Parásitos protozoarios entéricos en ambientes acuáticos

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Parásitos protozoarios entéricos en ambientes acuáticos

  1. 1. Parásitos Protozoarios entéricos en ambientes acuáticos:Métodos de concentración y detecciónWalter Q. Betancourt 1 y Luis J. Querales21 PhD. Ciencias Marinas, Universidad del Sur de Florida, EEUU.Investigador, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas(IVIC), Venezuela. Dirección: IVIC, Centro de Microbiología yBiología Celular. Laboratorio de Genética Molecular. ApartadoPostal: 20632. Caracas, Venezuela 1020A. e-mail:wbetanco@ivic.ve2 Estudiante Doctoral del Postgrado en Ciencias Biológicas,Mención Microbiología. IVIC, Venezuela. e-mail: lquerale@ivic.veRESUMENLa transmisión de parásitos protozoarios patógenos a través delagua representa uno de los problemas de salud pública másprominentes en el mundo entero. Los estudios sobre presencia deparásitos protozoarios en aguas son fundamentales para conocera fondo la epidemiología de enfermedades que afectan apoblaciones humanas en diferentes zonas geográficas. De estamanera, se pueden implementar en todo el mundo las medidas desalud pública que permitan el control y prevención deenfermedades transmitidas a través del agua. Los métodoscorrientes para el monitoreo de Cryptosporidiumparvum, C.hominis y Giardiaintestinalis son empleados para la detección deToxoplasma gondii y Cyclosporacayetanensis en ambientesacuáticos. La combinación de nuevas técnicas de filtración yconcentración junto con los métodos moleculares y cultivo celularforma parte de la estrategia científica dirigida a evaluar lasignificancia de microorganismos patógenos actuales yemergentes de interés para la salud pública. Este artículo revisaavances recientes en métodos de concentración y detección deprotozoarios patógenos transmitidos a través del agua, cuyaaplicación reviste importancia en ambientes acuáticos de todaAmérica Latina, donde se requiere mayor investigación científicaen esta área.PALABRAS CLAVE / Aguas / Concentración / Detección /Métodos / Protozoarios /La transmisión ambiental de microorganismos patógenosconstituye un medio altamente efectivo para la diseminación deenfermedades a una gran proporción de la población. LaOrganización Mundial de la Salud estima que un 24% de lasenfermedades que ocurren en el mundo están asociadas confactores ambientales, entre ellos el agua de calidad insegura yprecarias condiciones higiénicas (WHO, 2007). Los cuerpos deaguas naturales que reciben desechos fecales de animales yhumanos contienen numerosos microorganismos patógenoscapaces de sobrevivir fuera de su hospedero. Estosmicroorganismos son transmitidos indirectamente a poblaciones
  2. 2. susceptibles a través de las aguas de distribucióninadecuadamente tratadas o a través de aguas recreacionalesfuertemente impactadas con aguas residuales y desechos fecalesde animales domésticos (Hurst y Murphy, 1996).Los parásitos protozoarios Giardiaintestinalis(sinónimo para G.lambliay G.duodenalis), Cryptosporidiumparvum y C. hominis sonpatógenos intestinales excretados con las heces de humanos yanimales infectados en concentraciones de hasta 1×109(oo)quistes por gramo de heces (Danciger y López, 1975;Pickeringet al., 1984; Jokipii y Jokipii, 1986; Chappellet al., 1996;Morgan-Ryanet al., 2002; Chappellet al., 2006). Los (oo)quistes(abreviación para ooquiste y quiste) son las formas infectantes yconstituyen un estadio del ciclo de vida de estos parásitos que loscapacita para sobrevivir en el ambiente acuático y resistir losprocesos de tratamiento de aguas de distribución y aguas dedesecho doméstico (Betancourt y Rose, 2004). La ingestión nointencional de (oo)quistes infecciosos con las aguas y alimentoscontaminados, así como la ingestión inadvertida de aguascontaminadas durante