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Tema1 Tema1 Presentation Transcript

  • Tema 1. Nociones esenciales de Genética you can never have too many mutants La Genética aplicada a la investigación de los fenómenos biológicos. Utilidad de los mutantes en la elucidación de problemas biológicos
  • Qué es la Genética El uso de mutaciones y análisis mutacional para estudiar un proceso biológico y el estudio del proceso hereditario Hawley y Walker, 2003
  • La Genética hoy en día
    • ¿Para qué molestarnos en hacer Genética?
    • ¿Qué podemos obtener del aislamiento e identificación de mutantes que no podamos aprender haciendo “-ómicas”?
    • La base de la Genética es la mutación
  • Hacer Genética: más que obtener mutantes
    • Maximizar la probabilidad de resolver las preguntas iniciales
    • Proveer de tantas nuevas perspectivas biológicas como sea posible
    • Facilitar una mayor comprensión de la estructura y función del genoma en estudio
    • Comprender qué tipos de mutaciones se pueden obtener y cómo, y cómo analizarlas
    Aislamiento y caracterización de mutantes para: P.e. análisis de mutantes supresores
  • Hacer Genética
    • Herramientas intelectuales básicas:
      • Mutación
      • Complementación
      • Supresión
      • Recombinación
      • Regulación (epistasia)
  • Mutación
    • Muller (1932)
      • Nulomorfos
        • Sin función génica
      • Hipomorfos
        • Algún grado de función génica, alelo “débil”. Frente a deleciones, se diferencia de los nulomorfos
      • Hipermorfos
        • Producto hiperactivo o exceso de producto génico
      • Antimorfos
        • Antagoniza, o envenena, el alelo silvestre
      • Neomorfos
        • Aparición de función en otro lugar. Ganancia de función.
  • Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de función: mutación amórfica (nula) Fenotipo mutante Pérdida de actividad génica en M coincide con la deleción de una copia del alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de actividad génica en M compensada por duplicación
  • Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de función: mutación hipomórfica (rezumante) Fenotipo mutante Pérdida de actividad génica en M menos severa que la deleción del alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de actividad génica en M compensada por duplicación
  • Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Ganancia de función: mutación hipermórfica Fenotipo mutante Ganancia de actividad génica en M parcialmente compensada con la deleción Fenotipo mutante Ganancia de actividad génica en M más severa por duplicación
  • Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Ganancia de función: mutación neomórfica Nuevo fenotipo mutante Nueva actividad génica codificada por M insensible a la dosis génica del gen silvestre: siempre fenotipo M
  • Controles Silvestre homozigoto Duplicación Deleción Pérdida de actividad génica por deleción de una copia del alelo silvestre compensada por la duplicación de un alelo silvestre Fenotipo silvestre Pérdida de función: mutación antimórfica, dominante negativa Fenotipo mutante La actividad génica codificada por M inactiva la actividad génica del silvestre, ofreciendo un fenotipo similar a un nulomorfo o un hipomorfo fuerte
  • Terminología moderna de los mutantes
    • Pérdida de función: mutantes que reducen el nivel de expresión de un producto génico
      • Nulos : pérdida de función completa
      • Pérdida de función parcial
      • Pérdida de función condicional :
        • Termosensibles u otros condicionales
    • Dominante negativo : antimorfo
    • Ganancia de función :
      • Expresión inapropiada durante el desarrollo
      • Producto regulado de forma inapropiada
      • Mutantes heterocrónicos : expresan genes en el momento incorrecto
  • Terminología a nivel molecular
    • Sustituciones de pares de bases
    • Inserciones
    • Deleciones
    • Relacionadas con traducción:
      • Cambios de sentido ( missense )
      • Sin sentido ( nonsense )
      • Sustituciones silencionas ( silent )
      • Cambio de fase ( frameshift )
  • Búsqueda de mutantes:¿por y para qué?
