem seletivamente reconhecer outras, aderindo a algumas células ou migrando sobre outras. Os eventos moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de células e sua transforma- ção em tecidos e órgãos, ocorrem na superfície celular. Enquanto o paradigma domi- nante na genética do desenvolvimento é a expressão diferencial do gene, o paradigma dominante na morfogênese envolve afinidade celular diferencial. Essas afinidades podem ser para superfícies de outras células ou para moléculas da matriz extracelular secretadas pelas células. Neste capítulo veremos como superfícies de células adjacen- tes interagem durante o desenvolvimento, visando localizar as células em sítios apro- priados dentro de tecidos e órgãos. Afinidade celular diferencial Assim como a demonstração da importância dos genes no desenvolvimento gerou desentendimentos entre pesquisadores, também se desenvolveu um debate sobre o papel da superfície celular na formação do embrião.Asuperfície celular parece a mes- ma em todos tipos de células, e muitos pesquisadores mais antigos pensavam até que a superfície celular não era uma parte vital da célula. Observações sobre fecundação e desenvolvimento embrionário precoce feitas por E. E. Just (1939) sugeriam que a superfície celular diferia em tipos diferentes de células, mas a análise moderna da morfogênese se inicia com os experimentos deTownes e Holtfreter em 1955. Conside- rando a descoberta de que tecidos de anfíbios se dissociavam em células isoladas quando colocados em soluções alcalinas, eles prepararam suspensões de células isoladas provenientes de cada uma das três camadas germinativas dos anfíbios, logo após a formação do tubo neural. Duas ou mais dessas suspensões de células isoladas poderiam ser combinadas de várias maneiras, e quando o pH era normalizado, as células aderiam umas às outras, formando agregados em placas de Petri cobertas com agár. Usando embriões de espécies que tinham células de diferentes tamanhos e co- res, Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das células recombinadas (Figura 3.2). Figura 3.1Figura 3.1Figura 3.1Figura 3.1Figura 3.1 Sumário dos principais processos morfogenéticos em células mesenquimatosas e epiteliais ±
  • PROCESSO AÇÃO MORFOLOGIA EXEMPLO CÉLULAS MESENQUIMATOSAS Condensação Mesênquima se Mesêquina da cartilagem torna epitélio cartilagem Divisão Mitose para produzir Mesênquima celular mais células (hiperplasia) dos membros Morte Célula morre Mesênquima celular interdigital Migração Célula se move em tempos Mesênquima e lugares determinados do coração Secreção de Síntese ou remoção da Mesênquima matriz e degradação camada extracelular da cartilagem Crescimento Células ficam Células maiores (hipertrofia) gordurosas CÉLULAS EPITELIAIS Dispersão Epitélio mesênquima Degeneração do (estrutura inteira) ducto Mülleriano Delaminação Epitélio mesênquima Hipoblastos de (parte da estrutura) de galinha Mudança de Células permanecem ligadas Neurulação forma ou crescimento com alteração da morfologia Migração celular Linhas do epitélio se fundem Gastrulação (intercalação) para formar menos linhas de vertebrados Divisão celular Mitose dentro da linha ou Gastrulação de outra direção vertebrados Secreção de matriz Síntese ou remoção da Formação de e degradação camada extracelular órgãos vertebrados Migração Formação de bordas Ectoderma de livres galinha
  • 82 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Células epidérmicas presuntivas Dissociação de células Reagregação espontânea Segregação de tipos de células Células da placa neural Seção através da bola de células segregadas Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. Em primeiro lugar, verificaram que células reagregadas se tornavam espacialmente segregadas. Ou seja, em lugar de permanecerem misturadas, cada tipo de célula se posicionava em sua própria região. Assim, quando células epidérmicas (ectodérmicas) e mesodérmicas foram ajuntadas para formar um agregado misto, as células epidérmicas foram encon- tradas na periferia do agregado e as células mesodérmicas no seu interior. Em nenhum caso as células permaneceram misturadas ao acaso, e na maioria dos casos, um tipo de tecido envolvia o outro completamente. Em segundo lugar, os pesquisadores observaram que as posições finais das célu- las reagregadas refletiam suas posições embriônicas. O mesoderma migra centralmen- te à epiderme, aderindo à sua superfície interna (Figura 3.3A). O mesoderma também migra centralmente em relação ao intestino ou endoderma (Figura 3.3B). Entretanto, quando as três camadas germinativas são misturadas entre si, o endoderma se separa do ectoderma e mesoderma e é então envolvido por eles (Figura 3.3C). Na sua configu- ração final, o ectoderma está na periferia, o endoderma é interno e o mesoderma se situa na região entre eles. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade seletiva. A superfície interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas células mesodérmicas e uma afinidade negativa para o endoderma, enquanto o mesoderma tem afinidades positivas para ambas as células, ectodérmicas e endodérmicas. A mimetização da estrutura embrionária normal por agregados celulares também pode ser vista na recombinação de células da epiderme e da placa neural (Figura 3.3D). As células epidérmicas presuntivas migram para a periferia, como antes; as células da placa neural migram para o centro, formando uma estrutura reminescente do tubo neural. Quando células axiais mesodérmicas (notocorda) são adicionadas à suspen- são de células presuntivas, epidérmicas e neurais, a segregação celular resulta em uma camada epidérmica externa, um tecido neural localizado centralmente, e uma camada de tecido mesodérmico entre eles (Figura 3.3E). De alguma maneira, as células têm a capacidade de distribuirem-se em suas próprias posições embriológicas. Tais afinidades preferenciais foram também observadas por Boucaut (1974), que injetou células individuais de específicas camadas germinativas de volta na cavidade gastrular de anfíbio. Ele verificou que essas células migram para sua camada germinativa apropriada. Células endodérmicas encontram posições no endoderma do hospedeiro, enquanto que células ectodérmicas se localizam em seu Figura 3.2Figura 3.2Figura 3.2Figura 3.2Figura 3.2 Reagregação de células da nêurula de anfíbi- os. Células epidérmicas presuntivas de em- briões pigmentados e células da placa neural de embriões não pigmentados são dissociadas e misturadas entre si. As células reagrupam- se de tal forma que um tipo (aqui, a epiderme presuntiva) cobre o outro. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 83 Mesoderma Mesoderma Endoderma Placa Epiderme Placa neural neural (A) (B) (C) (D) (E) Epiderme Placa neural + + Epiderme Mesoderma Mesoderma Placa neural Mesoderma axial + + + + + mesoderma endoderma endoderma epiderme epiderme Epiderme Endoderma Mesoderma Epiderme Epiderme Mesoderma ectoderma.Assim, afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informação posicional às células embrionárias. A terceira conclusão de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas mudam durante o desenvolvimento. Isso deveria ser esperado, pois células embrioná- rias não mantêm uma única relação estável com outras células. Para que ocorra o desenvolvimento, células precisam interagir de forma diferente com outras popula- ções celulares em tempos específicos. Essas mudanças na afinidade celular foram dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963), que mostrou uma clara correlação entre mudanças de adesão in vitro e o comportamento da célula embrionária. Mais recentemente, os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comporta- mento no ouriço-do-mar, durante seu desenvolvimento. Na blástula, todas as células parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. Cada célula tem também uma alta afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrião, e uma baixa afinidade para as proteínas dentro da cavidade embrionária (blastocele). Entretanto, ao iniciar-se a gastrulação, um grupo específico de células, no pólo vegetal da blástu- la, perde sua afinidade pelas células vizinhas e pela matriz extracelular externa, en- quanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas protéicas que forram a blasto- cele (Figura 3.4). Essas mudanças de afinidade causam a perda de contato das células Figura 3.3Figura 3.3Figura 3.3Figura 3.3Figura 3.3 Distribuição e reorganização de relacionamen- tos embrionários espaciais em agregados de células embrionárias de anfíbios. (Modificado de Townes e Holtfreter, 1955.)
  • 84 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Decréscimo de afinidade por células vizinhas e camada hialina. Aumento de afinidade por fibrilas da bastocele. (A) (B) Camada hialina Células da blástula Fibrilas da blastocele Alta afinidade por células vizinhas e camada hialina com suas vizinhas e a migração para dentro da blastocele, onde elas formarão o esqueleto da larva. Quando elas começam a formar esse esqueleto, suas proprieda- des adesivas terão que mudar novamente. Essas células, que tinham sido “anti- sociais” entre si desde seu ingresso na blastocele, devem agora aderir para formar os rudimentos do anel esquelético. Essas mudanças na adesão são específicas temporalmente e também específicas para as células precursoras esqueléticas (McClay e Ettensohn, 1987). Tais mudanças na afinidade celular são extremamente importantes nos processos da morfogênese. A reconstrução de agregados de embriões tardios de aves e mamíferos foi obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as células entre si (Moscona, 1952). Quando as células isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e agitadas de modo que a força de cisalhamento destruísse adesões não específi- cas, as células se distribuíram de acordo com seu tipo celular. Dessa maneira, elas reconstruíram a organização do tecido original (Moscona, 1961; Giudice, 1962). A Figura 3.5 mostra a “reconstrução” do tecido da pele de um embrião de camundon- go de 15 dias. As células da pele são separadas por enzimas proteolíticas e depois agregadas em uma cultura rotatória. As células epidérmicas migram para a perife- ria, e as dérmicas migram para o centro. Em 72 horas, a epiderme foi reconstituída, formou-se uma camada de queratina e folículos de pêlo são vistos na região dermal. Essa reconstrução de tecidos complexos a partir de células únicas é chamada de agregação histotípica. O modelo termodinâmico de interações celularesO modelo termodinâmico de interações celularesO modelo termodinâmico de interações celularesO modelo termodinâmico de interações celularesO modelo termodinâmico de interações celulares A células, então, não se distribuem ao acaso, mas se movem ativamente para criar organização tissular. Quais forças dirigem o movimento celular durante a morfogêne- se? Em 1964, Malcolm Steinberg propôs um modelo que explicava o direcionamento da Figura 3.4Figura 3.4Figura 3.4Figura 3.4Figura 3.4 Sumário das modificações na adesão celular de células precursoras do esqueleto (encaixadas). (A) Na blástula do ouriço-do-mar, cada célula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato, a camada hialina. (B) Enquanto progride o desenvolvimento, mu- danças na superfície celular produzem um enfraquecimento das afinidades pelas células vizinhas e camada hialina e um aumento de afinidade pelas proteínas da cavidade interna da blastocele. O resultado é que essas células migram para a blastocele (flechas) e formarão o esqueleto.
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 85 (A) (B) (C) Epiderme Derme Folículo piloso primário (A) (B) (C) (D) (E) Folículos de pêlo Derme Derme Epiderme Camada queratinizada distribuição celular baseado em princípios termodinâmicos. Usando células derivadas de tecidos embrionários tripsinisados, Steinberg mostrou que certos tipos de células sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de células, mas migram perifericamente quando combinadas com outras. A Figura 3.6 ilustra as interações entre culturas de células pigmentadas e células neurais da retina. Quando suspensões de células isoladas desses dois tipos são misturadas, elas formam agre- gados de células organizadas ao acaso. Entretanto, após algumas horas, já não se observa células pigmentadas da retina na periferia dos agregados; em dois dias, duas distintas camadas são vistas, com as células pigmentadas localizadas internamente às células neurais da retina. Os mesmos tipos de interações podem ser observados quan- do agregados esféricos de tecidos são colocados em contato, uns com os outros. Um dos tecidos finalmente envolve o outro, e a topografia final é independente das posi- ções de partida (Figura 3.7). Além disso, tais interações obedecem a uma hierarquia (Steinberg, 1970). Se a posição final de um tipo de célula, A, é interna em relação a um segundo tipo, B, e a posição final de B é interna a um terceiro tipo, C, então a posição final deAserá sempre interna a C. Por exemplo, células pigmentadas da retina migram internamente às células neurais da retina, e células do coração migram centralmente em relação à retina pigmentada. Portanto, células do coração migram internamente às células neurais da retina. Essa observação levou Steinberg a propor que as células misturadas, interagem para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3.8). Em outras Figura 3.5Figura 3.5Figura 3.5Figura 3.5Figura 3.5 Reconstrução da pele a partir de uma suspensão de células de pele de um embrião de camundon- go de 15 dias. (A) Seção através da pele embrionária, mostrando a epiderme, derme e folículos pilosos primários. (B) Suspensão de células isoladas de pele tanto da derme como da epiderme. (C)Agregados após 24 horas. (D) Seção através de um agregado mostrando migração de células epidérmicas para a periferia. (E) Nova diferenciação dos agregados (72 horas), mostrando epiderme e derme reconstituídas, completa com folículos de pêlo e camada queratinizada. (de Monroy e Moscona, 1979, cortesia de A. Moscona.) Figura 3.6Figura 3.6Figura 3.6Figura 3.6Figura 3.6 Agregados formados pela mistura de células da retina neural (não pigmentada) de um embrião de galinha de 7 dias com células pigmentadas da retina (escuras). (A) Cinco horas após a mistura das suspensões de células isoladas, são vistos agregados de células distribuídas ao acaso. (B) Em 19 horas, as células pigmentadas da retina não são mais vistas na periferia. (C) Após dois dias, a maioria das células pigmentadas da retina estão localizadas em uma massa central interna rodeadas pelas células da retina neural. (As células pigmentadas espalhadas são provavelmente células mortas). (de Armstrong, 1989, cortesia de P. B. Armstrong.)
