• Share
  • Email
  • Embed
  • Like
  • Save
  • Private Content
Tesis tratamiento de aguas residuales
 

Tesis tratamiento de aguas residuales

on

  • 5,921 views

 

Statistics

Views

Total Views
5,921
Views on SlideShare
5,921
Embed Views
0

Actions

Likes
2
Downloads
176
Comments
0

0 Embeds 0

No embeds

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

    Tesis tratamiento de aguas residuales Tesis tratamiento de aguas residuales Document Transcript

    • DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS TANQUES DEECUALIZACIÓN, ACIDIFICACIÓN Y CORRIENTE DE SALIDA DE LA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA CERVECERA DE BOGOTA D.C. MÓNICA MOYA MORENO MÓNICA ADRIANA RODRÍGUEZ PINZÓN PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología Industrial Bogotá, D.C; 2000 1
    • DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS TANQUES DEECUALIZACIÓN, ACIDIFICACIÓN Y CORRIENTE DE SALIDA DE LA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA CERVECERA DE BOGOTA D.C. TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIOLOGO INDUSTRIAL María Mercedes Martínez Directora Isabel Cristina Gutiérrez Coodirectora PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología Industrial Bogotá, D.C; 2000 2
    • “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado” Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1946 3
    • DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS TANQUES DEECUALIZACIÓN, ACIDIFICACIÓN Y CORRIENTE DE SALIDA DE LA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA CERVECERA DE BOGOTA D.C. MÓNICA MOYA MORENO MÓNICA ADRI ANA RODRÍGUEZ PINZÓN_______________________________ ________________________Dra. AURA ROSA MANASCERO Dr. CARLOS CORREDOR Directora de la Carrera de Decano Académico Microbiología Industrial Facultad de Ciencias PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C; 2000 4
    • DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS TANQUES DEECUALIZACIÓN, ACIDIFICACIÓN Y CORRIENTE DE SALIDA DE LA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA CERVECERA DE BOGOTA D.C. Dra. MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ DIRECTORA Dra. ISABEL CRISTINA GUTIÉRREZ COODIRECTORA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C; 2000 5
    • 6
    • DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LOS TANQUES DEECUALIZACIÓN, ACIDIFICACIÓN Y CORRIENTE DE SALIDA DE LA PLANTA DE TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA INDUSTRIA CERVECERA DE BOGOTA D.C. Dra. SANDRA BAENA JURADO Dr. MANUEL EDUARDO RUIZ JURADO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C; 2000 7
    • A Dios, a mis padres y a mi hermano quienes hansido el más grande aliciente en mi carrera. Mónica Moya MorenoA mis padres y hermanas por brindarme su apoyo ycomprensión en la realización de este proyecto. Mónica Adriana Rodríguez Pinzón 8
    • AGRADECIMIENTOSLos Autores expresan sus agradecimientos a:Las directivas de la División de Producción y al Departamento de Investigación yDesarrollo de la Industria Cervecera por permitir el desarrollo del proyecto ycontribuir con el patrocinio total para su ejecución.La Dra. María Mercedes Martínez, Directora del proyecto por su constanteorientación científica en el manejo de la investigación, y por su estímulo para eléxito del proyecto.La Dra. Isabel Cristina Gutiérrez, Codirectora del proyecto por su constante apoyoy su empeño en la realización de la investigación.A nuestros amigos y compañeros con quienes hemos tenido la fortuna decompartir estos años.A todas las personas que en una u otra forma contribuyeron al logro de lainvestigación. Septiembre de 2000 9
    • TABLA DE CONTENIDO Pág.RESUMEN xx1. INTRODUCCIÓN....................................................................................... 12. MARCO TEORICO.................................................................................... 22.1. Industria cervecera.................................................................................... 32.1.1. Proceso de elaboración de la cerveza.................................................... 32.1.2. Puntos críticos de contaminación de los efluentes cerveceros................ 42.1.3. Características de los vertimientos de una industria cervecera............. 52.2. Aguas residuales....................................................................................... 62.2.1. Características de las aguas residuales.................................................. 72.3. Tratamiento de aguas residuales..... .......................................................... 92.3.1. Pretratamientos o tratamientos primarios............................................. 102.3.1.1. Homogenización y regulación del caudal.......................................... 112.3.2. Tratamientos secundarios...................................................................... 112.3.2.1. Tratamientos anaerobios.................................................................... 132.3.3. Tratamientos terciarios.......................................................................... 182.4. Metabolismo y bioquímica de la digestión anaerobia.............................. 202.4.1. Hidrólisis.................................................................................. ............. 212.4.1.1.Tanque de ecualización o igualación................................................... 222.4.2. Acidificación......................................................................................... 232.4.3. Acetogénesis.......................................................................................... 242.4.4. Metanogénesis....................................................................................... 242.5. Sistema actual de tratamiento de aguas residuale s de la cervecería en 25estudio.............................................................................................................2.5.1. Tratamiento primario............................................................................. 272.5. 2. Tratamiento secundario......................................................................... 272.5.2.1. Homogenización de caudales............................................................. 272.5.2.2. Acidificación...................................................................................... 292.5.2.3. Proceso metanogénico........................................................................ 292.6. Microorganismos indicadores de la calidad........................................... 322.7. Legislación sobre vertimientos............................................................... 35 10
    • 2.7.1. Legislación internacional...................................................................... 352.7.2. Marco legal colombiano...................................................................... 373. JUSTIFICACION........................................................................................ 394. OBJETIVOS................................................................................................ 414.1. Objetivo General....................................................................................... 414.2. Objetivos Específicos............................................................................... 415. METODOLOGIA...................................................................................... 425.1 Ubicación................................................................................................... 425.2. Temporalidad.................. .......................................................................... 425.3. Muestreo.................................................................................................. 425.3.1. Frecuencia de muestreo......................................................................... 425.4. Procesamiento de muestras..................................................................... 445.4.1. Análisis microbiológicos....................................................................... 465.4.1.1. Recuento de heterótrofos.................................................................... 465.4.1.2. Recuento de coliformes...................................................................... 465.4.1.3. Recuento de mohos y levaduras......................................................... 465.4.1.4. Aislamiento y recuperación de cepas................................................. 465.4.1.5. Identificación de cepas aisladas.......................................................... 475.5. Evaluación de microorganismos patógenos............................................. 475.5.1. Evaluación de la presencia de Salmonella sp........................................ 475.5.2. Evaluación de la presencia de Listeria sp.............................................. 485.5.3. Evaluación de la presencia de Staphylococcus aureus.......................... 485.5.4. Evaluación de la presencia de Campylobacter sp. ............................... 485.6. Análisis físico químicos......... .................................................................. 485.7. Análisis estadístico................................................................................... 495.7.1. Análisis de anova para grupos microbianos.......................................... 495.7.1.1. Hipótesis planteada............................................................................. 495.7.2. Comparación múltiple de scheffé para grupos microbianos................. 505.7.2.1. Hipótesis planteada............................................................................. 505.7.3. Comparación de la proporción de crecimiento por bacteria para cadatanque............................................................................................................... 505.7.3.1. Hipótesis planteada............................................................................. 50 11
    • 5.7.4. Análisis de correlación de las variables fisíco-químicas con losrecuentos microbianos por tanque................................................................... 505.7.4.1. Hipótesis planteada............................................................................. 506. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................ 526.1. Muestreo................................................................................................... 526.2. Recuentos microbianos obtenidos............................................................ 536.2.1. Grupo de microorganismos heterótrofos............................................... 536.2.2. Grupo de coliformes.............................................................................. 566.2.3. Grupo de mohos y levaduras................................................................. 616.3. Resultados de análisis físico químicos..................................................... 656.3.1. Comportamiento de DQO.................................................................... 656.3.2. Comportamiento del pH...................................................................... 676.3.3. Correlación entre ácidos grasos volátiles y alcalinidad......................... 686.4. Correlación de variables físico-químicas con los grupos microbianos... 716.5. Microorganismos identificados................................................................ 726.5.1. Evaluación de microorganismos patógenos.......................................... 807. CONCLUSIONES...................................................................................... 838. RECOMENDACIONES............................................................................. 84BIBLIOGRAFÍAANEXOS 12
    • INDICE DE TABLAS Pág.Tabla 1. Puntos críticos de contaminación de los vertimientos cerveceros..... 4Tabla 2. Características típicas de un efluente de cervecería......................... 5Tabla 3. Parámetros de las aguas residuales y concentraciones máximaspermisibles para verter a un cuerpo de agua y/o red de alcantarilladopúblico. ............................................................................................................ 8Tabla 4. Procesos preliminares del tratamiento de aguas residuales............... 10Tabla 5. Diferencias entre los sistemas de tratamiento aerobio y anaerobio... 12Tabla 6. Principales sistemas de tratamiento anaerobio.................................. 13Tabla 7. Compuestos tóxicos........................................................................... 17Tabla 8. Procesos de tratamiento terciario....................................................... 18Tabla 9. Microorganismos patógenos.............................................................. 33Tabla 10. Legislación internacional................................................................. 36Tabla 11. Concentraciones máximas permisibles para verter a un cuerpo deagua y/o red de alcantarillado público según la resolución 1074 delDAMA............................................................................................................. 37Tabla 12. Número de asignación de los muestreos......................................... 44Tabla 13. Análisis de anova para los grupos microbianos evaluados............. 49Tabla 14. Comparación múltiple de scheffé para el gr upo de heterótrofos.... 55Tabla 15. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de coliformes....... 59Tabla 16. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de mohos ylevaduras.......................................................................................................... 64Tabla 17.Comparación múltiple de scheffé para los valores de DQO............ 66Tabla 18. Valores máximos y mínimos de pH en cada tanque........................ 67Tabla 19. Comparación múltiple de scheffé para los valores de pH............... 68Tabla 20. Comparación múltiple de scheffé para los valores de AGV yAlcalinidad....................................................................................................... 71Tabla 21. Niveles de correlación de las variables físico-químicas con losrecuentos microbianos en las etapas del tratamiento....................................... 72Tabla 22. Descripción macroscópica y microscópica de las coloniasidentificadas..................................................................................................... 73Tabla 23. Géneros de microorganismos identificados..................................... 76 13
    • Tabla 24. Valores de Z Calculado para las proporciones d crecimiento en erelación a la etapa de tratamiento.................................................................... 79Tabla 25. Prueba de ausencia-presencia de microorganismos patógenos....... 80 14
    • INDICE DE FIGURAS Pág.Figura 1. Puntos críticos de los vertimientos producidos durante laelaboración de la cerveza................................................................................. 3Figura 2. Reacción general de la digestión anaerobia..................................... 13Figura 3. Reactor UASB.................................................................................. 15Figura 4. Metabolismo de la digestión anaerobia............................................ 21Figura 5. Reacciones bioquímicas durante la hidrólisis.................................. 22Figura 6. Reacciones bioquímicas durante la acidificación............................ 24Figura 7. Reacciones bioquímicas durante la acetogénesis............................. 24Figura 8. Reacciones bioquímicas dur ante la metanogénesis.......................... 25Figura 9. Origen de los vertimientos que llegan a la planta de tratamientode aguas residuales.......................................................................................... 26Figura 10. Diagrama de la planta de tratamiento de aguas residuales en 28estudio..............................................................................................................Figura 11. Diagrama de los reactores de mezcla completa versión UAS........ 31Figura 12. Localización de los puntos de muestreo......................................... 43Figura 13. Procesamiento de muestras............................................................ 45Figura 14. Esquema de operaciones que afectaron las corrientes vertidas ala ptar durante Abril y Junio de 1999............................................................. 52Figura 15. Comportamiento de heterótrofos en la ptar en el tanque deecualización en los meses de abril y junio de 1999......................................... 53Figura 16. Comportamiento de heterótrofos en la ptar en el tanque deacidificación en los meses de abril y junio de 1999........................................ 53Figura 17. Comportamiento de heterótrofos en la ptar en la corriente desalida durante los meses de abril y junio de 1999........................................... 54Figura 18. Comportamiento de heterótrofos en la ptar en los tanques deecualización, acidificación y corriente de salida en los meses de abril yjunio de 1999................................................................................................... 54 15
    • Figura 19. Comparación múltiple de scheffé para el grupo deheterótrofos...................................................................................................... 55Figura 20. Porcentaje de remoción de heterótrofos......................................... 56Figura 21. Crecimiento de coliformes totales en cromocult durante los 56muestreos.........................................................................................................Figura 22. Comportamiento del grupo coliforme en la ptar (tanque deecualización, meses de Abril y Junio de 1999)............................................... 57Figura 23. Comportamiento del grupo coliforme en la ptar (tanque deacidificación, meses de Abril y Junio de 1999)............................................... 57Figura 24. Comportamiento del grupo coliforme en la ptar (corriente desalida, meses de Abril y Junio de 1999).......................................................... 57Figura 25. Comportamiento de coliformes en la ptar en los tanques deecualización, acidificación y corriente de salida en los meses de Abril yJunio de 1999................................................................................................... 58Figura 26. Porcentaje de remoción microbiana de coliformes....................... 59Figura 27. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de coliformes...... 59Figura 28. Confirmación de coliformes en la PTAR en los tanques deecualización, acidificación y corriente de salida durante los meses de abril yjunio de 1999 por medio de la técnica de NMP.............................................. 60Figura 29. Reacción positiva de fluorescencia en caldo fluorocult................. 60Figura 30. Comportamiento de mohos y levaduras en la PTAR ( tanque deecualización, meses de Abril y Junio de 1999)............................................... 62Figura 31. Comportamiento de mohos y levaduras en la PTAR ( tanque deacidificación, meses de Abril y Junio de 1999)............................................... 62Figura 32. Comportamiento de mohos y levaduras en la PTAR (corrientede salida, meses de Abril y Junio de 1999)..................................................... 62Figura 33. Comportamiento de mohos y levaduras en la ptar en los tanquesde ecualización, acidificación y corriente de salida en los meses de Abril yJunio 1999....................................................................................................... 63Figura 34. Porcentaje de remoción microbiana de mohos y levaduras........... 63Figura 35. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de mohos ylevaduras......................................................................................................... 64 16
    • Figura 36. Morfología macroscópica de los hongos identificados.................. 64Figura 37. Valores de DQO registrados en la PTAR en los tanques deecualización, acidificación y salida durante los meses de Abril y Junio de1999................................................................................................................. 65Figura 38. Comparación múltiple de scheffé para la DQO............................. 66Figura 39. Valores de pH registrados en la PTAR en los tanques deecualización, acidificación y salida durante los meses de abril y junio de1999................................................................................................................. 67Figura 40. Comparación múltiple de scheffé para el pH................................. 68Figura 41. Valores de AGVs y Alcalinidad registrados en la PTAR en eltanque de ecualización en los meses de abril y aunio de 1999...................... 69Figura 42. Valores de AGV y Alcalinidad registrados en la PTAR en eltanque de acidificación en los meses de abril y junio de 1999........................ 69Figura 43. Comportamiento de la relación AGVs/Alcalinidad durante losmeses de abril y junio de 1999........................................................................ 70Figura 44. Comparación múltiple de scheffé para los valores de AGV yAlcalinidad....................................................................................................... 71Figura 45. Reacciones bioquímicas observadas en la prueba de API 20 E..... 72Figura 46. Porcentaje de aparición de géneros bacterianos identificados encada etapa del tratamiento .............................................................................. 74Figura 47. Porcentaje de aparición de levaduras identificadas en cada etapadel tratamiento................................................................................................. 75Figura 48. Reacciones bioquímicas observadas en la prueba paraidentificación de levaduras.............................................................................. 78Figura 49. Prueba rápida de identificación para Salmonella sp..................... 81Figura 50. Prueba rápida de identificación para Listeria sp........................... 81 17
    • INDICE DE ANEXOSAnexo 1.Formulación de medios de cultivoAnexo 2. Técnicas empleadasAnexo 3. Fórmulas y cálculos estadísticosAnexo 4. Datos numéricos obtenidosAnexo 5. Perfil bioquímico de los microorganismos identificados 18
    • RESUMENLos sistemas de digestión anaerobia y en especial el Manto de Lodos de FlujoAscendente (UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket), representan unaalternativa importante para el tratamiento de aguas residuales industriales de altacarga orgánica, dadas las condiciones de operación del mismo, los bajos costos deoperación y la remoción de materia orgánica junto con la producción de biogás.En Colombia, la industria ha implementado sistemas de tratamiento de aguasresiduales a fin de aumentar la calidad de los efluentes; industrias como lacervecera utilizan tratamientos anaerobios siendo la tecnología UASBampliamente utilizada.Teniendo en cuenta que el sistema UASB no tie ne como objetivo la remoción demicroorganismos, la caracterización microbiana de los efluentes da a conocer a laindustria cervecera la composición de los mismos en vista de que legislacionesColombianas pudieran ser implementadas a corto plazo, exigiendo una mayorcalidad de los vertimientos industriales descargados en sistemas de alcantarilladopúblico o cuerpos de agua receptores.En el presente estudio se realizó un diagnóstico microbiológico en los tanques deecualización, acidificación y en la corriente de salida de la planta de tratamientode aguas residuales en una industria cervecera, la cual cuenta con un sistemaanaerobio de reactores de mezcla completa versión UAS. Para tal fin serealizaron recuentos microbianos de heterótrofos, coliformes, hongos y levaduras;encontrando porcentajes de remoción del 11%, 12% y 47% respectivamente, en elefluente con relación a la corriente de entrada. Entre los microorganismosidentificados predominaron bacterias entéricas destacándose géneros comoEnterobacter (16%), Escherichia (33%), Klebsiella (12%) y Serratia (6%) conel mayor porcentaje de aparición. Así mismo las bacterias identificadas aisladassobre el agar Cromocult mostraron a Escherichia coli como el principalcoliforme; dada su persistencia en las etapas del tratamiento evaluado. Dentro deldiagnóstico microbiológico se evaluó la presencia de patógenos como Salmonella 19
    • sp., Listeria sp., Staphylococcus aureus, y Campylobacter sp.(ausencia/presencia),encontrándose Listeria sp y Campylobacter sp. en una de las muestras de lacorriente de salida. Los parámetros físico químicos como DQO, Ácidos grasosvolátiles, pH y alcalinidad evaluados en las etapas del tratamiento, permitierondeterminar la influencia de los mismos sobre el comportamiento microbiano;encontrándose una relación inversa del 42% entre la DQO y coliformes en laetapa de acidificación. 20