    • Identificar genes requeridos en un proceso biológico
      • Vuelo, meiosis, ciclo celular…
    • Aislar más mutaciones en un gen de interés
      • Muchos alelos de un gen de interés
      • Marcadores moleculares
    • Herramientas mutacionales para análisis estructura-función
    • Aislar mutaciones en un gen identificado por aproximaciones moleculares (g. inversa)
  • Mutagénesis
    • Radiaciones ionizantes
      • Rayos X, 
    • Mutágenos químicos
      • Muy eficiente
    • Elementos transponibles
      • Trazabilidad
        • Pérdida de función
          • Disrupción secuencia codificante
          • Disrupción secuencia reguladora
          • Bloqueo de potenciador de promotores
          • Disrupción de secuencias de procesamiento o terminación
        • Transposones diseñados para ganancia de función
    • Disrupción génica dirigida
      • KO (knock out) génico
  • Complementación
    • Gran número de mutantes
      • “ Nunca se pueden tener demasiados mutantes” J. Roth
    • ¿Cuántos genes diferentes están representados en los mutantes aislados?
    • Prueba de complementación
  • Complementación en haploides (ej. S. cerevisiae, E. coli )
    • Dos estirpes haploides mutantes, de distinto tipo sexual, E1 y E2, con el mismo fenotipo. Genotipos m1 y m2.
    • Formación de diploide entre las dos estirpes. Si su fenotipo es:
    • MUTANTE
    • Las mutaciones están en el mismo gen
    • Genotipo: m1/m2
    • El defecto de una estirpe no es complementado por la otra
    • Son dos alelos mutantes del mismo gen
    • No hay complementación
    m2 m1
    • SILVESTRE
    • Las mutaciones están en distinto gen
    • Genotipo: m1 + /+ m2
    • El defecto de una estirpe es complementado por la otra
    • Son dos alelos mutantes del genes distintos, m1 y m2
    • Hay complementación
    + m2 m1 +
  • Complementación en diploides (ej. Drosophila, Arabidopsis )
    • Dos estirpes mutantes homozigotas de distinto sexo, hermafroditas o monoicas, E1 y E2, con el mismo fenotipo. Genotipos m1/m1 y m2/m2.
    • Formación de gametos. Cruzamiento entre las estirpes.
    • Observación de la descendencia. Si su fenotipo es:
    • MUTANTE
    • Las mutaciones están en el mismo gen
    • Genotipo: m1/m2
    • Gametos m1 y gametos m2
    • El defecto de una estirpe no es complementado por la otra
    • Son dos alelos mutantes del mismo gen
    • No hay complementación
    m2 m1
    • SILVESTRE
    • Las mutaciones están en distinto gen
    • Genotipo: m1 + /+ m2
    • Gametos m1 + y gametos + m2
    • El defecto de una estirpe es complementado por la otra
    • Son dos alelos mutantes del genes distintos, m1 y m2
    • Hay complementación
    + m2 m1 +
  • Reglas de la prueba de complementación
    • Sólo puede realizarse cuando los dos mutantes son recesivos
    • No requiere que los mutantes tengan exactamente el mismo fenotipo
    • Hay casos en los que un doble heterozigoto tiene un fenotipo más extremo que cualquiera de los homozigotos: complementación negativa (  alelos letales sintéticos)
  • ¿Cuándo miente la prueba de complementación?
