Rapy 3 gc, hplc, etc

1,539 views
1,195 views

Published on

Published in: Education
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
1,539
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
6
Actions
Shares
0
Downloads
8
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide
  • To be effective in FFF, a field must have three properties. First, it must be sufficiently strong to drive sample components into localized regions of the parabolic flow profile. Second, it must be adequately selective such that different components are driven to different parts of the flow profile to achieve separation. Third, it must be easily implemented to make instrument developments practical and possibly economical.
  • L’immagine mostra i componenti a partire dai quali assembliamo in laboratorio i canali a fibra cava. Le fibre, che sono ampiamente utilizzate per applicazioni di dialisi o ultrafiltrazione, sono disponibili commercialmente in un’ampia gamma di materiali polimerici e di cutoff di massa molecolare. Un tratto di fibra del diametro interno di circa 0.8 mm e della lunghezza di 24 cm viene inserito in un tubo in teflon e fissato alle estremità. Quando attraverso la fibra viene fatto passare un flusso, a causa della porosità della parete, il fluido in entrata si ripartisce in due componenti, una longitudinale, il flusso di eluizione, ed una radiale, che defluisce attraverso la giunzione a T qui mostrata, e che genera all’interno del canale un campo radiale di frizione idrodinamica.
  • Il meccanismo separativo realizzato dall’azione combinata di questi due flussi è quello classico del frazionamento in campo flusso: la componente longitudinale, a causa del diametro capillare della fibra, assume un regime laminare con profilo parabolico di velocità, massima sull’asse della fibra e nulla sulla parete. Il rapporto di ritenzione di un analita dipenderà quindi dalla sua distanza media dalla parete durante l’eluizione. Va innanzitutto osservato che la separazione avviene per effetto idrodinamico, senza coinvolgere alcuna interazione chimica dell’analita con la fase mobile ed in assenza di fase stazionaria. Questo consente un’ampia flessibilità nella scelta della fase mobile, che può essere resa biocompatibile o compatibile con altre tecniche analitiche da applicare a valle del frazionamento. Gli analiti, inoltre, non subendo interazioni forti durante il frazionamento vengono eluiti mantenendo il loro stato originario. Per analiti di dimensioni macromolecolari e nanoparticelle, fino ad alcune centinaia di nanometri, la distanza dalla parete viene determinata dall’equilibrio tra la forza di trascinamento idrodinamico generata dal flusso radiale, che trascina l’analita verso la parete, ed i moti browniani che ne determinano la diffusione verso il centro della fibra. Si dimostra quindi che in base a questo meccanismo, detto normale o browniano, il tempo di ritenzione è determinato dal coefficiente di diffusione, e l’ordine di eluizione va dalle particelle più piccole a quelle più grandi. Vediamo ora i risultati dell’applicazione di questo modo di eluizione a campioni di proteine intere.
  • Let’s see now two examples that show capabilities of HF FlFFF with intact proteins . The first example show d ifferent intact proteins of a broad molecular weight range fractionated at different retention times. We can observe fractionation at very high molar mass range, like in the case of HSF, the dimer of which is almost 900 KDa in molar mass . The second example shows separation between a mixture of myoglobin and BSA . We know that efficiency in terms of number of plate s is, in general, relatively poor in FFF. However, HF FlFFF selectivity is relatively high. So, resolution turns out to be generally lower than resolution in LC or CZE because peaks in HF FlFFF are quite broader due the high D -base selectivity. In other words, HF FlFFF is able to “sort” protein molecules according to even very small differences in D. This makes particularly interesting use of HF FlFFF with ESI/MS since, in general, ESI/MS is itself more resolving in terms of molar mas s than a separation technique like chromatography .