  • 86 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) DISTRIBUIÇÃO (C) SEPARAÇÃO (B) AO ACASO Tecido A Tecido B Dissociar os tecidos e reagregar Colocar tecidos juntos, bem encaixados Movimento do tecido B para envolver o tecido A Movimento das células A para dentro, distante da periferia Células A localizadas centralmente às células B palavras, as células se rearranjam na forma termodinamicamente mais estável. Se as células dos tipos Ae B têm diferentes forças de adesão, e se a força da conexão A-Aé maior do que aquela entre A-B ou B-B, vai haver distribuição com centralização das células do tipo A. Se a força da conexão A-A é menor ou igual a da conexão A-B, o agregado permanecerá com uma mistura de células ao acaso. Finalmente, se a conexão A-Ativer uma força muito maior do que a conexãoA-B – em outras palavras, as células Ae B não mostram basicamente nenhuma adesividade entre si – então as célulasAe B formarão agregados separados. Para que as células sejam distribuídas, o essencial é que tenham diferenças em suas forças de adesão. Na forma mais simples desse modelo, todas as células poderiam ter o mesmo tipo de “cola” distribuída na sua superfície. A quantidade desse produto da superfície celular, ou a arquitetura celular que permite à subs- tância ser concentrada diferencialmente, originará diferentes números de conta- tos estáveis entre tipos de células. Alternativamente, as diferenças termodinâmicas poderiam ser causadas por vários tipos de moléculas de adesão. Esse modelo termodinâmico é chamado hipótese da adesão diferencial. Nessa hipótese, o em- brião precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilíbrio até que alguma mudança na atividade gênica altere as moléculas na superfície celular. Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configuração de equilíbrio para as células. Figura 3.7Figura 3.7Figura 3.7Figura 3.7Figura 3.7 Espalhamento de um tipo de célula sobre outro tipo.Aposição final de agregados compostos de dois tipos de tecidos é independente de sua posição inicial. Uma condição final idêntica é obtida, se os tecidos são transformados em suspensões de células isoladas e, então, reagregadas ou os tecidos são mantidos intactos e colocados em contato. (De acordo comArmstrong, 1989.) Figura 3.8Figura 3.8Figura 3.8Figura 3.8Figura 3.8 Distribuição como um processo tendendo à estabilidade termodinâmica máxima. (A) Distribui- ção ocorre quando a força adesiva média entre diferentes tipos de células (ωab )é menor que a força adesiva média homotípica (A-Aou B-B) (ωaa , ω bb ).As células mais adesivas se localizam centralmente. (B) Se a força das adesõesA-B é maior ou igual à média das adesões homotípicas, não vai haver distribuição, porque o sistema já atingiu o equilíbrio termodinâmico, e a mistura dos tipos de células será ao acaso. (C) Se as ligaçõesA-B são muito mais fracas que a média das adesões homotípicas, haverá uma completa separação, como é característico para óleo e água.
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 87 Blastema marcado Pulso Cotovelo Antebraço Blastemanãomarcado PulsoCotoveloAntebraço E Evidência para o modelo termodinâmico responder duas questões: (1) pode o fe- nômeno da distribuição ser explicado pela tensão superficial gerada pela adesão ce- lular?, e (2) essa distribuição realmente ocorre durante o desenvolvimento? Foty e colegas no laboratório de Steinberg (1994) analisaram a tensão su- perficial interfacial em vários tecidos em- brionários. Eles comprimiram amostras de tecido entre as placas de vidro de um tensiômetro, e mediram a tensão superfi- cial dos tecidos em termos da habilidade desses em retornar à forma esferóide ori- ginal. Dessa maneira, a tensão superficial de cada tecido poderia ser calculada em dines por centímetro. Foty e seus colabo- radores encontraram uma completa corre- lação entre a tensão superficial do tecido e sua tendência de distribuir-se no centro ou na periferia de um agregado misto. Te- cidos com uma maior tensão superficial sempre se localizavam internamente quan- do misturados com outros de menor ten- são superficial. Parece que a distribuição pode ser explicada unicamente pelas ten- sões superficiais das células justapostas. [cell1.html] Até recentemente, era muito difícil pla- nejar experimentos para testar, in vivo, esse modelo de distribuição celular; entretanto, estão surgindo evidências para essa hipó- tese em estudos de regeneração de mem- bros na salamandra. Aqui, o tecido mais proximal (perto do corpo) envolverá o mais distal (Nardi e Stocum, 1983). vidências recentes para a hipóte- se da adesão diferencial surgiram em pesquisa com o objetivo de Membros de salamandra têm alguns atributos surpreendentes. Quando um membro anterior é amputado no antebra- ço, o toco remanescente forma na sua ponta, uma massa de células desdiferen- ciadas (blastema regenerativo), que se divide e diferencia formando um novo membro. O novo tecido do membro se ini- cia no local da amputação, nesse caso, formando o resto do membro, do antebra- ço para baixo. Quando o membro é ampu- tado no pulso, forma-se um blastema re- generativo parecido. Entretanto, não é re- formado o tecido do antebraço, cotovelo e cúbito; em lugar disso, o local “sendo conhecido” regenera somente o pulso e os dígitos. Como é armazenada essa “memória posicional”? Nardi e Stocum (1983) de- monstraram que colocando junto dois blastemas de membros de salamandra com o mesmo nível de origem eles se fundem, mas nenhum envolve o outro (Figura 3.9). Entretanto, quando os blastemas são de níveis diferentes, o mais proximal (perto do corpo) envolve o mais distal. Parece, então, que as propriedades adesivas des- sas células formam um gradiente ao lon- go do eixo proximodistal; essas proprie- dades são maiores no pulso e menores no antebraço. Crawford e Stocum (1988) conseguiram relacionar essa distribuição de células in vitro ao processo de regeneração de mem- bro ao vivo. Blastemas do pulso, cotovelo ou antebraço foram enxertados na junção blastema-toco de um membro posterior re- generando a partir da meia coxa. Os blastemas de membro anterior migraram distalmente até o nivel correspondente do membro posterior do hospedeiro e regene- raram uma nova estrutura (Figura 3.10). O blastema do antebraço imediatamente re- generou um membro completo a partir do nível da meia coxa; o blastema do cotovelo se moveu ao nível do joelho e formou o resto do braço a partir desse ponto; o blastema do pulso foi deslocado até o fim do membro posterior em regeneração, onde formou um pulso ao nível do tarso do pé. Esses dados sugerem que as hierarquias da distribuição celular, vistas in vitro, re- fletem diferenças que são usadas pelo cor- po, in vivo, na construção de novos órgãos. Figura 3.9Figura 3.9Figura 3.9Figura 3.9Figura 3.9 Distribuição quando blastemas de níveis iguais ou diferentes, de membros anteriores, são co- locados juntos em cultura. (Um membro de cada par foi marcado com tritio para distinguí- lo do outro). Depois de três dias em cultura, os agregados foram fixados e secionados. Blastemas do mesmo nível fundiram em uma linha reta. Quando os blastemas eram de dife- rentes níveis, o blastema proximal parecia ten- tar envolver as células mais distais. (de Nardi e Stocum, 1983, cortesia de D. Stocum.) Informações adicionais Especulações &
  • 88 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Blastema de pulso Blastema de cotovelo Blastema de antebraço Blastema de coxa mediana Enxertar blastema no blastema em regeneração da coxa mediana Permitir crescimento externo dos enxertos A base molecular das adesões célula-célula As classes de moléculas de adesão celularAs classes de moléculas de adesão celularAs classes de moléculas de adesão celularAs classes de moléculas de adesão celularAs classes de moléculas de adesão celular A formação de tecidos e órgãos é mediada por eventos que ocorrem na superfície de células adjacentes. A superfície celular inclui a membrana plasmática, as moléculas diretamente abaixo dela e a ela associadas, e as moléculas encontradas no espaços extracelulares. Células eucarióticas são envolvidas por uma complexa borda molecular chamada membrana plasmática (ou celular).Amembrana plasmática é uma bicamada fluida lipídica que contém proteínas capazes de interagir com o ambiente externo. Certas proteínas têm seus sítios ativos apontando para fora, em direção a outras células; existem três classes de moléculas da membrana celular (principalmente prote- ínas) que estão particularmente envolvidas no controle de interações específicas com outras células (Edelman e Thiery, 1985): • Moléculas de adesão celular. Essas proteínas participam da adesão célula- célula. Elas podem unir células em lâminas epiteliais e condensar células me- senquimatosas em agregados coesos. Elas têm um papel crítico na separação de diferentes tecidos entre si. • Moléculas da junção celular. Essas moléculas fornecem vias de comunicação entre o citoplasma de células adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade e força mecânica às lâminas epiteliais. • Moléculas de adesão a substrato. Essas moléculas permitem ligação das célu- las às suas matrizes extracelulares. Elas incluem componentes da matriz extra- celular e seus receptores situados na superfície da célula. Moléculas de ade- são a substrato permitem o movimento de células do mesênquima e neurônios, e permitem a separação espacial das lâminas epiteliais. Os padrões locais de expressão dessas moléculas da superfície celular, propiciam uma conexão importante entre o código genético unidimensional e o organismo tri- dimensional. Modulando o aparecimento dessas moléculas, o potencial genético pode se manifestar no processo mecânico da morfogênese. Figura 3.10Figura 3.10Figura 3.10Figura 3.10Figura 3.10 Distribuição in vivo, onde blastemas de mem- bros anteriores em regeneração (em cores) en- xertados em blastemas da coxa mediana (cin- za) são deslocados para a região correspon- dente do membro posterior em regeneração (pulso ao tarso; cotovelo ao joelho; antebraço à coxa mediana) onde iniciam a formação do membro anterior, distalmente daquele ponto. (de Crawford e Stocum, 1988.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 89 Secionar e cultivar clones cujos sobrenadantes testam positivo Cultivar clones de hibridomas individuais de poços positivos Seleção em meio HAT; selecionar anticorpos Fusão Células de mielomaCélulas de baço de camundongo Células mutantes de mieloma, sem enzima HPRT Imunização Anticorpos monoclonais e genética reversa Monitoramentodemodificaçõesdamem- brana celular através de anticorpos mo- noclonais. A expressão de componentes da membra- na muda no espaço e no tempo. Diferen- tes tipos de células possuem componen- tes da superfície celular que são diver- sos, e que mudam enquanto a célula se desenvolve. Esses componentes da mem- brana, tecido-específicos, são freqüente- mente reconhecidos por antisoros e, por essa razão, denominados antígenos de diferenciação (Boyse e Old, 1969). Antígenos de diferenciação específicos podem atualmente ser identificados por anticorpos monoclonais (Figura 3.11). Ge- ralmente, esses anticorpos são produzi- dos injetando celulas estranhas em ca- mundongos (ou células de camundongos de uma linhagem em animais de outra li- nhagem). Os linfócitos B do camundon- go começarão a produzir anticorpos con- tra cada um dos componentes estranhos dessas células, sendo que cada linfócito B produz um único tipo de anticorpo. Es- ses linfócitos são tornados “imortais” pela fusão com células cultivadas de linfócito B de tumores (mielomas), que foram mutados de modo a: (1) não sintetizar seus próprios anticorpos e (2) não ter a enzima de recuperação de purinas, hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT). Devido a essa última alteração, as células do mieloma só podem produzir nucleotídeos de purina de novo, não podendo usar as purinas do meio de cultura. Após a fusão, as células são cultivadas em um meio con- tendo aminopterina, uma droga que inibe a via de síntese de novo da purina. Assim, células do mieloma não fundidas morrem por fome de purinas. Elas não podem pro- duzir nucleotídeos de purina usando a via de recuperação mediada por HPRT e a aminopterina bloqueia também a via de novo. Linfócitos B normais também não dividem-se em cultura, de modo que eles morrem igualmente. O produto da fusão do linfócito B e da célula do mieloma – o hibridoma – prolifera, porque possui a enzima de recuperação de purina do linfócito B e as propriedades de cresci- mento do tumor. Mais ainda, cada um Figura 3.11Figura 3.11Figura 3.11Figura 3.11Figura 3.11 Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. Células do baço de um camundongo imuniza- do são fundidas com células mutadas de mieloma, sem a enzima HPRT. Células são cultivadas em um meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (HAT). Células de mieloma não fundidas não podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a única via para sinte- tizar nucleotídeos purínicos. Células B morrem nesse meio, mesmo contendo a enzima (HPRT) que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio.As células fundidas (hibridomas) crescem e se dividem. Os poços nos quais crescem os hibridomas são selecionados quanto à presença do anticorpo efetivo, e as células de poços positivos são semeadas em densidade suficientemente baixa para permitir que células individuais originem clones discretos. Esses clones são isolados e selecionados para o anticorpo efetivo. Tal anticorpo é monoclonal. Os hibridomas produzindo esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. (de Yelton e Scharff, 1980.) Informações adicionais Especulações &