    • 1. INTRODUCCIONEl creciente desarrollo industrial del país, ha contribuido a la producción deresiduos sólidos, líquidos y gaseosos, descargados en la mayoría de los casos sinningún tipo de tratamiento. Los vertimientos generados en la industria cervecera,por su alto contenido de materia orgánica constituyen uno de los principalesaspectos de la problemática medioambiental, haciendo necesario introducirregulaciones legislativas destinadas a proteger el medio ambiente (Arrieta, 1998).En Colombia el marco legal para la disposición de aguas residuales estácontemplado en el Decreto 1594 del Ministerio de Salud, 1984 que reglamenta losusos del Agua y el manejo de los Residuos Líquidos; así como en la Resolución1074 del 28 de octubre de 1997 del Departamento Administrativo del MedioAmbiente DAMA.Una de las alternativas para el tratamiento de aguas residuales es el tratamientobiológico, en el que se reduce la materia orgánica. Los sistemas de tratamientoanaerobio de tipo UASB han sido de amplia aplicación en la industria cervecera yde bebidas, dada su adaptabilidad para aguas con alta carga orgánica, siendo ladigestión anaerobia la solución más conveniente para transformar la materiaorgánica en ácidos grasos volátiles para la producción de metano y dióxido decarbono; teniendo en cuenta que este sistema no ha sido diseñado para laremoción de microorganismos.Dentro del marco de la problemática ambiental la industria cervecera se hainteresado en conocer las poblaciones microbianas predominantes en susvertimientos, así como la eventual presencia de microorganismos patógenos que anivel de salud pública puedan representar un riesgo para la población;realizándose así un trabajo de base a fin de cuantificar e identificar la cargamicrobiana característica, en las etapas de ecualización, acidificación y en lacorriente de salida. 1
    • 2. MARCO TEORICO2.1. Indus tria cerveceraLa creciente concientización de la industria cervecera en su problemática medioambiental y la implantación de un marco legal que garantice la protección delmedio ambiente mediante el control de los vertimientos industriales, ha hechonecesario el tratamiento adecuado de desechos líquidos mediante procesosbiológicos que aseguren la remoción de materia orgánica (Arrieta, 1998).2.1.1. Proceso de elaboración de la cervezaEl proceso de elaboración de la cerveza consta de tres etapas: la preparación dela malta a partir de la cebada, preparación del mosto de cerveza y fermentación(Figura 1). • Materias primas empleadas en la producción de la cerveza: agua, cebada, malta, triturado de arroz y azúcar, los cuales son recibidos en tolvas que cuentan con extractores de polvo. En el área de cocinas son mezcladas las materias primas de las cuales se obtiene inicialmente una solución compleja de sustancias solubles en suspensión que con ayuda de aumento en la temperatura reaccionan entre sí, a fin de obtener azúcares fermentables, dextrinas no fermentables, y el mínimo de proteínas solubles (principales constituyentes del mosto), después de la ebullición el mosto es bombeado a la olla especial para que mediante una sedimentación se separen las proteínas coagulantes insolubles. • Fermentación: luego de un proceso de aireación y enfriamiento el mosto es enviado a la cava de fermentación, en donde se adiciona la levadura; las cepas para la fabricación de la cerveza son de dos tipos principales; las levaduras que fermentan en la parte superior y las que fermentan en el fondo, siendo las primeras las que permanecen distribuidas de modo uniforme en el mosto en fermentación y son llevadas a la parte superior por el CO2 generado 2
    • Figura 1. Puntos críticos de los vertimientos producidos durante la elaboración de la cerveza 3
    • durante el proceso de fermentación, en tanto que las levaduras del fondo se asientan en los tanques. Las levaduras de la superficie se usan en la fabricación de ales, y las levaduras del fondo se usan para fabricar las cervezas Lager (Brock, 1999). • Maduració n: ocurrida la fermentación, la cerveza es conducida a las cavas de maduración en donde se clarifica y estabiliza el sabor por la reducción del ácido sulfhídrico, acetaldehído, diacetilo y la sedimentación de resina de lúpulo y levadura. Posteriormente la cerveza es filtrada y carbonatada para ser enviada a la envasadora de donde se pasa al proceso de pasteurización. Finalmente ya embotellada es etiquetada y dispuesta en canastas para su distribución (Pabón, 1998).2.1.2. Puntos críticos de contaminac ión de los efluentes cervecerosLos elementos contaminantes en un vertido cervecero son principalmente denaturaleza orgánica, resultado de pérdidas en el proceso de fabricación que van aparar al drenaje, al igual que los vertidos provenientes de aguas de lavado y aguassanitarias.En estudios realizados se ha encontrado que dentro del proceso de fabricación dela cerveza existen puntos críticos que aportan en mayor grado la cargacontaminante, afectando la calidad del efluente final (Figura 1, Tabla 1). Tabla 1. Puntos críticos de contaminación de los vertimientos cerveceros SECCION APORTE DE CONTAMINANTES Cavas y Cocina • Sedimentos producto del lavado de las ollas de cocción. • Soda caústica de lavado. • Agua de enjuague y restos de cerveza. • Levadura y Tierra diatomácea. Envase • Soda caústica de lavado de botellas. • Residuos de lubricantes de trenes de transporte. • Cerveza por rotura de botellas. Sala de máquinas • Aceites y grasas de maquinaria. Planta de llenado • Residuos de cerveza envasada. de latas • Lubricantes de maquinaria. • Aceites solubles. Fuente: Pabón, 1998 4
    • 2.1.3. Características de los vertimientos de una industria cerveceraEl consumo específico de agua en la industria cervecera se puede situar en elrango de los 6-9 Hl/Hl cerveza (Hectolitros/ Hectolitros), con un valor frecuentede 7Hl/Hl cerveza. La mayor parte del agua utilizada en la elaboración decerveza acaba en la red de drenajes de fábrica (entre un 70-80% del consumo).Las características típicas de un efluente de cervecería se muestran en la Tabla 2.Las concentraciones de contaminantes dependen del consumo específico de aguao radio vertido/producción, de las pérdidas que tienen lugar durante la fabricación,el destino de los subproductos o residuos, y del tipo de reactivos químicosempleados (Galdos, 1989). Tabla 2. Características típicas de un efluente de cervecería PARAMETRO UNIDAD VALOR PROMEDIO Consumo de Agua Hl/Hl 7.5 Volumen de Vertidos Hl/Hl 6 DQO mg/l 2700 Kg/m3 cerveza 16 DBO mg/l 1400 Kg/m3 cerveza 8.5 DBO/DQO - 0.55 N-NH4 mg/l 20 P-PO4 mg/l 10 SO4 mg/l 300 PH 7.5 Temperatura °C 30 Fuente: Arrieta, 1998Es así como tanto la naturaleza como la composición son muy variables a lo largode un día de trabajo o en temporadas de alta y baja producció n. Esto se debe a lanaturaleza discontinua del proceso de elaboración de la cerveza (proceso porlotes), razón por la cual el efluente varia en caudal y concentración en cortosperíodos de tiempo, coincidiendo con los momentos en el día en los que seproduce una determinada operación.Además de lo anterior se tienen en cuenta las frecuentes incidencias durantedeterminadas operaciones tanto de cocción como de embotellado, que ocasionanvertidos accidentales altamente cargados o con elevado pH (O’Rourke, 1992). 5
    • Durante la elaboración del mosto se vierten aguas de lavado de la malta, en sumolturación, así como aguas de aclarado en tanques de almacenamiento, quecontienen materias primas y aditivos. También se vierte mosto, en las operacionesfinales de la olla de filtración; bagazo, y turbio caliente en las paradas de limpiezaproducidas en la etapa de cocción.Durante la adición de la levadura, la fermentación y maduración, se vierte mosto ycerveza al final de las operaciones de transferencia desde coci iento hasta mfermentación y desde ésta a maduración. En la filtración se vierte cerveza,levadura y las tierras diatomáceas y adicionalmente el principio y fin de cadafiltración se vierte normalmente al drenaje. En las operaciones de envasado sevierte cerveza por rebose ya sea durante las operaciones de llenado de botellas opor roturas de las mismas en el embalaje. También se vierten papel, adhesivos,tintas, agentes de limpieza alcalinos (soda), ácidos (nítrico y fosfórico),detergentes y desinfectantes (Arrieta, 1998).El agua residual proveniente de la industria de la fermentaciones se caracterizapor velocidades de flujo variable (137m 3/h), alta carga orgánica (6 a 20kgDQO/m3), bajo pH y una relación alta C-N. Dada las características del aguares idual es necesario un pretratamiento in situ antes de ser descargada en sistemasde alcantarillado local y si es posible un eventual tratamiento secundario(Fernández & Polanco, 1996).2.2. Aguas residualesLas aguas residuales son las corrientes de agua que ya han tenido uso alguno ohan sido empleadas durante un determinado proceso de producción; presentandoelevados niveles de contaminación por concentraciones de materia orgánica ysólidos. Su descarga directa en los cuerpos receptores de agua alteran y modificanla calidad de la misma, siendo indispensable el tratamiento previo (CEPIS, 1993). 6
    • Las aguas residuales pueden ser clasificadas de acuerdo al origen del cualprovienen y de acuerdo a la función para la cual fueron empleadas en domésticas,industriales y agrícolas. Las aguas residuales domésticas provienen de lasnecesidades diarias de la comunidad, incluyendo las aguas sanitarias, mientras lasindustriales incluyen el agua que ha sido utilizada para el proceso de producción,lavado, y aguas sanitarias de la planta de producción a diferencia de las aguasresiduales agrícolas que provienen de la escorrentía superficial de las zonasagrícolas (Orozco, 1992).Los vertimientos industriales presentan grandes diferencias en cuanto a suspropiedades físicas y sus constituyentes químicos y biológicos dependiendo de lasmaterias primas empleadas. La mayor parte de los residuos se descargan en lasalcantarillas públicas para su tratamiento en las plantas locales de aguas negras, yalgunas veces la descarga se hace en un río, canal, estuario o en el marocasionando la contaminación de cuerpos de agua receptores (Winkler, 1995).2.2.1. Características de las aguas residualesLa calidad de agua residual es medida de acuerdo con los parámetros físicos,químicos y biológicos que indican el grado y tipo de contaminación del agua.Entre los parámetros físicos se encuentran color, turbiedad, olor, temperatura yconductividad; entre los químicos están parámetros como la demanda química deoxígeno(DQO), demanda bioquímica de oxígeno(DBO), oxígeno disuelto (OD),sólidos suspendidos totales (SST), gases (ácido sulfhídrico y metano), pH yconstituyentes químicos inorgánicos como: alcalinidad, cloruros, metales pesados,nitrógeno, fósforo y azufre (Tabla 3). Las caracter ísticas biológicas se determinanpor los principales grupos de microorganismos y la evaluación de organismospatógenos (CEPIS, 1993). 7
    • Tabla 3. Parámetros de las aguas residuales y concentraciones máximas permisibles para verter a un cuerpo de agua y/o re d de alcantarillado público PARÁMETROS CARACTERÍSTICAS NORMA REFERENCIA Temperaturas del rango mesófilo Biton, 1994 Temperatura desde 25ºC hasta 40ºC con una < 30 °C DAMA temperatura óptima de 35ºC. Res.1074 Color Tonalidad causada por la materia orgánica y contaminantes No aplica Winkler, 1995FÍSICOS Olor Gases producidos por la Winkler, 1995 descomposición de la materia No aplica orgánica. Sólidos Materia disuelta en el agua, que por 2.0 ml / l DAMA Sedimentables decantación forma sedimentos Res.1074 Sólidos Materia flotante y en suspensión, en DAMA Suspendidos dispersión coloidal y el disolución. 800 mg / l Res.1074 Totales El rango de pH utilizado oscila entre Biton, 1994 pH 6.7 a 7.4 pero raramente entre 7.0 a 5- 9 DAMA 7.2. Res.1074 La proporción entre el total de ácidos Mantenerla AGV/Alcalinidad grasos volátiles (como ácido acético) y por debajo Sahm, 1984 el total de la alcalinidad (como de 0.1. carbonato de calcio). Volumen de oxígeno requerido para QUÍMICOS DQO oxidar la fracción orgánica de una Biton, 1994 muestra susceptible de oxidación al 2000 mg / l DAMA dicromato o permanganato, en ácido. Res.1074 Medida de la cantidad de oxígeno requerido para la oxidación de la Biton, 1994 DBO materia orgánica biodegradable 1000 mg / l DAMA presente en la muestra del agua y Res.1074 como resultado de la acción de oxidación bioquímica aerobia Plata Ag 0.5 mg / l Metales Niquel Ni 0.2 mg / l DAMA Plomo Pb 0.1 mg / l Res.1074 Coliformes Se detectan a través de la técnica del 102 MICROBIOLÓGICOS NMP para coliformes. UFC/100ml Keith, 1999 Bacterias Evaluación de la presencia de Listeria Patógenas sp. Campylobacter sp, Salmonella sp, Ausencia Baker, 1999 E. coli. Virus Virus entérico, colifagos somáticos y F Ausencia Baker, 1997 Parásitos Evaluación de protozoos y helmintos. ≥ 1 huevo / OMS, 1989 litro 8
    • 2.3. Tratamiento de aguas residualesEs un proceso que busca la eliminación de los componentes contaminantes, o conefectos nocivos para el medio ambiente, y ajustar la calidad del agua vertida a lasespecificaciones legales (DAMA, 1984).La mejor forma de tratar una agua residual depende de una serie de factores comocaudal, composición, calidad requerida del efluente y las posibilidades dereutilización o vertido a una depuradora municipal.• Caudal : es la cantidad de agua residual tratada por unidad de tiempo, depende del tipo y el tamaño de la industria, así como del grado de reutilización del agua y el pretratamiento de la misma. La fluctuación de los caudales es elevada al generarse descargas intermitentes.• Composición: se refiere a las cantidades de constituyentes químicos, físicos y biológicos presentes en las aguas residuales; la composición en los residuos líquidos puede variar según el tipo de proceso industrial.• Calidad requerida del efluente: para evitar impactos ambientales adversos, la calidad de los efluentes tratados y vertidos debe ser coherente con los usos posteriores de los mismos, teniendo en cuenta parámetros como (OD, SS, pH, y químicos tóxicos)• Posibilidades de reutilización: refiriéndose al uso del agua residual para fines beneficiosos tales como el riego agrícola; refrigeración industrial, o la incorporación a un sistema de abastecimiento.• Posibilidad de vertido a una depuradora municipal: es importante la evaluación de los diferentes métodos de evacuación del agua tratada, ya sea por vertido y dilución en aguas al medio ambiente o por aplicación en cuerpos de agua receptores (Orozco, 1992).Así teniendo en cuenta las características y el origen de los vertimientos a tratares posible diseñar un sistema de tratamiento adecuado mediante el cual se alcanceel nivel de depuración requerida bien sea con posibilidades d reutilización o tan esólo bajo los estándares contemplados en la legislación.El tratamiento de aguas residuales comúnmente es llevado a cabo por medio dediferentes etapas que disminuyen el grado de contaminación en relación con la 9
    • cantidad de materia or gánica; básicamente son llevados a cabo procedimientosfísicos, biológicos y químicos, que constituyen las tres principales etapas de lossistemas de tratamiento.2.3.1. Pretratamientos o tratamientos primariosLos pretratamientos de las aguas residuales implican la reducción de sólidos ensuspensión o el acondicionamiento de las aguas para su descarga bien en losreceptores o para pasar a un tratamiento secundario.Pueden emplearse medios físicos diferentes para realizar la separación de losmateriales de mayor tamaño, entre ellos se encuentran: rejas, tamicesautolimpiantes, tamices inclinados, microfiltros; y para la separación demateriales muy finos es posible montar procesos de desarenación, en donde lasedimentación es la base de la separación. También pueden emplearse procesosquímicos para la precipitación de sólidos suspendidos y coloidales, con el fin deeliminar los sólidos flotantes y grasas (Metcalf & Eddy, 1995).Así estos tratamientos primarios pretenden también llevar a cabo la separació n deaceites, grasas y otros materiales menos densos que el agua, puede realizarseaprovechando la diferencia de densidades (Tabla 4). Tabla 4. Procesos preliminares del tratamiento de aguas residuales OPERACIÓN O PROCESO FUNCIÓN Dilaceración Trituración de los sólidos remanentes después del desbaste grueso. Preaireación Suministro de Oxígeno disuelto para mejorar la distribución hidráulica Cribado Reducción de sólidos en suspensión de tamaños distintos Tamices Desbaste do sólidos gruesos mediante un giro continuo o intermitente de agua a través de un disco inclinado con ranuras fresadas de cobre o bronce. Floculación Mejora de las características de sedimentación de los sólidos en suspensión Sedimentación Eliminación de sólidos en suspensión del mismo tamaño de acuerdo a la diferencia del peso específico entre las partículas sólidas y el líquido donde se encuentran. Desarenado Retención de arenillas, tierra, cáscaras de huevo, semillas y demás partículas con gravedades específicas cercanas, para p revenir el taponamiento de las tuberias. (Velocidad próxima a 0.3m/s) 10
    • Flotación Eliminación de sólidos suspendidos y flotantes previo a la decantación primaria. Precipitación Eliminación de sólidos sedimentables y coloidales y del fósforo. química Fuente: Metcalf & Eddy, 19952.3.1.1. Homogenización y regulación del caudalLa homogenización tiene por objeto uniformizar los caudales y características delefluente cuando los vertidos son irregulares, discontinuos o diferentes de unosmomentos a otros, evitando que descargas puntuales puedan afectar todo elproceso posterior. Para conseguir la homogenización y evitar la sedimentación desólidos, el depósito o tanque donde se lleve a cabo este proceso debe estarprovisto de un sistema de agitación, mecánico o por aire.2.3.2. Tratamientos secundariosLos tratamientos secundarios comprenden una gran variedad de procesosbiológicos en donde las bacterias y varias poblaciones de microorganismos sonlos encargados de destruir y metabolizar la materia orgánica soluble y coloidal,reduciendo la DBO y la DQO a valores inferiores a 100mg/l cuando se trata desistemas aerobio y anaerobio complementario. La velocidad de degradacióndepende de la presencia de los microorganismos adecuados, teniendo en cuentalas características metabólicas requeridas en cada una de las etapas del tratamientoseleccionado.En general los procesos biológicos también llamados procesos de tratamientosecundario, son utilizados para la conversión de la materia orgánica disuelta yfinamente dividida, en flóculos biológicos sedimentables y en sólidos siendoeliminados en los fangos de sedimentación, generando así la reducción de lamateria orgánica (Metcalf & Eddy, 1995). En un tratamiento secundario no sebusca la eliminación de microorganismos patógenos o carga microbiana engeneral, básicamente se centra en la reducción de la materia orgánica.Los procesos biológicos se pueden clasificar en dos grandes grupos, aerobios yanaerobios. Los primeros emplean bacterias que se desarrollan en presencia de 11
    • oxígeno disuelto en el agua, mientras que en los segundos las bacterias sobrevivenen ausencia de oxígeno. En ambos casos las poblaciones microbianas conviertenla materia orgánica en nueva biomasa o fango, dióxido de carbono y metano.Las características de ambos tipos de procesos presentan ventajas y desventajascon relación a las características de diseño, condiciones técnico económicas yeficiencias de remoción de la carga contaminante; así los procesos anaeróbicosofrecen una diversidad de atractivos a diferencia de los procesos aeróbicos, dadoque la tasa a la que se puede llevar a cabo el tratamiento no está limitada por latasa a la que se pueda suministrar el oxígeno. El anaerobio tiene bajas tasas deproducción de lodos residuales, y no requiere de la introducción de un sistema deaeración; lo que reduce sustancialmente los costos de operación, siendo suprincipal desventaja la remoción incompleta de DBO (70-80%) (Arrieta,1998)(Tabla 5). Tabla 5. Diferencias entre los sistemas de tratamiento aerobio y anaerobio TRATAMIENTO AEROBIO TRATAMIENTO ANAEROBIOù Rendimientos de eliminación de DQO ùRendimiento de eliminación de DQO entre 70- mayor al 90% 80% ù Gran consumo energético, requerido ùMuy bajo consumo energético. Produce bajas en la aireación. Genera de 3 a 20 cantidades de lodo. veces mas lodos. ù Mayor consumo de nutrientes ùBaja cantidad de nutrientes (DQO:N:P= (DQO:N:P =100:5:1) 100:0.5:0.1) ù Adecuado para DQO > 2000mg/l ùAdecuado para DQO mayores a 1500mg/l ù No permite paradas sin sustrato, ni ùRequiere control de olores, y mayor control de pH aireación (6.5-7.5)Fuente: Arrieta, 1998 12
    • 2.3.2.1. Tratamientos anaerobiosPara las aguas residuales con alta carga orgánica (2000-30000 o más mg DBO/l)la degradación anaerobia puede representar la digestión más conveniente. Endicho proceso la materia orgánica se descompone por la acción de losmicroorganismos en la ausencia de oxígeno produciendo metano y dióxido decarbono (Figura 2). La gran variedad de géneros microbianos predominan en tesvertimientos tan fluctuantes y con altos niveles de materia orgánica como son losde la industria de alimentos y bebidas permiten que la digestión anaerobiaconstituya una buena alternativa para el tratamiento secundario, obteniendo altosporcentajes de remoción, aproximadamente de un 90% (Winkler, 1995). Materia Orgánica CH4 + CO 2 + H2 + NH3 + H2S Figura 2. Reacción general de la digestión anaerobia Fuente: Schroeder, 1990Básicamente en un reactor anaerobio cerrado, para evitar el contacto del aire, lamateria orgánica soluble y coloidal, se transforma en ácidos volátiles que a su vez,se transforman en metano y CO2. Esos procesos fermentativos son mediados pordiferentes tipos de bacterias que llegan a producir un 65% de metano en el gasproducido, lo cual permite aprovecharlo para mantener la temperatura idónea de ladigestión.Así el tratamiento anaerobio se puede operar en distintos sistemas, variando lascondiciones en el flujo de la corriente a tratar, los materiales de construcción y lossoportes de acuerdo a las características y los caudales tratados (Tabla 6). Tabla 6. Principales sistemas de tratamiento anaerobioSISTEMA FUNCIONAMIENTO REFERENCIAReactores de El sistema donde la biomasa no tiene soporte físico y Contacto mediante agitación se favorece el contacto bacterias- Ramalho, 1991 (CSTR) sustrato, evitando las sedimentaciones de sólidos en el interior del reactor. Filtro En el interior del reactor un material de relleno actúa de Anaerobio soporte físico para la biomasa, y el agua circula en el Fernández, 1996 interior en dirección ascendente.Reactores de En estos reactores los microorganismos se adhieren al Lecho Fijo medio inerte, que puede ser cualquiera de los medios Hernandez, 1992 13
    • usados en los lechos bacterianos. Se destacan reactores de lecho expandido, fundido y reciclado. Reactor Sistema a través del cual el agua residual fluye UASB ascencionalmente a través del fango anaerobio Arrieta, 1998 alcanzándose la depuración y la retención de la biomasa por medio de los separadores de tres fases. (Agua – fango – gas)CSTR: Continually Stirred Tank Reactor UASB: Upflow Anaerobic Sludge BlanketUno de los sistemas anaerobios más utilizado para el tratamiento de aguasresiduales es el sistema UASB (Upflow Anaerobic Sludge Banket), dicho sistemafue introduc ido a mediados de la década de los setenta por Lettinga ycolaboradores en la Universidad Agrícola de Wageningen (UAW) en Holandapara el tratamiento de aguas residuales industriales generadas de la industriaalimenticia (Orozco & Giraldo, 1986).En los años 80 se reconoció el potencial de la aplicación de la tecnología UASBpara el tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales en países en víade desarrollo.En Colombia se ha llevado a cabo la implementación de sistemas anaerobios detipo UASB en industrias productoras de levaduras (NABISCO ROYALCOLOMBIANA), con un 60% de remoción de DQO; embotelladora de bebidasgaseosas (con un 85% de remoción de DQO), industria cervecera (con un 80% deremoción de DQO), y efluentes de matadero y frigorífico (con un 75% deremoción de DQO)(Aldo & Magallana, 1999). En el campo cerveceroreconocidas industrias han implementado sistemas de tratamiento combinadosentre biológicos, físicos y químicos que logran obtener eficiencias de remoción deDQO entre el 96 y el 98% obteniendo un efluente de alta calidad fisicoquímica ymicrobiológica (Toquica, 1999).Este tipo de sistema no lleva ningún material de soporte de los microorganismos,pues la propia biomasa produce unos flóculos o granos relativamente densos queactúan de auto soporte. El sistema UASB se adapta muy bien al tratamiento deafluentes con alto contenido de materia orgánica, siendo empleado en casos 14
    • donde la eliminación o conversión de la misma en metano es el objetivo principal. Las partes más de stacables del reactor UASB son el sistema de alimentación, la distribución del influente y el separador de fases. En este tipo de reactor el agua se reparte por toda la sección inferior a través de una capa densa de fango anaerobio atravesando ésta en su movimiento ascensional, donde la DQO removida es convertida parcialmente en biogás (Figura 3). Campana colectoraDeflector Efluente Tolva Sistema de Recirculacion de lodosCorriente a tratar Reactor Figura 3. Reactor UASB Fuente: Industria cervecera, 1999 En la parte superior del reactor se encuentra el separador que descarga el efluente tratado, el fango y el biogás. A medida que el biogás es separado y evacuado a través del sistema de campanas colectoras que conforman el separador, se reduce la turbulencia restableciéndose la tranquilidad y el fango pesado se decanta en el reactor (Metcalf & Eddy, 1995). El proceso de digestión anaerobia es afectado por múltiples factores como la temperatura, el tiempo de retención, el pH, la composición química del agua 15