las actividades recreacionales, puedeocasionar problemas de salud pública. En países en vías dedesarrollo, las enfermedades causadas por Cryptosporidium yGiardia forman parte del complejo grupo de enfermedadesparasitarias que, junto con las enfermedades bacterianas y virales,son un factor que impide el avance potencial y el progreso social yeconómico de sus habitantes. Estos parásitos fueron incluidosrecientemente en la Iniciativa de la Organización Mundial de laSalud para las enfermedades desatendidas (Savioliet al., 2006).La Iniciativa persigue abordar enfermedades parasitarias y otrasenfermedades tropicales (entre ellas las helmintiasis intestinales,esquistosomosis, leishmaniasis, leptospirosis, etc.) de maneraintegrada a fin de garantizar el manejo efectivo (control yeliminación) de estas enfermedades (www.paho.org,www.who.int).Numerosos brotes epidémicos de enfermedades gastrointestinaleshan ocurrido por transmisión indirecta de los parásitosprotozoarios Giardia y Cryptosporidium a través de aguas dedistribución y cuerpos de aguas naturales y artificiales (lagos, ríos,playas y piscinas) empleados para recreación (Thompson et al.,1993; MacKenzieet al., 1994; Fayeret al., 2000; Rose et al., 2002;Nygårdet al., 2006). De igual manera, los protozoariosCyclosporacayetanensis y Toxoplasmagondii han estadoasociados con brotes de enfermedades transmitidas a través delagua (Benensonet al., 1982; Raboldet al., 1994; Bowie et al., 1997;Isaac-Rentonet al., 1998; Araminiet al., 1999; Dubey, 2004;Schuster y Visvesvara, 2004; Karaniset al., 2007). A esta lista sesuman los protozoarios intestinales Entamoebahistolytica yBalantidiumcoli, los cuales son considerados patógenos deatención para la salud pública y con potencial de transmisión através de las aguas, particularmente en países en vías dedesarrollo (Ashbolt, 2004; Karaniset al., 2007). En poblaciones dezonas urbanas y rurales de estos países son comunes lasprotozoosis intestinales ocasionadas por todos los parásitosanteriormente mencionados (Chacín-Bonilla et al., 1998, 2006a, b;
  3. 3. Díaz et al., 2000; Xiaoet al., 2001; Alarcón de Noyaet al., 2003;Seppoet al., 2005).La transmisión de los protozoarios intestinales Cryptosporidium yGiardia a través del agua se considera uno de los problemas desalud pública más prominentes en el mundo entero (Rose et al.,2002; Carey et al., 2004). Esto es evidente al considerar las bajasdosis infecciosas de C.parvum(9-1042 ooquistes; DuPont et al.,1995; Okhuysenet al., 1999), de C. hominis (10-83 ooquistes;Chappellet al., 2006) y de G. intestinalis(10-100 quistes; Rendtorff,1954) y su resistencia a los tratamientos. En Venezuela existenestudios sobre protozoarios entéricos en ambientes acuáticos(Arcay y Bruzual, 1993; Quintero-Betancourt y Botero, 2000); sinembargo, son pocos y se requiere de mayor información en zonascosteras y sistemas de tratamiento de aguas para suministro.Existen numerosos métodos de concentración y detección deprotozoarios entéricos en aguas, que aplicados en conjunto conlos métodos moleculares y cultivo celular permiten determinar demanera eficiente y sensible las especies y genotipos asociadoscon enfermedades en humanos. Conocer la importancia relativade vías específicas de transmisión de protozoarios intestinales,incluyendo las fuentes potenciales de contaminación ambiental,constituyen aspectos fundamentales que permiten entender laepidemiología de las enfermedades parasitarias, de esta manerase pueden aplicar medidas correctivas que minimicen laprevalencia e incidencia de estas enfermedades en la población.Métodos para el Estudio de Protozoarios Entéricos en AguasLos métodos de detección de protozoarios intestinales enambientes acuáticos, desarrollados en instituciones de diversospaíses, son evaluados constantemente con el fin de optimizar losdiferentes