  • 90 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Célula epitelial não diferenciada Fotorreceptor Fotorreceptor maduro Neurônio Neurônio sensorial fotorreceptor 28H9 antígeno Vários antígenos não específicos 22C10 antígeno 24B10 antígeno 21A6 antígeno Figura 3.13Figura 3.13Figura 3.13Figura 3.13Figura 3.13 Mudanças temporais na membrana celular correlacionadas com a morfogênese de uma célula retinal fotorreceptora da Drosophila. Enquanto se procede a diferenciação, diferentes antígenos se expressam na membrana celular. (de Venkatesh et al., 1885.) Segmentos externos de fotorreceptores Somas de fotorreceptores (camada nuclear externa) Camada sináptica externa Camada nuclear interna (soma interneuronal) Camada sináptica interna Soma das células ganglionárias Axônios das células ganglionárias (A) (B) (C) (D) desses hibridomas secreta o anticorpo es- pecífico do linfócito B. O meio no qual estão crescendo os hibridomas é testado quanto à presença de anticorpos que se ligam à população original das células es- tranhas. Tais anticorpos, tendo um único linfócito B como sua fonte original, é de- nominado anticorpo monoclonal.Anticor- pos monoclonais podem ser produzidos em grandes quantidades e podem reco- nhecer antígenos (proteínas, lipídeos e carboidratos) que são fracamente expres- sos (Köhler e Milstein, 1975). Anticorpos monoclonais dirigidos contra tipos específicos de células, de- monstraram numerosos antígenos de di- ferenciação aparecendo em diferentes tempos e lugares durante o desenvolvi- mento. A Figura 3.12 mostra diferentes moléculas da superfície celular, em dife- rentes camadas espaciais da retina neural de um pinto recém-eclodido. Cada um dos anticorpos monoclonais reconhece uma molécula diferente na membrana celular. Como está evidente nesta fotografia com- posta, as membranas de todas as células da retina neural não são iguais. Na verda- de, regiões da mesma membrana celular podem ser diferentes; as membranas dos axônios e da soma do nervo, por exemplo, contêm moléculas diferentes.AFigura 3.13 mostra mudanças temporais na membrana celular de uma única célula epitelial de Drosophila enquanto ela se desenvolve em um fotorreceptor retinal. Anticorpos monoclonais foram obtidos após injetar camundongos com homogenatos de teci- do da cabeça de Drosophila, e um painel de anticorpos foi testado em células do disco imaginal do olho larval que se dife- renciavam em estruturas do olho. Assim que as células epiteliais, não diferencia- das, do disco mostram propriedades neuronais, elas expressam o antígeno 22C10. Esse antígeno é também encontra- do em outros tipos de células neuronais. Mas logo em seguida, a célula começa a expressar outra molécula da membrana, o antígeno 24B10. Essa molécula é encon- trada somente nos neurônios que se trans- formarão em fotorreceptores. Nos estági- os seguintes (aproximadamente 80 horas mais tarde), o antígeno 21A6 é expresso em certas regiões de fotorreceptores em maturação, e outro antígeno, 28H9, é ca- racterístico de fotorreceptores retinais ter- minalmente diferenciados (Zipursky et al.,1984). Assim, membranas celulares de diferentes tipos de células contêm molé- culas diferentes, e essas podem mudar du- rante a maturação da célula. Da proteína ao gene Como antígenos de diferenciação são pro- teínas cuja expressão é regulada no tem- po e no espaço, e como essas mudanças são freqüentemente correlacionadas com mudanças morfológicas específicas (como mostra a Figura 3.13), seria interessante saber como seus genes são regulados. Por exemplo, o conhecimento de como a pro- teína 24B10 se expressa poderia dar indicacões sobre os mecanismos genéti- cos da diversidade neuronal. Como po- demos realizar essa “genética reversa” indo da proteína para o gene? Em primeiro lugar, ligamos anticorpos monoclonais às particulas de resinas e passamos homogenatos de retina em colunas contendo esse material (Figura 3.14). (Essa é uma coluna de imunoafini- dade.) O anticorpo se liga somente ao antígeno reconhecido originalmente, e a proteína ligada à resina é eluída (por so- luções salinas) e submetida à eletrofore- se em gel para separá-la de um possível Figura 3.12Figura 3.12Figura 3.12Figura 3.12Figura 3.12 Especificidade da superíficie celular da retina neural de galinha. (A) Fotografia de contraste de fase de uma seção da retina neural de um pinto recém-eclodido. (B) Seção de retina marcada com um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece células retinais (mas não outras neuronais). (C) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos neuronais mas não corpos celulares na retina. (D) Seção retinal marcada com anticorpo mono- clonal fluorescente que reconhece antígeno em um subconjunto de processos em células nervo- sas nas camadas sinápticas externas e internas. (Cortesia de G. Grunwald.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 91 Anticorpo monoclonal ao antígeno 24B10 Juntar anticorpo marcado ao antígeno 24B10, na seção retinal 1 Cobrir partículas de resina com anticorpo monoclonal Localização de 24B10 por anticorpo monoclonal marcado com fluoresceína 2 Preparar coluna de imunoafinidade com partículas cobertas Homogenato retinal 3 Adicionar homogenato de retina contendo antígeno 24B10 (•) e outros antígenos (•) 4 Depois que outros antígenos (•) passam através da coluna, eluir material (•) remanescen- te nas partículas, separar por eletroforese em gel e corar gel para proteína Proteína purificada, antígeno 24B10 5 Eluir proteína purificada 24B10 do gel e seqüenciar o amino terminal Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro AUG- GAA - GAA - AGG - CAG - AAC - CC TAC - CTT - CTT - TCC - GTC - TTG - GG 6 Gerar uma seqüência mensageira possível e sintetizar uma seqüência complementar radioativa 7 Usar essa sonda para selecionar a biblioteca de fago do genoma da Droso- phila; seqüenciar o clone positivo 8 Isolar e caracterizar gene Seqüência esperada TCC ATG TTC GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu Thr His Tyr Pro Pro Cys Thr Tyr Asn Val Met Cys contaminante. A região do gel contendo a proteína é separada, a proteína eluída da matriz do gel é parcialmente seqüen- ciada. É necessário sintetizar oligonucle- otídeos radioativos que se ligariam a uma seqüência de DNA capaz de codificar tal proteína. No caso da 24B10, essas son- das radioativas foram usadas para sele- cionar uma biblioteca de clones de DNA recombinante contendo regiões do ge- noma de Drosophila. O DNA de Droso- phila de cada clone positivo foi seqüen- ciado para verificar se esse complemen- tava a seqüência da proteína original iso- lada pelo anticorpo monoclonal. Por essa via, podemos ir de uma rara proteína identificada por um anticorpo monoclo- nal a um pedaço específico do DNA genômico. (Zipursky et al.,1984; Venka- tesh et al., 1985.) Figura 3.14Figura 3.14Figura 3.14Figura 3.14Figura 3.14 Protocolo para encontrar o gene que codifi- ca a proteína identificada por um anticorpo monoclonal. O oligonucleotídeo decodificado pela estrutura da proteína não precisa ser um par perfeito com a verdadeira seqüência. (de Venkatesh et al., 1985; fotografia corte- sia de S. Benzer.)
  • 92 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Célula isotípica marcada com 3 H (cartilagem) Célula heterotípica marcada com 14 C (fígado) Agregado (cartilagem) Contar células radioativas que aderiram ao agregado Rotação por seis horas Moléculas de adesão celular Identificando moléculas de adesão celular e seu papel noIdentificando moléculas de adesão celular e seu papel noIdentificando moléculas de adesão celular e seu papel noIdentificando moléculas de adesão celular e seu papel noIdentificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimentodesenvolvimentodesenvolvimentodesenvolvimentodesenvolvimento Os estudos de distribuição de Holtfreter e Steinberg não identificaram as moléculas envolvidas na adesão celular diferenciada. Roth (1968; Roth et al., 1971) demonstrou que diferentes tipos de células mostram uma adesão celular seletiva independente da distribuição das células. Ele modificou o ensaio de agregação rotatório, incubando células de cartilagem marcadas com 3 H e hepatócitos marcados com 14 C em uma solu- ção em rotação, contendo pequenos agregados de células de cartilagem não marcadas. Medindo as células marcadas com 14 C e 3 H nesses agregados, ele demonstrou que os agregados de cartilagem escolheram especificamente células de cartilagem. Experi- mentos similares estenderam essas conclusões às células do músculo e do fígado (Figura 3.15). Esses estudos indicaram que tipos diferentes de células podiam usar diferentes moléculas de adesão. A tarefa seguinte é identificar as moléculas mediadoras da adesão celular e desco- brir como conseguem realizar esse feito. Várias moléculas de adesão celular (CAMs), foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas, cujas propri- edades de adesão celular dependem de íons cálcio e as CAMs da superfamília de imunoglobulinas, cujos domínios de ligação às células se parecem aqueles de molécu- las de anticorpos. A Tabela 3.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas. CaderinasCaderinasCaderinasCaderinasCaderinas Íons de cálcio são freqüentemente necessários para a adesão celular. Os íons esta- bilizam as conformações adesivas de certas proteínas da superfície celular chama- das caderinas. Caderinas têm um papel crítico no estabelecimento e manutenção de conexões intercelulares, e parecem ser cruciais para a segregação espacial de célu- las e para a organização da forma animal (Takeichi, 1987). Caderinas interagem com outras caderinas de células adjacentes e são ancoradas na célula por complexos de proteínas chamados cateninas (Figura 3.16). O complexo caderina-catenina forma a clássica junção aderente que liga as células epiteliais entre si. Mais ainda, como as cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina, elas integram as células epiteliais em uma unidade mecânica. Em embriões de vertebrados, quatro classes principais de caderinas foram identificadas: Figura 3.15Figura 3.15Figura 3.15Figura 3.15Figura 3.15 Especificidade da associação célula-célula.Agregados coletores, cada um consistindo de um tipo de célula, são colocados em um frasco de cultura giratório contendo células isoladas do mesmo tipo (isotípico) e de tipos diferentes (heterotípico).As células isoladas, isotípicas e heterotípicas, foram previamente marcadas com diferentes radioisótopos. Após seis horas, os agregados foram colhidos, lavados e determinados os números de células isotípicas e heterotípicas que aderiram ao agregado, como mostra a tabela abaixo. (Dados de Roth, 1968.) Contagem das células radioativas que aderiram ao agregadoContagem das células radioativas que aderiram ao agregadoContagem das células radioativas que aderiram ao agregadoContagem das células radioativas que aderiram ao agregadoContagem das células radioativas que aderiram ao agregado Células isoladas marcadas em suspensão* Tipo de agregado Cartilagem Fígado Músculo peitoral Cartilagem 100 6 48 Fígado 10 100 0 Músculo peitoral 38 49 100 * Porcentagem do número médio de células coletadas pelos agregados isotípicos.
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 93 Sítios de fosforilação Reconhecimento do sítio de adesão Sítio de ligação de cálcio Membrana celular Cateninas Actina Ligação caderina-caderina Caderina Caderina • E-caderina (caderina epitelial, também chamada uvomorulina e L-CAM) é ex- pressa em todas as células embrionárias precoces de mamíferos, mesmo no estágio de uma célula. Mais tarde, essa molécula é restrita a tecidos epiteliais de embriões e adultos. • P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em célu- las placentárias do embrião de mamífero, que fazem contato com a parede uterina (as células trofoblásticas) e o próprio epitélio da parede uterina (Nose e Takeichi, 1986). É possível que a P-caderina facilita a conexão do trofoblasto com o útero, pois a P-caderina nas células uterinas é visualizada em contato com a P-caderina das células trofoblásticas de embriões de camundongos (Kadokawa et al., 1989). TTTTTabela 3.1abela 3.1abela 3.1abela 3.1abela 3.1 Classificação geral das principais moléculas de adesão celular (CAMs) Classe CAM Tipo celular Caderinas N-caderina (a.k.a. A-CAM) Nervos, rins, lentes, coração (cálcio-dependente) P-caderina Placenta, epitélio E-caderina (a.k.a. L-CAM, Epitélio, blástula de camundongo uvomorulina) CAMs da super N-CAM Músculos, nervos, rins família de imuno- Ng-CAM (a.k.a. L1, NILE) Glia, neurônios globulinas Neurofascina Neurônios de Drosophila (cálcio-independente) CAM-celular Hepatócitos LFA-1 Linfócitos CD4 glicoproteína (HIV receptor) Indutor de células T Figura 3.16Figura 3.16Figura 3.16Figura 3.16Figura 3.16 Representação esquemática da adesão celular mediada por caderina. Caderinas estão associ- adas com três tipos de cateninas. As cateninas podem se associar com o sistema de microfila- mentos de actina.Aimportância dessas intera- ções para o desenvolvimento normal é vista na Figura 3.18; caderinas que não têm o domínio extracelular podem interferir com o desenvol- vimento. Presumivelmente, elas competem com as caderinas normais, ligando as cateninas disponíveis com seus domínios citoplasmáti- cos. (de Takeichi, 1991).