  • Lo canale a fibra cava è applicabile anche al frazionamento di particelle microniche, quali sono le cellule. In questo caso il meccanismo è leggermente diverso, perché per particelle di queste dimensioni la diffusione è trascurabile, e ad opporsi al campo sono forze di sollevamento idrodinamico che dipendono dalle caratteristiche morfologiche della particella stessa, fra cui le dimensioni, la forma, la rigidità e le caratteristiche superficiali. Questo meccanismo è detto gaussiano o ipersitrato, e siccome a parità di altri fattori gli analiti eluiscono in ordine inverso di dimensione ripetto al modo normale, si parla anche di FFF in modo inverso. Per questo modo non esiste una relazione analitica tra tempo di ritenzione e caratteristiche delle particelle, in quanto non esiste un modello generale per la descrizione delle forze di sollevamento, per cui un’eventuale conversione del tempo di ritenzione in dimensioni dell’analita va realizzata in modo empirico Abbiamo applicato questo modo di eluizione al frazionamento di cellule batteriche.
  • In questa diapositiva vediamo qualche esempio di alcune separazioni possibili tra batteri di tipo diverso e tra batteri di una stessa specie in diverse condizioni di vitalità. Vediamo che, ad un certo tempo di eluizione e raccolta frazioni, la possibilità di arricchimento di una specie rispetto all’altra è notevole. Vediamo che e’ possibile ottenere frattogrammi diversi anche per uno stesso tipo di batterio se posto in condizioni di crescita su piastra o se allo stato liofilizzato. La fase mobile che abbiamo usato risulta compatibile con il MALDI TOF in quanto costituita da componenti volatili non in grado di dare addotti stabili con le proteine.
  • In questo filmato è possibile ...
  • Rapy 3 gc, hplc, etc

    1. 1. GAS CROMATOGRAFIA (GC)
    2. 2. Confronto tra colonne impaccate e capillari
    3. 3. Le colonne capillari
    4. 4. Confronto tra colonne capillari
    5. 5. Polarità: un criterio per scegliere la fase stazionaria
    6. 6. Alcune fasi stazionarie di uso comune per GLC capillare
    7. 8. INIETTORI PER GC
    8. 9. INIETTORI PER GC
    9. 10. Iniettore splitt
    10. 11. Microestrazione in fase solida (SPE)
    11. 12. Estrazione purge & trap
    12. 13. RIVELATORI PER GC
    13. 14. Rivelatore a termoconducibilità (TCD)
    14. 15. Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)
    15. 16. Rivelatore a cattura elettronica (ECD)
    16. 17. I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna Equazione di Clausius-Clapeyron p = tensione di vapore  v H = variazione di entalpia di vaporizzazione TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC
    17. 18. CROMATOGRAFIA LIQUIDA … .forense: vediamo Catherine mentre prepara campioni per HPLC…. (da CSI, M. Helgenberger) La Cromatografia Liquida è diventata una tecnica analitica indispensabile in molti settori: farmaceutico, biologico, biomedico, clinico e …..
    18. 19. HPLC CROMATOGRAFIA LIQUIDA Durante il processo cromatografico la velocità con la quale ciascun analita procede lungo la colonna dipende dalle interazioni che stabilisce con la fase mobile e stazionaria, quindi la separazione è dovuta alla differenza nei coefficienti di distribuzione delle singole molecole nelle due fasi . La definizione HPLC ( H igh P ressure L iquid C hromatography) in origine riferita alle elevate pressioni di esercizio caratteristiche di questa tecnica, è stata oggi sostituita con H igh P erformance L iquid C hromatography o semplicemente L iquid C hromatography ( LC ).