    • residual, la competencia de las metanogénicas con las bacterias sulfato-reductoras,y la presencia de tóxicos; siendo el principal problema de este sistema laretención de la biomasa dentro del reactor, trabajando con tiempos de retenciónhidráulicos bajos (velocidades de agua elevadas). La actividad metanogénicapotencial de dicha biomasa se ve principalmente afectada por aspectos físicos dediseño (capacidad y tiempo de retención, contacto biomasa-agua, inhibición porretroalimentación y compuestos tóxicos) del reactor que limitan su capacidad detratamiento.• Capacidad de retenciónEn los reactores UASB la retención de la biomasa en el interior del reactor selogra por medio de los separadores de tres fases (agua, fango y gas) colocados enla parte superior. Si la velocidad del agua a través del separador es demasiado alta,o a la altura del separador existe una gran turbulencia originada por una granproducción debiogás, el efluente arrastra más fango del que se crea en el interior del reactor, loque se traduce en una pérdida paulatina de la biomasa y de la capacidad detratamiento (Arrieta, 1998).La mayor ventaja del UASB a través de su diseño es que permite la retención deuna gran cantidad de biomasa activa en comparación con otros sistemasanaerobios, tolerando así altas descargas orgánicas. El flujo ascendente es uno delos principales factores para la formación de lodo granular responsable de la altatasa de depuración (Lettinga et al, 1990). Para el tratamiento de aguas residualesde industrias de bebidas se ha optado por la implementación de sistemas UASBgracias a la habilid ad para retener grandes cantidades de biomasa debida a laadhesión de células bacterianas en gránulos de biomasa manteniendo un ambientenutricionalmente favorable dado el gran flujo de nutrientes que se presenta(MacLeod , 1990).• Tiempo de retenciónEl tiempo de retención hidráulico (TRH), depende de las características ycondiciones de diseño, éste debe ser el suficiente para que se lleve a cabo elmetabolismo anaerobio bacteriano en el digestor. Los digestores que presentan un 16
    • crecimiento uniforme tien un TRH más bajo que aquellos digestores que enpresentan un crecimiento disperso. En el caso de tanques de acidificación se haencontrado un tiempo de retención adecuado de 3 horas, y en los reactores hasta 6horas, cuando se trabaja con reactores de fases separadas (Polprasert, 1989).• Contacto biomasa/aguaEl segundo aspecto limitante para la plena utilización de la capacidad de labiomasa en la eliminación de la materia orgánica del agua residual es el contactofango/agua. Este contacto se mejora con una buena expansión o fluidificación delmanto de fangos en el interior del reactor, así como una buena distribución delinfluente sobre toda la sección del reactor (Arrieta, 1998).• Formación y acumulación de H2SLa presencia de sulfatos en aguas residuales estimula la actividad de bacteriasreductoras de sulfato (BSR) durante el tratamiento anaeróbico de estos vertidos.La actividad de estas bacterias limita la producción de metano al competir, poralgunos substratos comunes (Hidrógeno y Acetato), con las bacteriasmetanogénicas, ya que éstas utilizan el acetato como fuente de electrones (Smul& Verstraete, 1999).• Presencia de compuestos tóxicosUn amplio rango de tóxicos son los responsables de fallas en el proceso dedigestión anaerobio. La inhibición en el proceso es evidenciada en la reducciónde la producción de metano y un aumento en la concentración de ácidos volátiles(Tabla 7). Tabla 7. Compuestos tóxicos COMPUESTOS EFECTOS REFERENCIA Oxígeno Inactiva enzimas claves en la actividad Wolfe, 1989 metanogénica. Amonio Disminuye la retención de sólidos y Parkin, 1989 aumenta el tiempo de retención. Concentraciones entre 1500-3000 g/l son tóxicas e inhibitorias de la actividad metanogénica. Metales Pesados Inhiben la actividad metanogénica, Parkin, 1989 Pb+2,Cd + 2, Ni+2, cuando la afinidad del metal por el lodo Zn+2, Cr +6 disminuye. Sulfuro Se difumina a través de la membrana Rinzema, 1988 celular. Estos son tóxicos cuando los niveles exceden 150-200 mg/l. Acidos Grasos de Acidos como el caprílico, laurílico, Wolfe, 1989 17
    • cadena larga mirystico y oleico, inhiben la actividad de las bacterias acetoclásticas.2.3.3. Tratamientos terciariosEste tipo de tratamientos complementa el tratamiento de las aguas residualescuando se requiere una depuración mayor de la conseguida con los tratamientosprimarios y secundarios. Esta etapa del tratamiento incluye procesos específicoscomo precipitación, adsorción en carbón activo, oxidación química, inyección conaire a vapor, intercambio iónico, ósmosis inversa y elec trodiálisis (Cepis, 1993)(Tabla 8). Tabla 8. Procesos de tratamiento terciario PROCESO FUNCIONAMIENTO REFERENCIA Filtración Eliminación de sólidos arrastrados, el medio de filtración puede ser arena, grava, antracita, u otro Hernandez, material adecuado. 1992 Adsorción Concentración de un soluto en la superficie de un sólido, acumulándose una capa de moléculas de Rozano, 1995 soluto en la superficie del sólido por el desequilibrio de las fuerzas superficiales. Ozonificación Oxidación con ozono O3 para la eliminación de compuestos orgánicos no saturados presentes en el Rigola, 1989 AR, reducción de la formación de espuma. Cloración Desinfección con cloro por la fuerte capacidad de oxidación de iones metálicos y cianuros a productos Rozano, 1995 inocuos, por la reducción de la DBO, y la eliminación de colores y olores. Desinfección Exposición a radiaciones UV con longitud de onda de Doménec et al., con UV 254nm, es una alternativa efectiva para evitar los 1999 efectos nocivos de la cloración. AR: Agua Residual UV: UltravioletaLa importancia de la implementación de los sistemas terciarios radica en lanecesidad de destruir agentes patógenos que signifique un grave riesgo sobre lasalud pública. Los procesos de desinfección son esenciales como barrera entre losagentes causantes de enfermedades y el hombre. Los sistemas terciariosexistentes comprenden procesos físico y químicos. 18
    • La cloración es uno de los esquemas de desinfección mas utilizados como sistematradicional, en sus var iantes hipoclorito de calcio (estado sólido), hipoclorito desodio (estado líquido) y cloro gaseoso, dado su fácil acceso y variedad de costos.La desinfección del cloro actúa por la alteración y ruptura de la pared celular,ocasionando la desintegración celular (Bosch, 1993). Sin embargo el granproblema de la utilización de cloro para la desinfección de aguas residuales es laformación de trihalometanos como cloroformo, diclorometano, bromoformo,1,2docloroetano; compuestos considerados carcinógenos (Archer, 1992).La ozonización es uno de los sistemas de desinfección más efectivos para laremoción de patógenos sin embargo dados los costos que puede significar suimplementación no es usado ampliamente solo cuando se requieren efluentes dealta calidad (Kuo & Yamashita, 1999).El ozono es un agente fuertemente oxidante y es muy efectivo para la remoción deolor, sabor y color. Este oxidante es utilizado para la inactivación de patógenos(bacterias y parásitos) y para la oxidación de hierro y manganeso; compuestoscausantes del olor, sabor y color. En medio acuoso el ozono produce radicaleslibres que inactivan los microorganismos, afectando la permeabilidad, la actividadenzimática y el DNA bacteriano (Ishizaki, 1984). Algunos efectos adversosrelacionados con el uso del ozono son los incrementos en la mutagenicidad convalores >3 mg/l, sin embargo esto puede contrarrestarse con filtros de carbónactivado (Matsuda, 1992).La desinfección con radiación ultravioleta UV utiliza lámparas de mercurioencerradas en tubos de cuarzo para permitir la irradiación bajo las corrientes deagua ejerciendo así un efecto germicida a 2.537 nm debido a que en los ácidosnucleicos (ADN y ARN) microbianos son producidas mutaciones, impidiendo sureproducción y causando así su destrucción. Una de las dificultades para laaplicación de la radiación ultravioleta consiste en calculo de la dosis necesaria aun flujo determinado para la desinfección del agua residual. Otras desventajasson los altos costos de mantenimiento y limpieza y en algunas ocasiones es 19
    • necesario agregar cloro posterior. Sin embargo es eficiente en la inactivación debacterias , virus y parásitos, no presenta problemas de olores, no requiere muchoespacio ni almacenaje de químicos (Bitton, 1994).Otros sistemas terciarios son los de tipo físico que consisten en microfiltración yfiltración por membranas, procesos de sedimentación y coagulación por agentesquímicos. Estos sistemas son mucho mas económicos y pueden ser unaalternativa en los tratamie nto de aguas residuales, permiten la remoción departículas así como de parásitos y bacterias (Edzwald & Kelley, 1998).2.4. Metabolismo y bioquímica de la digestión anaerobiaLa digestión anaerobia se realiza en tres etapas en las cuales la materia orgá nica estransformada por la acción de microorganismos en 78% de biogás (mezcla de CH4+ CO2); 20% de materia orgánica degradada que continúa en disolución; y 1-2%en nuevos microorganismos (crecimiento anaerobio). La degradación de materiaorgánica se realiza a través de una serie compleja de reacciones bioquímicas quetranscurren tanto en paralelo como en serie (Fernández, 1996).Las distintas reacciones bioquímicas que tienen lugar en el tratamiento anaerobiose pueden agrupar en 4 fases diferenciadas que incluyen hidrólisis, acidificación,acetogenésis y metanogenésis (Figura 4). 20
    • MATERIA ORGANICA PROTEINAS CARBOHIDRATOS LIPIDOS HIDRÓLISIS AMINOÁCIDOS AZUCARES ACIDOS GRASOS PRODUCTOS INTERMEDIARIOS PROPIONATO, BUTIRATO, LACTATO Fermentación Oxidación Anaeróbica ACETATO HIDROGENO METANO Figura 4. Metabolismo de la digestión anaerobia Fuente: Arrieta, 19982.4.1. HidrólisisLa materia orgánica en suspensión con estructura compleja se transforma encompuestos solubles por actuación de exoenzimas. Las proteínas sontransformadas en simples aminoácidos, las grasas en glicerol y ácidos grasos y loscarbohidra tos en azúcares; esta degradación se da con el fin de facilitar lapenetración de sustratos al interior de la célula (Figura 5).Dado el alto contenido de hidratos de carbono (almidón y azúcares) presente en elefluente cervecero, dicho polisacárido es atacado por el complejo de amilasasmicrobianas produciendo así sustratos más asimilables por las poblacionesmicrobianas que intervienen en las etapas posteriores de la digestión anaerobia. 21
    • Hidrólisis de Carbohidratos C6 H1 2O6 C4H 9OH + 2CO 2 + H2 O Glucosa Butanol Dióxido de carbono Agua C4H9OH + H2 O 3CH4 + CO2 + H2 O Butanol Agua Metano Dióxido de carbono Agua Hidrólisis de Proteínas CO(NH2 ) 2 + H2O CO2 + 2NH 3 + H 2S + 4(CH2 NH2.COOH) + 2H 2O Agua D. de carbono Amoniaco Sulfuro de H Agua 4(CH2NH2.COOH) + 2H2O 3CH4 + 5CO 2 + 4NH3 Agua Metano D. de carbono Amoniaco Hidrólisis de Grasas C 3H5(CH3.(CH2)1 6.COO)3 + 3H2 O C3 H5(OH) 3 + 3(CH 3.(CH2 )16 .COOH) Agua Glicerol 4(C3 H5(OH) 3) - 2H2O 7CH4 + 5CO2 Metano D. de carbono 12(CH3 .(CH2)16.COOH) + 3H 2O 52CH4 + 20CO 2 Metano D. de carbono 59CH 4 + 25CO2 Metano D. de carbono Figura 5. Reacciones bioquímicas durante la hidrólisis Fuente: Hernández, 1992Durante el proceso de hidrólisis están asociados microorganismos anaerobiospertenecientes a los géneros Bacteroides, Acetivibrio, Ruminococcus, Closttridiumy Anaerovibrio entre otros y microorganismos facultativos pertenecientes a losgéneros Pseudomonas, Bacillus y mohos como Aspergillus sp y Penicillium sp(Speece, 1983).2.4. 1.1.Tanque de ecualización o igualaciónEste se hace necesario cuando las variaciones en el flujo o composición del aguaresidual son muy altas. La principal función de este depósito es regular el flujo deun desecho y homogenizar las características de los caudales a fin de dar inicio alproceso de transformaciones bioquímicas previas al tratamiento anaerobio.Además es un sistema de amortización para altas descargas orgánicas,permitiendo mejorar la transferencia de (Carvajal, 1997). 22
    • 2.4.2. AcidificaciónLas bacterias acidificantes transforman la materia orgánica disuelta aminoácidos,azúcares, y ácidos grasos de cadena larga, en ácidos grasos volátiles como el ácidoláctico, acético, propiónico, y butírico principalmente, en función del sustratobase, y CO2 + H2 . Así la cinética del proceso es rápida a pH bajo (5.8 – 6.2).Durante el proceso de acidogénesis, están bacterias fermentativas pertenecientes alos géneros Clostridium, Bacteroides, Lactobacillus, Acetivibrio entre otros yalgunos microorganismos facultativos que conciernen a los géneros Escherichia,Salmonella y Klebsiella, correspondientes a la familia Enterobacteriaceae.Este proceso es esencial para que se lleve a cabo la digestión anaerobia, pues laproducción de dichos ácidos libera compuest os simples como hidrógeno yacetato primordiales para las poblaciones microbianas presentes en losreactores (Figura 6).De igual manera previo a la entrada de los reactores es necesario un proceso deneutralización de los vertidos. Esta neutralización persigue eliminar la acidezmezclando vertidos de pH opuesto, de manera que los vertidos ácidos seneutralizan por adición de un álcali, en general cal, por razones económicas,aunque a veces es necesario utilizar solución concentrada de NaOH o Na 2CO 3, dereacción más rápida y que no pueden dar problemas de precipitación de sulfato decalcio. El principal fin de esta neutralización es alcanzar un pH de 6.5 a 7.0óptimo para el crecimiento de las poblaciones metanogénicas presentes en losreactores (Rozano, 1995).En la industria cervecera es llevado a cabo un proceso de neutralización a travésde gaseado con dióxido de carbono o soda cáustica para ajuste del pH neutro, asímismo durante la etapa de acidificación se lleva a cabo la adición demicronutr ientes como Sulfato de magnesio heptahidratado, cloruro de calcio,cloruro férrico, sulfato de manganeso y macronutrientes como urea y ácidofosfórico (Metcalf, 1998). 23
    • AA-Azúcares-Ac.Grasos Ac.Orgánicos + Alcoholes -Cetonas + Acetato + CO2 + H2 Acético, Fórmico Propiónico, Láctico Butírico, Succínico A.A: Aminoácidos azufrados H2S Figura 6. Reacciones bioquímicas durante la acidificación Fuente: Bitton, 19942.4.3. AcetogénesisEn esta etapa del proceso las bacterias acetogénicas convierten los productos delas acidificantes en ácido acético, hidrógeno y dióxido de carbono; estas convivencon y dependen de las metanogénicas ya que solo pueden metabolizar cuando lasmetanogénicas o las sulfatoreductoras mantienen suficientemente baja laconcentración de acetato y la presión parcial del hidrógeno en el líquido (Arrieta,1998) (Figura 7). Etanol + Ac.Propiónico + Ac. Butírico Acido Acético CH3 CH2OH + CO2 CH3 COOH + 2H2 Etanol Ac. Acético CH3 CH2COOH + 2H2O CH3 COOH + CO2 + 3H2 Ac. Propiónico Ac. Acético CH3 CH2 CH2COOH + 2H 2O 2CH3 COOH + 2H2 Ac. Butírico Ac. Acético Figura 7. Reacciones bioquímicas durante la acetogénesis Fuente: Bitton, 1994En el proceso de acetogénesis están asociados Syntrophobacter wolinii ySyntrophobacter wolfei (Boone et al, 1980), Syntrophomonas sp. (McInerney etal, 1981) y Syntrophus sp.2.4.4. MetanogénesisEs el proceso final en donde las bacterias metanogénicas producen CH4 a partir demezclas de acetato y CO2 + H2, este proceso tiene lugar en condicionesestrictamente anaerobias, a un pH óptimo de 7.0 y temperatura óptima de 35°C. 24
    • La producción de metano se lleva a cabo mediante dos rutas metabólicas, lareducción del dióxido de carbono y el hidrógeno (metanogénicas hidrogenofílicas)y la fermentación del ácido acético (metanogénicas acetoclásticas) (Figura 8)(Bitton, 1994). Metanogénicas Hidrogenofilicas CO 2 + 4H2 CH4 + 2H2O D. de carbono Hidrógeno Metano Agua Metanogénicas Acetoclásticas CH COOH 3 CH4 + CO2 Ac. Acético Metano D. de carbono Figura 8. Reacciones bioquímicas durante la metanogénesis Fuente: Hernández, 1992El grupo de metanogénicas se localiza al final de la cascada de nutrientes y son losencargados de convertir el CO 2 , H2 , y acetato a metano (MacLeod et al, 1990).Investigaciones realizadas por MacLeod et al (1990) en lodos de digestoresanaerobios , identificaron como el principal metanógeno hidrofílicoMethanospirillum hungatei también se identificó Methanobrevibacter sp, yMethanosarcina sp en pequeños agregados (Dubourguier, 1993).2.5. Sistema actual de tratamiento de aguas residuales de la cervecería enestudioLa planta de tratamiento de aguas residuales estudiada se encuentra ubicadadentro del área de la planta de producción de la industria cervecera. Cue nta conun tratamiento primario constituido por sistemas de desbaste de sólidos y untratamiento secundario de tipo anaerobio con reactores de mezcla completaversión UAS presentados como ANAPULSE (reactor anaerobio de manto delodos pulsado). La llegada de los vertimientos a la planta proviene de dosgrandes corrientes; la principal, correspondiente al drenaje de tapas, maltería,cocinas, cavas, y casino, incluyendo aguas sanitarias; y la corriente que provienedel salón de envases y planta de llenado de latas, entra a la planta como unacorriente diferente (Figura 9). 25
    • Sala de máquinas y calderas Tapas y Malteria Salón de Envase Cavas Planta de Cocinas Cocina Nordon Steineker Llenado de latas Alcantarillado CasinoPlanta de Tratamiento de Aguas Residuales Figura 9. Origen de los vertimientos que llegan a la planta de tratamiento de aguas residuales 26
    • 2.5.1. Tratamiento primarioLa planta cuenta con un tratamiento primario en donde por medio de procesosfísicos como el desbaste por rejillas y tamices, se lleva a cabo la separación desólidos de mayor tamaño, y una posterior desarenación en donde se retiran porsedimentación arenillas, tierra diatomácea y en general sólidos suspendidos.En vista que los vertimientos tratados en la planta, son recibidos en dos grandescorrientes; la corriente de tapas, maltería, cocinas, cavas, casino, y aguassanitarias sufre un procesos físico de desbaste por tamices estáticos; mientras quela corriente de envases y de la planta de llenado de latas sufre un desbaste portamices gruesos rotatorios, dado el tamaño de los sólidos a separar provenientesde esta corriente (tapas, colillas y etiquetas principalmente).2.5.2. Tratamiento secundarioEn el tratamiento secundario se lleva a cabo un proceso biológico de tipoanaerobio, el cual involucra los procesos de hidrólisis, acidificación, acetogénesis,y metanogénesis.2.5.2.1. Homogenización de caudalesPosterior al tratamiento físico por desbaste y desarenación la dos corrientes seunen al llegar al tanque de ecualizació n, donde es llevada a cabo lahomogenización de caudales. Este tanque tiene una capacidad volumétrica de770m3, maneja un caudal promedio de 216m 3/h, un tiempo de retención hidráulicade 3.6h y un pH que varia entre 6-10; condiciones dadas al momento del estudio(Figura 10). 27
    • Envase -Planta de llenado de latas Tamices gruesos Cavas y Cocinas rotatorios TK. ECUALIZACIÓN DESARENADOR Q= 216 m 3/h Volumen: 1680m 3 TRH= 7.8h TRH= 3.6h pH= 6-10 TK. ACIDIFICACIÓNRecolección de Cascarilla TAMIZADO Bomba sumergible Mezclador sumergible TK. BOMBEO 86 m3 TK. NEUTRALIZACIÓN 35 m3 TRATAMIENTO PRIMARIO TRATAMIENTO SECUNDARIO Figura 10. Planta de tratamiento de aguas residuales en estudio Fuente: Industria cervecera, 1999 28
    • 2.5.2.2. AcidificaciónEl proceso de acidificación es llevado a cabo en un tanque cuyas condiciones deoperación están determinadas por una capacidad volumétrica de 1680m3 , untiempo de retención hidráulica de 7.8 horas, y un pH entre 5.8 - 6.2. En esta etapadel proceso se lleva a cabo la adición de micronutrientes como son sales de hierro,zinc, cobalto y molibdeno, al igual que macronutrientes como urea (Figura 10).Transcurrido el tiempo de retención en este tanque el agua pasa por rebose altanque de neutralización a fin de controlar las condiciones de pH previo a laentrada a los reactores, esto se lleva a cabo mediante sensores de pH dispuestosen las tuberías, siendo controlado con adición de soda cáustica hasta alcanzar unpH de 6.8 – 7.2.Posteriormente la corriente pasa por rebose al tanque de bombeo en dondesensores de flujo unidos a las tuberías facilitan la medición del caudal.2.5.2.3. Proceso metanogénicoPara llevar a cabo el proceso metanogénico el sistema cuenta con cuatro reactoresanaerobios de mezcla completa de versión UAS de manto de lodos de lechopulsado con recirculación de lodos desde un decantador lateral utilizando para elloel mismo biogás.Las condiciones de operación de los reactores están determinadas por unacapacidad volumétrica de 1620m 3, un volumen de reacción de 655m3 , y dado quelos reactores operan por pulsos ma nejan un caudal promedio de 60–80m3 cada 10minutos y tienen un tiempo de retención hidráulica de 4 horas. Posteriormente elagua tratada se dirige hacia una canaleta Parshall, de allí es vertida alalcantarillado, donde tiene como cuerpo receptor el río Bogotá, siendo en parteutilizada para riego agrícola (Figura 11).La planta de tratamiento de aguas residuales cuenta con un sistema de eliminaciónde olores en el cual el control del H2S producido en los tanques de ecualización,acidificación, neutralización y bombeo, se realiza extrayendo el colchón de gas 29
    • formado en estos tanques y haciéndolo pasar por una resina empacada la cualabsorbe el H2 S (Pabón, 1998).El biogás producido es llevado a través de una tubería hacia una tea decombustión siendo regulado el caudal y la presión del mismo mediante ungasómetro. 30
    • T. Neutralización T. de bombeo. T. Neutralización Temperatura: 26 - 27 grados ºC pH: 7.17 Bomba sumergible Reactor 1 Reactor 2 Volumen : 1620m 3 V. de reacción: 655m3 Canaleta PARSHALL Figura 11. Diagrama de los reactores de mezcla completa versión UAS Fuente: Industria cervecer a, 1999 31
    • 2.6. Microorganismos indicadores de la calidad del agua residualDentro de los organismos patógenos para el hombre que se transmiten por el aguase incluyen virus, bacterias y protozoarios, éstos organismos se desarrollan en elintestino y abandonan al organismo en las heces. Entonces la contaminación fecalde los suministros de agua puede ocurrir y si ésta no es tratada adecuadamente lospatógenos penetran en un nuevo huésped al consumir agua (Brock & Madigan,1999).Dado el impacto que pueden ocasionar los microorga nismos patógenos sobre lasalud pública; recientes investigaciones se han dedicado a la detección rápida delos indicadores tradicionales como lo son los coliformes y otros organismos queactúan como patógenos emergentes transmitidos por el flujo de agua en caso deser reutilizada para suministro directo en operaciones de limpieza oindirectamente en el riego de cultivos, lo que generaría un alto riesgo decontaminación para el hombre, representado en infecciones gastrointestinales,enfermedades transmitidas por alimentos que ha sido regados con aguas tratadas yen general el desencadenamiento de brotes epidemiológicos por contacto condichos patógenos, afectando por ende la calidad de vida (Baker, 1998).Como consecuencia de la contaminación fecal, las aguas residuales presentanregularmente una contaminación con varios patógenos, incluyendo Salmonellasp., Helicobacter sp. , Listeria sp. , y Campylobacter sp. ; además algunasinvestigaciones han mostrado la prevalencia de gastroenteritis en los trabajadoresde las plantas de tratamiento de aguas residuales en donde síntomasgastrointestinales y constantes dolores abdominales se han atribuido a la presenciade patógenos entéricos en las corrientes tratadas (Kearney et al., 1993, Baker etal., 1999)Estudios realizados en sistemas de digestión anaerobia han demostrado lapresencia de bacterias entéricas como E.coli, Salmonella typhimurium, Yersiniaenterocolitica, Listeria monocytogenes y Campylobacter jejuni tras tratamientosde tipo anaerobio, teniendo en cue nta que las aguas residuales tratadas incluían 32
    • aguas sanitarias (aguas domésticas), siendo estas la principal fuente decontaminación de origen fecal (Kearney et al, 1994).En los países desarrollados el principal objetivo del tratamiento es la remoción demateria orgánica y nutrientes, pues una tifoidea o un caso de parasitismo sonexcepcionales. En cambio, en los países en desarrollo, el objetivo prioritario detratamiento de las aguas residuales debe ser la remoción de parásitos, bacterias yvirus patógenos que ocasionan enfermedades endémicas (CEPIS, 1995).Las excretas y las aguas residuales contienen generalmente elevadasconcentraciones de agentes patógenos, sobre todo en países donde predominan lasenfermedades diarreicas y los parásitos intestinale s. Dada la importancia quereviste a nivel de salud pública; es necesario mantener un sistema de vigilanciapara la evaluación de microorganismos patógenos que pudieran desencadenarbrotes epidemiológicos. Las aguas superficiales juegan un papel importante en latransmisión de agentes patógenos descargados a través de las heces humanas yanimales. Estos agentes llegan a esta agua, provenientes de aguas residualesdomésticas e industriales y pueden retornar a los humanos por varias vías como eluso de esta a gua para recreación, deportes, riego, así como agua potable (Tabla 9)(Khuder, 1998). Tabla 9. Microorganismos patógenos PATOGENOS CARACTERÍSTICA FOTOGRAFIA RFERENCIA Bacilo Gram negativo de la familia Enterobacteriaceae, Le Minor, Salmonella sp. anaerobio facultativo, patógeno Bergey´s en humanos causante de Manual 1984 gastroenteritis y septicemia. Bacilo Gram positivo, aerobio y anaerobio facultativo, habitante de aguas residuales, suelo y Seeliger & Listeria sp ensilajes, esta asociada con Jones, enfermedades de riesgo severo Bergey´s como septicemia, cefalea y Manual 1984 meningitis 33
