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Sequenciamento de dna
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  • 1. Sequenciamento de DNAO sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos queconstituem a molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada umapresenta vantagens e desvantagens.Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadoresde cadeia” ou de “Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento dogenoma humano. Sua estratégia consiste em identificar,continuamente esequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na extremidade dealongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permitadetecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeiasimples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metadecomplementar da dupla hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (fig 1). FIG 1A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzimaDNA polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeotrifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²Pou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P (fig 2a). Como a enzima utilisada catalisa somente oalongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequenofragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade3’ do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, efornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciadorou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de DNA recémsintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatroreações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (eapenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeotrifosfatos (ddNTPs) (fig 2b). FIG 2Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por nãoapresentarem 3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloquearátodo processo. Como todos os nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento dacadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase insira um análogo (ddNTP).Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto em que seualongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Osfragmentos assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em quetubo de reação o análogo foi adicionado, são separados por tamanho em gel de poliacrilamidaindividualmente: um canal de análise para cada reação. O gel é “transferido” para um suporte de
  • 2. nitrocelulose (filtro).Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode servisualizada e obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada: que serviude “molde”. Levando estas observações em consideração, é possível conhecer a sequência denucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a superior do gel.O resultado e as etapas do processo descrito acima, frequentemente mostrado em fotografias noslivros especializados, podem ser observados no esquema da Fig. 3. FIG 3O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada porcomputadores com “softs” que lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitiráexecutar o processo em grande escala. Neste caso utilizam-se simultaneamente os 4didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência fig 4a. Como cada reação(A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforesedestes realizada em um único canal do gel de sequenciamento fig 4b. O sinal fluorescentediferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará osprodutos baseado na diferença de comprimento de onda. A luz emitida é detectada por“escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador fig 4c. Variáveis mais modernas,consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com ainclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.