    19. 20. IL SISTEMA HPLC <ul><li>I componenti fondamentali del sistema HPLC sono: </li></ul><ul><li>una pompa che regola e mantiene costante il flusso della fase mobile. Poiché la fase stazionaria è costituita da particelle di diametro micrometrico impaccate, il flusso della fase mobile attraverso la fase stazionaria richiede un’elevata pressione; </li></ul><ul><li>un sistema di introduzione del campione ; </li></ul><ul><li>una colonna contenente la fase stazionaria. Può essere presente una precolonna (o colonna di guardia) che riduce la quantità della matrice del campione che entra nella colonna analitica. La colonna può essere termostatata per migliorare la riproducibilità della separazione; </li></ul><ul><li>un rivelatore che evidenzia, mediante segnali elettrici, gli analiti che eluiscono dalla colonna; il grafico della risposta del rivelatore in funzione del tempo è chiamato cromatogramma . </li></ul>
    20. 21. IL SISTEMA HPLC Contenitori dei solventi che costituiscono la fase mobile miscelatore pompa sistema di introduzione del campione precolonna e colonna rivelatore computer raccoglitore di frazioni
    21. 22. STRUMENTAZIONE HPLC
    22. 23. Pompa HPLC a pistoni reciprocanti
    23. 24. Iniettore HPLC a loop
    24. 25. LA COLONNA LC Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi . Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe 15-25 cm , hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10  m . Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5  m . Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm , diametro interno di 1 mm e materiali di 10  m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7 .
    25. 26. TIPI DI LC SU COLONNA <ul><li>I tipi di cromatografia liquida su colonna possono essere classificati in base alla natura del processo di separazione: </li></ul><ul><li>cromatografia di adsorbimento : la fase stazionaria è un adsorbente e la separazione è basata su un susseguirsi di stadi di adsorbimento e desorbimento . </li></ul><ul><li>cromatografia di ripartizione : la separazione è basata sulla ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria, entrambe liquide. </li></ul><ul><li>cromatografia di scambio ionico : la separazione è basata sull’ interazione ionica tra fase stazionaria ed analiti. </li></ul><ul><li>cromatografia di esclusione dimensionale : la separazione è basata sulle dimensioni relative degli analiti . </li></ul>
    26. 27. LC DI SCAMBIO IONICO (IEC) La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti . Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili . Quanto è più forte la carica del campione, tanto più verrà trattenuto all’interno della colonna. La fase mobile è un tampone acquoso in cui il pH e la concentrazione vengono regolati per controllare il tempo di eluizione degli analiti. + + - - - - + flusso
    27. 28. La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti. La fase stazionaria è costituita da materiale di porosità controllata . Le molecole grandi eluiscono prima di quelle piccole . Infatti le molecole che sono troppo grandi per entrare nei pori della fase stazionaria hanno un percorso più breve nella colonna, rispetto a quelle che entrano nei pori. La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico intervallo di dimensioni. LC DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC) flusso
    28. 29. SEC di proteine intere 1: Tiroglobulina (669 kD) 2: Catalasi (669 kD) 3: BSA (67 kD) 4: Ovalbumina (43 kD) 5: Ribonucleasi (13.4 kD)
    29. 30. SEC di proteine intere
    30. 31. Esempi di fasi stazionarie per SEC
    31. 32. LC DI ADSORBIMENTO La fase stazionaria è un solido . La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento . CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido . La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile ( solubilità relativa ). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute. flusso flusso
    32. 33. LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione , che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi : Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte , anche se non sempre in maniera esattamente speculare. FASE NORMALE E IN FASE INVERSA
    33. 34. FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento , la fase stazionaria è un solido poroso . In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida , che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP) . Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice : i gruppi OH della silice ( silanoli ) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria . Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale ; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa . LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
    34. 35. La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata . FASI STAZIONARIE PER LC DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
    35. 36. SUPERFICIE DI UNA PARTICELLA DI SILICE PER LC
    36. 37. MORFOLOGIA DI FASI SILICEE <ul><li>Struttura porosa a particelle aggregate </li></ul><ul><li>Struttura microporosa </li></ul><ul><li>Struttura monolitica </li></ul>(c)
    37. 38. La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C 18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP) SUPPORTO SILICEO FASE STAZIONARIA LIQUIDA Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH Si OH
    38. 39. Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi” . Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Il grado di ricopertura , espresso in  mol/m 2 , è una misura della densità di fase sulla superficie della particella. DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE Si O Si OH Si OH Si O Si OH Si O
    39. 40. I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto , spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-capping utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto. DISATTIVAZIONE DELLA SILICE ( END-CAPPING ) Si O Si OH Si OH Si O Si OH Si O
    40. 41. FASI MOBILI IN LC In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale , la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione . E’ possibile utilizzare un solvente singolo , tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’ eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile ) o un’ eluizione in gradiente ( la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.