    • Cuando hay complementación, y las mutaciones están en el mismo gen
    • Complementación intragénica
    • Cuando no hay complementación, y las mutaciones están en distinto gen
    • Ausencia de complementación no alélica, no complementación de un segundo sitio (SSNC)
      • Tipo I: interacciones venenosas
      • TipoII: secuestro
      • Tipo III: haploinsuficiencia combinada
  • Complementación intragénica
    • Proteínas con distintos dominios con papeles bien diferenciados: se requiere la presencia de al menos uno delos dominios funcionales
    • Proteínas homomultiméricas
    • Otros casos
    A + A + A 1 A 1 A 2 Silvestre Mutantes A 2 Silvestre Silvestre Mutante Mutante
  • SSNC tipo I: “envenenamiento”
    •  - y  -tubulina de Saccharomyces
    • Dos alelos mutantes de cada gen, que no producen subunidad funcional A B m y A m B: letales
    • La prueba de complementación A B m /A m B da negativo (no complementación) porque producen una subunidad venenosa (sigue siendo letal)
    • La interacción es específica de ambos alelos
    A + B + Subunidad funcional A m B m Mutantes que no se ensamblan con las proteínas silvestres Subunidad venenosa
  • SSNC tipo II: “secuestro”
    •  - y  -tubulina de Drosophila
    • Dos alelos mutantes de cada gen, A 1 y B 1 , recesivos
    • La prueba de complementación A B 1 /A 1 B da negativo (no complementación)
    • La interacción es específica de uno de los alelos (A 1 )
    1/4 subunidades funcionales 3/4 subunidades no funcionales Estéril A + B 1 / A 1 B + A + B - / A - B + 1/2 funcionales Fértil A + B - / A 1 B + 1/2 no funcionales 1/4 subunidades funcionales Estéril A + B + A 1 B 1 A 1 B + B 1 A + A + B + A - B - A + B + A 1 B - A 1 B + B - A +
  • SSNC tipo III: haploinsuficiencia combinada
    • No es necesaria la interacción física entre proteína
    • Reducir la dosis de un alelo no produce fenotipo, a no ser que se reduzca la dosis del alelo del otro gen
    • Más común y la menos interesante
    • La interacción no es específica de ninguno de los alelos
    Letal A + B - / A - B + A + B + / A - B + Viable A + B - / A + B + Viable
  • Complementación negativa
    • Mutaciones letales sintéticas : dos alelos mutantes de genes distintos que son letales juntos en la misma estirpe
    • Dos motivos
      • Acción de cada gen en una ruta redundante o de acción similar
      • Productos génicos que interaccionan físicamente
    A + B + A - B + A + B - A - B - Silvestre Pérdida parcial de función Nulo (letal) Función (p.e. actividad)
  • Genética a partir de mutantes
    • ¿Cuál es el siguiente paso una vez identificados mutantes en una serie de genes?
      • Mapeo genético
        • Identificación de SSNC
      • Análisis de reversión y supresión
        • Supresión de sintéticos letales
      • Clonación y análisis molecular
        • Análisis de expresión
  • Reversión/supresión
    • Obtener estirpes de fenotipo silvestre a partir de mutantes, mediante una nueva mutación
      • Reversión verdadera: restauración del genotipo (ADN) silvestre
      • Reversión mismo sitio (pseudoreversión)
      • Reversión segundo sitio (supresión intragénica)
        • Una segunda mutación en el mismo que no cambia la mutación original
    • Reversión: reservado para mutaciones en el mismo gen
  • Reversiones I Proteína silvestre Mutagénesis Proteína mutante inactiva Reversión: tres revertientes activos si los aminoácidos tienen carga opuesta Proteína silvestre Silvestre Reversión mismo sitio (pseudoreversión) Reversión segundo sitio (mutación compensatoria)
  • Reversiones II Proteína silvestre Mutagénesis Mutante inactivo Reversión Segundo stio (compensatoria Proteína activa: se restaura por condiciones estéricas Mutagénesis: adición de una base Reversión segundo sitio: deleción de una base
  • Supresión intragénica
    • Pseudoreversión (reversión mismo sitio)
    • Mutación compensatoria (reversión segundo sitio)
    • Supresión traduccional
    Silvestre GGA (glicina) Mutante UGA (fin mensaje) Pseudo. AGA (arginina) UUA (leucina) UGC (tirptófano) Silvestre ACG GTC AGC AAC Mutante ACG GAT C AG C AA C Supres. ACG GAT CAG AAC
  • Supresión (extragénica)
    • Una mutación en un gen suprime el efecto de una mutación en otro gen
      • Transcripcional (ARN)
      • Traduccional
      • Modificación postraduccional
      • Interacción proteína-proteína
      • Sin interacción física
  • Supresión transcripcional (ARN)
    • Transposon gypsy de Drosophila impide la acción de potenciadores a través de la proteína SuHu
      • Mutaciones en SuHu restauran la función del potenciador
    • Estabilización mensajero en C. elegans
      • Mutaciones de fin de mensaje, bajo nivel de lectura por error
      • Mutación que aumenta la estabilidad del mensajero, expresan con cierto nivel la proteína
    Potenciador gypsy Gen SuHu SuHu + SuHu - Lectura por error del codón de terminación Nivel de proteína silvestre
  • Supresión traduccional
    • ARNt supresores
      • Mutación en el ARNt que suprime un fin de mensaje
      • Cambio de fase:anticodón de 4 bases
      • Aumento de número de copias de ARNt que se “equivoca” con mayor frecuencia
      • ARNt son redundantes: redundancia numérica y funcional. Usados en E. coli, S. cerevisiae, C. elegans
    • Proteínas ribosómicas, factores de traducción, ARNr supresores.