  • 94 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (C) (B) (A) Ectoderma Crista Neural Células migratórias Tubo neural E-caderina N-caderina • N-caderina (caderina neural) é vista inicialmente nas células mesodérmicas no embrião em gastrulação enquanto elas perdem sua expressão de E-caderina. É intensamente expressa nas células do sistema nervoso central em desenvolvi- mento (Figura 3.17; Hatta e Takeichi, 1986). • EP-caderina (C-caderina) é crítica na manutenção da adesão celular entre os blastômeros da blástula de Xenopus e é necessária para os movimen- tos normais de gastrulação (Figura 3.18; Heasman et al., 1994; Lee e Gumbiner, 1995). Caderinas promovem a aderência celular, ligando-se ao mesmo tipo de caderina em outra célula. Assim, células com E-caderina grudam em outras células que têm E- caderina, e se separarão de outras células contendo N-caderinas em suas membranas. Essa ligação é chamada ligação homofílica. Células expressando N-caderinas rapida- mente se isolam de células N-caderina-negativas in vitro, e anticorpos univalentes contra caderinas converterão um agregado de células tridimensional histotípico, em uma camada única (Takeichi et al., 1979). Mais ainda, quando genes ativados de E- caderina são transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles ex- pressos (usualmente eles não expressam essa proteína), E-caderina é vista em suas superfícies celulares, e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos outros (Nagafuchi et al.,1987). Na verdade essas células começam a se portar como células epiteliais. Expressão de caderinas é freqüentemente correlacionada com agregação e disper- são. Células da crista neural (que estão na porção mais dorsal do tubo neural), inicial- mente expressam N-caderina. Em seguida, enquanto deixam o tubo neural, migrando como células individuais (para formar células pigmentadas, neurônios sensoriais e outros tipos de células), elas perdem a expressão de N-caderina (veja Figura 3.17; veja também Capítulo 7). Entretanto, quando as células migrantes chegam ao seu destino e começam a se agregar entre si para formar gânglios nervosos, elas tornam a expressar N-caderina (Hatta et al.,1987). Expressão diferencial de caderina pode também explicar os dados de distribuição homotípica discutida anteriormente. Como foi discutido, Roth e colaboradores de- monstraram que células de fígado tendem a coletar células de fígado e que células retinais coletam outras células retinais.Takeichi (1987) demonstrou que células retinais expressam N-caderina e células hepáticas expressam E-caderina, e que a distribuição seria a esperada devido a essa diferença na expressão de caderinas. Ele também suge- riu que as observações deTownes e Holtfreter poderiam ser, da mesma forma, explicadas por expressão diferencial de caderinas. Suporte para essa idéia veio de estudos nos quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camun- dongo, que não expressam habitualmente qualquer tipo de caderina. Fibroblastos expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina, enquanto fibroblastos de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. Também, quando tecido pulmonar embrionário foi dissociado e sua recombinação permitida na presen- ça de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento, os fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos túbulos epiteliais pulmo- nares (que expressam E-caderina), enquanto que os fibroblastos não tratados se asso- ciaram às células mesenquimatosas (que não expressam caderinas) (Nose et al.,1988). Todos esses experimentos foram realizados com células cultivadas. Recentemen- te, estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crítico nos fenôme- nos de distribuição ocorrendo dentro do embrião. Quando o mRNA para N-caderina de galinha é injetado em um dos dois blastômeros da primeira clivagem em embrião da rã Xenopus, N-caderina é freqüentemente expressa em células que normalmente não a possuem. Os embriões que expressam N-caderina extra são muitas vezes caracteriza- dos por amontoados de células e camadas tissulares engrossadas. Normalmente, o tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das células que se transformarão em epiderme (a qual expressa E-caderina). Em embriões nos quais a epiderme e o tubo neural expressam a N-caderina extra, o tubo neural não se separa da epiderme (Detrick Figura 3.17Figura 3.17Figura 3.17Figura 3.17Figura 3.17 Localização de duas diferentes caderinas du- rante a formação do tubo neural no camun- dongo. Foi usada marcação imunofluorescen- te dupla para localizar E-caderina (A) e N- caderina (B) na mesma seção transversal do cérebro posterior de um embrião de camun- dongo de 8.5 dias. Anticorpos para E-caderi- na foram marcados com um tipo de corante fluorescente (o qual fluoresce em um interva- lo de comprimento de onda), enquanto anti- corpos para N-caderina foram marcados com um segundo tipo de corante (que emite sua cor em outros comprimentos de onda). Foto- grafias obtidas em diferentes comprimentos de onda. mostram que o ectoderma externo expressa E-caderina predominantemente, ao passo que a invaginante placa neural cessa a expressão de E-caderina, mas passa a expres- sar N-caderina. (C) quando se forma o tubo neural, ele expressa N-caderina, a epiderme expressa E-caderina e as células da crista neural nenhuma das duas. (Fotografias de K. Shimamura e H. Matsunami, cortesia de M. Takeichi; C de Rutishauser, 1988.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 95 (A) (B) et al., 1990; Fujimori et al., 1990).Assim, as caderinas estão, provavelmente, tendo um papel principal na organização das células em tecidos. [cell2.html] CAMs da superfamília de imunoglobulinasCAMs da superfamília de imunoglobulinasCAMs da superfamília de imunoglobulinasCAMs da superfamília de imunoglobulinasCAMs da superfamília de imunoglobulinas Como discutimos no Capítulo 1, anticorpos foram usados inicialmente para identificar moléculas de adesão celular em Dictyostelium. Gerisch e colegas (Beug et al.,1970), prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo que somente suas regiões monovalentes ligantes de antígeno permanecessem – os fragmentos Fab. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados, porque de outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar células e o efeito não poderia ser medido). Isso levou à descoberta de uma glicoproteína de 80-kDa que é mediadora da adesão célula-célula durante a agregação no fungo pegajoso. A mesma estratégia foi usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al., 1977) que levou ao isolamento de uma molécula de adesão de células neurais (N-CAM). [cell3.html] N-CAM é um membro de uma classe de CAMs que não necessitam íons de cálcio e que têm uma estrutura semelhante (Figura 3.19). Essa estrutura extracelular com seus domínios globulares imobilizados por pontes dissulfeto, se assemelha à molécula de imunoglobulina, e é mesmo possível que as imunoglobulinas sejam derivadas desse grupo de CAMs (Williams e Barclay, 1988; Lander, 1989).Assim, essas glicoproteínas são chamadas CAMs da superfamília de imunoglobulinas*. As CAMs da superfamília de imunoglobulinas podem ter um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. N-CAM é necessária para uma ligação adequada de axônios às células musculares alvos (Covault e Sanes, 1986; Tosney et al.,1986).Além disso, N-CAM parece ser crítica para o empacotamento (fasciculação) de axônios para que se movimentem como uma unidade. Anticorpos à N-CAM po- dem quebrar essas ligações, permitindo que os axônios se dispersem (Fraser et al., 1988; Landmesser et al.,1988). Uma situação similar parece ocorrer em insetos, onde * A designação superfamília é freqüentemente usada porque as diferentes classes de mo- léculas de imunoglobulinas também constituem, elas mesmas, uma “família”. Esses outros membros da superfamília têm estruturas semelhantes às imunoglobulinas, mas não são exata- mente família “próxima”. Figura 3.18Figura 3.18Figura 3.18Figura 3.18Figura 3.18 Importância de caderinas em manter a coesão entre células em desenvolvimento. (A) Quando oócitos são injetados com oligonucleotídeos antisense contra uma mensagem de caderina herda- da maternalmente, as células centrais dispersam quando o hemisfério animal é removido. Em embriões controle (direita), as células internas permanecem juntas. (B) No estágio de quatro células, os blastômeros que formam o lado esquerdo do sapo são injetados com um mRNA para N-caderina que não tem a região extracelular da caderina. Durante a neurulação as células com a proteína mutante não formam uma camada coerente. (de Heasman et al., 1994; B de acordo com Kintner et al, 1992; fotografias cortesia de J. Heasman e C. Kintner.)
  • 96 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (C)(B)(A) Domínios semelhantes à imunoglobulina (A) Extracelular Domínios semelhantes à fibronectina Citoplasma N-CAM ou fasciclina II ou IgM L1 ou neurogliana Interações de N-CAM célula-célula ou (B) ou N N N N N N N N C C C C C as CAMs da superfamília de imunoglobulinas, chamadas fasciclinas (Figura 3.20) ajudam a migração de axônios (Harrelson e Goodman, 1988). L1 é necessária para a produção de certos axônios (Lemmon et al., 1989), e mutações de L1 no homem causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia, retardamento mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al., 1994). Expressão diferencial de CAM é crítica nos limites entre dois grupos de células. Nesses lugares, o corpo segrega diferentes células em diferentes regiões. Células da notocorda não entram no tubo neural e nem células dermais trespassam para a epiderme. Figura 3.19Figura 3.19Figura 3.19Figura 3.19Figura 3.19 Moléculas de adesão da superfamília de imunoglobulinas. (A) Três membros da superfamília de imunoglobulinas. A forma da molécula de IgM ligada à membrana tem duas cadeias pesadas, cada uma com cinco domínios, e duas cadeias leves, cada uma com dois domínios. N-CAM é um polipeptídeo com cinco domínios. Sua âncora na membrana pode ser a seqüência de aminoáci- dos de uma proteína transmembrana ou um lipídeo. L1 é uma proteína transmembrana com seis domínios globulares. Fasciclina II, a molécula de adesão celular de insetos, e neurogliana se assemelham a N-CAM e L1, respectivamente. (B) Modelo para a adesão das CAMs da super- família de imunoglobulinas. Figura 3.20Figura 3.20Figura 3.20Figura 3.20Figura 3.20 Expressão de fasciclina no sistema nervoso do gafanhoto em desenvolvimento. (A) Estrutura em andaime dos axônios fasciculados em um embrião de gafanhoto como visto em um microscópio de Nomarski. Acom e Pcom são as comissuras anterior e posterior cujos axônios atravessam o segmento; ISN é um neurônio intersegmental e con é um neurônio conectivo. (B,C) Sistema nervoso embriônico como em (A), mas marcado com anticorpos monoclonais feitos para as glicoproteínas fasciclinas da superfície celular. O anticorpo em (B) reconhece um subconjunto de axônios nas comissuras anterior e posterior, enquanto o anticorpo em (C) se liga a uma glicoproteína de membrana dos mais longitudinais fascículos de axônios. As flechas mostram os mesmos locais em (B) e (C). Note que o anticorpo marca somente uma porção de cada axônio. (de Bastiani et al., 1987, cortesia de C. Goodman.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 97 (A) (D) (B) (D) Espaço intracelular (15-40 nm) Canais de comunicação Membranas celulares Conexões (A) (B) Essa segregagação pode ser conseqüência da diferença de CAMs nas populações adjacentes. Por exemplo, penas são induzidas quando células mesenquimatosas deri- vadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de células imediatamente abaixo da epiderme da pele da galinha. As células ectodérmicas estão ligadas entre si por E-caderina, enquanto as células mesenquimatosas, CAM-negativas anteriormen- te, começam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3.21). Através do desenvolvimento da pena, diferentes grupos de células se separam umas das outras, como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM, E-caderina, ou ambas as proteínas (Chuong e Edelman, 1985a,b). Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda Junções em fenda são regiões intercelulares especializadas onde células adjacentes se encontram entre 15-40 nm de distância. Finas conexões servem como canais de comunicação entre células adjacentes (Figura 3.22A,B). Células assim ligadas são chamadas “acopladas”, e pequenas moléculas (MW<1500) e íons podem passar livremente de uma célula para outra. Na maioria dos embriões, pelo menos alguns Figura 3.21Figura 3.21Figura 3.21Figura 3.21Figura 3.21 Distribuição de diferentes CAMs em bordas tissulares. Enquanto as células mesodérmicas se reúnem para induzir o broto das penas no ectoderma, as células mesenquimatosas recém- agregadas expressam N-CAM (A) e as células ectodérmicas expressam E-caderinas (B) nas suas respectivas membranas celulares. (de Chuong e Edelman, 1985a, cortesia de G. Edelman). Figura 3.22Figura 3.22Figura 3.22Figura 3.22Figura 3.22 Proteínas das junções em fenda. (A) Micro- grafia eletrônica de uma fileira de junções em fenda ligando duas células justapostas. (B) Mi- crografia fluorescente de junções em fenda em túbulo renal de embrião de camundongo de 17 dias. (C) Compartimento formado por prote- ínas da junção de fenda entre células que se comunicam umas com as outras. Esse com- partimento na gástrula de camundongo pode ser visto injetando o corante Lucifer Yellow em um célula e observando sua transferência a um pequeno grupo de células. (D) Estrutura da subunidade da junção em fenda. (A de Peracchia e Dulhunty, 1976, cortesia de C. Peracchia; B de Sainio et al., 1992, cortesia de K. Sainio; C de Kalimi e Lo, 1988, cortesia de C. Lo; D conforme Darnell et al., 1986.)
  • 98 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) dos blastômeros precoces estão ligados por junções em fenda, dessa forma permi- tindo que íons e pequenas moléculas solúveis passem livremente entre eles. A habi- lidade de células em formar junções em fenda com algumas células, e não com outras, cria “compartimentos” fisiológicos dentro do embrião em desenvolvimento (Figura 3.22 C). A importância de junções em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em embriões de anfíbios e mamíferos (Warner et al., 1984). Quando anticorpos contra proteínas da junção em fenda foram microinjetados em uma célula específica de uma blástula de Xenopus de oito células, a progênie daquela célula que usualmente está ligada por junções de fenda, agora não podia permitir a passagem de íons ou molé- culas pequenas de uma célula à outra. Ainda mais, os girinos que resultaram das blástulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino de- senvolvimental da célula injetada (Figura 3.23).Aprogênie de tal célula não morreu, mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al., 1984). No em- brião de camundongo, os oito primeiros blastômeros são conectados entre si por junções em fenda. Apesar de frouxamente associadas entre si, essas oito células se movem juntas para formar um embrião compacto. Se a compactação for inibida por anticorpos contra proteínas da junção em fenda, o desenvolvimento posterior ces- sa. Os blastômeros tratados continuam a dividir-se, mas a compactação não ocorre (Lo e Gilula, 1979; Lee et al., 1987). Se RNA antisense contra as mensagens da junção em fenda é injetado em um dos blastômeros de um embrião normal de camundongo, aquela célula não formará junções em fenda e não será incluída no embrião (Bevilacqua et al., 1989). Os canais da junção em fenda são feitos de proteínas chamadas conexinas. Em cada célula, seis conexinas idênticas da membrana se agrupam para formar um canal transmembrana contendo um poro central. O complexo de junção em fenda de uma célula se conecta ao complexo de junção em fenda de outra célula, permitindo que se juntem os citoplasmas de ambas as células (Figura 3.22D). Existem aproximadamente doze tipos de conexinas, e algumas podem ser reguladas por caderinas. Jongen e colaboradores (1991) observaram que em células acopladas por E-caderina, a comu- nicação entre células, mediada por junções em fenda, depende da função de caderinas. Evidências sugerem que caderinas permitem não só o contato entre as células como também modificam as proteínas tipo conexina. Os diferentes tipos de proteína conexina têm papéis separados, mas parcialmente sobrepostos, no desenvolvimen- to normal. Por exemplo, a proteína de junção em fenda conexina-43 é encontrada em quase todos os tecidos do embrião do camundongo em desenvolvimento. Entretan- to, se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereçamento de genes, o embrião ainda se desenvolverá. Parece que a função da proteína conexina-43 pode ser assumida por outras conexinas. Mas, logo após o nascimento, esses camundon- gos têm respiração convulsiva, se tornam cianóticos e morrem. Autópsia desses animais mostra que o ventrículo direito – a câmara que bombeia sangue aos pulmões através da artéria pulmonar – está cheio de tecido que fecha a câmara e impede o fluxo de sangue (Reaume et al.,1995). Mesmo que a perda da proteína conexina-43 possa ser compensada em muitos tecidos, parece que ela é crítica para o desenvol- vimento normal do coração. [cell4.html] A membrana celular tem, então, vários mecanismos pelos quais pode fazer liga- ções com membranas de outras células. Podem ser usadas CAMs da superfamília de Figura 3.23Figura 3.23Figura 3.23Figura 3.23Figura 3.23 Efeitos da junção em fenda no desenvolvimento. Seção de um girino de Xenopus no qual um dos blastômeros, no estágio de oito células, foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um anticorpo contra a proteína da junção em fenda. O lado formado pelo blastômero injetado não tem o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. (de Warner et al., 1984, cortesia deA. E. Warner.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 99 Epitélio Lâmina basal Colágeno Figura 3.24Figura 3.24Figura 3.24Figura 3.24Figura 3.24 Localização e formação da ma- triz extracelular no embrião de galinha.Amicrografia eletrônica de varredura mostra a matriz ex- tracelular na junção das células epiteliais (acima) e mesenquima- tosas (abaixo). As células epite- liais sintetizam uma lâmina den- sa com base de glicoproteína, enquantoascélulasmesenquima- tosas secretam a lâmina reticular feita primariamente de colágeno. (Cortesia de R. L. Trelsted.) imunoglobulinas, CAMs dependentes de cálcio e proteínas de junção. Mas isso não esgota seu repertório. Como já mencionado, a célula também pode se ligar a componentes específicos da matriz extracelular.Agora voltamos nossa atenção para esses componentes. A base molecular da afinidade célula-substrato Afinidade diferencial a substratoAfinidade diferencial a substratoAfinidade diferencial a substratoAfinidade diferencial a substratoAfinidade diferencial a substrato A migração de células, como a migração de pássaros e borboletas monarca, depende da percepção de quando começar a migração, quando cessar a migração e qual rota tomar. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar às células, mas os principais parecem envolver substâncias na matriz extracelular.Ahipótese da afinidade diferen- cial a substrato postula que diferentes células reconhecem diferentes moléculas em várias matrizes extracelulares. Cada tipo de célula migratória prefere certas combina- ções de moléculas da matriz a outras combinações, e essas moléculas orientam a célula para quando e onde migrar. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a célula, por vezes, pode interagir com seus substratos através do sistema chave-fechadura, ou seja, entre a membrana celular e a matriz extracelular. O relacionamento entre a proteína da membrana celular e a molécula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e substrato ou anticorpo e antígeno. Durante a última década foi demonstrado que esse tipo de interação é muito importante para a migração celular. [cell5.html] A matriz extracelularA matriz extracelularA matriz extracelularA matriz extracelularA matriz extracelular A matriz extracelular consiste de macromoléculas secretadas pelas células no seu ambiente imediato. Essas moléculas interagem de modo a formar uma estrutura insolú- vel que pode ter várias funções no desenvolvimento. Em algumas situações, ela pode separar dois grupos adjacentes de células e prevenir qualquer interação. Em outros casos, a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as células migram, ou pode até induzir diferenciação em certos tipos celulares. Um tipo de matriz é mostrado na Figura 3.24.Aqui, uma lâmina de células epiteliais está adjacente a uma camada de tecido mesenquimatoso frouxo.As células epiteliais formaram uma apertada camada extracelular chamada lâmina basal; as células mesenquimatosas secretam uma frouxa lâmina reticular. Juntas, essas camadas constituem a membrana basal da lâmina de células epiteliais. Existem três componentes principais na maioria de matrizes extracelulares: colágeno, proteoglicanos e glicoproteínas grandes que são chamadas moléculas de adesão a substrato (Tabela 3.2).