    41. 42. SCELTA DELLA FASE MOBILE IN LC <ul><li>La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: </li></ul><ul><li>nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante ; </li></ul><ul><li>nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; </li></ul><ul><li>nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’ arrangiamento sterico delle molecole degli analiti. </li></ul>
    42. 43. <ul><li>Non tutti i solventi possono essere utilizzati in LC. </li></ul><ul><li>Devono infatti possedere queste caratteristiche : </li></ul><ul><li>devono essere miscelabili in diverse proporzioni </li></ul><ul><li>non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi </li></ul><ul><li>non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) </li></ul><ul><li>devono avere una bassa viscosità </li></ul><ul><li>devono essere poco tossici e poco infiammabili </li></ul><ul><li>devono essere non troppo costosi </li></ul><ul><li>La fase mobile più comune in LC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF). </li></ul>SOLVENTI PER FASI MOBILI LC
    43. 44. SERIE ELUOTROPICA E CUTOFF UV DI SOLVENTI PER FASI MOBILI
    44. 45. Ottimizzazione della fase mobile in RP HPLC Metodo del triangolo di Snyder
    45. 46. Esempio di applicazione <ul><li>Alcol benzilico </li></ul><ul><li>Fenolo </li></ul><ul><li>3’-4’dimetossiacetofenone </li></ul><ul><li>m-dinitrobenzene </li></ul><ul><li>p-dinitrobenzene </li></ul><ul><li>o-dinitrobenzene </li></ul><ul><li>Benzoino </li></ul>
    46. 47. Gradiente di fase mobile <ul><li>Alcol benzilico </li></ul><ul><li>Fenolo </li></ul><ul><li>3’-4’dimetossiacetofenone </li></ul><ul><li>Benzoino </li></ul><ul><li>Benzoato di etile </li></ul><ul><li>Toluene </li></ul><ul><li>2,6-dimetossitoluene </li></ul><ul><li>o-metossibifenile </li></ul>
    47. 48. Rivelatori per LC
    48. 49. Rivelatore ad indice di rifrazione (RI)
    49. 50. Rivelatore RI: disegno costruttivo
    50. 51. RIVELATORE UV/Vis <ul><li>E’ un rivelatore che misura la capacità di assorbire una radiazione luminosa nell’UV/Vis (200-700 nm) da parte degli analiti. </li></ul><ul><li>I solventi che compongono la fase mobile non devono assorbire alle lunghezze d’onda utilizzate per l’analisi. </li></ul><ul><li>I rivelatori UV/Vis si distinguono in: </li></ul><ul><li>rivelatori a lunghezza d’onda singola </li></ul><ul><li>rivelatori a lunghezza d’onda variabile </li></ul><ul><li>rivelatori a matrice di fotodiodi (photodiode array) </li></ul>
    51. 52. SCHEMA DI RIVELATORE UV/Vis
    52. 53. Questa figura riporta un rivelatore UV/Vis a filtro (in rosso), che permette di leggere l’assorbanza ad una sola lunghezza d’onda (quella selezionata dal filtro). Sostituendo il filtro con un monocromatore, si ottiene un rivelatore a lunghezza d’onda variabile, che permette di rivelare in una sola analisi composti con spettri di assorbimento molto diversi tra loro. La cella a flusso di lettura qui rappresentata è doppia: in una delle due celle passa l’eluato della colonna, nell’altra passa la fase mobile. Questo permette di migliorare la linea di base per sottrazione del segnale del solvente RIVELATORE UV/Vis A FILTRO E A MONOCROMATORE