procedimientos que permitan detectar de manerasensible y específica los protozoarios patógenos en aguas(Anónimo, 1999; EPA, 1999a, b, 2005). Inicialmente, los métodosfueron diseñados y aprobados para el monitoreo de la presenciade Cryptosporidium yGiardia en aguas de distribución y cuerposde aguas naturales; sin embargo, han sido adaptados para elestudio y detección de Toxoplasma gondii yCyclosporacayetanensis (Sturbaumet al., 1998; Quintero-Betancourt et al., 2002; Villena et al., 2004; Dumetre y Darde,2005).El método estándar para el estudio de Cryptosporidium yGiardiaen aguas incluye tres procedimientos básicos: concentración,purificación y detección. Los procedimientos iniciales deconcentración y purificación incluyen los siguientes pasos: 1)filtración de un volumen determinado de agua (10-1000 litros) conel propósito de capturar los (oo)quistes en una matriz de filtración;2) lavado del filtro con soluciones detergentes para desprender los(oo)quistes capturados en la matriz de filtración; 3) centrifugacióna velocidad moderada (1100-1500g) a fin de reducir el volumen demuestra (£5ml) y concentrar el material en suspensión junto con
  4. 4. los (oo)quistes; 4) separación selectiva de (oo)quistes de losmateriales inespecíficos en suspensión, utilizando partículasmagnéticas conjugadas con anticuerpos específicos paraprotozoarios (separación inmunomagnética). La detección de(oo)quistes se realiza mediante microscopía de fluorescenciautilizando anticuerpos monoclonales o policlonales marcados conisotiocianato de fluoresceína (ITFC), lo que permite incrementar lacapacidad de visualizar los (oo)quistes y diferenciarlos demateriales inespecíficos y algas microscópicas (microalgas)presentes en ambientes acuáticos. La confirmación de (oo)quistesaislados de ambientes acuáticos se lleva a cabo mediantemicroscopía por contraste de fases o también mediantemicroscopía de interferencia diferencial. Adicionalmente se aplicanfluorocromos específicos para ácidos nucleícos tales como el 4`,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y el yoduro de propidio o PI porsus siglas en Ingles (PropidiumIodide). La microscopía porcontraste de fases y de interferencia diferencial permite visualizarla morfología y estructuras internas de los (oo)quistes, tales comoesporozoitos (Cryptosporidium) axonema y núcleos (Giardia). Latinción con los fluorocromos DAPI y PI permite no solo confirmar lapresencia de (oo)quistesesporulados, sino que suministra ademásinformación acerca de la viabilidad de los (oo)quistes. Esto sedebe a la habilidad que tienen los fluorocromos de penetrar demanera selectiva al interior de la estructura parasitaria (Campbellet al., 1992). El DAPI es un fluorocromo de tamaño pequeño quepenetra fácilmente al interior de las células y tiñe selectivamentelas regiones del DNA ricas en adenina y timina, por ello permitedistinguir (oo)quistesesporulados potencialmente viables (Figura1). El PI es un fluorocromo de gran tamaño que penetra el interiorde las células únicamente cuando la continuidad de las barrerasfísicas (pared celular y membrana celular) han sido interrumpidas(Belosevicet al., 1997), de ahí que los (oo)quistes que han incluidoPI se consideran no viables.Figura 1. Fotomicrografías de Cryptosporidiumparvumobtenidascon microscopía de inmunofluorescencia. Nótese en la imagenizquierda un ooquiste no viable de Cryptosporidiumteñido confluoresceína y yoduro de propidio. La micrografía a la derechacorresponde a cuatro ooquistesesporulados (DAPI+) teñidos confluoresceína, Alexa fluor y DAPI (nótese los cuatro esporozoitos en