  • 100 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento COLÁGENO. Colágeno é uma família de glicoproteínas contendo altas porcenta- gens de resíduos de glicina e prolina. Quase metade das proteínas do corpo são constituídas de colágeno, que é o principal suporte estrutural de quase todos os órgãos dos animais. Existem numerosos tipos de colágeno servindo funções espe- ciais. Colágeno Tipo I, encontrado nas matrizes extracelulares da pele, tendões e ossos, perfaz quase 90 porcento do colágeno do corpo. Colágeno Tipo II é mais evidente como secreção das células cartilaginosas, mas também é encontrado na notocorda e no corpo vítreo do olho. Vasos sangüíneos apresentam colágeno Tipo III, e o Tipo IV é encontrado na lâmina basal produzida por células epiteliais (Vuorio, 1986). Outros tipos de colágeno são encontrados ao longo do corpo, especialmente em cartilagem. Colágeno é importante para a formação da lâmina basal, e também está implicado na ramificação dos túbulos epiteliais nas glândulas salivares, pul- mões e outros órgãos. [cell6.html] PROTEOGLICANOS. São tipos específicos de glicoproteínas nas quais: (1) o peso dos resíduos de carboidratos é muito maior do que o da proteína; (2) os carboidratos são cadeias lineares compostas de dissacarídeos repetitivos. Usualmente, um dos açúcares do dissacarídeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva é chamada glico- saminoglicano (GAG). ATabela 3.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns; a es- trutura básica dos proteoglicanos é mostrada na Figura 3.25.Ainterconexão de proteí- na e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede, e em muitos tipos de células móveis, o proteoglicano envolve as células impedindo que elas se juntem (Figura 3.26).Aconsistência da matriz extracelular depende da relação entre colágeno e prote- oglicanos. Cartilagem, que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos, é macia, enquanto tendões, que contêm predominantemente fibras de colágeno, são rígidos. Na lâmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular além de propiciar suporte estrutural. COLÁGENOS Moléculas longas e delgadas (Tipo I é o mais comum; Tipos II, III, e V-XIII são também encontradas) que se organizam para formar fibrilas, usualmente com 60-70 nm de diâmetro. Colágenos proporcionam força e estabilidade aos tecidos. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Compostos de proteínas e dissacarídeos repetitivos (glicosaminogli- canos). Glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico, uma enorme molécula (108 Da) que liga grandes quantidades de água. Proteoglica- nos sulfatados compreendem uma proteína linear interna à qual estão ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados (condroitina, heparan, queratan e dermatan sulfato). Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares; sua disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades não conhecidas. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Moléculas às quais células aderem permitindo-lhes que se movam. Elas incluem fibronectina, condronectina e tenascina. TTTTTabela 3.2abela 3.2abela 3.2abela 3.2abela 3.2 Principais constituintes da matriz extracelular Matriz extracelular mesenquimatosaMatriz extracelular mesenquimatosaMatriz extracelular mesenquimatosaMatriz extracelular mesenquimatosaMatriz extracelular mesenquimatosa Lâmina basal das células epiteliaisLâmina basal das células epiteliaisLâmina basal das células epiteliaisLâmina basal das células epiteliaisLâmina basal das células epiteliais COLÁGENO IV Os componentes estruturais majoritários da lâmina basal.Ao contrá- rio de outros colágenos, suas fibrilas são como um fino “arame de galinheiro” e se organizam em um substrato semelhante a feltro. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Ácido hialurônico e proteoglicanos sulfatados são freqüentes na lâmi- na basal. Sua presença pode facilitar a passagem de produtos secretados pela lâmina. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Laminina, o componente funcional majoritário da lâmina basal. Um trímero de glicoproteína com sítios de adesão para a membrana celu- lar, colágeno IV e glicosaminoglicanos. Lâmina basal pode conter fibronectina, tenascina, nidogen e outras glicoproteínas adesivas. Fonte: Adaptado de Bard, 1990.
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 101 Proteína esqueleto Monômeros de proteoglicanos Pequenos glicosaminoglicanos (tal como condroitina sulfato) Ácido D-glucurônico N-acetil-D-glucosamina Ácido hialurônico Glicosaminoglicano Ácido hialurônico Glicoproteínas ligantes Agregados de proteoglicanos Figura 3.25Figura 3.25Figura 3.25Figura 3.25Figura 3.25 A estrutura da subunidade e a montagem de um proteoglicano complexo. O dissacarídeo repetitivo do glicosaminoglicano (tal como condroitina sulfato; veja Tabela 3.3) se liga a um esqueleto protéico relativamente peque- no (colorido), para produzir as cadeias de pro- teoglicanos. Essas cadeias podem ser conec- tadas por glicosamino-glicanos mais longos (mostrado aqui como ácido hialurônico) para produzir redes complexas. Glicoproteínas ligantes estabilizam essas últimas associações. (Modificado de Cheney e Lash, 1981.) Ácido hialurônico Ácido glucurônico-N- Tecidos conjuntivos, osso, acetilglucosamina corpo vítreo Condroitina sulfato Ácido glucurônico-N- Cartilagem, córnea, artérias acetigalactosamina sulfato Dermatan sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] Pele, coração, vasos sangüíneos N-acetilgalactosamina sulfato Queratan sulfato Galactose-N-acetilglucosamina Cartilagem, córnea sulfato Heparan sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] Pulmão, artérias, superfície celular N-acetilglucosamina sulfato a Essas são unidades repetitivas típicas desses glicosaminoglicanos. Entretanto, algumas regiões de cada GAG podem ter sacarídeos ligeiramente modificados. GlicosaminoglicanoGlicosaminoglicanoGlicosaminoglicanoGlicosaminoglicanoGlicosaminoglicano Unidade dissacarídica repetitivaUnidade dissacarídica repetitivaUnidade dissacarídica repetitivaUnidade dissacarídica repetitivaUnidade dissacarídica repetitivaaaaaa DistribuiçãoDistribuiçãoDistribuiçãoDistribuiçãoDistribuição TTTTTabela 3.3abela 3.3abela 3.3abela 3.3abela 3.3 Unidadesdissacarídicasrepetitivasdeglicosaminoglicanosmaiscomuns encontradasemproteoglicanosdamatriz
  • 102 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Proteoglicanos também são importantes como mediadores de conexões entre tecidos adjacentes em um órgão. No órgão, eles reúnem células soltas para formar uma lâmina epitelial* (San Antonio et al.,1987; Thesleff et al., 1989; Vainio et al., 1989; Bernfield e Sanderson, 1990). Em alguns casos, proteoglicanos secretados por um tipo de célula são essenciais para o crescimento de células vizinhas. Axônios dos gânglios da raiz dorsal têm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas prote- ínas da superfície celular; a remoção desses proteoglicanos impede a proliferação ao seu redor, das células de Schwann associadas (Ratner et al.,1985). Uma maneira pela qual cadeias de glicosaminoglicanos, de proteoglicanos, podem funcionar é reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Fatores de cres- cimento são proteínas semelhantes a hormônios que regulam mitose ou diferencia- ção quando se ligam a determinadas células. Entretanto, o receptor celular para o fator de crescimento freqüentemente não liga o fator com grande afinidade. Na verdade, o fator é inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano, e isso concentra o fator de crescimento localmente, de modo a ser possível a ligação com o receptor (Massagué, 1991; Yayon et al.,1991). GLICOPROTEÍNAS EXTRACELULARES. Matrizes extracelulares contêm uma va- riedade de outras moléculas especializadas, tais como: fibronectina, laminina e te- nascina. Essas glicoproteínas grandes provavelmente são responsáveis pela orga- nização de colágeno, proteoglicanos e células em uma estrutura ordenada. Fibro- nectina é um dímero de glicoproteína, muito grande (460-kDa), sintetizada por fibroblastos, condrócitos, células endoteliais, macrófagos e certas células epiteliais (como hepatócitos e amniócitos). Uma função da fibronectina é servir como adesivo Figura 3.26Figura 3.26Figura 3.26Figura 3.26Figura 3.26 Capadeproteoglicanosenvolvendocélulasmó- veis. (A) Capa de hialuronidato envolve mioblastos de galinha. Mioblastos em cultura excluem pequenas partículas (nesse caso, hemácias fixadas) em distância significante da borda celular. (B) quando os mioblastos são tratados com hialuronidase (a qual dissolve áci- do hialurônico), essa capa extracelular desapa- rece. (C) A capa também desaparece quando os mioblastos cessam a divisão e se juntam enquanto se diferenciam. (D) Micrografia ele- trônica de hialuronidato em solução aquosa mostra uma rede fibrilar ramificada. (A-C de Orkin et al., 1985, cortesia de B. Toole; D de Hadler et al., 1982, cortesia de N. M. Hadler.) *Proteoglicanos de heparan sulfato são considerados como agregadores de condrócitos, as células produtoras de cartilagem. Níveis excessivos de glicose inibem a síntese do esqueleto de proteína do proteoglicano, inibindo a formação da cartilagem. Leonard e colaboradores (1989) propuseram esse como um possível mecanismo para explicar problemas esqueléticos em crianças nascidas de mães severamente diabéticas.
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 103 Domínios para ligação de células da crista neural de aves Sítio de alta afinidade RGDS CS1 H2 N (B) COOH Domínio ligante de fibrina e heparina Domínio ligante de colágeno Domínios ligantes de células para fibroblastos Sítio II ligante de heparina Sítio II ligante de fibrina (A) molecular em geral, ligando células a substratos, tais como: colágeno e proteoglica- nos. Fibronectina também organiza a matriz extracelular por ter vários pontos de ligação distintos, que interagindo com as moléculas apropriadas produz um alinha- mento adequado de células e sua matriz extracelular (Figura 3.27). Como será visto em capítulos posteriores, fibronectina tem também um papel im- portante na migração celular. As “rodovias” pelas quais se movem certas células migratórias são pavimentadas com essa proteína.Amigração de células mesodérmicas na gastrulação é vista na superfície de fibronectina em muitas espécies, e o movimento dessas células cessa quando a fibronectina é localmente removida. Em embriões de galinha, os precursores do coração, as células precardíacas, migram na fibronectina para se mover das laterais do embrião para a linha mediana. Se embriões de galinhas são injetados com anticorpos à fibronectina, as células precardíacas não migram para a linha mediana e desenvolvem dois corações separados. Anticorpos fluorescentes à fibronectina demonstraram um gradiente da proteína no caminho de migração entre o endoderma e o mesoderma. Se essa região for cortada e sofrer uma rotação, as células do coração seguem o gradiente para novas posições se afastando da linha mediana (Linask e Lash, 1988a,b).Assim, a fibronectina parece ter um papel principal na migra- ção das células precardíacas para a linha mediana do embrião. Outros tipos de células, como as células germinativas, precursoras de embriões do sapo, também migram so- bre células que secretam fibronectina em suas superfícies (Heasman et al.,1981). Laminina é um componente principal da lâmina basal. É composta de três cadeias peptídicas, e, como fibronectina, pode se ligar ao colágeno, glicosaminoglicanos e célu- las.OcolágenoligadoporlamininaédoTipoIV(específicoparalâminabasal),earegião ligante de células da laminina reconhece principalmente células epiteliais e neurônios.A adesão de células epiteliais à laminina (na qual elas se assentam e usam) é muito maior do que a afinidade de células mesenquimatosas pela fibronectina (à qual elas devem se ligar e liberar se deverá haver migração). Como a fibronectina, a laminina tem um papel na montagem da matriz extracelular, promovendo adesão celular e crescimento, mudando a formadacélulaepermitindoamigraçãocelular(Hakomorietal.,1984). Nem todas grandes glicoproteínas celulares promovem adesão celular. Tenascina (também chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade Figura 3.27Figura 3.27Figura 3.27Figura 3.27Figura 3.27 Fibronectina no embrião de galinha em desen- volvimento. (A)Anticorpos fluorescentes para fibronectina mostram que a deposição de pro- teína no embrião de 24 horas se situa ao longo da lâmina basal de muitos órgãos. (B) Estrutu- ra e domínios de ligação na fibronectina. Os retângulos representam domínios resistentes a proteases. O domínio para a ligação de fibro- blastos compreende duas unidades, o sítio RGD e o sítio de alta afinidade; ambos são essenciais para ligação da célula. Células da crista neural de aves têm outro sítio necessário para sua mobilidade em um substrato de fibro- nectina. Outras regiões na fibronectina permi- tem ligações com colágeno, heparina* e outras moléculas da matriz extracelular. (A cortesia de J. Lash; B conforme Dufour et al., 1988.) *Heparina é uma porção de um proteogli- cano de heparina secretada por mastócitos e basófilos. Heparan e heparan sulfato são nomes dados a glicosaminoglicanos similares encontra- dos na matriz extracelular ou na superfície da célula. Presume-se que os sítios de ligação para heparina sejam os mesmos que os para heparan sulfato (Bernfield e Sanderson, 1990).