    53. 54. RIVELAZIONE DEL SEGNALE Fototubo <ul><li>Si basa sull’effetto fotoelettrico: un fotone incide sul catodo rivestito di un materiale fotosensibile, provocando l’emissione di un elettrone </li></ul><ul><li>Si ottiene una corrente proporzionale alla intensità della radiazione incidente </li></ul><ul><li>I fototubi sono soggetti ad un rumore di fondo (dark current) causato da effetti termici </li></ul>+ _ catodo anodo
    54. 55. <ul><li>Questi rivelatori sono simili al fototubo: la radiazione colpisce infatti un catodo iniziale, provocando l’emissione di elettroni </li></ul><ul><li>Gli elettroni prodotti vengono però moltiplicati attraverso la collisione con una serie di catodi intermedi </li></ul><ul><li>La corrente misurata è così amplificata, rispetto a quella iniziale, di un fattore molto elevato (10 6 – 10 7 ) </li></ul>Fotomoltiplicatori (PM) RIVELAZIONE DEL SEGNALE/2 anodo catodo catodi intermedi
    55. 56. RIVELAZIONE DEL SEGNALE/3 <ul><li>Rivelatori a stato solido: fotodiodo </li></ul><ul><li>Quando si applica un opportuno potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree: </li></ul><ul><li>In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente </li></ul>regione p regione n <ul><li>n - ricche di elettroni </li></ul><ul><li>p - ricche di cariche positive </li></ul>
    56. 57. <ul><li>Rivelatori a stato solido: fotodiodo </li></ul><ul><li>Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione incidente produce nuove coppie di cariche positive e negative all’interno del materiale, permettendo il passaggio della corrente. </li></ul><ul><li>L’intensità di corrente è proporzionale alla quantità di luce incidente. </li></ul><ul><li>Un fotodiodo è più sensibile di un fototubo e costa meno di un fotomoltiplicatore. </li></ul>RIVELAZIONE A FOTODIODO
    57. 58. <ul><li>Array di fotodiodi </li></ul><ul><li>E’ costituito da una serie di fotodiodi, ricavati ad intervalli di spazio regolari su di un microchip </li></ul><ul><li>Inserito in uno strumento con una ottica opportuna, questo tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente radiazioni di diverse lunghezze d’onda </li></ul>reticolo RIVELAZIONE A SERIE DI DIODI
    58. 59. Il rivelatore a matrice o serie di fotodiodi (photodiode array) permette di misurare contemporaneamente un intervallo di lunghezze d’onda , per ottenere lo spettro completo degli analiti eluenti. Percorso della fase mobile all’interno di una cella di misura del tipo a “Z” RIVELATORE A SERIE DI DIODI (DAD)
    59. 60. RIVELATORE A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI reticolo lampada a deuterio fenditura cella porta campione otturatore lampada a tungsteno rivelatore a serie di diodi lente lente
    60. 61. Principio di funzionamento DAD Serie di diodi OTTICA INVERTITA Sorgente continua Cella a flusso Monocromatore  1  4  5  6  7  8  9  11  12  3  10  2 Istante per istante, lo strumento registra lo SPETTRO dell’analita che in quell’istante attraversa la cella. Il riferimento è lo spettro del fluido di trasporto
    61. 62. cella a flusso lampada al deuterio lampada al tungsteno combinatore di raggio lente di focalizzazione filtro specchio reticolo serie di diodi guida ottica cella a flusso DAD con cella a fibra ottica e guida ottica
    62. 63. Tecniche LC: criteri di scelta / P.M.< 2000
    63. 64. Tecniche LC: criteri di scelta / 2000 < P.M.< 10 5-6
    64. 65. Tecniche FFF/ P.M. > 10 4 sezione trasversale del canale FFF Pompa Iniettore Flusso Canale FFF Fase mobile 0.123 IN OUT Collettore frazioni Rivelatore UV-Vis Registratore Acquisizione dati Campo