    • Coco Gram positivo, es la especie más patógena de la familia Micrococaceae, capaz de Koneman, Staphylococcus producir dolores abdominales, 1993 aureus vómito, diarrea y nauseas. Bacilo curvo gramnegativo, microaeróbico, se transmite al Brock, 1993 hombre por los alimentos Sebald & Campylobacter contaminados o por aguas Veron, residuales y superficiales no Bergey´s sp. sometidas a cloración Manual 1984Es evidente que la reutilización de aguas residuales representa un alto riesgo tantopara la salud pública como para los trabajadores del sistema de depuración, ya quela exposición a microorganismos patógenos y a sustancias tóxicas es más elevadaen estos casos. Auque el contacto con agentes patógenos que generen peligro en lasalud de la población no se refiere tan sólo a la ingestión del agua residualdepurada o al contacto con la piel o mucosas, pues en los sistemas de reutilizaciónpueden resultar afectadas diversas matrices ambientales, entre las cuales sedestaca el aire, las aguas subterráneas, la tierra y los vegetales regados con aguastratadas. (CEPIS, 1995)Los principales patógenos encontrados en las aguas residuales hacen referencia alos causantes de enfermedades gastrointestinales, como Salmonella y E.coli, puesen América Latina y en el Caribe estas figuran entre las diez primeras causas demuerte (Yánez, 1994).Algunas investigaciones realizadas recientemente en México muestran lapresencia de Salmonella sp. en diferentes sitios de una planta de tratamiento deaguas residuales y la presencia de dicha bacteria en los operadores de la planta,dado que a principios de 1972, en México se presento una epidemia de tifoideaocasionada por la ingesta de agua contaminada procedente de un canal destinadoal riego agrícola con aguas residuales. En vista de que las enfermedadesinfecciosas como salmonellosis y fiebre 34
    • tifoidea son enfermedades con mortalidad relativamente alta, se han relacionadocon la presencia de Salmonella sp. en aguas residuales empleadas para riego, dadoque esta bacteria en estado de resistencia o vida vegetativa sobreviveextraordinariamente a los sistemas de digestión anaeróbica (Garza, 1999).Es importante tener en cuenta que la calidad final del efluente depende en granmanera del tratamiento que se le de al agua, pues los tratamientos previosmediante rejas o dilaceración no tiene ningún efecto en el contenido de patógenosen agua residual, al igual que sistemas de tratamiento como la digestión anaerobia,los cuales no han sido diseñados para la remoción de patógenos comoCampylobacter sp. y Listeria sp. pues las facultades adaptativas de estas bacteriasa las condiciones anoxigénicas les permiten sobrevivir al tratamiento (Curtis,1999).Los tratamientos con lodos activados tienen realmente poca efectividad en laremoción de patógenos, mientras que los estanques o lagunas para el tratamientode aguas residuales son capaces de conseguir cua lidades microbiológicassuficientemente buenas con tiempos de retención de 15 a 30 días, ofreciendo asíbuenas condiciones para la sedimentación de protozoos y helmintos.A pesar de esto para la eliminación completa y continua de organismos patógenosen aguas residuales es necesario implantar sistemas de tratamiento terciario quecomplementen los tratamientos biológicos; siendo la cloración uno de losesquemas de desinfección mas ampliamente utilizados.2.7. Legislación sobre vertimientos2.7.1. Legislación internacionalEl tratamiento de aguas residuales ha empezado a centrarse en los problemas desalud pública relacionados con la descarga al medio ambiente de contaminantesquímicos y biológicos, causando impactos medioambientales producidos por losvertidos de aguas residuales. Por esta razón se ha hecho necesaria laimplementación de legislaciones estrictas que establezcan parámetros que se 35
    • ajusten a las condiciones locales, teniendo en cuenta los factores epidemiológicos,socioculturales y ambientales; con el fin de que los países puedan promulgar unalegislación racional para controlar el aprovechamiento de las aguas residuales(OMS, 1989).En cuanto a estándares internacionales la OMS establece los aspectos sanitariosdel uso de aguas residuales en el informe técnico 778 de 1989; así mismos paísescomo México poseen la norma oficial mexicana NOM-001-ECOL de 1996, queestablece los limites máximos permisibles de contaminantes en las descargas deaguas residuales en aguas y bienes nacionales.En Inglate rra la agencia ambiental controla la regulación de descargas de aguasresiduales en aguas costeras, superficiales y aguas subterráneas a través delEnvironmental Quality Standards.En países como Estados Unidos existen leyes a nivel estatal como en el estado deVirginia donde existe el Water Quality Standard, Cap. 260, Sección 160, Agency25 controla la calidad de los vertimientos excretados en cuerpos de agua. Lasnormas del departamento de salud pública del estado de California establecenlineamientos más estrictos para la calidad de agua residual con fines de riego.(NPDES, 1996) (Tabla 10) Tabla 10. Legislación internacionalINSTITUCIÓN NORMAS REFERENCIA O PAIS OMS Establece un limite permisible de 1000coliformes OMS, Informe fecales/100ml para las verduras consumidas regadas 778. 1989 con aguas residuales tratadas. El departamento de salud pública del estado de CEPIS-OMS- Estados Unidos California permite un total de 23 0 2,2 OPS,1997 coliformes/100ml de agua según el cultivo regado y el método de riego empleado. El ministerio del medio ambiente en Ontario decreta Ontario Ministry como limites permisibles DBO 5 15 mg/L max. OD of the Canadá 2 mg/L max. Environment, SS 15 mg/L max. 1978 Coliformes Fecales 200/100ml max. Japón DBO5 20 mg/L max. SS 70 mg/L max Tamaki, 1980 Coliformes Fecales 30/100ml max pH 5- 10 Coliformes Fecales 1000- NOM-001- 2000/100ml (NMP) ECOL de 1996 México Temperatura 40°C Parásitos 1 huevo de helminto/ litro de agua DBO5 200mg/L 36
    • 2.7.2. Marco legal colombianoEn Colombia la resolución 1074 del 26 de Octubre de 1997 por la cual seestablecen estándares ambientales en materia de vertimientos y el Director delDepartamento Técnico Administrativo del Medio Ambiente DAMA en uso de susfacultades legales, en especial las conferidas en el Artículo 66 de la Ley 99 de1993, el decreto 673 de 1995 y el Artículo 10 del Acuerdo 19 de 1996,consideran: • Que el decreto 1594 de 1984, reglamenta los usos del agua y el manej de los o residuos líquidos. (Tabla 11) • Que todo vertimiento, además de las disposiciones contempladas en el artículo 82 del Decreto 1594 de 1984, deberá cumplir con las normas que sobre estos se establezcan. • Que según lo establecido en los artículos 113 y 120 del decreto 1594 de 1984 las personas naturales y jurídicas que recolecten, transporten y dispongan residuos líquidos, deberán cumplir con las normas de vertimiento y obtener el permiso correspondiente. • Que el artículo primero del Decreto Distrital 673 de 1995, dispone que el DAMA es la autoridad ambiental dentro del perímetro urbano del Distrito Capital.Tabla 11. Concentraciones máximas permisibles para verter a un cuerpo de agua y/o red de alcantarillado público según la resolución 1074 del DAMA PARAMETRO EXPRESADA COMO NORMA (mg/l)Arsénico As (mg/l) 0.1Bario Ba (mg/l) 5.0Cadmio Cd (mg/l) 0.03Carbamatos Agente activo 0.1*Cianuro CN (mg/l) 1.0Zinc Zn (mg/l) 5.0Cloroformo Extracto de ECC (mg/l) 1.0carbón Cu (mg/l) 0.25Cobre Fenol 0.2Compuestos fenólicos Concentración de agente activo 0.05*Compuestos organoclorados Concentración de agente activo 0.1*Compuestos organofosforados Cr + 6 (mg/l) 0.5Cromo hexavalente Cr total (mg/l) 1.0Cromo total (mg/l) 1000DBO5 Dicloroetileno 1.0 37
    • Dicloroetileno Concentración de agente activo N.D. * *Difenilpolicl rados o (mg/l) 2000DQO (mg/l) 100Grasas y aceites Mn (mg/l) 0.II2Manganeso Hg (mg/l) 0.02Mercurio Hg (mg/l) N.D. * *Mercurio orgánico Ni (mg/l) 0.2Niquel Unidades 5– 9pH Ag (mg/l) 0.5Plata Pb (mg/l) 0.1Plomo Se (mg/l) 0.1Selenio SS (mg/l) 2.0Sólidos sedimentables SST (mg/l) 800Sólidos suspendidos totales Sulfuro de carbono 1.0Sulfuro de carbono (mg/l) 1.0Tetracloruro de carbono Tetracloruro de carbono (mg/l) 1.0Tricloroetileno Tricloroetileno (mg/l) <30Temperatura Grados centígrados (°C) 0.5Tensoactivos (SAAM) (mg/l)* Concentración de tóxico que produce la muerte del organismo** Se entendera por valor no detectable (N.D.) a la concentración de la sustancia queregistra valores por debajo de los límites de detección empleando los métodos del manualStandard Methods for the Examination of Water and Waste Water (Ultima Edición).nation of Water and Waste Water (Ultima Edición). 38
    • 3. JUSTIFICACIÓNEl manejo inadecuado de las aguas residuales generadas en el proceso deproducción industrial constituye uno de los principales aspectos que afectan lasalud pública y causan deterioro ambiental, e impacto en el desarrollo económicoy el bienestar de una sociedad. Ambientalmente efectos como la reducción en elnivel de oxígeno disuelto, la eutroficación de recursos hídricos y la toxicidad aorganismos acuáticos debido a altas cargas de material contaminante y nutrientescomo fósfor o y nitrógeno, han llevado en los últimos años a la investigación yoptimización de procesos para su remoción (Amaya, 1995).En Colombia y específicamente en Bogotá dada la necesidad de que las aguasresiduales se ajusten a las normas legales consignadas en el Decreto 1594 de 1984del Ministerio de Salud y la resolución 1074 de 1997 del DAMA que reglamentalos usos del agua y el manejo de los residuos líquidos, industrias como lacervecera han realizado grandes inversiones en Plantas de Tratamiento de AguasResiduales que garanticen una mejor calidad de sus efluentes en relación con ladisminución de la carga orgánica.A pesar de las medidas establecidas por las entidades de salud pública en lospaíses de América Latina y el Caribe, las enfermedades gastrointestinales figuranentre las diez primeras causas de muerte. Una de las principales causas de la altamortalidad y morbilidad es la inadecuada disposición de un 90% de las aguasresiduales que son descargadas indiscriminadamente en cuerpos de aguasreceptores. Así la presencia de patógenos como Salmonella sp., Listeria sp.,Staphylococcus aureus y Campylobacter sp. que pueden mantenerse en lacorriente de salida representan un gran riesgo para la salud pública, más aúncuando las aguas residuales están siendo usadas para el riego de cultivos envegetales de consumo crudo, incrementándose así la posibilidad de desencadenarbrotes epidemiológicos de enfermedades endémicas como diarreas, parasitismo,fiebre tifoidea y salmonellosis. 39
    • Esta crítica situación ha promovido en países como México y Perú elestablecimiento de legislaciones más estrictas a fin de ejercer un mayor controlsobre la calidad de los vertimientos, razón por la cuál crece la posibilidad de queen un futuro cercano en Colombia la legislación se ajuste a parámetros másestrictos.Esto ha generado en la industria cervecera en estudio la preocupación por conocerla calidad microbiológica de sus efluentes en términos de microorganismospatógenos pues teniendo en cuenta que el sistema UAS no ha sido diseñado parala remoción de carga microbiana ni patógenos, la presencia de éstosmicroorganismos en la corriente de salida podría poner en riesgo la salud de lapoblación y ocasionar problemas futuros para la empresa en miras de que losvertimientos tuvieran que ajustarse a normas legales más estrictas.Por tal razón en el presente trabajo se realizó un diagnóstico microbiológico en lostanques de ecualización, acidificación y en la corriente de salida de la planta detratamiento de aguas residuales de la industria cervecera en estudio, evaluando lapresencia de patógenos en el efluente, con el objeto de proporcionar a la empresauna herramienta útil frente a la solución de futuros problemas. 40
    • 4. OBJETIVOS4.1. OBJETIVO GENERALRealizar un diagnóstico de la carga microbiana predominante en los tanques deecualización, acidificación y salida de la Planta de Tratamiento de AguasResiduales de la industria cervecera.4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS • Identificar los géneros microbianos predominantes en las etapas de ecualización, acidificación y salida durante el proceso de Tratamiento de Aguas Residuales. • Determinar la presencia de microorganismos patógenos en los vertimientos finales de la planta en estudio. • Correlacionar con los parámetros físico-químicos la carga microbiana presente en cada una de las etapas del proceso de tratamiento estudiadas. • Evaluar la disminución de la carga microbiana patógena durante el tratamiento evaluado. 41
    • 5. METODOLOGÍA5.1. UbicaciónEl presente trabajo de investigación se realizó en su totalidad en las instalacionesde la planta de tratamiento de aguas residuales y en el laboratorio que correspondea la División de Producción, Departamento de Investigación y Desarrollo de unaIndustria Cervecera de Bogotá.5.2. TemporalidadEl muestreo se realizó durante los meses de Abril y Junio del año de 1999; lasmuestras se tomaron los días lunes, miércoles y viernes en cada uno de los puntosde muestreo.5.3. MuestreoLa recolección de las muestras tuvo lugar en los tanques de Ecualización yAcidificación de la planta de tratamiento de aguas residuales en estudio; así comotambién los efluentes de dicha planta (mezcla de 4 reactores) (Figura 12), con elfin de realizar de esta manera la identificación de la carga microbianapredominante en estas etapas del proceso y la evaluación de microorganismospatógenos en la corriente de salida.Las muestras se tomaron en frascos Pyrex de 100ml, adicionados con tiosulfato;en el momento de tomar las muestras las llaves de salida fueron desinfectadas conoxonia (0.1%).5.3.1. Frecuencia de muestreoSe realizó un muestreo de tipo aleatorio estratificado, en donde los tanques deecualización, acidificación y la corriente de salida representan cada uno de losestratos; el tamaño de la muestra se halló de acuerdo a un muestreo piloto endonde fueron tomadas y procesadas 12 muestras, los días lunes, miércoles yviernes, durante el mes de Abril de 1999(Anexo 3); incluyendo los datos de estemuestreo piloto para el análisis final de los resultados. 42
    • Figura 12. Localización de los puntos de muestreo 43
    • Los muestreos fueron realizados durante los meses de Abril y Junio de 1999(Tabla 12) ; llevando a cabo durante el mes de Mayo la identificación de lascolonias aisladas a partir de los muestreos del mes de abril. Las muestras fuerontomadas entre las 8:00 –10:00 am., los días lunes, miércoles y viernes, con el finde tener un cubrimiento del ciclo de producción semanal de la industria cervecera,en donde tienen una producción que inicia los lunes y cesa los sábados almediodía con operaciones de limpieza de equipos y locaciones en general. Tabla 12. Número de asignación de los muestreos DIAS NUMERO DE DIAS NUMERO DE MUESTRADOS MUESTREO MUESTRADOS MUESTREO Abril 5 1 Junio 15 15 Abril 7 2 Junio 16 16 Abril 9 3 Junio 18 17 Abril 12 4 Junio 21 18 Abril 14 5 Junio 23 19 Abril 16 6 Junio 25 20 Abril 19 7 Junio 26 21 Abril 21 8 Junio 30 22 Abril 23 9 Julio 7 23 Abril 26 10 Julio 9 24 Abril 28 11 Junio 17 a 1 Junio 23 Patógenos Abril 30 12 Julio 21 a 2 Julio 28 Junio 10 13 Agosto 7 a 3 Agosto 13 Junio 11 145.4. Procesamiento de muestrasUna vez tomadas las muestras fueron llevadas al laboratorio de la División deProducción, en donde se proc esaron y se realizaron los análisis microbiológicos(Figura 13). 44
    • Figura 13. Procesamiento de muestras 45
    • 5.4.1. Análisis microbiológicos5.4.1.1. Recuento de heterótrofosTomadas las muestras de los tanques de ecualización, acidificación y en lacorriente de salida se realizaron diluciones seriadas hasta 10-13, sembrando 1ml enprofundidad de cada dilución, y adicionando 15ml de Agar Plate Count fundidoa 45°C (Merck, 1994) (Anexo 1), efectuando controles del medio y del agua dedilución; con posterior incubación a 37°C durante 48 horas.5.4.1.2. Recuento de coliformesSe realizaron diluciones seriadas de las muestras hasta la dilución 10-8 , sembrandoen profundidad y por duplicado 1ml de las diluciones respectivas, adicionando15ml de Agar Cromocult fundido a 45°C (Merck, 1994) (Anexo 1), realizando losrespectivos controles del medio y del agua de dilución; con posterior incubacióna 37°C durante 48 horas.Simultáneamente en la muestra tomada el día miércoles, se cuantificaroncoliformes fecales por la técnica del NMP (Anexo 2) en caldo Fluorocult (Merck,1994) (Anexo 1), para confirmar los recuentos obtenidos en placa.5.4.1.3. Recuento de mohos y levadurasSe realizaron diluciones seriadas de las muestras hasta la dilución 10-7 , sembrandoen profundidad y por duplicado 1ml de las diluciones respectivas, adicionando15ml de Agar YGC (Extracto de Levadura-Glucosa-Cloranfenicol) fundido a45°C (Merck, 1994) ) (Anexo 1), con los respectivos controles del medio y delagua de dilución; y llevando a incubar a 25°C durante 5 a 7 días.5.4.1.4. Aislamiento y recuperación de cepasA partir de las colonias obtenidas en los recuentos realizados, se obtuvieronaislamientos en Agar Mac Conkey y Agar Nutritivo (Merck, 1994) (Anexo 1)paralas colonias recuperadas en los recuentos de Heterótrofos y Coliformes, y en AgarSaboureaud y Agar PDA (Papa, Dextrosa, Agar) (Merck, 1994) ) (Anexo 1)para 46
    • las colonias recuperadas en el recuento de Mohos y Levaduras. A partir de lascolonias aisladas se realizó una descripción macroscópica y coloración de Gram.Una vez recuperadas las cepas completamente puras se reaislaron utilizando AgarNutritivo y Agar Saboureaud, para bacterias y levaduras respectivamente.5.4.1.5. Identificación de cepas aisladasPara la identificación de las cepas se realizaron aislamientos de colonias puras enmedios de cultivo no selectivos como Agar nutritivo y Agar saboureaud(Merck, 1994), para bacterias y levaduras respectivamente; una vez realizada lacoloración de Gram y la descripción macroscópica se realizaron las pruebas decatalasa y oxidasa. (Anexo 2), llevándose a cabo la identificación bioquímica delas colonias mediante la metodología API (Biomérieux, 1999) (Anexo 2).5.5. Evaluación de microorganismos patógenosLa evaluación de microorganismos patógenos se llevó a cabo en la corriente desalida de la planta de tratamiento de aguas residuales en estudio, por medio depruebas rápidas de diagnóstico.5.5.1. Evaluación de la presencia de Salmonella sp.Se realizó mediante Salmonella Rapid Test Oxoid (Anexo 2), la cual es unaprueba diseñada para la detección presuntiva de Salmonella sp. móvil enalimentos, materia prima, producto terminado y muestras ambientales. Elprincipio de esta prueba se basa en inocular la muestra homogenizada ypreenriquecida en un vaso de cultivo que contiene Medio Selectivo paraSalmonella sp. y dos tubos. Cada tubo contiene dos capas, una inferior con medioselectivo y otra superior con medio indicador, separadas por una interfase porosa.Así, si la muestra procesada contiene Salmonella sp. , ésta migrará activamente através del medio inferior hacia el superior, donde su presencia se pondrá demanifiesto por un cambio de color (Oxoid, 1995). 47
    • 5.5.2. Evaluación de la presencia de Listeria sp.La evaluación se realizó por medio de Listeria Rapid Test Oxoid (Anexo 2); estaprueba esta diseñada para la detección de especies de Listeria sp. en alimentos,vegetales, muestras ambientales, cerámica, materiales de porcelana y vidrio. Elprotocolo permite la obtención de resultados en 2 días de trabajo tras la recepciónde la muestra en el laboratorio. El procedimiento contempla la utilización de dospasos de enriquecimiento cuidadosamente seleccionados para la máximarecuperación y crecimiento de Listeria sp., seguido por un inmunoensayo en undispositivo para la prueba; este sencillo sistema permite una visión clara de losresultados en 20 minutos tras la adición de la muestra calentada y enfriada (Oxoid,1995).5.5.3. Evaluación de la presencia de Staphylococcus aureusLa evaluación se llevó a cabo por medio de la Prueba de Staphylase DR595(Oxoid, 1995). Esta prueba detecta la presencia del factor de agregación deStaphylococcus aureus (producción de coagulasa libre o ligada)por agregación deeritrocitos de oveja sensibilizados con fibrinógeno (Anexo 2).5.5.4. Evaluación de la presencia de Campylobacter sp.Se llevo a cabo por medio de siembra en medio base de Agar selectivo exento desangre para Campylobacter sp. El medio fue preparado de acuerdo a lasinstrucciones del proveedor (Oxoid, 1995) y después de esterilizado se adicionó elsuplemento selectivo CCDA, suplemento Cefoperazona OXOID (SR 125), el cualcontiene Anfotericina B para evitar el desarrollo de hongos o levaduras quepueden actuar como contaminantes (Anexo 2).5.6. Análisis físico químicosLos análisis físico químicos fueron realizados en las instalaciones de la planta detratamiento de aguas residuales y fueron tomados de los registros diarios deoperación de la planta las determinaciones correspondientes a la demanda químicade oxígeno (DQO), ácidos grasos volátiles (AGV), alcalinidad y pH, todos ellosrealizados siguiendo la metodología Standard Methods, 1989. 48
    • 5.7. Análisis estadísticoCon el fin de validar estadísticamente los resultados obtenidos se aplicó unanálisis de varianza y una comparación múltiple de Scheffe aplicando un ModeloExperimental de Efectos Fijos Unifactorial; para determinar si los recuentosobtenidos en cada una de las etapas del tratamiento evidenciaban una variaciónsignificativa, lo que mostraría una remoción.El mismo análisis se realizó con cada una de las bacterias y de las levadurasidentificadas con el fin de observar si existía remoción en cuanto a los géneroscon relación a las etapas del tratamiento; teniendo en cuenta las implicaciones enla salud pública que algunos de ellos pueden tener. En relación con los datos delos registros fisicoquímicos se evaluó la variación de los parámetros DQO, AGVs,Alcalinidad y pH; para cada una de las etapas del proceso.5.7.1. Análisis de anova para grupos microbianos5.7.1.1. Hipótesis planteadaLa hipótesis planteada para este análisis se basó en que el valor promedio de losrecuentos microbianos obtenidos en el tanque de ecualización es igual al valorpromedio de los recuentos microbianos obtenidos en el tanque de acidificación yen la corriente de salida.Ho: µ Heterótrofos Tk. Ecualización = µHeterótrofos Tk. Acidificación = µHeterótrofos Salida (1)Ho: µColiformes Tk. Ecualización = µColiformes Tk. Acidificación = µColiformes Salida (2)Ho: µHongos Tk. Ecualización = µC Hongos Tk. Acidificación = µ Hongos Salida (3)Hi : Por lo menos un µ es ≠ (4)Ecuaciones correspondientes a la estadística de prueba (Anexo 3), las tablas deanova para los grupos microbianos evaluados aparecen en la tabla 13. Tabla 13. Análisis de anova para los grupos microbianos evaluados Fuente de Grados de Suma de Cuadrados F variación Libertad Cuadrados Medios calculada Heterótrofos Tanque 2 19.4531 9.72656 1.07 Error 61 555.018 9.09866 49
    • Total 63 574.471 Coliformes Tanque 2 6.92407 3.46204 0.78 Error 61 271.062 4.44364 Total 63 277.986 Mohos y Tanque 2 208.165 104.083 22.40 Levaduras Error 61 283.392 4.64577 Total 63 491.5575.7.2. Comparación múltiple de scheffé para grupos microbianos5.7.2.1. Hipótesis planteadaLa hipótesis planteada para este análisis se basó en que el valor promedio de losrecuentos microbianos obtenidos en el tanque de ecualización es igual al valorpromedio de los recuentos microbianos obtenidos en el tanque de acidificación yen la corriente de salida.Ho* : µHeterótrofos K = µHeterótrofos l Hi* : µHeterótrofos K ≠ µHeterótrofos l (5)Ho* : µColiformes K = µColiformes l Hi* : µColiformes K ≠ µColiformes l (6)Ho* : µHongos K = µ Hongos l Hi* : µHongos K ≠ µ Hongos l (7)K (Ecualización, Acidificación, Salida) ≠ l (Ecualización, Acidifica ción, Salida)Ecuaciones correspondientes a la estadística de prueba (Anexo 3)5.7.3. Comparación de la proporción de crecimiento por bacteria para cadatanque5.7.3.1. Hipótesis planteadaLa hipótesis planteada para este análisis se basó en que la proporción decrecimiento de cada microorganismo identificado es igual en las tres etapasevaluadas dentro del tratamiento (ecualización, acidificación y corriente de salida)Ho**: Población Bacteriana Ecualización = Población Bacteriana Acidificación (8)Hi** : Población Bacteriana Ecualización ≠ Población Bacteriana Acidificación (9)5.7.4. Análisis de correlación de las variables fisíco-químicas con los recuentosmicrobianos por tanque5.7.4.1. Hipótesis planteada 50
    • La hipótesis planteada para este análisis se basó en que la relación que existe entrela carga microbiana y los parámetros físico-quimicos es igual a cero (No existerelación ni inversa, ni directa).Ho** : C carga bacteriana Vs. parámetros FQ = 0 (10)Hi** : C carga bacteriana Vs. parámetros FQ ≠ 0 (11) 51
    • 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN6.1. MuestreoPara la mayor comprensión e interpretación de los resultados obtenidos en losrecuentos microbianos, se empleo un sistema de codificación para cada uno de lasmuestras obtenidas (Tabla 12). Así mismo los datos obtenidos se analizaron conbase en las operaciones de la cervecería que afectaron las corrientes vertidas a laplanta de tratamiento de aguas residuales durante los muestreos realizados (Figura14). Días de Muestreo 1 Circuito de aseo en dos tanques (60Hl) Soda 3.15% INYECCIÓN DE LODOS 2 3 4 Aseo Tanque #5, Equipo 1 Soda 0.9% (70m3) 5 Aseo Olla Whirpool Cocina Steineker 6 7 8 9 Descarga de Soda Equipo 1 Tk. #5 (2.0% 70m3) 10 11 Aseo Tanque Whirpool 12 Aseo Cocina Steineker 13 14 15 Aseo Filtro Prensa Soda al 4% 16 Aseo Equipo 5 – Tk. #7 Soda 1.6% 17 3 18 19 Aseo Enfriador de Mosto – Descarga de Soda al 1.6% 20 21 Descarga de Soda al 2.5% 22 Aseo Secador de levadura 23 Aseo Equipo 4 Soda al 0.4% (30m3) 24 Incremento en pH Incremento en Carga Orgánica Incremento en Carga Orgánica y pH Figura 14. Esquema de operaciones que afectaron las corrientes vertidas a la PTAR durante abril y junio de 1999 52