  • 104 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento do comprimento da molécula, e é encontrada transitoriamente em várias matrizes extracelulares durante o desenvolvimento embrionário. Entretanto, diferentes células reagem de maneira diferente à tenascina. Algumas células aderem a ela, outras são arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3.28; Spring et al., 1989). Diferentes quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vários graus de adesividade. Além disso, tenascinas parecem aumentar a síntese e secreção de proteases das células que nela se localizam (Werb et al., 1990).Ambas as caracterís- ticas podem ser importantes na geração de vias para a migração celular, e na remode- lação da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al., 1987; Bronner- Fraser, 1988; Wehrle e Chiquet, 1990). Receptores celulares para moléculas da matriz extracelularReceptores celulares para moléculas da matriz extracelularReceptores celulares para moléculas da matriz extracelularReceptores celulares para moléculas da matriz extracelularReceptores celulares para moléculas da matriz extracelular INTEGRINAS. A habilidade de uma célula em ligar essas glicoproteínas adesivas depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana, que se torna o lugar de ligação na célula para essas grandes moléculas. Os principais receptores de fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação das células à fibronectina (Chen et al.,1985; Knudsen et al., 1985). Foi obser- vado que o complexo receptor de fibronectina é capaz não só de ligar fibronectina no exterior da célula, como também proteínas do citoesqueleto dentro da célula. Então, parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular e une dois tipos de matrizes. Dentro da célula, serve como um sítio de ancoragem para os microfilamentos de actina que movimentam a célula; fora da célula, se liga à fibronectina da matriz extracelular (Figura 3.29). Horwitz e colaboradores (1986; Tamkun et al., 1986) denominaram essa família de receptores protéicos como integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que funcionem conjuntamente. Proteínas integrinas foram encontradas atravessando a membrana de numerosos tipos de células. No lado extracelular, integrina se liga à seqüência arginina-glicina-aspartato (RGD) de várias proteínas adesivas em matri- zes extracelulares, incluíndo vitronectina (encontrada na lâmina basal do olho), fi- bronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher, 1987). No lado citoplasmático, a integrina se liga à talina e ααααα-actinina, duas proteínas que se ligam aos microfilamen- tos de actina. Essa ligação dupla permite o movimento da célula pela contração dos microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al., 1993). Tipos diferentes de células podem ter diferentes moléculas de integrinas com dife- rentesafinidadespormoléculasdamatrizextracelular(Hemleretal.,1987;Hemler,1990). Cada molécula de integrina tem duas subunidades distintas, α e β, e diferentes combinações binárias das subunidades α e β permitem que a integrina se ligue a determinadas moléculas extracelulares. Por exemplo, α2β1 se liga ao colágeno e laminina, enquanto α4β1 se liga somente à fibronectina. Ambas as unidades α e β são necessárias para a ligação com fibronectina ou laminina, mas somente a unidade β conecta com o citoesqueleto interno. Durante a migração, as ligações unindo a unidade β da integrina ao citoesqueleto, podem ser continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e está especifi- camente localizada em sítios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato. É possível que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o citoesqueleto (Beckerle et al., 1987). A importância de integrinas é dramaticamente ilustrada durante a embriogênese de Drosophila. Como as integrinas de vertebrados, as integrinas de Drosophila são compostas de subunidades α e β que atravessam a membrana celular. Nas duas integrinas de Drosophila que são conhecidas, as subunidades β são idênticas, mas as subunidades α são diferentes. Essas duas integrinas freqüentemente funcionam em conjunto efetuando adesão tissular e celular durante o desenvolvimento. No desenvolvimento da asa da Drosophila, duas lâminas epiteliais são aproximadas. A integrina PS1 está situada na superfície basal do epitélio na asa presuntiva dorsal, enquanto a integrina PS2 está na superfície superior do epitélio na asa presuntiva Figura 3.28Figura 3.28Figura 3.28Figura 3.28Figura 3.28 Inibição de adesão celular por tenascina. Fibronectina e tenascina foram colocadas em placasdeculturadetecidos,dispostasemforma de letras. Fibroblastos foram adicionados às placas podendo aderir e migrar. O resultado mostraquefibronectinafoiosubstratopreferido no plástico da cultura de tecidos, enquanto que as células não aderiram ou migraram bem sobre a tenascina. (Cortesia de M. Chiquet.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 105 (A) Fibronectina RGD Sítio de ligação de RGD Sítios de ligação de cálcio Subunidade ß de integrina Subunidade ß de integrina Subunidade α de integrina Extracelular Citoplasma α Actinina Vinculina Talina α Actinina Microfilamento de actina ventral. Durante a metamorfose, esses dois epitélios se encontram e aderem para formar a lâmina de duas camadas da asa. Mutações nas integrinas produzem asas com regiões onde os dois epitélios se separam, como evidenciado por bolhas entre as duas lâminas (Brower e Jaffe, 1989; Wilcox et al.,1989).Algumas mutações de integrinas em Drosophila são letais, porque integrina é necessária para anexar músculos à epiderme e à parede do intestino. Na mutação letal (1) myospheroid, existe uma deficiência nos genes codificando a subunidade β das integrinas de Drosophila. Na ausência dessa subunidade, nenhuma integrina se forma, e os músculos somáticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo e do intestino (Leptin et al.,1989). Integrinas não são as únicas moléculas capazes de se ligar à laminina e à fibronec- tina. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqüência RGD na cadeia A de laminina, outro receptor protéico de laminina na membrana celular se liga a uma se- qüência diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al.,1987;Yow et al., 1988). Os recepto- res têm afinidade diferente por laminina, e essas podem ser importantes para sua função (Horwitz et al., 1985).Aintegrina a3β1 de fibroblastos, por exemplo, tem uma afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M), enquanto a afinidade por laminina de seu receptor epitelial é muito mais alta (Kd =2 x10-9 M). O receptor usado pode ser importante em permitir que as células usem laminina ou como membrana basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a migração (na qual receptores de afinidade menor seriam usados). GLICOSILTRANSFERASES. Outro grupo de proteínas que pode aderir células a proteínas da matriz extracelular são as glicosiltransferases da superfície celular. Essas enzimas ligadas à membrana são rotineiramente encontradas no retículo en- doplasmático e nas vesículas de Golgi, onde elas são responsáveis por adicionar resíduos de açúcar a peptídeos para produzir glicoproteínas. Existem numerosas glicosiltransferases, cada uma específica para um dado açúcar e algumas mostrando também especificidade de substrato. Assim, galactosiltransferase é uma enzima capaz de transferir galactose de um molécula doadora ativada (UDP-galactose) a uma unidade aceptora. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades para diferentes moléculas aceptoras. Galactosiltransferases são enzimas funcionais da membrana celular, e sua adesão à matriz extracelular representa uma catálise “frustrada” (Figura 3.30).Aenzima neces- sita de dois substratos para completar a catálise, o carboidrato aceptor e o açúcar ativado.As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas Figura 3.29Figura 3.29Figura 3.29Figura 3.29Figura 3.29 Dupla função de integrinas ao se ligar com matrizes extracelulares e com o citoesqueleto interno. (A) Imunofluorescência indireta co- rando os microfilamentos de actina de uma célula extendendo um lamelapódio.As fibras de actina irradiam da grade ordenada do cito- esqueleto para o lamelapódio. (B) Diagrama especulativo relacionando a ligação do cito- esqueleto à matriz extracelular através da mo- lécula de integrina. (A de Lazarides, 1976, cortesia de E. Lazarides; B conforme Luna e Hitt, 1992.)
  • 106 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) NDP-açúcar + aceptor NDP + açúcar-aceptor Glicosil transferase Doador de açúcar ativado (NDP-açúcar) Enzima glicosil- transferase (B) Aceptor insolúvel Ligação Ligação de NDP-açúcar à glicosiltransferase Catálise cliva açúcar de NDP e o adiciona ao aceptor (C) proteínas da matriz extracelular tal como a laminina. Isso causa adesão. Quando o segundo substrato aparece, essas adesões podem ser quebradas pela catálise. Em algumas instâncias (como fertilização no camundongo, onde a galactosiltransferase na membrana celular do espermatozóide interage com componentes carboidrato da matriz extracelular secretada pelo óvulo), a adesão é crítica e a catálise não ocorre. Em células migratórias, tanto adesão como catálise são observadas (Toole, 1976; Shur, 1977a,b; Turley e Roth, 1979; Eckstein e Shur, 1989). Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltiplaAdesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltiplaAdesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltiplaAdesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltiplaAdesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla Apesar de estarmos discutindo sistemas de adesão como unidades separadas, os processos morfogenéticos de interação célula-célula são provavelmente realizados por combinações de moléculas de adesão celular. Por exemplo, a fixação inicial do embrião de camundongo à parede uterina parece ser mediada por vários sistemas de adesão. Primeiro, as células de fora do embrião (as células trofoblásticas) têm recepto- res para o colágeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endométrio uterino, e interferência com essa ligação pode impedir a implantação (Farach et al.,1987; Carson et al., 1988, 1993). Segundo, Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as células trofoblásticas podem também aderir às células uterinas através das glicosiltransfera- ses da superfície celular.Terceiro, Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que P- e E-caderinas estão presentes tanto no tecido uterino como no trofoblástico no local da implantação.Assim, células podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem ligar e/ou migrar em substratos específicos. As células também usam sistemas múltiplos para remodelar tecidos por digestão. Por exemplo,quandoembriõesdemamíferosseembebemnoútero,eles“digerem”seucami- nhoatravésdoepitéliodoúteroeatravésdesuamembranabasaldelaminina,fibronectina ecolágenoTipoIV(Behrendtsenetal.,1992).Crescimentodoosso,regressãodacaudado girino e formação de órgãos ramificados (tais como: glândulas salivares, rins e pulmões) também requerem quebra da membrana basal. Essa degradação controlada de moléculas damatrizextracelularécompletadaporumconjuntodeenzimascoletivamentechamadas deMetaloproteinasesdegradativasdematrizes(Matrisian,1992;Satoetal.,1994).Algu- mas dessas enzimas estão ligadas à membrana celular, enquanto outras são secretadas diretamentepelascélulasparadentrodamatrizqueserádissolvida.Essasmetaloproteinases incluem: (1) colagenases que digerem colágenos dos Tipo I, II e III; (2) gelatinases que digerem elastina e colágenos IV e V; e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos, fibronectina e laminina. A ativação dos genes das metaloproteinases é realizada coordenativamente, e várias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das enzimas digestivas (Figura 3.31). Logo após a ativação das metaloproteinases, as células ativam os genes para os inibidores dessas proteínas.Aprodução e degradação controlada damatrizextracelularéparteessencialdodesenvolvimentonormal. Figura 3.30Figura 3.30Figura 3.30Figura 3.30Figura 3.30 Interações da superfície celular através de gli- cosiltransferases. (A) A reação padrão de gli- cosiltransferase, na qual um açúcar é transferi- do de um carregador nucleosídeo difosfato a um receptor. (B) Interação entre glicosiltrans- ferases e o grupo carboidrato (aceptor) na gli- coproteína da matriz extracelular. Se o açúcar ativado está ausente, ocorre a adesão (consi- dera-se que isso ocorra durante a fertilização). Se o açúcar ativado está presente em pequenas quantidades, a migração é permitida. (C) Mar- cação da glicosiltransferase da superfície celu- lar, incubando seções microscópicas de um em- brião de galinha de 10-somitos, com UDP-[3 H] galactose. Radioatividade insolúvel vista por radioautografia mostra que esse açúcar radioa- tivo foi transferido às superfícies celulares, es- pecialmente das células mesodérmicas migra- tórias. (A e B modificado de Pierce et al., 1980; C de Shur, 1977a, cortesia de B. Shur.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 107 Procolagenase Colagenase Plasminogênio Colagenase muito ativaAtivaUroquinase Plasmina Prostromelisina Estromelisina Ativação transcricional Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais Os destinos das células são freqüentemente determinados pelas interações em suas superfícies, onde uma molécula de receptor encontra seu ligante complementar. Mas como que certas interações na superfície da célula causam a transcrição de genes específicos dentro do núcleo? As vias entre a membrana celular e o genoma são chamadas vias de transdução de sinais. Várias vias foram descobertas, aqui serão mencionadas as principais. Como veremos, elas parecem ser variações de um mesmo tema. O tema é deveras elegante: cada receptor se estende através da membrana tendo uma região extracelular, uma região transmembrana e uma região citoplasmáti- ca. Quando um ligante é acoplado na região extracelular, sua forma muda e a porção citoplasmática passa a ter atividade enzimática. Essa atividade é usualmente a de uma quinase, que pode usar ATP para fosforilar proteínas, inclusive a si mesmo. O receptor ativo pode agora catalizar reações que fosforilam outras proteínas, e final- mente, a fosforilação ativa um fator de transcrição, antes dormente. Esse fator de transcrição pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. O ligante iniciador da reação pode estar ligado a uma célula ou matriz extracelular ou, ainda, ser uma molécula difusível. Quando a molécula difusível vem do sangue é conside- rada um sinal endócrino. Se o sinal vem de células vizinhas difundindo-se de uma para outra é chamado parácrino. A via JAKA via JAKA via JAKA via JAKA via JAK-----STSTSTSTSTAAAAATTTTT No Capítulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrição inativos até que um sinal de outra célula produz sua fosforilação. Esses fatores de transcrição são as proteínas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrição) (Ihle,1995, 1996). As STATs são fosforiladas pela forma ativa da uma família de quinases, a JAK. A via JAK-STAT é muito importante na diferenciação de células sangüíneas e na ativação do gene de caseína na produção de leite (Briscoe et al., 1994; Groner e Gouilleux, 1995). Nesses casos, um certo fator de diferenciação se liga a seus receptores membrana-abrangente, fazendo com que esse se dimerize (que forme dímeros) (Figura 3.32). Proteínas JAK estão ligadas a cada um dos receptores (em suas respectivas regiões citoplasmáticas), e agora ao serem aproximadas fosforilam o receptor em vários sítios. Os receptores ativados têm agora sua própria ativida- de quinásica e podem fosforilar certos STATs inativos, induzindo sua dimerização. Os dímeros são a forma ativa dos STAT que são translocados para o núcleo onde se ligam às regiões específicas do DNA. Figura 3.31Figura 3.31Figura 3.31Figura 3.31Figura 3.31 Cascata de ativação de metaloproteinases de membrana. Uroquinase é um ativador de plasminogênio, que cliva o plasminogênio dando plasmina. Plasmina ativa as formas precurso- ras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de digerir matrizes extracelulares. (Conforme Matrisian, 1992.)