      • Fidelidad de la traducción
    Silvestre ACG GTC AAG AAC Mutante ACG GAT U AG AAC Supres. ACG GAT U AG AAC Mutante ACG GAT A C A GAA C Supres. ACG GAT A C AG AAC UUC A UC STOP AGC GUU A C UC Fin mensaje Cambio fase
  • Supresión en proteínas
    • Modificación postraduccional
      • Fosforilación. Superproducción de quinasas que restauran los niveles de fosforilación de los mutantes
    • Interacción proteína-proteína
      • Ej.: Ciertos supresores de mutantes termosensibles de P22 eran de por sí criosensibles
      • Supresor conformacional: FliG y MotA, flagelo de E. coli
        • Llave--cerradura
    - - - + + Arg Glu Asp Asp Arg FliG MotA + - - + + Lys Movimiento: 1 Movimiento: 0.23 - - - + - Glu Movimiento: 0 + - - + - Glu Movimiento: 0.77 Lys
  • Supresión sin interacción física
    • Supresión de mutaciones anti- o neomórficas
    • Supresión “bypass”:
      • La segunda mutación permite sobrellevar el defecto causado por la primera mutación
    • Contrabalanceo de actividades opuestas
    • Supresión multicopia
    A B C D F A E G
  • Diseño de búsqueda de supresores
    • Elección del mutante a suprimir
      • Fin de mensaje
      • Cambio de sentido
      • Pérdida de función
    • Elección del mutágeno
      • Químico
      • Transposón
    • ¿Qué estamos buscando?
      • ¿Qué proteínas interaccionan con otra?
      • ¿Cómo puede la célula o el organismo sobrellevar nuestra mutación?
  • Epistasia: ordenar la función de los genes
    • Dos mutantes que reducen 50% la duración de la vida de Drosophila
      • Misma o diferente ruta
        • Si A - A - /B - B - tiene un 50% de duración de la vida, actúan en la misma ruta
      • Si actúan en la misma ruta, ¿cuál actúa primero?
    50% duración vida 50% duración vida duración vida normal A B 50% duración vida (A B) Otras influencias duración vida normal
  • Ordenar función de genes
    • Ruta biosintética: mutantes pérdida de función
      • Mutantes posteriores en la ruta son epistáticos sobre los anteriores
      • Mutantes nulos en genes diferentes que no muetran epistasia no pueden estar en la misma ruta
    • Rutas no biosintéticas
      • Recombinación meiótica en Drosophila
    A B C D E 1 2 3 4 Mutante 3 es epistático sobre 1 y 2 mei-9 mei-218 10% recombinación 10% recombinación mei-9/me218 10% recombinación Dos rutas recombinación mei-9/me218 1% recombinación Una ruta recombinación
  • Análisis de epistasia: conjugación en S. cerevisiae
    • Conjugación (fecundación): reconocimiento de señales entre los tipos sexuales a y 
    • Mutantes con dos fenotipos diferentes:
    • Mutantes que no conjugan o que no señalan: ste2, 7, 11
    • Mutantes que señalan constitutivamente: STE11c, STE4c
    • Análisis de dobles mutantes
    • mutantes fenotipo conclusión significado ruta
    • ste7 STE4c estéril ste7 espistático sobre STE4c STE4 necesita STE7 4  7
    • ste11 STE4c estéril ste11 espistático sobre STE4c STE4 necesita STE11 4  7, 11
    • ste2 STE4c señala STE4c espistático sobre ste2 STE4 no necesita STE2 2  4  7, 11
    • ste7 STE11c estéril ste7 espistático sobre STE11c STE11 necesita STE7 2  4  7  11