    • 6.2. Recuentos microbianos obtenidosUna vez colectadas las muestras y realizado el recuento de microorganismos serealizó un análisis gráfico para cada uno de los grupos de microorganismos(heterótrofos, coliformes y hongos) con el fin de observar el comportamiento decada uno de ellos en relación con los 24 muestreos realizados.6.2.1. Grupo de microorganismos heterótrofosLas figuras 15 – 18 muestran el comportamiento bastante fluctuante en la etapade ecualización, sin observarse una reducción marcada en el tanque deacidificación e incluso llegándose a incrementar los recuentos como en e l día 12.Este mismo comportamiento se presenta en relación con la corriente de salida, endonde no se observa una disminución estadísticamente considerable en losrecuentos microbianos de Heterótrofos. Los datos correspondientes a losrecuentos de heteró trofos indican poblaciones del orden de 105 a 1012 ufc/ml,destacándose los días de muestreo 10, 12, y 16 con mayor población (Anexo 4). 20 LOG UFC/ml 15 Figura 15. Comportamiento de 10 heterótrofos en la PTAR en el tanque de ecualización en los 5 meses de abril y junio de 1999. 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 22 20 18 16 Figura 16. Comportamiento de LOG UFC/ml 14 heterótrofos en la PTAR en el 12 tanque de acidificación en los 10 8 meses de abril y junio de 1999. 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 DIAS DE MUESTREO 53
    • 16 14 12 LOG UFC/ml 10 Figura 17. Comportamiento de 8 6 heterótrofos en la PTAR en la 4 corriente de salida durante los 2 meses de abril y junio de 1999. 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 18 16 14 LOG UFC/ml 12 10 8 6 4 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO ECUALIZACION ACIDIFICACION SALIDA Figura 18. Comportamiento de heterótrofos en la PTAR en los tanques de ecualización, acidificación y corriente de salida en los meses de abril y junio de 1999Los elevados recuentos de este grupo de microorganismos posiblemente se debena la gran variedad de géneros bacterianos que se presenta n en los vertimientos,con elevados niveles de materia orgánica a la entrada de la planta de tratamientocomo es el caso de las aguas residuales procedentes de industrias de fermentacióncomo la cervecera (Grismer et al., 1999).Teniendo en cuenta que el grupo de heterótrofos encierra todos losmicroorganismos cuya proliferación es favorecida por un medio como el AgarPlate Count, es comprensible que se hallan obtenido recuentos elevados. Como seobserva en la Figura 18, en los días de muestreo 10, 11, 12 y 16 se presentaron losrecuentos más elevados para el grupo de heterótrofos, el incremento de la cargamicrobiana en estos días se debió a operaciones de aseo y limpieza en equipos de 54
    • las cocinas, dado que al realizar la limpieza de los tanques y equipos se arrastranlos sedimentos depositados en los mismos (Figura 14).En vista de que estos materiales tienen un alto contenido de materia orgánicaproducto de la cocción del mosto (sustrato para la fermentación que da origen a lacerveza), el agua de lavado incrementa la contaminación de la corriente que llegaal sistema de drenaje (registros control de fuente PTAR 1999).El análisis estadístico realizado permitió evidenciar que no existe diferencia entrelas poblaciones microbianas encontradas en cada una de las etapas del proceso detratamiento de aguas residuales, razón por la cual el grupo de heterótrofos tuvo uncomportamiento homogéneo respecto a los tanques de Ecualización, Acidificacióny la Corriente de Salida (Tabla 14, Figura 19). Tabla 14. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de heterótrofos TANQUE PORCENTAJE MEDIA GRUPOS HOMOGÉNEOS Ecualización 24 11.25 X Acidificación 24 11.04 X Salida 16 12.40 X RECUENTO DE HETEROTROFOS 14 13 12 11 10 EQUALIZACION ACIDIFICACION SALIDA ETAPA DEL TRATAMIENTO EVALUADA Figura 19. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de heterótrofosEn relación con el porcentaje de remoción microbiana para el grupo deheterótrofos, fue de un 11% respecto a los niveles de heterótrofos encontrados a laentrada del tratamiento, corroborando esto los resultados del análisis estadístico(Figura 20). 55
    • 11% 89% % Remoción de Heterótrofos % No Removido Figura 20. Porcentaje de remoción microbiana de heterótrofos6.2.2. Grupo de coliformesLa cuantificación de este grupo de microorganismos es importante en vista de loscriterios de selección que les hacen un grupo indicador de contaminación fecal,entre ellos la posibilidad de estar presentes en el t racto gastrointestinal en grandescantidades, la prevalencia por más tiempo en el agua que las bacterias patógenas yla capacidad que poseen para comportarse de igual manera que los patógenos enlos sistemas de desinfección (Campos, 1999). La figura 21 muestra como seevidencio el crecimiento de coliformes en el medio Cromocult. Figura 21. Crecimiento de coliformes totales en cromocult durante los muestreosLas figuras 22-25 muestran el comportamiento del grupo coliforme durante losmuestreos realizados, sin presentarse reducción en los recuentos en la etapa deacidificación con respecto a la entrada (ecualización) e incluso llegándose aincrementar en la corriente de salida como en el caso del día 14. 56
    • 14 12 10 LOG UFC/ml 8 Figura 22. Comportamiento del grupo coliforme en la PTAR 6 (tanque de ecualización, meses 4 de abril y junio de 1999) 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 16 14 12 LOG UFC/mlFigura 23. Comportamiento del grupo 10 coliforme en la PTAR (tanque de 8acidificación, meses de abril y junio de 6 1999) 4 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 14 12 10 LOG UFC/ml 8 Figura 24. Comportamiento del 6 grupo coliforme en la PTAR 4 (corriente de salida, meses de abril y junio de 1999) 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 57
    • 16 14 12 LOG UFC/ml 10 8 6 4 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO ECUALIZACION ACIDIFICACION SALIDA Figura 25. Comportamiento de coliformes en la PTAR en los tanques de ecualización, acidificación y corriente de salida en los meses de abril y junio de 1999Teniendo en cuenta que el tratamiento de aguas residuales en la industriacervecera estudiada es de tipo anaerobio, es factible que se mantengan recuentosde coliformes a la salida dado que el tratamiento anaerobio de tipo UASB noremueve microorganismos.Algunos estudios realizados con sistemas anaerobios han obtenido recuentos decoliformes del orden de 102 ufc/100ml, demostrando que tras un tratamientoanaerobio pueden mantenerse coliformes en la corriente de salida, con ordenes demagnitud significativamente reducidos en comparación con los valores deentrada; tan solo cuando posterior a los reactores son utilizados procesos deflotación y filtración, seguidos por una desinfección con ozono y rayosultravioleta a fin de lograr la remoción de E.coli y coliformes totales (Ceysz,1991).Esto puede explicar los elevados recuentos de coliformes en la corriente de salidaobtenidos en el presente estudio, pues posterior al proceso UAS la planta nocuenta con tratamientos terciarios que aseguren la reducción de carga microbiana.La figura 26 confirma la poca variación que se presento en los recuentos, razónpor la cual se evidencio un porcentaje de remoción del 12%; así mismo el diseñoestadístico aplicado permitió evidenciar que no existe diferencia entre los 58
    • recuentos de coliformes, los cuales presentaron un comportamiento homogéneodurante los muestreos realizados, sin observarse diferencias estadísticamentesignificativas de los mismos con relación a las etapas del tratamiento evaluadas(Tabla 15, Figura 27). 12% 88% %Remoción de Coliformes %No Removido Figura 26. Porcentaje de remoción microbiana de coliformes Tabla 15. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de coliformes TANQUE PORCENTAJE MEDIA GRUPOS HOMOGÉNEOS Ecualización 24 9.21 X Acidificación 24 9.50 X Salida 16 8.65 X RECUENTO DE COLIFORMES 10,3 9,7 9,1 8,5 7,9 7,3 6,7 EQUALIZACION ACIDIFICACION SALIDA ETAPA DEL TRATAMIENTO EVALUADA Figura 27. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de coliformesLa presencia de microorganismos entéricos en las etapas del tratamiento evaluadoy en especial en la corriente de salida fue confirmada mediante la identificación delas colonias recuperadas a partir del recuento en placa en Agar Cromocult.Con el fin de confirmar los recuentos obtenidos mediante la técnica de siembra enprofundidad en Agar Cromocult se realizó un análisis semanal por medio de latécnica del NMP (Número Más Probable) en caldo Fluorocult. Los recuentos 59
    • obtenidos al realizar esta prueba como se observa en la Figura 28 muestran uncomportamiento paralelo entre el NMP y la técnica de siembra en profundidad enAgar Cromocult para la detección de coliformes totales y fecales. 14 12 LOG UFC/100ml 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 SEMANAS DE MUESTREO Ecualización Acidificación Salida Figura 28. Confirmación de coliformes en la PTAR en los tanques de ecualización, acidificación y corriente de salida durante los meses de abril y junio de 1999 por medio de la técnica de NMPEn todas las pruebas realizadas se evidenció una reacción de fluorescencia al serexpuestos los tubos bajo luz UV, siendo ocasionada por la hidrólisis del sustratofluorogénico (MUG) 4-metil-umberifenilglucuronido por la acción de l enzima aâ–glucuronidasa propia de Escherichia coli (Elmund et al, 1999) (Figura 29). Figura 29. Reacción positiva de fluorescencia en caldo fluorocultLa cuantificación de E.coli realizada mediante la técnica del NMP basada ensustratos fluorogénicos muestra recuentos del orden de 108 NMP/100ml, llegandoestas cifras a reflejar la presencia de patógenos entéricos de origen fecal. 60
    • Teniendo en cuenta la futura implementación de legislaciones más estrictas enmateria de vertimientos en Colombia es importante tener un conocimiento previode la caracterización microbiana de los efluentes de la industria en estudio,contemplando la posibilidad de aumentar la calidad de los efluentes en caso detener que ajustarse a una normatividad más rígida.En países como Estados Unidos donde la legislación esta encaminada a lareutilización de las aguas residuales se han realizado estudios en tratamientos deaguas residuales, encontrando recuentos de coliformes fecales a la salida del ordende 33x102 UFC/100ml (Elmund et al. 1999).A nivel latinoamericano dada la problemática de salud publica asociada aenfermedades gastrointestinales, organizaciones como CEPIS y la OMS en elinforme técnico 778 de 1989 estiman como valor máximo permisible 1000coliformes fecales/100ml, en caso de que las aguas residuales sean utilizadas parariego de vegetales de consumo crudo.En países como Perú, el primer criterio de calidad para el uso de aguas residualesen la agricultura radica en la remoción de coliformes; se recomienda unareducción hasta de 103 coliformes fecales por 100ml, mientras en México lanorma NOM-001-ECOL de 1996, permite un rango de Coliformes Fecales de1000-2000/100ml (NMP). Existen también normas aún más estrictas como las delDepartamento de Salud Pública del Estado de California, las cuales permiten untotal de sólo 23 coliformes por cada 100 ml, según el cultivo regado y el métodode riego empleado (Cepis, 1997).6.2.3. Grupo de mohos y levadurasEl grupo de mohos y levaduras como lo muestran las figuras 30-33 presentaron uncomportamiento fluctuante en los días de muestreo, pero a diferencia de los otrosgrupos microbianos, los recuentos de mohos y levaduras obtenidos muestran unadiferencia marcada en la corriente de salida con relación al tanque deecualización. 61
    • Los datos correspondientes a este recuento (Anexo 4) como se observa en lafigura 30, los días 20 y 22 se obtuvieron los recuentos más elevados en el ordende 1013ufc/ml en el tanque de ecualización, posiblemente debido a que en estosdías fueron efectuadas operaciones de limpieza en el secador de levadura, lo cualgeneraría un aumento en la concentración de levadura de la corriente que llega alsistema de drenaje (Figura 18). 16 14 12 LOG UFC/ml 10 Figura 30. Comportamiento de mohos 8 y levaduras en la PTAR ( tanque de 6 ecualización, meses de abril y junio de 4 1999) 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 16 14 12 LOG UFC/ml Figura 31. Comportamiento de 10 mohos y levaduras en la PTAR 8(tanque de acidificación, meses de 6 abril y junio de 1999) 4 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 10 9 8 Figura 32. Comportamiento de mohos y 7 levaduras en la PTAR (corriente de LOG UFC/ml 6 5 salida, meses de abril y junio de 1999) 4 3 2 1 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO 62
    • La Figura 33 muestra la reducción de la carga microbiana respecto a poblacionesde mohos y levaduras en el tanque de acidificación; se observa una diferencia muymarcada en los recuentos microbianos obtenidos en la corriente de salida, enrelación con la carga presente en el tanque de ecualización. 16 14 LOG UFC/ml 12 10 8 6 4 2 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO EQUALIZACION ACIDIFICACION SALIDA Figura 33. Comportamiento de mohos y levaduras en la PTAR en los tanques de ecualización, acidificación y corriente de salida en los meses de abril y junio de 1999Este grupo de microorganismos presentó una remoción del 47% (Figura 34), lacual posiblemente se presentó debido a las condiciones de anaerobiosis estricta ya situaciones de competencia en los reactores que inhiben el crecimiento dehongos y levaduras, desfavoreciendo su prevalencia tras el tratamiento. 47% 53% % Remoción de Mohos y Levaduras % No Removido Figura 34. Porcentaje de remoción microbiana de mohos yCon relación a este grupo de microorganismos el diseño estadístico aplicado nomostró una diferencia entre los recuentos microbianos obtenidos en el tanque deacidificación respecto al de ecualización, pero si se presenta una diferenciasignificativa entre estos y la corriente de salida (Tabla 16, Figura 35). 63
    • Tabla 16. Comparación múltiple de scheffé para el grupo de mohos y levaduras TANQUE PORCENTAJE MEDIA GRUPOS HOMOGÉNEOS Ecualización 24 11.02 X Acidificación 24 9.85 X Salida 16 6.44 X RECUENTO DE MOHOS Y 13,4 11,4 LEVADURAS 9,4 7,4 5,4 EQUALIZACION ACIDIFICACION SALIDA ETAPAS DEL TRATAMIENTO EVALUADO Figura 35 .Comparación múltiple de scheffé para el grupo de mohos y levadurasEn cuanto a la identificación realizada a partir de los recuentos se evidenció lapresencia de hongos como Penicillum sp. , Aspergillus sp. , Cladosporium sp. ygéneros pertenecientes a la familia de los Mucorales, todos ellos hongos edáficosen las aguas residuales (Gerhard-Jagnow.1991) (Figura 36). Penicillium sp. Mucoral Figura 36. Morfología macroscópica de los hongos identificados 64
    • 6.3. Resultados de análisis Físico QuímicosPara la realización del análisis fueron tomados datos correspondientes a DQO(mgO 2/l), pH, ácidos grasos volátiles y alcalinidad en los tanques de Ecualizacióny Acidificación y DQO (mgO2 /l) y pH en la corriente de salida. Los datos fuerontomados directamente de los registros diarios de operación de la Planta deTratamiento de Aguas Residuales (Anexo 4).6.3.1. Comportamiento de DQOEn relación a la demanda química de oxígeno se observaron valores con uncomportamiento fluctuante (Figura 37). En la etapa de ecualización o entrada seobservaron fluctuaciones que van desde un valor mínimo de 1212 mgO2/l hasta unvalor máximo de 5368 mgO 2/l, con valores medios cercanos a 2276 mgO2/l; dichavariación en los niveles de materia orgánica posiblemente se debió a laprogramación en los niveles de producción, pues en el caso de las operaciones delavado se puede generar un mayor gasto de agua, tal es el caso ocurrido el día 17(18 de junio) con un valor de 5368 mgO 2/l, día en el cual fue realizado aseo en eltanque whirpool de la cocina Nordon. Otros factores como el lavado de botellas ysituacio nes generalizadas de aseo influyen directamente en las características delafluente. 6000 5000 DQO (mgO2/L) 4000 3000 DQO permitido 2000mgO2/L 2000 1000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 DIAS DE MUESTREO ECUALIZACION ACIDIFICACIÓN SALIDA • DQO establecido según Resolución 1074 del DAMA con relación a la corriente de salida Figura 37. Valores de DQO registrados en la PTAR en los tanques de ecualización, acidificación y salida durante los meses de abril y junio de 1999 65
    • En relación con las etapas posteriores se observó en el tanque de acidificación uncomportamiento similar a ecualización, encontrándose un nivel máximo de 2938mgO2 /l y un nivel mínimo de 1394 mgO2/l.La aplicación del análisis estadístico de los datos obtenidos para la DQO nospermitió demostrar que no existe una diferencia significativa entre los valores dela DQO en los tanques de ecualización y acidificació n observándose uncomportamiento homogéneo, pero si se evidencian diferencias significativas entreéstos y la corriente de salida donde se encontraron valores de DQO entre 215mgO2 /l a 976 mgO2/l (Tabla 17, Figura 38). Tabla 17. Comparación múltiple de scheffé para los valores de DQO TANQUE PORCENTAJE MEDIA GRUPOS HOMOGENEOS Ecualización* 24 2276 X Acidificación 24 1927 X Salida 16 543 X * Ecualización representa la entrada al sistema de tratamiento. 3000 2500 2000 DQO (mg/l) 1500 1000 500 0 Equalizacion acidificacion salida Figura 38. Comparación múltiple de scheffé para la DQOLa eficiencia de remoción de la carga orgánica en el sistema de digestiónanaerobio versión UAS en promedio durante el tiempo de muestreo fue de un73%; siendo un valor comprendido dentro de los parámetros para sistemasanaerobios cuyos rendimientos en la eliminación de DQO están entre un 70-80%.Además según la resolución 1074 de DAMA 1997 dictamina un nivel permisiblede DQO hasta 2000 mgO2 /l, cumpliendo de esta manera con la ley. 66
    • 6.3.2. Comportamiento del pHLos valores de pH presentaron fluctuaciones en los tanques de Ecualización,acidificación a diferencia de la corriente de salida cuyos niveles de pH semantuvieron constantes alrededor de un valor neutro (Figura 39, Tabla 18). 12 10 pH permitido (5-9 UN) 8 pH 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 DIAS DE MUESTREO SALIDA ACIDIFICACION ECUALIZACION • pH establecido según Resolución 1074 del DAMA con relación a la corriente de salida Figura 39. Valores de pH registrados en la PTAR en los tanques de ecualización, acidificación y salida durante los meses de abril y junio de 1999 Tabla 18. Valores máximos y mínimos de pH en cada tanque TANQUE VALOR DE pH mínimo VALOR DE pH máximo (UN) (UN) Ecualización 6.17 9.93 Acidificación 5.51 6.93 Salida 6.74 7.80Los valores de pH presentados en el tanque de ecualización tienen uncomportamiento cambiante debido a descargas de soda durante operaciones deaseo, como la presentada el día 5, en el cual se obtuvo un valor de pH de 9.93 pordescarga de soda al 2.3% proveniente del aseo de la olla Whirlpool de la cocinaSteineker. Dichas descargas fueron controladas en el tanque de ecualización através de la neutralización con CO2 , así como la homogenización de los caudalesque con el objeto de conseguir un caudal constante, reduce las cargas de choque aldiluirlas logrando la estabilización del pH (Metcalf & Eddy, 1995). 67
    • En el tanque de acidificación se presentó un comportamiento uniforme contendencia a mantener valores de pH entre 5 y 6, fenómeno entendido por laproducción de ácidos orgánicos; mientras que en relación con la corriente desalida se evidencio un comportamiento con tendencia a un valor neutro. Tras laaplicación del análisis estadístico a los valores de pH no existió una diferenciaestadísticamente significativa para los tanques de ecualización, acidificación ycorriente de salida (Tabla 19, Figura 40). Tabla 19. Comparación múltiple de scheffé para los valores de pH TANQUE PORCENTAJE MEDIA GRUPOS HOMOGENEOS Ecualización 24 7.68 X Acidificación 24 5.98 X Salida 16 6.99 X 14 12 10 pH (U) 8 6 4 2 0 Equalizacion acidificacion salida Figura 40. Comparación múltiple de scheffé para el pH6.3.3. Correlación entre ácidos grasos volátiles y alcalinidadEl monitoreo de los valores de AGV y alcalinidad constituyen un parámetro muysensible para determinar la capacidad tampón del sistema y permite adoptarmedidas preventivas para evitar la caída del pH e inhibición de la actividadmetanogénica (Bitton, 1994).El desempeño de las reacciones anaeróbicas se puede caracterizar por laproducción de metano, sin embargo se emplean medidas indirectas como los AGVque son productos intermedios del proceso previo a la metanogénesis.En el tanque de ecualización se observó un comportamiento fluctuante de losvalores de AGV y alcalinidad, evidenciándose valores superiores de alcalinidad 68
    • respecto a los valores de AGV (Figura 41). Tal fenómeno se relaciona con elincremento en la concentración de ácidos orgánicos en la medida en que ladegradación de materia orgánica es llevada a cabo. 1000 900 (>700 mg/L CaCO3) 800 estandar alcalinidad 700 UNIDADES 600 500 400 (<250 mg/L) 300 estándar AGV 200 100 0 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 DIAS DE MUESTREO AGV Alcalinidad Figura 41. Valores de AGVs y alcalinidad registrados en la PTAR en el tanque de ecualización en los meses de abril y junio de 1999La figura 42 ilustra el comportamiento de los AGVs y la alcalinidad en el tanquede acidificación, observando valores de alcalinidad en promedio de535mgCaCO3/l respecto a los AGVs 435 mg CH3COOH/l en promedio. 1000 800 UNIDADES 600 400 200 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO AGV Alcalinidad Figura 42. Valores de AGVs y alcalinidad registrados en la PTAR en el tanque de acidificación en los meses de abril y junio de 1999 69
    • Teniendo en cuenta que en el tanque de acidogénesis se inicia la producción deAGV es importante su seguimiento, dada la tendencia a mantener valores bajosde pH (en promedio de 5.98) evidenciado en las altas relaciones AGV/Alcalinidadencontradas, en promedio de 0.8 durante los muestreos (Figura 43). Esta altarelación AGV/Alcalinidad es corregida posteriormente en el tanque deneutralización donde la dosificación de soda cáustica controló el pH mantenie ndola capacidad tampón del sistema previo a la entrada a los reactores. 1,60 1,40 1,20 1,00 UN 0,80 0,60 0,40 0.1 * 0,20 0,00 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 DIAS DE MUESTREO * Valor estandar para la relación AGV/alcalinidad en los reactores, Samh, 1984. Figura 43. Comportamiento de la re lación AGVs/alcalinidad en el tanque de acidificación durante los meses de abril y junio de 1999La relación de AGV/alcalinidad es una medida de la capacidad tampón delsistema; sugiriéndose mantener esta proporción por debajo de 0.3 (Pabón, 1998,Samh, 1984) para reactores anaerobios de una sola unidad; en vista de que laplanta en estudio cuenta con un sistema en unidades separadas, las elevadasrelaciones AGV/Alcalinidad no afectan directamente la capacidad tampón delsistema dada la neutralización llevada a cabo en la corriente a tratar previo a suentrada a los reactores.Tras la aplicación del análisis estadístico para los valores de Alcalinidad seevidenció que no existe una diferencia significativa entre los tanques deecualización y acidificación, mientras que los valores de AGV muestran una 70
    • diferencia significativa dado el incremento de los mismos en la etapa deacidificación (Tabla 20, Figura 44). Tabla 20. Comparación múltiple de scheffé para los valores de AGV y alcalinidad TANQUE PORCENTAJE MEDIA GRUPOS (UN) HOMOGÉNEOS AGV Ecualización 24 134.83 X Acidificación 24 435.08 X Alcalinidad Ecualización 24 539.17 X Acidificación 24 535.5 X 700 600 500 400 300 Alcalinidad Alcalinidad 200 100 AGV AGV 0 Ecualización Acidificación Figura 44. Comparación múltiple de scheffé para los valores de AGV y alcalinidad6.4. Correlación de variables físico-químicas con los grupos microbianosLa estadística empleada para el análisis de correlación de variables físico-químicas con los grupos microbianos, se realizó teniendo en cuenta el p-valor de0,05 y con un nivel de confianza del 95% para cada tanque, aceptando orechazando la hipótesis (10) y (11)(Tabla 21)(Anexo 3). Teniendo en cuenta queel signo de los niveles de correlación indican el sentido de la misma se entenderáel signo (+) cuando se presenta una relación directa entre las variables y el signo(-) cuando se presente una relación inversa, indicando si el comportamiento entrevariables es independiente o no.Tras el análisis de correlación de varia bles físico-químicas con los gruposmicrobianos en el tanque de ecualización y la corriente de salida no se encontrórelación entre el comportamiento de cada uno de los grupos microbianos 71
    • evaluados con los parámetros físico-químicos (Tablas 21). En el ta nque deacidificación se encontró una relación inversa del 42,14% entre los recuentos decoliformes y los valores de DQO, lo que indica que una reducción de la cargaorgánica incrementaría los niveles de coliformes al ser empleada como sustrato enel metabolismo microbiano, con consecuente aumento en la biomasa. Tabla 21. Niveles de correlación de las variables físico -químicas con los recuentos microbianos en las etapas del tratamiento ETAPA DEL PARÁMETRO HETERÓTROFOS COLIFORMES HONGOSTRATAMIENTO AGV -0.2007 -0.1790 0.0401 Alcalinidad 0.1908 0.0386 -0.0132 Ecualización pH -0.4635 0.0651 -0.2960 DQO -0.0881 0.1213 0.0703 AGV -0.0329 0.1562 0.1749 Alcalinidad -0.0090 0.1994 0.2354 Acidificación pH -0.1754 0.4614 -0.1466 DQO -0.3820 -0.2038 -0.2986 pH 0.0175 -0.0658 -0.1196 Salida DQO 0.2756 0.1744 -0.0485p valor < 0.05.6.5. Microorganismos identificadosLa identificación de las colonias aisladas a partir de los recuentos de gruposmicrobianos permitió identificar 15 géneros de bact rias y 9 géneros de levaduras; econ base en sus características microscópicas y su comportamiento frente a laspruebas bioquímicas de la bateria de identificación API.(Biomereux, 1999)(Figura 45). 72