  • 108 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Receptores de prolactina Prolactina Receptores dimerizados ativos Extracelular Citoplasma Envoltório nuclear Núcleo Inicio da transcrição Promotor do gene de caseína A via RTKA via RTKA via RTKA via RTKA via RTK-R-R-R-R-Rasasasasas Avia de transdução de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as várias áreas da biologia do desenvolvimento. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila, vulvas de nematódeos e cânceres humanos chegaram à conclusão que estudavam o mesmo gene. A via RTK-Ras começa na superfície celular, onde o receptor tirosina quinase liga seu ligante específico. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de crescimento fibroblásticos, fatores de crescimento epidérmico e fatores de crescimen- to derivados de plaquetas. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e, quando conectado com seu ligante, sofre uma mudança conformacional que permite sua dimerização. Esses dímeros têm uma atividade quinásica latente, ativada por mudança conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resíduos particulares de tirosina. Assim, a introdução de um ligante no receptor causa uma autofosforilação no domínio citoplasmático do receptor. A tirosina fosforilada no receptor é reconhecida por uma proteína adaptiva (Figura 3.33)—especificamente, as tirosinas fosforiladas são reconhecidas por uma porção da proteína adaptativa chamada domínio SH2.As proteínas adptativas servem como uma ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de sinalização. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domínio SH2, a proteína adaptativausaseudomínioSH3pararegularoativadordeumaproteínaRasG.Normal- mente, a proteína de tipo selvagem Ras está na sua forma inativa e ligante de GDP. Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado, ela troca um fosfato de outro GTP para transformar o GDP ligado em GTP. Essa catálise é ajudada pelo fator de troca guanina nucleotídeo.ARas ligada a GTP é a forma ativa da proteína que transmite o sinal.Após a transmissão, o GTPé hidrolizado a GDP. Essa catálise é muito estimulada Figura 3.32Figura 3.32Figura 3.32Figura 3.32Figura 3.32 Avia JAK-STAT— nesse caso, a via de ativa- ção do gene de caseína por prolactina. O gene de caseína é ativado durante a última fase do desenvolvimento da glândula mamária (lacto- gênica) e seu sinal é a secreção de prolactina, um peptídeo de 9 aminoácidos da glândula pituitária anterior. Prolactina causa a dimeri- zação dos receptores de prolactina nas células epiteliais do ducto mamário. Uma proteína JAK específica (Jak2) está “atrelada” nesses receptores. Quando os receptores são dimeri- zados, as proteínas JAK fosforilam umas as outras e os receptores vizinhos, ativando a quinase dormente desses receptores. Esses adicionam um grupo fosfato a um resíduo de tirosina (Y) de uma proteína STAT específica (nesse caso Stat5). Isso permite que a proteí- na se dimerize e seja translocada para o núcleo onde se liga a regiões específicas de DNA. Em combinações com outros fatores de transcri- ção (que presumivelmente esperavam sua che- gada), a proteína STAT ativa a transcrição do gene de caseína. GR é o glucocorticóide recep- tor, OCT1 um fator de transcrição geral, e TBP o conjunto de proteínas responsável pela liga- ção de RNA polimerase. (Para detalhes, veja Groner e Gouilleux, 1995.)
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 109 Extracelular Ligante Receptor Citoplasma Ativação de eventos dependentes de cálcio e PKC Fator de transcrição inativo Fator de transcrição ativo Núcleo Modulação da transcrição pela complexação normal da proteína Ras à proteína ativadora de GTP-ase (GAP). Essa proteína de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes, e retorna a Ras à sua forma inativa (Trahey e McCormick, 1987; Gibbs et al., 1988). Realmente, mutações no gene RAS estão relacionadas com uma grande proporção de tumores humanos (Shih e Weinberg, 1982), e as mutações que tornam o gene oncogênico inibem a ligação da proteína GAP. Sem a proteína GAP, a proteína Ras não catalisa eficientemente a hidrólise de GTP permanecendo em sua configuração ativa (Calesetal.,1988;McCormick,1989). A proteína Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. A proteína Ras coloca a proteína inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et al.,1994; Stokoe et al., 1994).Aproteína Raf é chamada MAP-quinase-quinase-quinase (MAPKKK). (MAP quer dizer proteína associada à mitose, mas atualmente é conside- rada como um conjunto maior de fatores de transcrição). A MAPKKK fosforila a MAPKK que, por sua vez, pode fosforilar a MAP quinase. Essa última quinase fosforila os fatores de transcrição que especificam o destino da célula ou a proliferação. Em olhos de Drosophila, por exemplo, considera-se que a cascata ativa o fator de trans- crição Sina (Sevenless-in-Absentia), cuja presença é necessária para a diferenciação do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin, 1990; Dickson et al., 1992). Como veremos mais tarde neste livro, essa via é crítica em numerosos processos desenvolvimentais. Em humanos, mutações nessa via dão origem às formas mais comuns de nanismo, incluindo acondroplasia, que ocorre em 1 entre 50.000 nascimen- tos. Aqui, o tórax e a cabeça crescem normalmente, mas os braços e as pernas são encurtados proximalmente.Adeficiência reside na proliferação mínima da cartilagem da placa de crescimento dos ossos longos. A lesão genética parece estar no gene que Figura 3.33Figura 3.33Figura 3.33Figura 3.33Figura 3.33 A via RTK-Ras amplamente usada. O recep- tor tirosina quinase é dimerizado pelo ligante. Isso causa a autofosforilação do receptor. A proteína SH3 reconhece as fosfotirosinas e ativa as proteínas intermediárias (GRB2 e SOS), as quais ativam a proteína Ras G por permitir a fosforilação da porção GDP da Ras. Ao mesmo tempo, as proteínas GAP estimu- lam a hidrólise dessa ligação fosfato. A Ras ativa é capaz de ativar a proteína quinase C (PKC), que ao seu turno fosforila uma série de quinases. Por fim, a MAP quinase altera a ex- pressão gênica, fosforilando certos fatores de transcrição (que podem penetrar no núcleo para mudar os tipos de genes transcritos) e certos fatores de tradução (que alteram o nível de síntese de proteínas). Em muitos casos, essa via é reforçada pela liberação de íons cálcio.
  • 110 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) FGFR normal: FGF se liga causando dimerização do receptor de FGF (B) Receptor de FGF FGF FGFR dominante negativo FGFR normal FGFR mutante Domínio da tirosina quinase Sinal Receptores sem domínios intracelulares são inativos Excesso do receptor mutante pode seqüestrar o receptor normal do fator de crescimento. Esse heterodímero é inativo. Sem sinal Sem sinal codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9.19; Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994). Esse gene é expresso nas células da cartila- gem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. Quando ativado por um FGF, o FGFR3 sinaliza o condrócito para parar de dividir e começar a diferenci- ação. As mutações nesse gene causam um fenótipo de ganho de função onde o mutante FGFR3 é ativo constitutivamente (isto é, sem a necessidade de ser ativado por um FGF)* (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). [cell7.html] Mutações negativas dominantes em receptores * Nomes podem ser perigosamente ilusivos. Muitos compostos têm mais de uma função na célula, e o que fazem depende do contexto da célula. Certos “fatores de crescimento” podem inibir o crescimento, e alguns “fatores de transcrição” podem ser utilizados para inibir a transcrição. Realmente, alguns fatores de transcrição podem ser usados para regular a tradução. Aqui vemos que moléculas de adesão celular podem ser usadas para transdução de sinais. Proteínas celulares não respeitam nossas fronteiras disciplinares. Osignificado funcional de uma molécula ligante pode ser veri- ficado eliminando seu receptor. Uma maneira de fazer isso é criando mu- tações dominantes negativas de recep- tores. Esse tipo de experimento será bem sucedido se a dimerização for crítica para a função do receptor. Os receptores FGF ativos, em um caso, são dímeros de duas moléculas idênticas embebidas na mem- brana celular. O mutante dominante ne- gativo não formará um dímero ativo, mes- mo com um parceiro do tipo selvagem. Portanto, quando presente em concen- trações suficientemente altas, o receptor mutante compete com receptores FGF normais impedindo que suas proteínas sejam ativadas. Isso pode ocorrer em mutações naturais ou provocadas. Amaya e colaboradores (1991) injetaram mRNA de uma forma mutante de um re- ceptor FGF em embriões de duas células de Xenopus. Essas blástulas não conse- guem responder ao FGF (Figura 3.34). Nesse experimento, embriões que não ti- nham receptores FGF funcionais tinham mesoderma posterior e lateral dramatica- mente reduzido (Prancha 3). Figura 3.34Figura 3.34Figura 3.34Figura 3.34Figura 3.34 Ensaio para receptor dominante negativo para a importância de um determinado receptor. O receptor de FGF (FGFR) é uma RTK transmembrana. (A) Quando dímeros de FGF se ligam à porção extracelular desses receptores, esses se dimerizam e seus dois domínios de proteína quinase se fosforilam mutuamente. Quando fosforilados, acionam um sinal através do citoplas- ma. (B) O receptor dominante negativo não tem o domínio da proteína quinase. Quando liga FGF, produz um dímero inativo, mesmo se o outro parceiro é do tipo selvagem. Assim, o efeito de FGF não é transmitido à célula. Informações adicionais Especulações &
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 111 (A) (B) Extracelular Fosfolipase C Citoplasma RECEPTORES LIGADOS À PROTEÍNA G RECEPTORES LIGADOS À TIROSINA QUINASE (PDGF, EGF, etc). Extracelular Ligante Ligante Citoplasma Proteína G Via IP3 PATHWAY Receptor IP3 MAP quinase Retículo endoplasmático Atividade celular e mitogênese PKC A via do inositol fosfatoA via do inositol fosfatoA via do inositol fosfatoA via do inositol fosfatoA via do inositol fosfato Algumas vezes, a transdução de um sinal da superfície celular causa tantas mudanças, que alterações na expressão do gene constituem somente um pequeno subconjunto do que faz o sinal.Aativação da via do inositol fosfato promove mudanças drásticas na fisiologia da célula pela liberação de íons cálcio do retículo endoplasmático. Essa via é extremamente importante na ativação do espermatozóide e do óvulo, ambos neces- sitando de um aumento na concentração intracelular de íons cálcio. Figura 3.35Figura 3.35Figura 3.35Figura 3.35Figura 3.35 A via do inositol fosfato. (A) A reação de fosfolipase C, transformando PIP2 em DAG e IP3 . (B) Essa reação pode ser iniciada em dois pontos principais na membrana celular. Pri- meiro, a via é iniciada quando o receptor trans- membrana ligado à proteína G é ativado pela introdução do ligante. Essa ativação resulta na ligação de GTP à proteína heteromérica G e sua dissociação em subunidades ativas. Essas subunidades ativam enzimas fosfolipase C (PLC) quepodemcatalizaraformaçãodeDAG e IP3 . Em segundo lugar, a via pode ser ativada pela via RTK. IP3 pode se ligar a um receptor para liberar íons cálcio do retículo endoplas- mático. Neste ínterim, DAG (em presença dos íons cálcio liberados) ativa a proteína quinase C. A proteína quinase estimula o transporta- dor sódio/hidrogênio a trocar íons hidrogênio celulares por íons sódio extracelulares, assim levando a um aumento do pH.
