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  • 1. Biol. Rosalba Amaya Luna Temas Selectos de Biología PRACTICA 4. INOCULACIÒN, MORFOLOGÍA COLONIAL Y TINCIÓN DE GRAM.Objetivos: Aprender a inocular bacterias y a caracterizar una colonia de bacterias Conocer y aplicar la técnica de tinción de Gram para bacterias Aprender a inocular contexto de Pleurotus ostreatus y obtener micelio dicarióticoMaterial:Primera sesión: Tercera sesión: Cuarta sesión:Placas con medio de cultivo para bacterias Placas con colonias bacterianas Placas con medio de cultivo para hongos1 vaso de pp de 100 ml 3 microscopios ópticos 1 lámpara de alcohol1 asa bacteriológica Porta y cubreobjetos 1 pinza de disección1 lámpara de alcohol 1 asa bacteriológica 1 tijeras1 estufa de cultivo 1 triángulo de vidrio 1 estufa de cultivo1 campana de flujo laminar Fucsina 1 campana de flujo laminarAlcohol etílico Cristal violeta Alcohol etílico1 plumón indeleble Lugol 1 plumón indeleble1 anillo de egapack Aceite de inmersión 1 anillo de egapack5 muestras o inóculo para bacterias Piseta con agua destilada 1 vaso de pp de 500 mlAlgodón 2 goteros AlgodónSegunda sesión: 1 caja petri 1 bisturíPlacas con colonias bacterianas 1 pipeta de 5 ml Papel aluminioPlantilla de “Morfología colonial” Alcohol etílico 5 setas muy grandes1 reglaMetodología:Esta práctica se divide en 4 sesiones.Primera sesión INOCULACION (campana de flujo laminar): 1. Esterilizar la campana con un método químico y prenderla 15 minutos antes de iniciar el trabajo. 2. Inocular mediante la técnica de estría en placa cada una de las placas con medio de cultivo para bacterias. Utilizar una muestra o inóculo por placa. Sellar con el egapack y rotular cada caja con el nombre del inoculo, el número de equipo y la fecha. Incubar a 37º C durante 48 hrs.Segunda sesión MORFOLOGIA COLONIAL (salón): 1. Después de 48 horas de incubación sacar las placas de la estufa y llevarlas al salón de clase. Utilizando como referencia la plantilla “Morfología colonial” describe a las colonias que crecieron en las placas. Señalar para cada placa el inóculo y describir un número significativo de colonias. Tomar fotografías de las placas y guardarlas en el refrigerador hasta la siguiente sesión.Tercera sesión TINCIÓN DE GRAM (salón): 1. Limpia con alcohol 5 porta y cubreobjetos y déjalos secar al aire. Biol. Rosalba Amaya Luna TEMAS SELECTOS DE BIOLOGIA
  • 2. Biol. Rosalba Amaya Luna Temas Selectos de Biología 2. Colocar dos gotas de agua destilada en el extremo de un portaobjetos, disolver en ella una muestra de una colonia representativa de una placa. Tomar la muestra con el asa bacteriológica. 3. Con la solución anterior preparar un frotis. 4. Secar la preparación al aire y fijarla con la flama, pasar tres veces el portaobjetos por la flama durante unos segundos, dejar enfriar entre los pases. 5. Cubrir la preparación con cristal violeta durante 10 min. 6. Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua corriente o destilada 7. Cubrir el frotis con lugol durante un minuto 8. Escurrir el lugol y lavar con agua corriente o destilada 9. Decolorar con alcohol etílico, procurando que no salga mucho colorante 10. Cubrir el frotis con la solución de fucsina de 10 a 30 segundos 11. Escurrir el colorante y lavar con agua corriente o destilada, secar la preparación al aire y examinar al microscopio con el objetivo de inmersión. 12. Repetir el procedimiento para cada una de las placas. Las bacterias Gram + se tiñen de violeta y las Gram – de rojoCuarta sesión SIEMBRA DE CONTEXTO EN CAJA (campana de flujo laminar): 1. Esterilizar la campana de flujo laminar con un método químico. Prenderla de 10 a 15 minutos antes de iniciar el trabajo. Introducir en ella el material necesario. 2. Colocar el cuerpo fructífero en un trozo de papel aluminio o una caja petri (según el tamaño de la seta). Si el tamaño lo permite meter al hongo rápidamente al vaso de pp. con alcohol. 3. Cortar con un bisturí o con tijeras trozos pequeños (0.5-1 cm) del contexto del hongo. Con la aguja y la pinza de disección colocar 4 o 5 trocitos de contexto en cada placa con medio para hongos, sella la caja con el egapack y rotúlala con tus datos. Flamea constantemente los materiales, también puedes utilizar alcohol. 4. Colocar las cajas en la estufa de cultivo a 27° C. de 20 a 25 días o hasta que el micelio invada todo el medio de cultivo.RECUERDA QUE PARA EL TRABAJO EN LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR ES NECESARIO EL USODE BATA LIMPIA, CUBREBOCAS, GORRO QUIRÚRGICO Y GUANTES.Cuestionario: 1. Explicar detalladamente a que se debe la tinción diferencial de la técnica de Gram 2. ¿Cuál es la función del lugol y el alcohol en la técnica? 3. ¿Qué es un colorante vital? 4. ¿Cómo se clasifican los colorantes y las técnicas de tinción o coloración? 5. ¿En qué consiste la fijación? y ¿cómo se clasifican los fijadores? 6. ¿Para qué sirve describir la morfología de la colonia? 7. ¿Por qué las colonias de las placas son diferentes? 8. ¿Qué medidas de seguridad debemos tener al abrir una placa? 9. ¿Cómo se desecha las placas que ya no sirven? Biol. Rosalba Amaya Luna TEMAS SELECTOS DE BIOLOGIA

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