    65. 66. spessore w Flusso Detector Flusso a profilo parabolico spessore w Campione Il dispositivo FFF Campo esterno Ingresso del campione
    66. 67. Come funziona la FFF? Cammino particella Profil o flusso B Campo P rofil o flusso A Flusso
    67. 68. Modi di operazione FFF Versatilità rispetto al peso molecolare dell’analita: Modo normale: macromolecole e nanoanaliti Modo sterico/iperstrato: sistemi microdispersi
    68. 69. parete di accumulazione trasporto i ndotto dal campo campo A B A B Modo FFF normale trasporto indotto dalla diffusione
    69. 70. Modo FFF sterico/iperstrato A B A B sterico iperstrato trasporto indotto da lift idrodinamico campo campo
    70. 71. Tipi di campo e tecniche FFF Versatilità rispetto al tipo di campione da analizzare: FlFFF: universale (dalle macromolecole alle microparticelle) GrFFF: nano e microparticelle
    71. 72. flusso di campione in entrata flusso di campione in uscita flusso trasversale flusso trasversale flusso trasversale in uscita profilo parabolico A B C FlFFF in modo normale V 1 /D r 
    72. 73. FlFFF a fibra tubolare (HF FlFFF)
    73. 74. HF FlFFF in modo normale
    74. 75. Frazionamento in ampio intervallo di PM Alta selettività HF FlFFF di proteine intere
    75. 76. HF FlFFF in modo a iperstrato
    76. 77. HF FlFFF di batteri interi
    77. 78. FFF a campo centrifugo (SdFFF)
    78. 79. Uscita del campione Blocco di Plexiglas Spacer Parete in vetro o plastica Valvola di iniezione Iniezione FFF a campo gravitazionale (GrFFF)
    79. 80. CAMPO GRAVITAZIONALE Ritenzione in GrFFF w x Forze di sollevamento d
    80. 81. Campione iniettato : 1.25 ng HRP e 7.5  g PS/HRP 6  m Guardiamo dentro al canale GrFFF…. CCD FM con substrato al luminolo 0.75 123
    81. 82. (b), (c) E.coli non fimbriato (a) E.coli fimbriato GrFFF di batteri interi
    82. 83.   Il campo di forze che causa il trasporto differenziale e' di tipo elettrico . L'elettroforesi ha avuto il suo ideale campo di applicazione in bioanalitica.   La separazione si realizza in base al rapporto carica/raggio della molecola.     ELETTROFORESI CON ELETTROLITA LIBERO Problemi di convezione ELETTROFORESI CAPILLARE ELETTROFORESI CON SUPPORTO ELETTROFORESI/10 3 <P.M.<10 8
    83. 84. Aumento del rapporto superficie/volume   Tipi di supporto : acetato di cellulosa carta gel di poliacrilammide (PAGE) gel di agarosio I supporti danno un effetto di setaccio per separare in base alle dimensioni, uno volta che le specie siano state caricate in ambiente tamponato   Esempi di applicazioni : Analisi di proteine (Progetto “Proteoma”) Sequenziatura del DNA (Progetto “Genoma”) ELETTROFORESI SU SUPPORTO
    84. 85. PAGE <ul><li>Total percentage of acrylamide- acrylamide and bis-acrylamide- determines pore size of gel </li></ul><ul><li>Discontinuous gels are most common for highest resolution: </li></ul><ul><li>Low percentage (3%) and low pH (6.8) are used for stacking gel - all proteins run readily through until hit higher percentage and pH (8.6) of running or separating gel (4-20%), then stack up due to change in pH . </li></ul>
    85. 86. Formazione di un gel di PA Il setaccio tridimensionale si forma dalla co-polimerizzazione del monomero attivato ( acrilammide ) e del composto che forma i legami trasversali ( metilen-bis-acrilammide )