    • Figura 45. Reacciones bioquímicas observadas en la prueba de API 20 ESe llegó a aislar e identificar bacterias que por sus características morfológicas(Tabla 22) y su perfil bioquímico (Anexo 5), corresponden a géneros como:Enterobacter , Escherichia, Pseudomonas, Pantoea , y Klebsiella. entre otros,presentándose diferentes frecuencias de aparición (Figura 46); destacándose lapresencia de estos microorganismos en el tanque de ecualización dado quecorresponde a la etapa del tratamiento con recuentos más elevados.Estos resultados se corroboran con otras investigaciones en reactores anaerobiosUASB, donde aislaron e identificaron bacterias como Pseudomonaspaucimobilis, P. fluorescens, Salmonella sp., Escherichia coli, y Enterobacterfaecium (Riffat et al., 1999), así como en investigaciones realizadas por Rose,1996 donde las bacterias entéricas fueron los géneros comúnmente identificadosen la caracterización de aguas residuales. Tabla 22. Descripción macroscópica y microscópica de las colonias identificadas No. MICROORGANISMOS DESCRIPCIÓN DESCRIPCIÓNCOLONIA IDENTIFICADOS MACROSCOPICA MICROSCOPICA 01 Burkolderia cepacia Colonia crema claro, Bacilo Gram circular, brillante, borde Negativo irregular 02 Enterobacter aerogenes Colonias crema, borde Bacilo Gram irregular Negativo 03 Enterobacter sakazakii Colonias de borde Bacilo Gram irregular, amarillo claro, Negativo brillantes 04 Enterobacter Colonia de borde Bacilo Gram cancerogenus irregular, naranja claro, Negativo brillante 05 Enterobacter cloacae Colonia de borde Bacilo Gram irregular, brillante, Negativo Amarillo intenso 06 Escherichia coli Colonia pequeña, circular, Bacilo Gram plana, de color azul en Negativo Agar Cromocult 73
    • 07 Escherichia vulneris Colonia circular, borde Bacilo Gram regular, brillante, Negativo levantada, rosada intense en Agar Cromocult08 Klebsiella pneumonie Colonia circular pequeña, Bacilo Gram colo rojo a fucsia en Agar Negativo Cromocult09 Klebsiella terrígena Colonia circular, brillante, Bacilo Gram crema-beige, borde Negativo regular10 Pantoea sp. Colonia pequeña, amarillo Bacilo Gram claro, brillante, levantada Negativo11 Pseudomonas sp Colonias brillantes, Bacilo Gram crecimiento extendido, Negativo color crema12 Serratia ficaria Colonia redonda, grande, Bacilo Gram levantada, opaca, de color Negativo rosado claro.13 Pseudomonas fluorecens Colonia grande, Bacilo Gram extendida, cremosa, Negativo brillante, de color crema14 Serratia liquefaciens Colonia pequeña, opaca, Bacilo Gram plana, de color blanco Negativo15 Stenotrophomonas Colonia color crema. Bacilo Gram maltophilia Brillante, borde irregular, Negativo levantada16 Candida glabrata Forma levaduriforme Levadura ovalada17 Candida guillermondi Forma levaduriforme Levadura ovalada18 Candida krusei Forma levaduriforme Levadura circular16 Candida lusitaniae Forma levaduriforme Levadura ovalada20 Cryptococcus laurenti Forma levaduriforme Levadura circular21 Cryptococcus neoformans Forma levaduriforme Levadura ovalada22 Cryptococcus terreus Forma levaduriforme Levadura ovalada23 Rhodotorula glutinis Forma levaduriforme Levadura ovalada24 Saccharomyces cerevisiae Forma levaduriforme Levadura circular 74
    • 35 Porcentaje de aparición 30 25 20 15 10 5 0 Enterobacter E. coli Klebsiella Pseudomonas Serratia Pantoea Bacterias identificadas Ecualización Acidificación Salida Figura 46. Porcentaje de aparición de géneros bacterianos identificados en cada etapa del tratamientoEn la identificación de microorganismos realizada se observa la predominancia debacterias Gram negativas en el sistema de tratamiento de aguas residualesrepresentados e n géneros aerobios y facultativos que derivan su fuente de carbonoy energía a partir de compuestos orgánicos; en vista de que los efluentes de laindustria cervecera son ricos en materia orgánica, en su mayor parte hidratos decarbono (almidón, azúcares y celulosa), proteínas, alcohol y constituyentes de losrestos de la cerveza, las poblaciones microbianas que pertenecen a la familiaEnterobacteriacea como los géneros, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, ySerratia, metabolizan estos compuestos hasta ácidos orgánicos como el ácidoláctico, acético y butírico, alcoholes, acetato, CO2 e Hidrógeno; los cuales son lossustratos utilizados por las bacterias acetogénicas y metanogénicas para laproducción de metano.Así mismo la Figura 47 muestra el porcentaje de aparición de los diferentesgéneros de levaduras identificados en relación con cada una de las etapasevaluadas en el tratamiento. 75
    • 70 60 Porcentaje de aparición 50 40 30 20 10 0 Rhodotorula sp. Saccharomyces Candida sp. Cryprtococcus sp. cerevisiae Levaduras identificadas S a l i d a Ecualización Acidificación Figura 47. Porcentaje de aparición de levaduras identificadas en cada etapa del tratamientoLa Tabla 23 muestra la frecuencia de aparición de cada uno de losmicroorganismos identificados durante los 24 días de muestreo en los tanques deEcualización, Acidificación, y la Corriente de salida durante los meses de Abril yJunio de 1999 en la planta de aguas residuales en estudio. Tabla 23. Géneros de microorganismos identificados FRECUENCIA DE APARICION (*) MICROORGANISMOS Ecualización Acidificación Salida Burkolderia cepacia 0 1 0 Enterobacter aerogenes 1 6 4 Enterobacter sakazakii 7 5 2 Enterobacter cancerogenus 2 2 0 BACTERIAS Enterobacter cloacae 5 5 2 Escherichia coli 15 17 12 Escherichia vulneris 4 6 5 Klebsiella pneumonie 8 7 4 Klebsiella terrígena 3 7 2 Pantoea sp. 11 14 8 Pseudomonas sp 5 10 5 Serratia ficaria 9 5 3 Pseudomonas fluorecens 5 3 2 Serratia liquefaciens 5 3 0 Stenotrophomonas maltophilia 1 3 2 Candida glabrata 2 2 2 Candida guillermondi 7 7 1 LEVADURAS Candida krusei 3 1 1 Candida lusitaniae 2 2 1 Cryptococcus laurenti 5 3 1 Cryptococcus neoformans 11 13 6 Cryptococcus terreus 12 15 7 Rhodotorula glutinis 6 4 0 Saccharomyces cerevisiae 15 10 3 (*) Número de colonias aisladas en cada una de las etapas de tratamiento 76
    • Es importante tener en cuenta la presencia de muchas de estas bacterias entéricasen la corriente de salida de la planta de tratamiento de aguas residuales en estudio,en vista de que estos bacilos Gram negativos están ampliamente dispersos en lanaturaleza; se encuentran en suelo agua y plantas y en el tubo digestivo dehumanos y animales. Además pueden estar asociadas al desarrollo de procesos degastroenteritis y trastornos en el sistema digestivo (Koneman, 1997).La alta prevalencia de E. coli durante cada una de las etapas del tratamientopuede ser explicada dado el metabolismo fermentativo que le permite estarpresente en los procesos de hidrólisis y acidificación, pues la glucosa y otroscarbohidratos son fermentados para producir piruvato, el cual a la vez puede serconvertido en ácido láctico, acético y fórmico (Castellani & Chalmers, 1980).Además E. coli usualmente puede usar el acetato como única fuente de carbono yparte del ácido fórmico que produce por medio de un complejo de hidrogenoliasaes transformado en cantidades semejantes de CO2 y H2 , así la alta prevalencia deE. coli en la corriente de salida es entendida en vista de que favorece elcrecimiento de las poblaciones metanogénicas al suministrar los sutratosesenciales para la producción de metano (acetato, CO2 y H2), e igualmente dado elmetabolismo anaerobio facultativo le permite tolerar las condiciones deanaerobiosis del reactor, dado que una pequeña fracción de la poblaciónfermentativa es también capaz de utilizar el oxígeno. Se plantea que en generalaproximadamente el 1% de la población no metanogénica en un digestor estacompuesta por bacterias anaerobias facultativas como E. coli (Pabón, 1998).Otros géneros de enterobacterias identificados como Enterobacter y Klebsiella,presentaron un comportamiento similar con altos porcentajes de aparición conrelación a los demás géneros identificados, en vista del metabolismo anaeróbicofac ultativo que los caracteriza así como la capacidad que poseen para fermentar laglucosa y producir ácidos orgánicos como láctico, acético y fórmico y laproducción de gas (CO 2 y H2 ) con mayor proporción en CO2 , dichascaracterísticas explican la razón por la cual estos dos géneros tuvieron una mayorprevalencia en el tanque de acidificación (Trevisan, 1984). 77
    • Uno de los géneros pertenecientes a la familia enterobacteriaceae como Serratiapresentó un alto porcentaje de aparición en el tanque de ecualizació n posiblementepor sus enzimas hidrolíticas que actúan sobre lípidos y proteínas presentes en estaetapa del tratamiento, en las etapas posteriores se observa una marcada reduccióndado que esta bacteria no es un productor importante de ácidos orgánicos ni degases como CO2 y H2 , sustratos esenciales para la digestión anaerobia (Bizio,1984).Cabe resaltar la presencia Pantoea sp. perteneciente a la familiaenterobacteriaceae anteriormente ubicada dentro del género Enterobacter. Enespecial P. aglomerans es asociada con enfermedades infecciosas comobacteremia y endocarditis. Dadas las implicaciones que a nivel clínico revistePantoea sp, podríamos asumir que su aporte proviene de las aguas sanitariasdescargadas a la planta y que dado su metabolismo fermentativo le permite tomarparte activa en la formación de ácidos orgánicos (Olenginski,1991).También es importante resaltar la presencia de los géneros de levadurasidentificadas (Figura 48)en vista de la posible implicación de las mismas enenfer medades infecciosas entre ellas Cryptococcus terreus y Cryptococcusneoformans; considerados microorganismos patógenos asociados a infeccionesdel sistema nervioso central y tracto genitourinario (Koneman, 1994). La mayorfrecuencia de aparición la presentó Saccharomyces cerevisiae la cual no seconsidera patógena para el hombre (Koneman, 1994) y es considerada normaldadas las características del efluente tratado, por lo tanto se deduce que recuentosaltos de dicha levadura alcanzan a llegar al sistema de drenaje como consecuenciade las operaciones de lavado de los tanques de fermentación y del proceso defiltración, donde se separa la levadura de la cerveza (Arrieta, 1998). Figura 48. Reacciones bioquímicas observadas en la prueba para identificación de levaduras 78
    • Análisis de las proporciones de crecimientoTeniendo en cuenta las frecuencias de aparición de los géneros demicroorganismos identificados se realizó un análisis de las proporciones decrecimiento y su variación en relación con las etapas del tratamiento evaluado.Para la aceptación o rechazo de las hipótesis planteadas (8) y (9) se manejo unnivel de confianza del 95% y un margen de error de 0.05 con un Z calculado de1.96.Los valores de Z calculado para cada microorganismo permitieron evidenciar queel sistema de tratamiento de aguas residuales tipo UAS es eficaz para la remociónde Serratia liquefaciens , Candida guillermondi, Rhodotorula glutinis ySacharomyces cerevisiae ; dado que los valores de Z calculado se encontrabandentro de la zona de rechazo (-1.96 - 1.96)(Tabla 24). Tabla 24. Valores de Z calculado para las proporciones de crecimiento en relación a la etapa de tratamiento. MICROORGANISMO Z Calculado Z Calculado Z Calculado E Vs A E Vs S A Vs S Burkolderia cepacia -1.0105 IGUALDAD 1.0105 Enterobacter aerogenes -2.0447 -1.4174 0.7108 Enterobacter sakazakii 0.6666 1.8490 1.2268 Enterobacter cancerogenus 0 1.4446 1.4446 Enterobacter cloacae 0 1.2268 1.2268 Escherichia coli -0.6123 0.8728 1.4757 Escherichia vulneris -0.7108 -0.3698 0.3434 Klebsiella ornithinolytica 0.3113 1.3333 1.0302 Klebsiella oxitoca -1.4216 0.4724 1.8490 Klebsiella pneumonie -0.8667 0.8854 1.7380 Klebsiella terrígena -1.5569 0 1.5569 Pantoea sp. 1.4446 1.4446 IGUALDAD Pseudomonas fluorecens 0.7745 1.2268 0.4724 Serratia ficaria 0.6666 1.4216 0.7745 Serratia liquefaciens 0.7745 2.3624 1.7888 Stenotrophomonas maltophilia -1.0444 -0.5962 0.4724 Candida glabrata 0 0 0 Candida guillermondi 0 2.3237 2.3237 Candida krusei 1.0444 1.0444 0 Candida lusitaniae 0 0.5962 0.5962 Cryprtococcus laurenti 0.7745 1.7457 1.0444 Cryptococcus neoformans -0.5773 1.5089 2.0660 Cryptococcus terreus -0.8728 1.4757 2.3174 Rhodotorula glutinis 0.7108 2.6186 2.0889 Saccharomyces cerevisiae 1.4446 3.5777 2.2735 E: Ecualización A: Acidificación S: Salida. 79
    • Así mismo no se presentaron diferencias estadísticamente significativas en losdemás géneros de microorganismos identificados; es importante resaltar el altoporcentaje de aparición de géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,dentro de los cuales se destacan Escherichia coli, Enterobacter sp., Klebsiella sp.,Pantoea sp, y Pseudomonas sp. que prevalecieron a través de las etapas deltratamiento sin evidenciarse una diferencia estadísticamente significativa. Esimportante caracterizar el origen de Escherichia coli para determinar supatogenicidad.Teniendo en cuenta que los microorganismos más importantes en la evaluación dela calidad del agua son los microorganismos entéricos y que entre ellos loscoliformes han sido empleados como indicadores de la eficiencia en plantas detratamiento de aguas residuales, es importante resaltar la persistencia deEscherichia coli en cada una de las etapas del tratamiento evaluado, por lo cualpodría ser utilizado como un indicador de la eficiencia de la planta en estudio.6.5.1. Evaluación de microorganismos patógenosLa importancia de la evaluación de microorganismos patógenos en aguasresiduales radica en que uno de los objetivos principales para el aprovechamientode estas aguas es la eliminación de agentes patógenos, dado que los riesgos para lasalud pública (diarreas sintomáticas, infecciones entéricas e intestinales, fiebretifoidea, diarrea originada por rotavirus, hepatitis infecciosa y cólera entre otros)atribuidos al uso de las aguas residuales o excretas pueden estar relacionados conla supervivencia de los mismos (CEPIS, 1997). En el presente estudio se evaluóla presencia de algunos patógenos por el método ausencia -presencia, en vista delriesgo potencial que significa su aparición en la corriente de salida.Los resultados obtenidos en los análisis de microorganismos patógenos comoSalmonella sp., Staphylococcus aureus, Listeria sp y Campylobacter sp, indicanla ausencia de Salmonella sp.,y Staphylococcus aureus en los efluentes de laPlanta de Tratamiento de Aguas Residuales de las cervecería estudiada (Tabla 25). 80
    • Tabla 25. Prueba de ausencia-presencia de microorganismos patógenos FECHA Salmonella sp. Listeria sp. S. aureus Campylobacter sp. A P A P A P A PJunio 17 X X X XJunio 21 X X X XJunio 23 X X X XJulio 21 X X X XJulio 23 X X X XJulio 26 X X X XJulio 28 X X X XAgosto 9 X X X XAgosto 11 X X X XAgosto 13 X X X X A: Ausencia P: PresenciaCon relación a esto es importante resaltar la ausenc ia de Salmonella sp., siendoeste un patógeno que ha sido aislado de aguas residuales aún después de procesosde cloración (Kinde et al., 1997); teniendo en cuenta el grado de sensibilidad de laPrueba Salmonella Rapid Test que es de un 96.8% en relación al métodotradicional que tiene una sensibilidad del 90.13% (Figura 49).Así mismo se presentó un resultado positivo de la prueba de Ausencia-Presenciapara Listeria sp y Campylobacter sp (Figura 50)en la corriente de salida; factorque representa un alto riesgo de contaminación para la salud pública dado que enel efluente posterior al tratamiento anaerobio no existe ningún tipo de tratamientoterciario. Figura 49. Prueba rápida de Figura 50. Prueba rápida de identificación para Salmonella sp. identificación para Listeria sp. 81
    • A pesar de haberse hallado sólo en dos de las muestras de la corriente de salida aligual que la presencia de algunos patógenos entéricos pigmentados como Serratiasp. y Enterobacter sp. es importante establecer un programa de seguimientoperiódico, pues su incremento se puede llegar a constituir en un problema de saludpública dada la producción de sustancias tóxicas que pueden ser inhaladas oingeridas en caso de que el agua residual fuera utilizada para riego decultivos(Russin et al., 1997).Además para el caso específico de Campylobacter sp. la positividad de una delas pruebas es un resultado significativo ya que según Baker et al.1999 y deacuerdo con estudios realizados por Khuder et al.1998, se ha encontrado queCampylobacter sp. es un patógeno emergente en aguas, altamente vinculado concasos de gastroenteritis asociadas con la ingestión de agua. Ha llegado a serreconocido como una causa importante de la enfermedades diarreicas humanas, ysu presencia en el ambiente y en especial en aguas residuales llegando a ser unriesgo en caso de que los lodos de los digestores anaerobios fueran utilizadoscomo abono o en el caso de que las aguas residuales tratadas se utilizaran comoaguas de riego (Park & Sanders, 1992).Finalmente cabe resaltar la presencia de Stenotrophomonas maltophila durantelas etapas de tratamiento y aún en la corriente de salida, siendo este unmicroorganismo no encontrado a partir del análisis de patógenos, sino según losaislamientos e identificaciones de los recuentos de heterótrofos, de acuerdo a lametodología API (BioMérieux, 1999). La presencia de dicho microorganismo esimportante dado que este microorganismo anteriormente clasificado dentro delgénero Pseudomonas, actúa como un patógeno nosocomial emergente (Baker etal, 1999). 82
    • 7. CONCLUSIONES• Durante las etapas del tratamiento de aguas residuales de la cervecería en estudio predominaron los géneros de la familia enterobacteriaceae entre los cuales se destacaron Klebsiella (12%) , Enterobacter (16%), Pantoea (16%) y Escherichia (33%) con las mayores frecuencias de aparición en la corriente de salida.• La frecuencia de aparición de Escherichia coli no presentó variación en cada una de las etapas evaluadas, evidenciando así que no existe disminución para este microorganismo en el sistema de tratamiento.• La evaluación de microorganismos patógenos en la corriente de salida mostró la presencia de Listeria sp. y Campylobacter sp. representando un factor de alto riesgo para la salud pública, dado que estos microorganismos se han reportado como patógenos emergentes.• Existe una correlación inversa del 42% entre el comportamiento del grupo de coliformes y los valores de la DQO sin establecerse una relación entre las demás variables físico químicas y los grupos microbianos evaluados.• El proceso de tratamiento de aguas residuales de la cervecería en estudio, es efectivo para la remoción de Mohos y Levaduras; sin presentarse diferencias estadísticamente significativas en relación con los grupos de heterótrofos y coliformes. 83
    • 8. RECOMENDACIONES• Realizar un monitoreo de patógenos emergentes, mediante la evaluación periódica de la presencia de Listeria sp. y Campylobacter sp. en la corriente de salida, en vista de que la presencia de estos patógenos en aguas tratadas se han encontrado asociada a trastornos gastrointestinales desencadenando brotes epidemiológicos.• Serotipificar la cepa de Escherichia coli con el fin de conocer su patogenicidad a fin de garantizar su uso como indicador de contaminación fecal, ya que esta bacteria al formar parte del grupo de coliformes fecales permanece por más tiempo en el agua que los patógenos y tiene el mismo comportamiento de estos frente a los sistemas de desinfección.• Evaluar la posibilidad de implantar un sistema de tratamiento terciario; estudiando diferentes alternativas de tratamientos físicos (floculación, sedimentación y filtración) a fin de eliminar los residuos de lodo que puedan haber sido arrastrados a la salida de la tolva de sedimentación; o tratamientos químicos como la cloración a fin de alcanzar una mejor calidad en el efluente tratado, garantizando la oxidación de la materia orgánica y la remoción de patógenos. 84
    • BIBLIOGRAFIA1. Aldo M.C, Magallana H. Proyectos y sistemas ambientales. Facultad de ingenieria de UADY. Yucatán, México, 1999. Seminario Taller latinoamericano,. Memorias: IV Seminario Latinoamericano sobre Tratamiento de Aguas residuales. Bucaramanga2. American Public Health Association (APHA). American water works association, water pollution control federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Washington, D.C: 19th Ed. 1995.3. APHA, AWWA, WPCF. Métodos normatizados para el análisis de aguas potables y residuales. Madrid: Ediciones Días de Santos S.A. 1992.4. Archer A. Chlorination by-products and cancer: a meta -analysis. American Journal of Public Health. 1992; 82 (7): 128-130.5. Archer B. The microbiology and control of anaerobic digestion. London, UK : Ed. Elsevier; pp. 43-91, 199 .6. Arrieta J. Depuración de los efluentes de cervecería, aplicación de nuevos procesos anaerobios. Cadagua S.A. División de Proyectos Industriales. Bilbao. 1998: 24 - 28.7. Asano T, Levine D. Wastewater reclamation, recycling and reuse: and introduction in wastewater reclamation and reuse. Tecnomic Publishing. Lancaster. 1998: 1528.8. Bailey E. Nitrogen removal treated system. Water Environ. Research. 1998; 71 (1): 94.9. Baker K. Detection and occurrence of indicator organisms and pathogens. Water Environ. Research. 1998; 70 (4): 405-418.10. Baker K, Herson D. Detecction and ocurrence of indicator organisms and pathogens . Water Environment Research. 1999; 71 (5): 530-549.11. Beall S, Jenkins D, Vidanage S. A systematic analytical artificial that significantly influences anaerobic digestion efficiency measurement. Water Environ. Research. 1998; 70 (5): 1019-1024.12. Berg, J.D. Rapid detection of total and fecal coliforms in water by enzime hydrolisis of MUG. Proceedings of the International Conference on Water and Wastewater Microbiology, CA, Feb. 8-11, Vol.1. 1988. 85
    • 13. Biomerieux. Sistema de Identificación Bacteriana. 1999.14. Bitton G. Wastewater microbiology. United States of America: Ed. Wiley- Liss; 1994.15. Bizio. Genus Serratia . Bergey`s Manual, Volumen III. Gram negative Bacteria, p 530-549. 198416. Boone D, Bryant M. Propionate degrading bacterium Syntrophobacter wolinni sp from methanogenus ecosystems . Appl. Environ. Microbiol. 1980; 40: 626-632.17. Borrego J, Moriño M. Coliphagues as an indicator of faecal pollution in water. Its relationship with indicator and pathogenic microorganisms. Water Reseach. 1987; 21: 1473-1480.18. Bosch A, Diez M, Abad F. Desinfection of human enteric viruses in water by coper: silver and reduced levels of chlorine . Water Sci. Technol. 1993; 27: 351-356.19. Brock T, Madigan M. Biología de los Microorganismos. Madrid: 8a Edición. Prentice Hall. 1999.20. Campos C. Indicadores de la Contaminación Fecal en Aguas. Memorias II Congreso Internacional de Microbiología Ambiental., Santa fe de Bogotá D.C. 19-21 de mayo de 1999.21. Campos J.R. Anaerobic wastewater treatment in the food process industry. Water Science and Technology. 1998; 18 (12): 87.22. Carvajal M. Reactor anaerobio-aerobio a escala piloto para el tratamiento de aguas residuales. Centro de Documentación Facultad de Ingeniería (CIFI) Universidad de los Andes. Bogotá. 1997.23. Castellani, Chalmers. Genus Escherichia. Bergey`s Manual, Volumen III. Gram negative Bacteria, p 418-420. 1980.24. CEPIS. Manual de disposición de aguas residuales: origen, descarga, tratamiento y análisis de las aguas residuales. República Federal Alemana. 1993.25. Ceys A. Manual de disposición de aguas residuales. Centro Panamericano de Ing. Sanitaria y ciencias del Ambiente. Lima - Perú. OPS-OMS. 1991. 86
    • 26. CEPIS-OMS-OPS. 1997. Aspectos de aguas residuales relacionados con la salud. Artículos texto completo.27. CEPIS. 1997. Aspectos sanitarios de la utilizacion de aguas residuales y excretas en la agricultura y acuicultura. Artículos texto completo.28. CEPIS. 1998. Medidas de protección sanitaria en el aprovechamiento de agua residuales. Articulos texto completo.29. Chang S, Simger P. The impact of ozonation on particle stability and the removal of TOC and THM presursors. J. Am. Water Works assoc. 1991; 83: 71-79.30. Curtis T. Mechansims of pathogen removal in anaerobic digesters31. D´amato R, Dehollander G. Gaseus emissions from wastewater facilities. Water Environ. Reseach. 1999; 75 (5): 715-718.32. DAMA, 1997. Departamento Administrativo del Medio Ambiente, Resolución No. 1074. Estándares Ambientales en Materia de Vertimientos.33. Daniel W. Bioestadística base para el análisis de la ciencias de la salud. México: Ed. Limusa, 3a edición; 1996.34. Devaid I, Delaun E. Emissions of reduced malodorous sulfur gases from wastewater treatment plants. Water Environment Reseach. 1999; 71 (2): 203-207.35. Doménec J, Hirano R, Pitt P. Tertiary treatment using microfiltration and UV disinfection for water reclamation. Water Environ. Research. 1999; 71 (2): 224-231.36. Droste R. Theory and practice of water and wastewater treatment. United States of America: Ed. John Wiley & Sons; 1997.37. Dubourguier H.C, Prensier G, Samain E. Granular methanogenis sludge: microbial and structural analysis. Institute National de la Recherche Agronomique. 1993: 31-37.38. Eastma J. Phase of anaerobic digestion, WPCF. 1998; 53 (3): 552.39. Elmund G. K, Allen M. J, Rice E. W. Comparison of Escherichia coli, total coliform, and fecal coliform populations as indicators of wastewater treatment efficiency. Water Environ. Research. 1999; 71 (3): 332-339. 87