  • 112 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3.35; Berridge, 1993; Shilling et al., 1994). Um ponto de iniciação é o receptor tirosina quinase, mencionado anterior- mente. Além de ativar a proteína Ras G, as tirosina quinases ativadas podem interagir com um tipo de enzima, fosfolipase C (PLC1-y1, que também tem um domínio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). Fosfolipase C pode catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2 ) em dois segundos mensageiros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3 ) e diacilglicerol (DAG). IP3 é capaz de abrir canais de cálcio do retículo endoplasmático, liberando uma grande quantida- de de íons cálcio no citoplasma. DAG ativa a proteína quinase C, que por sua vez ativa a bomba de proteína que troca íons sódio por íons hidrogênio (Swann e Whitaker, 1986; Nishizuka, 1986). O resultado é a elevação de íons intracelulares de cálcio e um aumento no pH intracelular. Um segundo ponto de iniciação é outra classe de receptores, algumas vezes cha- mado de receptores serpentina, porque têm sete domínios transmembrana e “serpen- teiam” através da membrana. Esses receptores estão relacionados com outro tipo de proteína G, a proteína Gheteromérica. Quando o ligante liga-se ao seu receptor, esse ativa a proteína G. Essa ativação dissocia a proteína G em suas subunidades, as quais ativam outro conjunto de fosfolipase C, ou seja, PLC-β1 e PLC-β2. Esses dois tipos de fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Como vere- mos em capítulos posteriores, as mudanças nos íons hidrogênio e cálcio, efetuadas por essa via, alteram não somente a transcrição de genes, mas também a tradução de mRNA e a replicação de DNA. Cruzamentos entre viasCruzamentos entre viasCruzamentos entre viasCruzamentos entre viasCruzamentos entre vias Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares, onde a informa- ção flui em conduítes únicos. Na verdade, essas vias são apenas as principais estradas pelas quais se escoa a informação, pois entre elas existem ruas e avenidas que fazem as conexões entre elas. (Essa pode ser a razão da existência de tantos passos entre a superfície da célula e o núcleo. Cada passo é um ponto de regulação em potencial e um potencial ponto de interseção). Essa comunicação cruzada pode ser vista na Figura 3.35, onde duas vias reforçam uma a outra. Deve-se lembrar também que a célula tem numerosos receptores e está constantemente recebendo muitos sinais simultaneamente. Em alguns casos, a transcrição de genes requer dois sinais. Isso é visto durante o desenvolvimento de linfócitos, onde dois sinais são necessários, cada um produzindo um dos dois peptídeos de um fator de transcrição envolvido na produção de interleucina 2 (IL-2, também conhecida como fator de crescimento da célula T). Um fator, c-Fos, é produzido pela ligação do receptor da célula T ao antígeno (Figura 3.36). Isso ativa a cascata Ras, criando um fator de transcrição, Elk-1, ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. O segundo sinal vem da glicoproteína B7 na superfície da célula que apresenta o antígeno. Esse sinal ativa uma segunda cascata de quinases, finalmente produzindo c-Jun. Os dois peptídeos, c-Fos e c-Jun, podem produzir a proteína AP-1, um fator de transcrição que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expressão (Liet al., 1996). A matriz extracelular e a superfície da célula comoA matriz extracelular e a superfície da célula comoA matriz extracelular e a superfície da célula comoA matriz extracelular e a superfície da célula comoA matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimentofontes de sinais críticos para o desenvolvimentofontes de sinais críticos para o desenvolvimentofontes de sinais críticos para o desenvolvimentofontes de sinais críticos para o desenvolvimento Bissell e colegas (1982; Martins-Green e Bissell, 1995) propuseram que a matriz extracelular é capaz de induzir expressão gênica específica em tecidos em desenvol- vimento, especialmente aqueles do fígado e da glândula mamária, onde a indução de fatores de transcrição específicos dependem da ligação célula-substrato (Liu et al., 1991; Streuli et al., 1991; Notenboom et al.1996). Muitas vezes, a presença de integri- na ligada previne a ativação de genes que especificam a morte celular (Brooks et al., 1994; Montgomery et al., 1994). Portanto, a matriz extracelular é uma fonte importante de sinais que podem ser transduzidos para o núcleo para dar expressão gênica espe- cífica. Estudos recentes mostraram que a ligação de integrinas à matriz extracelular
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 113 CÉLULA APRESENTADORA DO ANTÍGENO SINAL 1 SINAL 2 Citoplasma MHC II Antígeno B7Receptor da célula T CD28 Extracelular Citoplasma T-LINFÓCITO RAF ELK-1 ativa transcrição de c-fos Fator de transcrição AP-1Intensificador de interleucina 2 Transcrição de IL-2 Núcleo pode estimular a via RTK-Ras, como também pode estimular a interação da célula com o L1, N-CAM e caderinas de uma célula vizinha (Bixby et al., 1994; Williams et al., 1994a; Clark e Brugge, 1995). Caderinas (mesmo as solúveis) podem dimerizar receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF, causando a liberação de íons cálcio, ativação transcricional e fenômenos de desenvolvimento caracterís- ticos das respostas do FGF celular (Figura 3.37; Williams et al., 1994b; Doherty et al., 1995). Comunicação cruzada é quase certa acontecer quando as moléculas de ade- são celular são também transdutores de sinais. Interações recíprocas na superfície celularInterações recíprocas na superfície celularInterações recíprocas na superfície celularInterações recíprocas na superfície celularInterações recíprocas na superfície celular Quando duas células interagem durante o desenvolvimento, ambas são modificadas na maioria das vezes. Essa indução recíproca é mediada por interações na membrana Figura 3.36Figura 3.36Figura 3.36Figura 3.36Figura 3.36 Dois sinais são necessários para efetuar a diferenciação de linfócitos T. O primeiro sinal vem de receptores que ligam o antígeno apresentado na superfície das células B ou macrófagos. O segundo sinal vem da ligação da proteína CD28 à proteína B7 que está na superfície da célula apresentante do antígeno. O primeiro sinal dirige a síntese de uma subunidade do fator de transcrição AP-1. A outra subunidade é sintetizada sob direção do segundo sinal. As duas subunidades, c-fos e c-jun, formam o fator de transcriçãoAP-1 que pode ativar intensificadores específicos para a célula T como os que regulam a produção de interleucina 2.
  • 114 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Citoplasma Molécula de adesão celular Receptor FGF Extracelular Citoplasma Sinal celular. Uma via intensamente usada é o sistema Wingless-Hedgehog. Nessa via, duas células (ou grupo de células) são adjacentes; uma delas produz a proteína Hedgehog e a secreta. O peptídeo age na célula vizinha ocasionando a produção da proteína Wingless (Wnt).A proteína Wingless, por sua vez, é também secretada e se liga à célula vizinha, estimulando-a a continuar a síntese de Hedgehog. O resultado é a estabilização de uma borda onde o tecido em um lado secreta proteína Hedge- hog, enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. Essa borda é crítica na produção de segmentos e apêndices em Drosophila, como também, subdivisões cerebrais e membros em mamíferos (Figura 3.38; Ingham, 1994; Niswander et al., 1994; Wilder e Perrimon, 1995). [cell8.html] A superfície celular é um lugar extremamente importante para interações desenvol- vimentais. Essas incluem adesão diferencial de uma célula a outras, a adesão diferen- cial de um tipo de célula a uma matriz extracelular e a comunicação de sinais para a diferenciação e divisão celulares. Em 1782, o ensaista francês Denis Diderot pôs a questão da morfogênese no sonho febril de um físico. Esse elemento podia imaginar que o corpo era formado por uma miríade de “pequenos corpos sensíveis” que se juntavam para formar um agregado, mas ele não podia imaginar como esse agregado poderia se tornar um animal. Estudos recentes mostraram que essa ordenação é devi- da às moléculas na superfície dessas células. Em capítulos subseqüentes, veremos com mais detalhes essas interações morfogenéticas. Estamos agora no estágio onde podemos iniciar o estudo da embriogênese precoce e ver a integração entre os proces- sos orgânicos, genéticos e celulares no desenvolvimento animal. Figura 3.37Figura 3.37Figura 3.37Figura 3.37Figura 3.37 Possíveis interações de moléculas de adesão celular com receptores de FGF. Os receptores FGF podem ser “seqüestrados” pelas moléculas de adesão e colocados juntos. Isso pode ser feito pela interação de moléculas de adesão opostas, ou “ligações cruzadas” de receptores de FGF das membranas celulares opostas podem ativar seus domínios quinase.
  • CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 115 Receptor Frizzled Wingless / proteína Wnt Proteína DPP Prot. Dishevelled Quinase Zw3 wingless patched decapentaplegic Prot. Armadillo (ß-catenina) engrailed hedgehog Proteína Smoothened Ci ativo Receptor Patched Ci inativo Proteína G Proteína engrailed Proteína Hedgehog Figura 3.38Figura 3.38Figura 3.38Figura 3.38Figura 3.38 Interações recíprocas entre células na via wingless-hedgehog em Drosophila. A pro- teína Wingless é secretada por uma célula e se difunde a uma curta distância. A célula vizinha liga a proteína Wingless originando a ativação da proteína, que bloqueia a ação inibidora da quinase Zeste-white-3 sobre a proteína Armadillo (uma catenina). A pro- teína Armadillo ativada induz a célula a transcrever o gene hedgehog (hh). Essa pro- teína é secretada e ligada pela célula vizi- nha. Ligando a proteína Hedgehog faz com que a célula transcreva o gene wingless e secrete a proteína. LITERATURA CITADA Ayama, E., Musci. T. J. and Kirschner, M. W. 1991. Expression of a dominant negative mutant of the FGF receptor disrupts mesoderm forma- tion in Xenopus embryos. Cell 66: 257-270. Armstrong, P. B. 1989. Cell sorting out: The self-assembly of tissues in vitro. CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24: 119-149. Bastiani, M. J., Harrelson, A. L., Snow, P. M. and Goodman, C. S. 1987. Expression of fasciclin I and II glycoproteins on subsets of axon pathways during neuronal development in the grasshopper. Cell 48: 745-755. Beckerle, M. C., Burridge, K., DeMartino, G. N. and Croall, D. E. 1987. Colocalization of calcium-dependent protease II and one of its substrates and sites of adhesion. Cell 51: 569-577. Behrendsten, 0., Alexander, C. M. and Werb, Z. 1992. Metalloproteinases mediate extra- cellular matrix degradation by cells from mouse blastocyst outgrowths. Development 114: 447-456. Bernfield, M. and Sanderson, D. 1990. Syndecan, a morphogenetically regulated cell surface pro- teoglycan that binds extracellular matrix and growth factors. Philos. Trans. R. Soc. Lond. [A] 327: 171-186. Berridge, M. J. 1993. Inositol triphosphate and calcium signalling. Nature 361: 315-325. Beug, H., Gerisch, G., Kempff, S., Riedel, V. and Cremer, G. 1970. Specific inhibition of cell contact formation in Dictyostelium by univalent antibodies. Exp. Cell Res. 63: 147-158. Bevilacqua, A., Loch-Caruso, R. and Erick- son, R. P. 1989. Abnormal development and dye coupling produced by antisense RNA to gap junction protein in mouse preimplanta- tion embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5444-5448. Bissell, M. J., Hall, H. G. and Parry, G. 1982. How does the extracellular matrix direct gene expression? J. Theoret. Biol. 99: 31-68. Bixby, J. L., Grunwald, G. B. and Bookman, R. J. 1994. Ca++ influx and neurite growthin response to purified N-cadherin and laminin. J. Cell Biol. 127: 1461-1475. Boucaut, J. C. 1974. Étude autoradiographique de la distribution de cellules embryonnaires isolées, transplantées dans le blastocèle chez Pleu- rodeles waltii Michah (Amphibien, Urodele). Ann. Embryol. Morphol. 7: 7-50. Boyse, E. A. and Old, L. J. 1969. Some aspects of normal and abnormal cell surface genetics. Annu. Rev. Genet. 3: 269-289. Brackenbury, R., Thiery, J.-P., Rutishauser, U. and Edelman, G. M. 1977. Adhesion among neural cells of the chick embryo. I. Immunolo- gical assay for molecules involved in cell-cell binding. J. Biol. Chem. 252: 6835-6840. Briscoe, J., Guschin, D., and Müller, M. 1994. Just another signalling pathway. Curr. Biol. 4: 1033-1035. Bronner-Fraser, M. 1988. Distribution of tenascin during cranial neural crest development in the chick. J. Neurosci. Res. 21: 135-147. Brooks, P. C. Montgomery, A. M. P., Rosenfeld, M., Reisfeld, R.A., Hu, T., Klier, G. and Cheresh, D.A. 1994. Integrin α v β 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 79: 1157-1164. Brower, D. L. and Jaffe, S. M. 1989. Require- ment for integrins during Drosophila wing de- velopment. Nature 342: 285-287. Cales, C., Hancock, J. F., Marshall, C. J. and Hall, A. 1988. The cytoplasmic protein GAP is implicated as a target for regulation by the ras gene product. Nature 332: 548-551. Carson, D. D., Tang, J.-P. and Gay, S. 1988. Collagens support embryo attachment and outgrowth in vitro: Effects of the Arg-GlyAsp sequence. Dev. Biol. 127: 368-375. Carson, D. D., Tang, J.-P. and Julian, J. 1993. Heparan sulfate proteoglycan (perlecan) expres- sion by mouse embryos during acquisition of at- tachment competence. Dev. Biol. 155: 97-106. Carthew, R.W. and Rubin, G.M. 1990. Seven -in-absentia, a gene required for the speci- fication of R7 cell fate in the Drosophila eye. Cell 63: 561-577 Chen, W. T., Hasegawa, E., Hasegawa, T., Weinstock, C. and Yamada, K. M. 1985. Deve- lopment of cell-surface linkage complexes in cultured fibroblasts. J. Cell Biol. 100: 1103-1114.
  • 116 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Cheney, C. M. and Lash, J. W. 1981. Diversification within embryonic chick somites: Differential response to notochord. Dev. Biol. 81: 288-298. Chuong, C.-M. and Edelman, G. M. 1985a. Ex- pression of cell adhesion molecules in embryo- nic induction. I. Morphogenesis of nestling feathers. J. Cell Biol. 101: 1009-1026. Chuong, C.-M. and Edelman, G. M. 1985b. Ex- pression of cell adhesion molecules in embryo- nic induction. II. Morphogenesis of adult feathers. J. Cell Biol. 101: 1027-1043. Clark, E.A. and Brugge, J. S. 1995. Integrin and signal transduction pathways: The road taken. Science 268: 233-239. Covault, J. and Sanes, J. R. 1986. Distribution of N-CAM in synaptic and extrasynaptic portions of developing and adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 102: 716-730. Crawford, K. and Stocum, D. L. 1988. Retinoic acid coordinately proximalizes regenerate pattern and blastema differential affinity in axolotl limbs. 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