    86. 87. Come migrano gli analiti… <ul><li>Voltage difference, E = voltage applied/distance between electrodes; generally expressed as volts/cm </li></ul><ul><li>Charge on molecule, q </li></ul><ul><li>Frictional component, f , determined by size and shape of molecule, pore size of matrix, viscosity of buffer </li></ul>Velocity of particle , v= Eq/f Mobility of particle , µ = v/E = q/f <ul><li>Size/shape </li></ul><ul><li>Charge </li></ul><ul><li>Both size/shape and charge </li></ul>Separation can be effected by
    87. 88. V = IR Ohm law <ul><li>Voltage is a function of current and resistance </li></ul><ul><li>Resistance decreases during electrophoretic run, therefore current increases if maintaining constant voltage </li></ul><ul><li>Why minimize current increase during run? </li></ul><ul><li>As current increases , power increases - much of power is dissipated as heat </li></ul><ul><li>Heat affects electrophoretic separation - diffusion increases ; samples can be sensitive to heat ; buffer viscosity decreases therefore resistance decreases and uneven heating occurs due to best cooling at gel edges </li></ul>Cosa causa la corrente elettrica…
    88. 89. L‘elettrolita e' all‘ interno di un tubo capillare , la convezione e' soppressa dato l'alto rapporto superficie volume. Il calore e' dissipato rapidamente: uso di alti voltaggi ELETTROFORESI CAPILLARE (CZE)
    89. 90. <ul><li>M ajor drawbacks of gel electrophoresis : speed of analysis.  </li></ul><ul><li>Speed could be improved by increasing the electric current of the system. </li></ul><ul><li>L arge amount of heat would be generated : high convection </li></ul><ul><li>CZE uses s ilica fused capillaries ranging from 0.150 to 0.375 millimeters in outer diameter to dissipate the heat produced. Increasing the electric fields produces very efficient separations and reduces separation times . </li></ul><ul><li>Very small amount of sample (0.1 to 10 nL) is required.  The sample solution is injected at one end and a electric field of 100 to 700 volts/centimeter is applied across the capillary. </li></ul>Vantaggi della CZE
    90. 91. Accoppiamento tecniche separative/MS Caratteristiche di un rivelatore ideale per tecniche separative <ul><li>Non alterare la risoluzione, ossia non produrre nel rivelatore una miscela dei composti separati. </li></ul><ul><li>Avere la massima sensibilità possibile. </li></ul><ul><li>Essere universale, cioè rivelare tutti i composti eluiti. </li></ul><ul><li>Fornire quante più informazioni possibile sulla struttura dei composti eluiti, per permetterne l’identificazione. </li></ul><ul><li>Essere selettivo, cioè consentire l’identificazione dell’analita in miscela. </li></ul><ul><li>Dare un segnale proporzionale alla concentrazione. </li></ul><ul><li>Avere un fattore di risposta costante, o quantomeno prevedibile. </li></ul><ul><li>Non danneggiare i prodotti. </li></ul><ul><li>Non produrre artefatti. </li></ul><ul><li>Consentire la deconvoluzione dei picchi, ossia la scomposizione dei picchi non risolti nei solo componenti. </li></ul><ul><li>Avere il più basso rapporto costi/prestazioni possibile. </li></ul>
    91. 92. Che cos’è la spettrometria di massa? Spettroscopia di ioni gassosi h ν ν 1 ν n Sorgente di fotoni Dispersione Spettro di frequenza Spettroscopia di fotoni Campo magnetico + – – – + + m/z Campo elettrico ( m/z ) 1 ( m/z ) 2 Spettro di massa
    92. 93. MS: un secolo di storia…

    ×