    • 40. Edzwald M, Kelley J. ICR treatment studies. J. am. Water works assoc. 1998; 90 (11): 70.41. Fernández P. Depuración anaerobia de aguas residuales. Departamento de Ingeniería Química-Universidad de Valladolid. Jornadas Tratamiento de Aguas Residuales Industriales. 1996.42. Galdos J. Desarrollos Recientes en el Tratamiento de Aguas Residuales de la Industria Cervecera. Cerveza y Malta, XXVI. 1989 (3): 103.43. Gautam R. UASB technology for wastewater treatment. Environ. Projects. 1998: 1-5.44. Garza H. Investigación de Salmonella en diferentes sitios de una planta de tratamiento de aguas residuales y su relación con la incidencia de dicha enterobacter ia en los operadores de la planta. Conferencia Sanitaria Mexicana. 1999.45. Gaviria B. Manual de Prácticas de Control Microbiológico en la Industria. Universidad Javeriana. 1998.46. Gerhard J. Biotecnología de los hongos. Zaragoza, España: Ed. Acribia; 1991.47. Grismer M.E, Carrm A, Shepherd H.L. Fermentation Industry. Water Environ. Research. 1999; 71 (5).48. Hammer M.J. Water and wastewater technology. New York : Ed. Wiley; 1986.49. Haun H. Distribution of wineri wastewater bordeaux, Journal Wastewater. 1998; 45 (3): 1203-1205.50. Hernández A. Depuración de aguas residuales. Madrid, España Ed. Colegio de Ingenieros de Caminos Canales y Puertos; 1992.51. Holt J, Krieg N, Sheath P, Staley J, Williams S. Bergey´s Manual of Determinative. Maryland U.S.A: williams & wilkins editores; 1994.52. Huser BA. Methanothrix soehngenii gen.nov.sp.nov.,a new acetotrophic noun-hidrogen-oxidizing bacterium . Microbiology. 1992; (132): 1-9.53. Ishizaki K, Shinriki, Ueda T. Degradation of nucleic acids with ozone. V. mechanism of action of ozone on deoxyribonucleoside. Chem. Pharm. Bull. 1984; (32): 3601-3606. 88
    • 54. Kataoka N. Improved technique for identification and enumeration for methanogenic bacterial colonies on roll tubes by epifluoresence microscopy. Applied Environ. Microbiol. 1991; (57): 3671-3673.55. Kearney T, Larkin M, Levett P. Metabolic activity of pathogenic bacteria during semicontinuous anaerobic digestion. Applied and Environ. Microbiol. 1994; 60 (10): 3647-3652.56. Kearney T, Larkin M, Levett P. The effect of slurry storage and anaerobic digestion on survival of pathogenic bacteria. Journal Applied. Bacteriol. 1993; 74 (86).57. Kenneth L, Kindzierski W.B. Health effeccts asociated with wastewater treatment, disposal, and reuse. Water Environ. Reseach. 1998; 70 (4).58. Kinde H, Adelson M, Ardans A. Prevalence of Salmonella sp in municipal sewage treatment plant effluents in southern california. Avian Dis. 1997; 41 (2).59. Kirsch E.J. Anaerobic digestión of organic matter. Critical Reviews in Environmental control. 1974: 131-191.60. Kirsop B.H. Methanogénesis. Crit.rev.Biotechnology. 1984; (1): 109-159.61. Koenraad P.P.F.J, Rombouts F.M, Notermans S.H.W. Epidemiological aspects of thermophilic Campylobacter in water -related environments: a review. Water Environ. Research. 1997; 69 (1): 52-63.62. Koneman A, Dowell J, Sommers W. Diagnóstico microbiológico. España: Ed. Panamericana: 1994.63. Koster I.W. Inhibition of methanogenesis from acetate in granular sludge by long-chain Fatty acids. Applied Environ. Microbiol. 1987; 53: 403-409.64. Khuder S.A, Arthur T, Schaubn, E.A. Prevalence of infection diseases and associates symptoms in wastewater treatment workers. Am. J. Ind. Med. 1998; 33: 571.65. Krogman U. Biosolids and sludge management. Water Environ. Research. 1999; 71 (5): 692.66. Kuo J, Yamashita L. Desinfection and antimicrobial proceses. Water Environ. Research. 1999; 71 (5): 685-691. 89
    • 67. Lessard E.J. Survival of natural sewage population of enteric bacteria in difusion and batch chambers in the marine environment. Applied Environ. Microbiol. 1983; 45: 950-59.68. Lettinga G, Hulshoff P, Wiegant W, “et al”. Upflow sludge blanket processes. Proceedings of the third international symposium on anaerobic digestion. Inc. Watertown, 139-158, 1990.69. Lori K. Desinfection and antimicrobial Proceses , Environ. Research. 1999; 71: 686.70. Mackie R.I. Metabolic activity of fatty acid-oxidizing bacteria and the contribution of acetate, propionate, butyrate and CO2 to methanogenesis in cattle waste at 40 and 60°C. Applied Environ. Microbiol. 1981; (41), pp.1363-73.71. Macleod F, Guiot S, Custerton J. Layered structure of bacterial aggregate produce in UASB and filter reactor. Applied and Environ. Microbiol. 1990; 56 (6): 1598-1607.72. Matsuda H, Yamamori H, Sato T, “et al”. Mutagenicity of ozonation products from humic substances and their components. Water Sci. Technol. 1992; 25 (3): 363-370.73. Mcinernay M.J. Sintrophomonas wolfei, gen.nov.sp.nov., and anaerobic sintrophic, fatty acid-oxidizing bacterium. Applied Environ. Microbiol. 1981; 41 (3): pp. 1029-1039.74. Mckinley W.L. Physical and chemical correlates of microbial activity and biomass in composting municipal sewage sludge. Applied Environ. Microbiol. 1985; 50 (7): 1395-1403.75. Merck. Manual de Medios de Cultivo. 1994.76. Metcalf, Eddy L. Ingeniería de Aguas Residuales. Tratamiento, Vertido y Reutilización. Tercera Edición. Madrid, España Vol. 1 y 2. Ed. MacGraw- Hill; 1995.77. Ministerio de Salud. 1984. Decreto No. 1594. En cuanto a usos de agua y residuos líquidos.78. Muller M. Characterization of Effluent from Wine. Bioproces Eng. 1999; 18 (4): 59. 90
    • 79. NOM-001-ECOL de 1996. Norma Oficial Mexicana que Establece los Límites Máximos Permisibles de Contaminates en las Descargas de Aguas residuales en Aguas y Bienes Nacionales. Secretaria del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca.80. Niemi R.M, Niemel⊗ S.I, Latí K, Niemi J.S. Coliforms and E. coli in Finnish Surface waters Proc. Int. Conf.-Coliforms E. coli: Problem Solution. Univ. Leeds, . U.K. R. Soc. Chem., 1995; 112.81. Olenginski T.P, Bush D.C, Harrington T.M. Plant thorn synovitis: an uncommon cause of monoarthritis. Semin. Arthritis. Rheum. 1991; 21 (5): 40-46.82. Orozco A. Tratamiento de aguas residuales domésticas a temperatura subóptima (13 +-18ºC ) en un biorreactor anaerobio de flujo pistón a escala laboratorio. Universidad de los Andes. Facultad de Ingeniera. 1989.83. Orozco A. Tratamiento Biológico de las Aguas Residuales. Medellín: Ed. Ceset (Centro de Servicios Técnicos. Universidad de Antioquia. Facultad de Ingeniería. Departamento de Ingeniería Sanitaria. 1992.84. Orozco Alvaro, Giraldo Eugenio. Tratamiento aaneróbico de las aguas residuales. Colombia . Universidad de los Andes, CIFI, 1986, p 22.85. Ortiz J. Tratabilidad de aguas residuales con filtro anaerobio. Tecnología e investigación. 1996; 5 (2): 61-70.86. O’rourke J.T. Effects of Brewery Wastes on Treatment. Industrial Water Wastes. 1992; 7 (5): 1101-1104.87. Orozco A, Giraldo E. Tratamiento anaeróbico de las aguas residuales. Colombia . CIFI. Universidad de los Andes. Bogotá, 1986.88. Oxoid. Manual de Medios de Cultivo. España: Ed. Unipath. 1995.89. Park C, Sanders G. Ocurrence of Thermotolerant Campylobacters in Fresh Vegetables Sold at Farmers’ Outdoor Markets and Supermarkets. Canadian Journal Microbiology. 1992; 38 (313) 1203-1205.90. Pabon, Narda. Evaluación del tratamiento microbiológico de las aguas residuales de la cervecería de Bogotá . Bavaria S.A. Colenvases. Santa fe de Bogotá. Trabajo de grado (Bacterióloga. Universidad Javeriana. Facultad de ciencias, carrera de Bacteriología. 1998. 91
    • 91. Parra M. Arranque de filtro anaerobio. Fac ultad de Ingeniería química. Universidad del Valle. Santiago de Cali, 1997.92. Polprasert.C. Organic waste recycling. UK: Ed. Wiley. Chichestel. 1989.93. Ramalho K.S. Tratamiento de Aguas Residuales. España: Ed. Reverté S.A. 1991.94. Rebac S, Omil F, Jules B, Lettinga G. Tratamiento anaerobio de aguas residuales de baja carga en condiciones psicrófilas (10-12ªC. Universidad Santiago de Compostela, Departamento de Ingeniería Química. 1997.95. Riffat R, Dararat S, Krongthamchat K. Anaerobic Processes. Water Environment Research. 1999; 71 (5): 656-676.96. Rigola, M. Tratamiento de Aguas Industriales: Aguas de proceso y residuales. España: Ed. Interamericana; 1991.97. Rinzema, A. Anaerobic Treatment of sulfate-containing waste water. España: Ed. CRC; 1996.98. Rose, J.B, Dickson L.J, Farrah S.R, Carnaham R.P. Removal of Pathogenic and Indicator Microorganisms by Full-Scale Water Reclamation Facility. Water Research. 1996; 30 (7): 2785.99. Rozano, E. Tratamiento Biológico de las Aguas Residuales. España: Ediciones Díaz de Santos S 1995. .A;100. Russin, P.A, Rose, J.B, Gerba, C.P. Health Significance of Pigmented Bacteria in Drinking Water. Water Science Technology. 1997; 35 (11); 1305-1307.101. Sahm, H. Anaerobic Waste Water Treatment. Biochemical. Engineering Biotechnology. 1984; 29 (4): 84-115.102. Schoroeder J. Water and Wastewater Treatment. New York: Ed. McGraw Hill, 1990.103. Shahnaz D, Oleszkiewicz J. Volatile fatty acid production and uptake in biological nutrient removal systems with process separation. Water Environmental Research. 1997; 69 (6): 1106-1111.104. Skirrow M.B. Review: Diseases Due to Campylobacter , Helicobacter and Related Bacteria. Journal Comp. Pathology. 1994; 111 (113): 1234-1236.105. Speece R.E. Anaerobic Biotechnology for Industrial Wastewater Treatment. Environmental Sc ience Technology. 1983; 5 (17) 416-427. 92
    • 106. Smul A, Verstraete W. Retention of sulfate-reducing bacteria in Expanded Grenular-Sludge-Blanket Reactors. Water Environ. Research, 1999; 71(4): 427-429.107. Steven S, Jenkims D, Scrimalie A, Vidanage A. Systematic analytical artificial that significantly influences anaerobic digestion afficiency measurement. Water Environment Research. 1998; 70 (5):1019-1024.108. Suzuky E, Cramer J, Bosch T. Anaerobic traetment of brewery wastewater using UASB reactors seeded with activated sludges. Bioresources. Tecnology. 1997; 64 (1); 33.109. Switzenbaum, M. Anaerobic Treatment of Wastewater . Recent Developmens. ASM News. 1983; 49 (5): 532-536.110. Tamaki, T. Wastewater Treatment Works in Japan. Journal of the Water Pollution Control Federation. 1980; 52 (39): 864.111. Toquica J. Tratamiento de Residuos Líquidos Cerveceros. Cervecería Leona S.A. II Congreso Internacional de Microbiología Ambiental. Bogotá, 1999.112. Torien D.F. Anaerobic fixed film wastewater treatment. Enzyme Microbiol. Technol 1994; 40 (3): 242-250.113. Trevisan. Genus Klebsiella. Bergey`s Manual, Volumen III. Gram negative Bacteria, p 461-462.114. Vanderhaegen B, Ysebaert Y, Favere K. Acidogenesis in relation to in- reactor granule yield. Lab. Of Microbiol Ecology. Unive of Gent Belgium, 21-29. 1993.115. Vogels. G. D. Biochemistry of Methane Production. New York. Ed. Wiley 1994.116. Warren B. Kindzierski. Health effects associated with wastewater treatment, disposal, and reuse. Water environmental research. 1997; 69 (4): 915-925.117. Widdel F, Pfennig N. Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that descompose fatty acids. Incomplete oxidation of propionate by Desulfobulbus propionicus gen.nov. Arch. Microbiol. 1982; 131(6): 360- 365.118. Winkler, M. Tratamiento Biológico de Aguas de Desecho. México: Ed. Limusa. 1995, 42-45. 93
    • 119. Wu W.M, Hickey R F, Zeikus J G. Charaterization of metabolic performance of methanogenic granules treating brewery wastewater: role of sulfate-reducing bacteria. Appl Environ. Microbiol. 1991; 57(4):3438-3449.120. Yañez, F. Reducción de Organismos Patógenos y Diseño de lagunas de estabilización en Países en Desarrollo. XIX Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental (AIDIS). Chile 1994.121. Zellner G, Diekman H, Austermann-haun U, Baumgarten G, and Seyfried C. Biofilm formation on polypropilenen during start-up of anaerobic fixed-bed reactors. Biofouling, 1993; 44 (6): 345-361. 94
    • ANEXO 1 Formulación de los Medios de Cultivo Empleados1. Agar Plate Count 2. Agar Chromocult Agar Triptona Glucosa Levadura g/l g/l Peptona 3.0 Triptona 5.0 Cloruro Sódico 5.0Extracto de levadura 2.5 KH2PO4 1.7Glucosa 1.0 K2HPO4 3.0Agar 9.0 Piruvato Sódico 1.0pH 7.0 +/- 0.2 Triptófano 1.0 Agar-Agar 12 Laurilsulfato Sódico 0.1 Mezcla de Cromógenos 0.2 pH 6.8 +/- 0.1 a 25°C3. Agar YGC 4. Caldo BHI Agar Extracto de levadura-Glucosa- g/lCloranfenicol Infusión de sólidos de g/l cerebro de ternera 112.5Extracto de levadura 5.0 Infusión de sólidos deD(+)-glucosa 20.0 cerebro de bovino 5.0Cloranfenicol 0.1 Proteosa peptona 10.0 Agar-Agar 14.9 Glucosa 2.0pH 6.6 +/- 0.2 Cloruro sódico 5.0 Fosfato disódico 2.5 pH 7.4 +/- 0.25. Agar Nutritivo 6. Agar MakConkey g/l g/lPolvo Lab Lemco 1.0 Peptona de caseína 17.0Extracto de levadura 2.0 Peptona de carne 3.0Peptona 5.0 Cloruro sódico 5.0Cloruro sódico 5.0 Lactosa 10.0Agar 15.0 Mezcla de sales biliares 1.5pH 7.4 +/- 0.2 Rojo Neutro 0.03 Violeta Cristal 0.001 Agar-agar 13.5 pH 7.1+/ - 0.17. Agar Baird Parker (Agar selectivo para Estafilococos)Base de Agar Aditivos g/l Emulsión de yema de huevo 50mlPeptona de caseína 10.0Extracto de carne 5.0 95
    • Extracto de levadura 1.0Piruvato sódico 10.0Glicina 12.0Cloruro de litio 5.0Agar-agar 15.0pH 6.8 +/- 0.28. Agar Selectivo para CampylobacterMedio selectivo Exento de Sangre para CampylobacterBase de Agar Selectivo Exentode Sangre para Campylobacter Suplemento Selectivo CCDA g/l Cada vial es suficiente para Caldo Nutritivo 25.0 suplementar 500ml de medio Carbón bacteriológico 4.0 g/l Hidrolizado de caseína 3.0 Cefoperazona 16mg Desoxicolato de sodio 1.0 Anfotericina B 5mg Sulfato Ferroso 0.25 Piruvato de sodio 0.25 Agar 12 pH 7.4 +/- 0.29. Sabouraud 10. PDA (Patata-Dextrosa-Agar) g/l g/lPeptona de caseína 5.0 Infusión de papa(*) 4.0Peptona de carne 5.0 D(+)-glucosa 20.0D(+)-glucosa 10.0 Agar-agar 15.0Maltosa 10.0 (*) Preparada a partir de 200g deAgar-agar 15.0 Papa.pH 5.6 +/- 0.1 pH 5.6 +/- 0.111. Fluorocult g/lPeptona 10.0Lactosa 10.0Bilis de buey desecada 20.0Verde Brillante 0.0133L-triptófano 1.04-metilumberifenil-β-D-glucurónido 0.1pH 7.2 +/- 0.1 96
    • ANEXO 2 Técnicas Empleadas1. NMPMateriales 5 Tubos con caldo Fluorocult a doble 10 Tubos con caldo Fluorocult a simple concentraciónTécnica Inocular la serie de 5 tubos con doble concentración y una serie de concentración simple con 1ml de la muestra. Inocular la serie de 5 tubos de simple concentración restante con 1ml de una dilución 10 -1 de la muestra. Llevar a incubar las tres series de 5 tubos a 37°C durante 24 – 48 horas. Lectura• El viraje de color del caldo de amarillo a verde azulado indica la positividad de la prueba para coliformes totales.• La presencia de fluorescencia al observar los tubos con una lámpara de luz ultravioleta, indica la positividad de la prueba para E.coli• Posteriormente se cuenta el número de tubos positivos en cada una de las series y las respectivas combinaciones se leen en la tabla de tres series de cinco tubos.• Interpretar los resultados comparando en la tabla de NMP y reportar / 100ml.2. CatalasaEl objetivo de esta prueba es determinar si la bacteria produce la catalasaque transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno; en vista de queel peróxido se forma como uno de los productos finales del metabolismooxidativo o aeróbico de los hidrat os de carbono. Técnica• Colocar sobre una lámina portaobjetos una o dos gotas de una solución de peróxido de hidrógeno al 3%• A partir de una colonia pura y aislada en un medio no selectivo, se transfieren las células del centro de la colonia con palillos estériles y se ponen en contacto con la gota de peróxido de hidrógeno al 3% colocada sobre la lámina portaobjetos.Lectura 97
    • La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia,indica una prueba positiva. Control Positivo: Staphylococcus aureus Control Negativo: Streptococcus 98
    • 3. Salmonella Rapid TestSalmonella Rapid Text Oxoid ha sido especialmente diseñado para la detecciónpresuntiva de Salmonellas móviles en alimentos, materia prima y `productoterminado y muestras ambiental s. e• PrincipioUna muestra homogeneizada y preenriquecida en un medio adecuado se ioculaene l vaso de cultivo que contiene Medio Electivo para Salmonella y dos tubos.Cada tubo contiene dos capas, una inferior con medio selectivo y otra superior conmedio indicador, separadas por una interface porosa. Si la muestra procesadacontiene Salmonella, ésta migrará activamente a través del medio inferior hacia elsuperior, donde su presencia se pondrá de manifiesto por un cambio de color.• Preparación de la muestraPreenriquecer la muestra en un medio adecuado por ejemplo por homogenizacióna dilución 1:10 en buffered water, (Oxoid Código CM509).• ProcedimientoPreparación del vaso de cultivoManipular asépticamente durante todo el proceso. Cada vaso de cultivo debeprepararse hasta el paso 6 antes de preparar el siguiente.1. Golpear en ángulo el vaso de cultivo para facilitar la uniformidad del medio que puede haberse compactado en los tubos. Destapar el vaso.2. Añadir agua destilada estéril hasta la línea inferior (línea 1) señalizada a un lado del vaso de cultivo (aproximadamente 27 ml). Comprobar que la parte inferior de los tubos A y B quedan por debajo del nivel del líquido.3. Manteniendo la aguja en la funda protectora acoplar a la jeringa. Retirar la funda y cuidadosamente introducir la aguja a través del agujero central del tapón azúl del tubo A. suavemnte retirar el embolo de la jeringa hasta que el nivel del líquido en el tubo alcance la línea 3 señalizada en el vaso de cultivo. El tiempo empleado en la operación de retirada del émbolo debe ser 5 segundos. Retirar jeringa y aguja introduciendo ésta en su funda protectora. Tener sumo cuidado en no desplazar los tubos de su posición en el vaso, así como de no aflojar el tapón de los tubos.4. Inmediatamente repetir el mismo procedimiento (paso 3) con el tubo B (tapón rojo).5. Tapar el vaso de cultivo, presionar firmemente un lateral del vaso de cultivo conteniendo los dos tubos contra un mezclador “vortex” y accionar éste. Es muy importante que los líquidos contenidos en los tubos sean vigorosamente agitados durante 5 segundos. Tras la agitación, dejar reposar 5 minutos. En este paso puede mantenerse hasta 4 haras antes de continuar con el paso.6. Destapar el vaso cuidadosamente. Verter Salmonella Rapid Test Elective Medium (SRTEM) estéril y enfriado al vaso de cultivo hasta que el nivel de líquido alcance la línea 2 que figura en la pared del vaso (preparar el Medio SRTEM según las directrices que figuran en la etiqueta del envase de CM857).7. Asépticamente añadir un disco de novobiocina.NOTA: Mantener el vaso de cultivo en vertical durante todo el procedimiento. 99
    • 8. Por medio de la llave que se suministra retirar los tapones azúl y rojo de los tubos. Durante esta operación se EVITARA TOCAR los tubos así como el interior de las paredes del vaso de cultivo.Desechar los tapones9. Tapar el vaso de cultivo. Ahora está preparado para utilizar.• Utilización del vaso de cultivo1. El caldo de pre-enriquecimiento debe agitarse tras la incubación y dejar reposar hasta que sedimenten las partículas mas gruesas.2. Registrar la identificación de la muestra en las etiquetas que se suministran y pegar al vaso de cultivo.3. Retirar la tapa del vaso de cultivo “preparado” y adicionar 1 ml del pre- enriquecido.4. Tapar de nuevo el vaso de cultivo.5. Incubar durante 24 horas en una estufa a 41ªC + o – 0.5ªC. (el vaso de cultivo debe mantenerse vertical durante todo el tiempo).• Lectura e interpretación de Resultados1. Tras 24 horas de incubación, retirar el vaso de cultivo de la estufa y a l luz a examinar la parte superior (medio indicador) de los tubos para visualizar el viraje! Puede aparecer ennegrecimiento en la parte inferior de los tubos, pero sólo deben considerarse los cambios de color de la parte superiores.2. La posible presencia de Salmonella se evidencia por un cmabio de color en la parte superior (medio indicador) de uno o de ambos tubos.POSITIVO:Tubo A- ENNEGRECIMIENTO EN MAYOR O MENOR GRADOTubo B- ENROJECIMIENTO O EBNNEGRECIMEINTO EN MAYOR OMENOR GRADO.NEGATIVO:Tubo A- AUSENCIA DE COLORACIÓN NEGRATubo B- AUSENCIA DE COLORACIÓN ROJA O NEGRA.NOTA: El propósito de esta escala de color es exclusivamente a modo de guiageneral. Si se observan reacciones mas debiles, los cultivos deben ensayarse consalmonella latex text.3. Los tubos positivos deben procesarse con Salmonella Latex Test Oxoid (Código FT203). Aquellas muestras cuyos tubos den positivo con Salmonella Látex Test deben informarse como “presuntivamente portadoras de Salmonella”. El hallazgo debe confirmarse mediante cultivo tradicional y técnicas serológicas, subcultivando una porción de la parte indicadora supeirr del tubo que haya dado un resukltado psitivo en la aglutinación de látex, en un medio de enriquecimiento selectivo.• PRECAUCIONES Manipular asépticamente durante todo el proceso. 100
    • No pipetear con la boca. Los vasos de cultivo deben autoclavarse antes de desechar.4. Listeria Rapid Test• PrincipioEl antígeno flagelar de Listeria ha sido extraido de una muestra que ha sidocultivada en dos enriquecimient os secuénciales. El test inmunoenzimáticoconsiste en una tira de membrana ( la unidad de prueba visual) sobre la cual esinmovilizado un anticuerpo específico para el flagelo de Listeria dejándoloinmovilizado. La mayoría de los anticuerpos especificos para Listeria, se unenprovocnado reacciones cromógenas por las partículas de latex, ocurridas en la tiradel test en presencia de la muestra ha evaluar.Si el antígeno de Listeria está presente en la muestra, se forma una reacciónsándwich con latex marcado y anticuerpos inmovilizados, resultando en una lineaazúl, la cual indica un resultado positivo. Una segunda línea de anticuerpos noespecífica es inmovilizada en la tira del test. Estos une el exceso de latex marcadosi el antígeno está presente o no, proporcionando un control integral.• Procedieminto1. Adicione la muestra a 9 volumenes de caldo Fraser.2. Homogenizar bien la mezcla. Incubar a 30ªC por un mínimo de 21 horas sin exceder 24 horas.3. Transferir 0.1ml de la mezcla incubada a 10 ml de Caldo enriquecido buffer Listeria (BLEB). Incubar a 30ªC de 21 a 24 horas.4. Transferir 2 ml del caldo incubado BLEB dentro de un tubo de vidrio a baño de agua a 80ªC por 20 minutos.5. Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente, y adicionar 135µl en la ventana de muestra del Clearviw Listeria Test Unit.6. Observe la unidad de prueba después de 20 minutos. Si aaprece una línea azúl en la ventana de resultados, la prueba es positivo para Listeria. Una línea azúl en la ventana de control demuestra que el test se ha realizado correctamente.5. CampylobacterLa técnica empleada para la búsqueda del microorganismo consistió en hacer unadilución 1:10 de la muestra de agua de la corriente de salida de la planta detratamiento de aguas residuales en estudio, utilizando como diluyente aguapeptonada al 0.1%, realizando posteriormente una siembra masiva con hisopos dealgodón estériles, sobre las cajas petri con el medio sólido; llevándolas aincubación a 37°C durante 48 horas, en una atmósfera entre 5-6% de oxígeno,10% de CO2 y 84-85% de Nitrógeno, confirmando posteriormente la presencia deCampylobacter por la morfología típica de esta bacteria en la coloración de Gram.6. Prueba de STAPHYLASE DR595• Prinicipio 101
    • La prueba Staphylasa de Oxoid, detecta la presencia del factor de agregación poragregación de eritrocitos de oveja sensibilizados con fibrinógeno. La especificidadde la reacción se confirma por una prueba simultanea con un reactivo control(eritrocitos de oveja sin sensibilizar), donde, naturalmente no debe observarsedicha agregación.• Procedimiento1. Las muestras a identificar pueden sembrarse bien sobre medios selectivos (Manitol SALT Agar, Baird-Parker Médium) o sobre medios no selectivos (Agar sangre)2. Realizar tinción de Gram y prueba de catalasa a las colonias sospechosas, para confirmar la presencia de cocos Gram -positivos, catalasa positivos.3. Agitar los reactivos de prueba y control y asegurarse la formación de una suspensión homogénea. Cualquier resto de células que haya podido quedar atrapado en el goteador debe mezclarse con la suspensión.4. Por medio de un asa, recoger de 1 a 3 colonias sospechosas y extender sobre el circulo de prueba y el de control de la tarjeta de reacción.5. Añadir 1 gota del reactivo de prueba al circulo de prueba y 1 gota del reactivo control al circulo control.6. Mezclar el contenido del circulo de prueba por medio de un asa. Flamear el asa y mezclar el contenido del circulo control. Observar la aparición de aglutinación mientras se mezcla.7. Desechar la tarjeta de reacción en desinfectante.• Resultados Se obtiene un resultado positivo si se observa agregación de la suspensión celular mientras se mezcla. Esto indica la presencia de Staphylococcus aureus. Los resultados no se pueden interpretar si aparece agregación en el control. En estos casos debe examinarse la pureza e identidad del cultivo.7. Baterias Bioquímicas APIAPI 20 ESistema de identificación para enterobacteriaceae y otros bacilos gram-negativos.API 20 E es un sistema para identificación de las enterobacteriaceae y otrosbacilos gram-negativos y no exigentes, mediante 23 tests bioquímicosestandarizados y miniaturizados, y una base de datos. La lista completa de lasbacterias que pueden identificarse utilizando este sistema aparece en la tabla deidentificación.Princ ipioLa galería API 20 E consta de 20 micro tubos que contienen los substratosdeshidratados. Los tests se inoculan con una suspensión bacteriana que rehidratalos medios. Durante la inoculación el metabolismo de la bacteria produce cambiosde color espontáneos o bien al añadir reactivos. 102
