MéTodos De Estudio En BiologíA Celular1

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MéTodos De Estudio En BiologíA Celular1

  1. 6. MÉTODOS DE ESTUDIO EN BIOLOGÍA CELULAR OBJETIVOS Describir los fundamentos de las siguientes metodologías: Identificar las utilidades de cada una, evaluando su grado de complejidad - microscopía óptica y electrónica - centrifugación total y fraccionada - ultracentrifugación Bibliografía: H. Curtis, B. Alberts - cultivos celulares - electroforesis
  2. 7. ‘ micros’ = pequeño ‘ scopein’ = ver
  3. 8. MICROSCOPÍA Kepler 1611
  4. 9. Simple Utilizan una sola lente (lupas) Compuesto Utilizan dos sistemas de lentes ocular objetivo
  5. 10. LUPA La lente se sitúa entre el ojo y el objeto Aumenta el ángulo visual 4 a 60 aumentos Aumento Cantidad de veces que se ve mayor el objeto
  6. 11. 0,1 a 0,2 mm Resolución Capacidad de percibir dos puntos de una muestra separadamente ( criterio Rayleigh) Identifica objetos que estén separados al menos 100 micrones
  7. 12. Electrónica Transmisión (TEM) Barrido (SEM) Campo claro Campo oscuro Contraste de fase Fluorescencia MICROSCOPÍA Aportan información descriptiva y estructural Confocal Óptica
  8. 13. Microscopio óptico Campo claro Campo oscuro Contraste de fase Fluorescencia
  9. 14. Microscopio electrónico de transmisión TEM
  10. 15. SEM
  11. 16. Microscopía Laser Confocal
  12. 17. MICROSCOPÍA
  13. 18. MICROSCOPÍA
  14. 19. MICROSCOPÍA SEM Aumenta 10X sobre MO
  15. 20. MICROSCOPÍA TEM Aumento de 1000 x sobre MO
  16. 21. MICROSCOPÍA TEM
  17. 22. MICROSCOPÍA Preparación de las muestras para microscopía <ul><li>Fijación </li></ul><ul><li>Teñidos </li></ul><ul><li>Deshidratados </li></ul><ul><li>Incluidos </li></ul><ul><li>Cortes finos </li></ul>De transmisión De barrido MO ME Réplicas de superficie habitualmente bañadas en oro
  18. 23. MICROSCOPÍA
  19. 24. CENTRIFUGACIÓN Rotor Motor Cabezal Refrigeración Vacío
  20. 25. CENTRIFUGACIÓN Unidades Rpm. La fuerza centrífuga está determinada por el diámetro del rotor y la velocidad de rotación. TOTAL
  21. 26. CENTRIFUGACIÓN FRACCIONADA
  22. 27. CENTRIFUGACIÓN FRACCIONADA <ul><li>Separación en base a </li></ul><ul><li>tamaño </li></ul><ul><li>densidad </li></ul>Utilidad: separación de organelas celulares
  23. 28. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN Muestra de Proteínas Moléculas lentas Moléculas rápidas <ul><li>Separa en base a </li></ul><ul><li>tamaño </li></ul><ul><li>forma </li></ul>
  24. 29. CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN Utilidad separación de diferentes proteínas
  25. 30. ELECTROFORESIS Separación de proteínas y ADN por su PM SOPORTES Acetato de celulosa Uso clínico Acrilamida (Proteínas ) Agarosa (ADN) Investigación
  26. 31. ELECTROFORESIS Buffer Ánodo (+) Caja acrílica Muestra Cátodo (-) Acrilamida (gel) SDS-PAGE
  27. 34. ELECTROFORESIS SDS-PAGE
  28. 36. 3EIMMBLOT.MOV
  29. 37. CULTIVOS CELULARES <ul><li>Células frecuentemente utilizadas </li></ul><ul><li>fibroblastos </li></ul><ul><li>macrófagos </li></ul><ul><li>células de tumores </li></ul><ul><li>Utilidad </li></ul><ul><li>interacción célula-célula. </li></ul><ul><li>Procesos celulares </li></ul>Ventaja Estudio sobre células vivas
  30. 38. Células CHO - Rab22-GFP
  31. 39. MÉTODOS PARA ÁCIDOS NUCLEICOS
  32. 40. ADN Aislamiento Del Material Genético ARN Ribosomas Cromosómicos - Minicírculos, <ul><li>Detección de ADN/ARN </li></ul>Fenol/cloroformo Lisis celular y extracción con resina
  33. 41. Amplificación de ADN <ul><li>Detección de ADN/ARN </li></ul>Reacción en Cadena de la Polimerasa Hebras = cadenas Polimerasa Nucleótidos Iniciadores = cebadores = primers
  34. 42. Estructura del ADN
  35. 43. Amplificación de ADN <ul><li>Detección de ADN/ARN </li></ul>Reacción en Cadena de la Polimerasa Iniciadores = cebadores = primers Hebras = cadenas
  36. 44. Amplificación de ADN <ul><li>Detección de ADN/ARN </li></ul>Reacción en Cadena de la Polimerasa Polimerasa Nucleótidos
  37. 45. Amplificación de ADN <ul><li>Detección de ADN/ARN </li></ul>Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR
  38. 46. Amplificación de ADN <ul><li>Detección de ADN/ARN parasitario </li></ul>Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR anidada PCR en tiempo real
  39. 48. Bromuro de etidio
  40. 50. ANÁLISIS DE LAS BANDAS DE AMPLIFICACIÓN OBTENIDAS. REA (restriction enzime analysis) RFLP (restriccion fragment length polymorphims) RADP-PCR (randomprimed)

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