    • La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de lectura y laidentificación mediante la tabla de identificación, API 20 E INDEX o el programainformatico para identificación.La caja API 20 E permite realizar 25 identificaciones y se compone de: • 25 galerías API20 E. • 25 cámaras de incubación. • 25 hojas de resultados. • 1 sistema de cierre. • 1ficha técnica.TÉCNICAPreparación de la galería • Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente y repartir 5 ml. De agua en los alvéolos para proporcionar una atmósfera húmeda. • Anotar la referencia de la muestra en la lengüeta lateral de la cubeta. • Colocar la galería en la cámara de incubación. • Paralelamente, realizar el TEST DE LA OXIDASA: - Colocar un trozo de papel de filtro sobre un portaobjetos. - Humedecer el papel con una gota de agua . - Añadir una gota de reactivo OX. - Si en el intervalo de 1 a 2 minutos aparece una tonalidad púrpura oscura, se trata de una reacción positiva. NOTA: API 20E debe utilizarse con los bacilos Gram negativos y no exigentes. Los microorganismos difíciles y exigentes para los cuales se necesita tener precauciones especiales de manipulación (ej.: Brucella y Francisella) no forman parte de la base de datos API 20 E. Excluir o confirmar su presencia.Preparación del inoculo • Abrir una ampolla de Medio suspensión API 20E (ref. 20, 110) o agua destilada estéril . • Por medio de una pipeta Pasteur estéril tomar una colonia bien aislada. • Realizar una suspensión homogénea delas bacterias en el medio.Inoculación de la galería • Llenar el tubo y la cúpula de los test CIT, VP, GEL, con la suspensión anterior • Llenar los tubo pero no las cúpulas de los demás tests. • Llenar las cúpulas de los tests ADH, LDC, ODC, URE, H 2S, con aceite de parafina para obtener anaerobiosis. • Cerrar la cámara de incubación e incubar a 35-37o C durante 18-24 horas. 103
    • Lectura de la galería• Después de 18-24 horas a 35-37o C debe hacerse la lectura dela galería según la tabla de lectura.• Anotar en la hoja de resultados las reacciones espontáneas.• Si la glucosa es positiva y /o 3 o más tests son positivos: efectuar el revelado de los tests que requieren reactivos. - TEST VP: Añadir una gota de VP 1 y VP 2. Esperar 10 minutos. Un color rojo o rosa fuerte indican una reacción POSITIVA. - TEST TDA: Añadir una gota de reactivo TDA. Un color marrón oscuro indica una reacción POSITIVA. - TEST IND: Añadir una gota de reactivo JAMES. La aparición inmediata de un coloración rosa indica que la reacción es POSITIVA, ó Añadir una gota de reactivo IND y espere dos minutos, la aparición de un amarillo rojo indica que la reacción es POSITIVA. - TEST NO 2: Añadir una gota de reactivo NIT 1 y NIT 2en un tubo GLU. Esperar 2 a 3 minutos. Un color rojo indica una reacción POSITIVA. Una reacción negativa pue de deberse a la reducción de los nitratos a N2 (acompañada muchas veces de la formación de burbujas); Añadir de 2 a3 mg de reactivo de Zn. Si después de 5 minutos el tubo permanece amarillo indica una reacción POSITIVA. Si la reacción da color rosa o rojo la reacción es negativa.• Si la glucosa es negativa y el numero de tests positivos es inferior o igual a 2: no añadir reactivos. - Inocular 2 medios API OF para comprobar el metabolismo de la glucosa. - Sembrar en MAC CONKEY. - Comprobar la movilidad. Inocular 1 medio API M. - Reincubar la galería 24 horas más. - Añadir los reactivos. - Anotar los resultados de la galería y los resultados de los tests complementarios en la hoja de resultados .Identificación• Mediante la tabla de identificación: Comparar las reacciones de la hoja de resultados con los de la tabla.• Con el API 20E Index o el programa informático para identificación: Del conjunto de reacciones debe obtener un perfil numérico. En la hoja de resulta dos los tests están separados en grupos de tres y un valor de 1,2 ó 4 está indicado para cada uno. La galería API 20E consta de 20 tests, los numero en el interior de cada grupo corresponde a las reacciones positivas. El test de la o oxidasa es el n 21 y si es positivo se le asigna el valor 4. Sumando los valores de los tests positivos par cada grupo se obtiene un código de 7 cifras. En algunos casos, el perfil de 7 cifras no discrimina suficientemente, debiendo realizar los tests complementarios siguientes: - Reducción de los nitratos a nitritos (NO 2) - Reducción de los nitratos a nitrógeno (N2) 104
    • - Movilidad (MOB) - Cultivo en Mac Conkey (McC) - Oxidación de la glucosa (OF-O) - Fermentación de la glucosa (OF-F)EsterilizaciónDespués de obtener la identificación correspondiente, todo el material empleadodebe ser esterilizado mediante autoclave, incineración o inmersión en ungermicida.LimitacionesEl sistema API 20E esta concebido para identificar bacilos Gram negativos y noexigentes incluidos en la base de datos. No puede identificar microorganismos queno estén incluidos en dicha base de datos.La interpretación de los resultados debe ser realizada por un analista teniendo encuenta el contexto clínico, el origen de la muestra estudiada y el aspecto macro ymicroscópico. Eventualmente deben tenerse en cuenta otros resulta dos incluido elantibiogramaAPI 20 NESistema de identificación de bacilos Gram-negativos no enterobacterias.API 20 NE es un micro -método estandarizado que combina 8 testsconvencionales y 12 tests de asimilación para la identificación de bacilos G ram-negativos no exigentes y no enterobacterias ( por ej., Pseudomonas,Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella,Vibrio, Aeromonas ,etc). Losmicroorganismos fastidiosos, exigentes y que requieren precauciones especialesde manipulación (ej.,Brusella y Francisella) no forman parte de la base de datosAPI 20 NE.Conviene utilizar otras técnicas para excluir o confirmar su presencia. La listacompleta de las bacterias que es posible identificar con este sistema se presenta enla tabla de identificación.Princ ipiosLa galería API 20 NE se compone de 20 cúpulas que contienen medios y /osustratos deshidratados.Los tests convencionales son inoculados con una suspensión bacteriana salina quereconstituye los medios. Las reacciones que se producen durante la incubación setraducen en variaciones de coloración espontáneas o reveladas mediante la adiciónde reactivos.Los tests de asimilación son con un medio mínimo y las bacterias se reproducensólo si son capaces de utilizar el sustrato correspondiente.La lectura de estas reacciones se lleva a cabo utilizando la tabla de lectura y laidentificación se realiza con la ayuda del catalogo analítico o de un programa deidentificación. 105
    • REACTIVOSComposición del envase (25 tests) • 25 galerías API 20 NE. • 25 cámaras de incubación. • 25 ampollas de medio sintético AUX Médium. • 25 hojas de resultados. • 1 ficha técnica.TÉCNICAPreparación de la galería • Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente y repartir 5 ml. De agua en los alvéolos para proporcionar una atmó sfera húmeda. • Anotar la referencia de la muestra en la lengüeta lateral de la cubeta. • Colocar la galería en la cámara de incubación. • Paralelamente, realizar el TEST DE LA OXIDASA: - Colocar un trozo de papel de filtro sobre un portaobjetos. - Humedecer el papel con una gota de agua . - Añadir una gota de reactivo OX. - Si en el intervalo de 1 a 2 minutos aparece una tonalidad púrpura oscura, se trata de una reacción positiva. NOTA: API 20E debe utilizarse con los bacilos Gram negativos y no exigentes. Los microorga nismos difíciles y exigentes para los cuales se necesita tener precauciones especiales de manipulación (ej.: Brucella y Francisella) no forman parte de la base de datos API 20 E. Excluir o confirmar su presencia.Preparación del inoculo • Abrir una ampolla de NaCl 0.85% Medio suspensión API 2 ml o agua destilada estéril. • Por medio de una pipeta Pasteur estéril tomar una colonia bien aislada. • Realizar una suspensión homogénea delas bacterias en el medio, para obtener una suspensión bacteriana de turbidez igualk ala del patron 0,5 de McFarland.Inoculación de la galería • Llenar el tubo y no las cúpulas de los test NO3, PNPGL, con la suspensión anterior. • Abrir una ampolla de AUX medio y transferir en ella aproximadamente 200 µL (6-8 gotas) de las suspensión precedente, homogenizar evitando la formación de burbujas, • Llenar los tubos y cúpulas de los tests GLU a PAC, cuidando que quede ek nivel horizontal o ligeramente convexo pero jamás cóncavo. Las cúpulas incompletamente o demasiado llenas pueden generar res ultados incorrectos. • Llenar de aceite de parafina las cúpulas de los tests subrayados (GLU ADH, URE), para formar un menisco convexo. • Cerrar la cámara de incubación e incubar a 30 oC durante 24 horas. 106
    • Lectura de la galería• Después de 24 horas a 30o C debe hacerse la lectura dela galería según la tabla de lectura.• Anotar en la hoja de resultados las reacciones espontáneas ( GLU ADH, URE, ESC, GEL, PNPG ).• El revelado de los dos test NO3 y TRP debe hacerse protegiendo los test de asimilación d eun acontaminación por ekl aaire. Para ello, colocar la tapa de la cámara de incubación por encima de los test. - TEST NO 3: Añadir una gota de reactivo NIT 1 y NIT 2en un tubo NO3. Esperar 5 minutos. Un color rojo indica una reacción POSITIVA. Una reacción negativa pue de deberse a la reducción de los nitratos a N2 (acompañada muchas veces de la formación de burbujas); Añadir de 2 a3 mg de reactivo de Zn. Si después de 5 minutos el tubo permanece amarillo indica una reacción POSITIVA. Si la reacción da color rosa o rojo la reacción es negativa. - TEST TRP: agregar una gota del reactivo de James. Una coloración rosada que se difunde por toda la cúpula indica una reacción positiva. - TEST DE ASIMILACIÓN: observar el crecimiento bacteriano. Una cúpula turbia indica una reacció n positiva. Pueden observarse crecimiento de intensidad intermedia que se pueden anotar, -+ ó +-. Una vez realizada esta lectura, la identificación debe realizarse como se indica en el párrafo identificación.Identificación• Mediante la tabla de identificación: Comparar las reacciones de la hoja de resultados con los de la tabla.• Con el API 20 NE Index o el programa informático para identificación: Del conjunto de reacciones debe obtener un perfil numérico. En la hoja de resulta dos los tests están separados en grupos de tres y un valor de 1,2 ó 4 está indicado para cada uno. La galería API 20E consta de 20 tests, los numero en el interior de cada grupo corresponde a las reacciones positivas. El test de la o oxidasa es el n 21 y si es positivo se le asigna el valor 4. Sumando los valores de los tests positivos par cada grupo se obtiene un código de 7 cifrasEsterilizaciónDespués de obtener la identificación correspondiente, todo el material empleadodebe ser esterilizado mediante autoclave, incineración o inmersión en ungermicida.LimitacionesEl sistema API 20NE esta concebido para identificar bacilos Gram negativos noenterobacterias y no exigentes incluidos en la base de datos, y solo a éstos. Nopuede identificar microorganismos que no estén incluidos en dicha base de datos. 107
    • La interpretación de los resultados debe ser realizada por un analista teniendo encuenta el contexto clínico, el origen de la muestra estudiada y el aspecto macro ymicroscópico. Eventualmente deben tenerse en cuenta otros resultados incluido elantibiogramaAPI 20 C AUXSistema de identificación de levaduras.PRINCIPIOLa galeria API 20 C AUX se compone de 20 cúpulas que contiene sustratosdeshidratados que permiten realizar 19 tests de asimilación. Las cúpulas soninocula das con un medio mínimo semisólido y las levaduras se reproducen solo sison capaces de utilizar el sustrato correspondiente.Las lecturas de estas reacciones se hace por comparación con un control decrecimiento y la identificación se obtiene mediante el Catálogo Analítico o unprograma informático de identificación.REACTIVOSComposición del envase (26 tests):• Suspensión Médium, 2ml (ref. 70 700) o NaCl 0,85% Médium, 2ml (ref. 20 070)• RAT Médium [Riz Agar Tween] (ref. 41 794)• SABOURAUD Medium (ref. 42 026 0 43 171)• Pipetas o PSIpettes (ref. 79 250)• McFarland Standard (ref. 70 900), punto 2• Catálogo Análitico API 20 C AUX (ref. 20 290) o programa informático de identificación (consultar a bioMérieux)• Una gradilla (ref. 70 200)Material de Laboratorio Necesario:• Estufa (30°C)• Refrigerador• Mechero de Bunsen• RotuladorLISTA DE LAS PRUEBASGLU Glucosa MDG α– Metil-D-GlucosidoGlY Glicerol NAG N – Acetil-D-Glucosamina2KG 2-Ceto-D-Gluconato CEL CelobiosaARA L-Arabinosa LAC LactosaXLY D-Xylosa MAL MaltosaADO Adonitol SAC SacarosaXLT Xylitol TRE TrehalosaGAL Galactosa MLZ MelezitosaINO Inositol RAF RafinosaSOR Sorbitol 108
    • TÉCNICALas muestras y los cultivos de levaduras deben ser considerados comopotencialmente infecciosos y deben ser manejados de manera adecuada porpersonal competente y preparado.Las técnicas asépticas y las precauciones habituales para la manipulación de laslevaduras deben ser respetadas a lo largo de toda la manipulación.Preparación de la Galería• Reunir el fondo y la tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5ml de agua destilada o desmineralizada [o toda agua sin aditivos o derivados susceptibles de liberar gases (Ej: Cl , CO2...)] en los 2 alvéolos del fondo con el fin de crear una atmósfera húme da.• Escribir la referencia de la muestra en la lengüeta lateral de la cámara.• Retirar la galería de su embalaje individual y depositarla en la cámara de incubación.Preparación del Inóculo• Abrir una ampolla de suspensión Médium o de NaCl 0.85% Médium o utilizar un tubo que contenga 2ml de la misma solución sin aditivo.• Realizar una suspensión de levaduras de turbidez igual a 2 de McFarland. Para ello, retirar una fracción de colonia mediante una pipeta por aspiración o por toques sucesivos.• Depositar una g de suspensión de levaduras en el RAT Médium [Riz Agar ota Tween] -• Abrir una ampolla de C Médium y transferir en ella 100µl (es decir 2 a 4 gotas) de una pipeta de la suspensión anterior. Homogenizar con la pipeta, evitando la formación de burbujas.Inoculación de la Galería• Llenar las cúpulas con la suspensión obtendida en C Médium. Evitar la formación de burbujas apoyando la punta de la pipeta en el borde de la cámara. Cuidar de crear un nivel horizontal o ligeramente convexo, pero jamás cóncavo. Las cámaras incompletamente o demasiado llenas pueden generar resultados incorrectos.• Cerrar la cámara de incubación e incubar durante 48-72 horas a 30°C.Lectura de la GaleríaDespués de 24, 48 o eventualmente 72 horas de incubación, si los tests y enparticular la glucosa, no son suficientemente patentes después de 48 horas,observar el crecimiento de levaduras. La cámara 0 sirve de testigo negativo. Unacámara más turbia que el testigo indica una reacción positiva, que debe anotarseen la hoja de resultados.NOTA: En caso de que la lectura no pueda realizarse a las 72 horas, puedeninterpretarse los resultados en las 24 horas que siguen.Con el fin de evitar cualquier contaminación por reincubación, retirar la tapa sólodurante el período de lectura. 109
    • Identific aciónLa identificación puede hacerse:• Con el Catálogo Analítico: Codificar el conjunto de las reacciones obtenidas en un perfil numérica: En la hoja de resultados, los tests están separados en grupos de tres y se indica para cada uno un valor de 1,2 ó 4. Sumando al interior de cada grupos los números que corresponden a reacciones positivas, se obtienen 7 cifras.Eliminación del Material UtilizadoDespués de utilizarlas, las ampollas, cajas, pipetas y galerías deben ser incineradaso decontaminadas en un autoclave o sumergiéndolas en un desinfectante, antes deeliminarlas.LimitacionesEl Sistema API 20 C AUX está destinado a la identificación de levaduraspresentes en la base de datos. 110
    • ANEXO 3 Fórmulas y Cálculos Estadísticos1. Tamaño de la MuestraDe acuerdo a los datos obtenidos en el muestreo piloto que se incluyen en elAnexo 4, mediante las siguientes fórmulas se calculó el tamaño de la muestra,teniendo en cuenta que los cálculos fueron realizados con los datoscor respondientes al tanque de ecualización, dado que en esta etapa del tratamientose obtuvieron los recuentos más elevados.Muestreo Piloto del Tanque de Ecualización MEDIA VARIANZA TAMAÑO estratos ARITMETICA δ (δ2 h) ESTRATO (Nh) Nh x δ2hHeterótrofos 9,57 9.70 12 116.4Coliformes 8.15 4.54 12 54.48Mohos y Levaduras 9.43 5.92 12 71.04∑ Nh x δ 2h = 241.92 W = Nh W = 12 = 0.33 N 36N = N2 x ∑ Nh x δ 2h donde N = Tamaño de la muestra de la población N2 e2 + ∑ Nh x δ 2h e = 5 Z2 Z = 1.96N = (36) 2 x (241.92) = 36 (36)2 52 + (241.92) (1.96)2Tamaño de muestra en cada Estrato: W x N = 0.33 x 36 = 12 Muestras2. Análisis de Anava § Planteamiento del Modelo: Y = µ + τi + Eij Y = Respuesta (Recuento de Microorganismos) µ= Crecimiento Microbiano τi = Efecto sobre la respuesta en el tanque i = Equalización, Acidificación, Salida. Eij = Error experimental § Nivel de Significancia α = 0.05 § Estadística de Prueba 111
    • Análisis de varianza Tabla de Anava Fuente de Grados de Suma de Cuadrados variación libertad cuadrados Medios F calculada Tanque α-1 ∑ Yi2 - Y2 SC Tanque CM Tanque n N a - 1 CM Error Error Por diferencia Por diferencia SC Tanque GL Error ∑∑Yij - Y 2 2 Total N-1 N Regla de decisión: Si F calculada > F teórica ⇒ Rechazo Ho2. Comparación Múltiple de Scheffé § Nivel de Significancia α = 0.05 § Estadística de Prueba Sα = Scv (a - 1) FTeórica Scv = CM Error 1 + 1 nK nl § Regla de decisión Si Diferencia > S α ⇒ Rechazo Ho*4. Análisis de correlación de las variables Físico-químicas con los recuentos microbianos.Para los análisis de correlación se trabajó con un nivel de confianza del 95% (pvalor 0,05). • Regla de Decisión si p-valor < 0.05 ⇒ Rechazo Ho**Tabla 23. Niveles de correlac ión de las variables físico-químicas con los recuentos microbianos en las etapas del tratamiento ETAPA DEL PARÁMETR HETERÓTROFO COLIFORME HONGOTRATAMIENT O S S O S AGV -0.20071 -0.1790 0.0401 Ecualización (24)2 (24) (24) 0.53183 0.5779 0.9016 Alcalinidad 0.1908 0.0386 -0.0132 (24) (24) (24) 0.4635 0.9051 0.9676 112
    • pH -0.4635 0.0651 -0.2960 (24) (24) (24) 0.1291 0.8407 0.3503 DQO -0.0881 0.1213 0.0703 (24) (24) (24) 0.7854 0.7072 0.8281 AGV -0.0329 0.1562 0.1749 (24) (24) (24) 0.1949 0.4661 -0.0329 Alcalinidad -0.0090 0.1994 0.2354 (24) (24) (24) Acidificación 0.3512 0.3502 -0.0090 pH -0.1754 0.4614 -0.1466 (24) (24) (24) 0.0655 0.3395 0.1563 DQO -0.3820 -0.2038 -0.2986 (24) (24) (24) 0.4122 0.0403 0.4942 PH 0.0175 -0.0658 -0.1196 (24) (24) (24) 0.9486 0.8086 0.6591 Salida DQO 0.2756 0.1744 -0.0485 (24) (24) (24) 0.3016 0.5182 0.85851. Nivel de Correlación 2.Número de muestras 3. p-valor.4. Comparación de la proporción de crecimiento por bacteria para cada Tanque § Nivel de Significancia = 0.05 § Estadística de Prueba Z = P1 - P2 p q 1 + 1 n1 n2donde p = n1 P1 + n2P 2 q = 1 + P n1 + n2Regla de decisión Si Zcal > Zk/2 ⇒ Rechazo Ho 113
    • ANEXO 4 Datos Numéricos Obtenidos1. Recuentos Microbianos DIAS DE HETERÓTROFOS COLIFORMES MOHOS Y LEVADURAS MUESTREO Ecualización Acidificación Salida Ecualización Acidificación Salida Ecualización Acidificación Salida 1 41x10 5 22x10 4 - 35x10 1 23x10 3 - 90x10 2 52x10 3 - 2 16x10 5 20x10 6 - 34x10 6 69x10 5 - 39x10 6 17x10 6 - 5 3 97x10 97x10 8 - 36x10 7 91x10 6 - 92x10 8 43x10 8 - 8 4 50x10 12x10 9 - 28x10 9 15x10 9 - 60x10 8 52x10 8 - 5 12x105 15x10 5 - 24x10 5 42x10 8 - 62x10 7 10x10 7 - 6 27x10 7 22x10 9 - 23x10 9 54x10 6 - 11x10 7 87x10 6 - 6 7 49x10 12x10 5 - 28x10 7 13x10 6 - 10x10 7 90x10 6 - 8 8 28x10 13x10 10 - 66x10 6 13x10 7 - 19x10 11 17x10 7 - 9 67x10 10 65x10 10 23x105 14x10 9 14x10 10 80x10 2 50x10 11 13x1013 12x10 2 13 10 10x10 10x10 12 99x109 21x10 7 14x10 8 24x10 7 15x10 11 10x10 8 61x10 4 12 11 66x10 14x10 14 44x10 13 42x10 5 25x10 8 38x10 6 11x10 9 10x10 10 11x10 4 12 11x10 13 10x10 13 58x10 11 38x10 7 29x10 7 31x10 7 77x10 8 21x10 8 12x10 4 10 13 24x10 30x10 10 16x109 30x10 9 23x10 9 18x10 8 10x10 10 23x10 7 54x10 6 11 14 18x10 29x10 11 28x10 10 28x10 6 12x10 8 15x10 9 26x10 9 15x10 8 97x10 4 15 24x10 11 24x10 11 26x10 10 26x10 9 20x10 8 14x10 8 10x10 9 96x10 8 70x10 2 16 24x10 14 15x10 10 22x109 79x10 9 19x10 11 12x10 8 16x10 11 19x10 10 20x10 6 12 17 28x10 28x10 10 49x10 12 20x10 6 10x10 9 13x10 7 51x10 12 34x10 9 83x10 5 10 18 50x10 70x10 11 19x10 11 27x10 10 20x10 10 27x10 8 70x10 12 26x10 10 18x10 8 19 28x10 12 54x10 11 41x10 11 67x10 11 50x10 11 41x10 11 69x10 12 66x10 10 98x10 5 12 20 13x10 96x10 11 62x109 10x10 8 20x10 10 19x10 7 23x10 13 22x10 11 56x10 7 12 21 43x10 23x10 12 22x10 11 14x10 10 11x10 9 25x10 5 17x10 11 12x10 9 90x10 5 22 18x10 12 14x10 10 25x10 11 21x10 9 32x10 12 47x10 7 96x10 13 16x10 11 61x10 5 11 23 11x10 25x10 10 10x10 10 65x10 10 35x10 9 22x10 8 50x10 9 32x10 9 50x10 5 11 24 64x10 14x10 10 83x10 10 15x10 10 20x10 10 30x10 8 12x10 12 76x10 10 75x10 5 115
    • 2. Logaritmo de los Recuentos Microbianos DIAS DE heterótrofos COLIFORMES MOHOS Y LEVADURAS MUESTREO Ecualización Acidificación Salida Ecualización Acidificación Salida Ecualización Acidificación Salida 1 6,61 5,34 - 2,54 4,36 - 3,95 4,72 - 2 6,20 7,30 - 7,53 6,84 - 7,59 7,23 - 3 6,99 9,99 - 8,56 7,96 - 9,96 9,63 - 4 9,70 10,08 - 10,45 10,18 - 9,78 9,72 - 5 6,08 6,18 - 6,38 9,623 - 8,79 8,00 - 6 8,43 10,34 - 10,36 7,73 - 8,04 7,94 - 7 7,69 6,08 - 8,45 8,11 - 8,00 7,95 - 8 9,45 11,11 - 7,82 7,11 - 12,28 8,23 - 9 11,83 11,81 6,36 10,13 11,15 3,90 12,70 14,11 3,08 10 14,02 13,01 11,00 8,32 9,15 8,38 12,18 9,00 5,79 11 13,82 15,16 14,64 8,62 9,4 7,58 10,04 11,00 5,04 12 14,04 14,01 12,76 8,58 8,46 8,49 9,89 9,32 5,08 13 11,38 11,48 10,20 10,48 10,36 9,26 11,00 8,36 7,73 14 12,26 12,46 11,45 7,45 9,08 10,18 10,41 9,18 5,99 15 12,38 12,38 11,41 10,43 9,30 9,15 10,00 9,98 3,85 16 15,38 11,18 10,34 10,90 12,28 9,08 12,20 11,28 7,30 17 13,45 11,45 13,69 7,30 10 8,11 13,71 10,53 6,92 18 11,70 12,85 12,28 11,43 11,30 9,43 13,85 11,41 9,26 19 13,45 12,73 12,61 12,83 12,70 12,61 13,84 11,82 6,99 20 13,11 12,98 10,79 9 11,30 8,28 14,41 12,34 8,75 21 13,63 13,36 12,34 11,15 10,04 6,40 12,23 10,08 6,95 22 13,26 11,15 12,40 10,32 13,51 8,67 14,98 12,20 6,79 23 12,04 11,40 11,00 11,81 10,54 9,34 10,70 10,51 6,70 24 12,81 11,15 11,92 11,18 11,30 9,48 13,08 11,88 6,88 116
    • 3. Datos Obtenidos de los Registros Fisico-quimicos DIAS DE ECUALIZACIÓN ACIDIFICACIÓN SALIDA MUESTREO DQO pH AGV Alkalinidad DQO pH AGV Alkalinidad DQO pH mg O2 /L CaCO3/L mg O2 /L CaCO3/L mg O 2/L 1 2131 8.49 2119 5.99 375 343 617 7.2 2 2247 7.59 2286 5.93 199 439 692 7.14 3 2092 8.95 1976 6.07 360 304 731 7.05 4 2441 9.21 2170 5.66 393 261 930 7.06 5 2441 9.93 2938 6.34 676 918 976 7.14 6 2275 9.74 1619 6.24 333 478 938 7.26 7 1246 7.01 1324 6.93 540 597 615 7.02 8 1869 6.62 2102 5.51 450 518 631 7.03 9 2726 8.96 2102 5.53 510 479 945 7.8 10 2102 6.72 1815 5.84 445 354 681 6.99 11 2141 6.77 2071 5.97 481 497 729 7.07 12 1545 6.95 1625 6.02 445 534 689 7.02 13 2204 6.17 135 622 1572 5.86 403 372 221 6.8 14 2104 6.57 154 381 1742 5.78 408 367 225 6.85 15 2359 7.72 104 346 1889 6.01 515 695 412 6.9 16 2779 7.25 56 895 1492 6.45 630 756 215 6.9 17 5368 7.4 232 441 2484 5.81 378 655 402 6.78 18 1886 6.98 153 471 1944 5.66 447 680 342 6.88 19 1212 6.45 102 639 1394 6.21 397 584 376 6.93 20 2642 7.39 103 364 2109 5.81 273 429 339 6.77 21 2329 6.6 210 365 2660 6.17 471 739 339 6.74 22 2219 8.04 168 910 1504 5.64 684 747 269 6.88 23 2560 9.47 86 697 1559 6.27 308 623 484 6.74 24 1729 7.23 115 339 1769 5.77 321 483 235 6.77 X 2276.96 7.68 134.83 539.17 1927.71 5.98 435.08 535.50 543.04 6.99 DS 774.07 1.14 51.28 209.67 403.72 0.32 118.70 166.97 253.68 0.23 117
    • ANEXO 5. Perfil Bioquímico de Microorganismos IdentificadosBACTERIASMicroorganismo % PRUEBAS BIOQUIMICAS Identificado (*) ONPG ADH LDC ODC CIT H2 S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX NO2Burkolderia 94.0 + - - + + - - + - + + - + + + - + + + + + -cepaciaEnterobacter 86.8 + - + + - - - - - + - + + + + + + + + + - +aerogenesEnterobacter 91.1 + + - + + - - - + + - + + - + + + + + + - +sakazakiiEnterobacter 99.9 + + - - - - - - - + - + + - - + - - + + - -cancerogenusEnterobacter 99.0 + + + + + - - - - + - + + - + + + + + + - +cloacaeEscherichia coli 96.1 + - + - - - - - + - - + + - + - - + + + - -Escherichia 95.7 + + - - - - - - - + - + + - - + - + + + - -vulnerisKlebsiella 97.6 + - + - + - + - - + - + + + + + + + + + - +pneumonieKlebsiella 92.4 + - + - - - - - - - - + + + + + + + + + - +terrígenaPantoea sp. 85.5 - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + - -Pseudomonas sp 75.0 - - - + + - - + - - - + + - - - + - - - - +Serratia ficaria 98.4 + - - - + - - - - + + + + - + + + + + + - +Pseudomonas 96.0 - + - - + - - - - - - + + - - - - + - + + -fluorecensSerratia 74.8 + + - + + - - + - - + + + + + - + - + + - +liquefaciensStenotrophomonas 88.3 + - - + + - - + - - + + - - - - - - - - - -maltophilia (*) PORCENTAJE DE CONFIANZA DE LA PRUEBA 118
    • LEVADURASMicroorganismo % PRUEBAS BIOQUIMICAS Identificado (*) o GLU GLY 2KG ARA XYL ADO XLT GAL INO SOR MDG NAG CEL LAC MAL SAC TRE MLZ RAFCandida 99.3 - + - - - - - - - - - - - - - - - - - -glabrataCandida 87.8 - + + - + + - + + + + + + + - + + + + +guillermondiCandida krusei 99.5 - + - + + + + - + - + - + + + + + - - +Candida 88.5 - + + + - + + + + - + - - - - + + + + -lusitaniaeCryprtococcus 99.5 - + - + + + + - + - + - + + + + + - - +laurentiCryptococcus 99.8 - + + + + - - + + + + + - - - + + + - +neoformansCryptococcus 99.6 - + + + - - - + + + + - + - - - - + + +terreusRhodotorula 99.9 - + - - + + - - + - - - - - - + + + + +glutinisSaccharomyces 93.5 - + - - - - - - + - - - - + - + + - - +cer evisiae 119 (*) PORCENTAJE DE CONFIANZA DE LA PRUEBA