  5. 5. el interior de los ooquistes) (imágenes digitales de Walter Q.Betancourt y G. D. Digiovanni).En la Tabla I se describen los métodos estandarizados para elestudio de Cryptosporidium y Giardia en aguas. El método 1622fue aceptado y aprobado para el estudio de Cryptosporidium por laAgencia de Protección Ambiental de los EEUU y forma parte de laregulación más reciente instaurada en ese país para el control deese parásito en aguas. La regla LT2 establece un nivel de ceroooquistes en aguas tratadas o un requerimiento de 99% (2-log10)de remoción de ooquistes cuando se emplea únicamentetratamiento por filtración (EPA, 2006). En el Reino Unido, laregulación vigente dictada en 1999 establece el monitoreo diariode Cryptosporidium en aguas tratadas. La regulación requiere unnivel máximo de 10 ooquistes por 100 litros y cualquier valor porencima constituye una ofensa criminal (Fairleyet al., 1999).Tabla IMétodos Convencionales para la Concentración, Purificación yDeteción de Giardiay Cryptosporidiumen Ambientes Acu áticosEl método 1622 fue rigurosamente validado por diferenteslaboratorios y los principios generales se describen en la Tabla I.El método 1623, también validado, fue posteriormentedesarrollado para la detección simultánea de Cryptosporidium y
  6. 6. Giardia en aguas (EPA, 1999b). Existen variaciones de losmétodos 1622 y 1623 que incluyen procedimientos alternos defiltración y separación inmunomagnética, así como diferentesanticuerpos monoclonales y métodos de detección. Losprocedimientos alternos se describen en la Tabla II y pueden serutilizados para el estudio y monitoreo de Cryptosporidium y Giardiaen aguas una vez aplicados los controles específicos de calidad(EPA, 2005). Los controles de calidad son ensayos de laboratorioque permiten evaluar la eficiencia de recuperación tanto delmétodo estándar como del método alterno. En estos ensayos seutilizan muestras de aguas sembradas con (oo)quistes, secuantifican los (oo)quistes recuperados y se determina la eficienciade recuperación. Los valores obtenidos deben satisfacer criteriosde aceptación establecidos para que tanto el método estándarcomo el método alterno puedan ser utilizados por laboratorios dereferencia en el estudio y monitoreo de Cryptosporidium y Giardiaen aguas. Con el desarrollo reciente de controles positivosinternos (ColorSeed, BTF Precise Microbiology, Australia) sepuede evaluar simultáneamente la eficiencia de recuperación y elnumero de (oo)quistes presentes en ambientes acuáticos. Loscontroles positivos internos consisten de (oo)quistes inactivadospor irradiación gamma y marcados con un fluorocromo diferente alque se emplea para evaluar la presencia de (oo)quistes enambientes naturales. Una vez procesada la muestra, los(oo)quistes se cuantifican con el microscopio de fluorescenciautilizando de forma simultánea filtros específicos para cadafluorocromo, de manera de diferenciar los (oo)quistes sembradosde los recuperados del ambiente. La eficiencia de recuperación seexpresa en base al número y porcentaje de (oo)quistesrecuperados. Con este procedimiento se determinan lasinterferencias que pueden ocasionar una baja eficiencia derecuperación y se estiman con mayor precisión la presencia ynúmero de (oo)quistes en una muestra de agua (Quintero-Betancourt et al., 2003).Tabla IIMétodos alternos para la concentración y deteción deCryptosporidiumy Giardiaen ambientes acu áticos
  7. 7. Detección de ProtozoariosEntéricos en AguasLa microscopía de inmunofluorescencia es el método estándarpara la detección de Cryptosporidium y Giardia en aguas, tantopara el método 1622/1623 en los EEUU como para el ProtocoloOperacional Estándar en Australia y el Reino Unido. En estemétodo se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonalesconjugados con ITFC. Sin embargo, se ha determinado queexisten diferencias significativas en cuanto a la avidez yespecificidad de los anticuerpos disponibles comercialmente(Hoffman et al., 1999). Diversos estudios han demostrado que ladetección de Cryptosporidium y Giardia en aguas es más eficientecuando se emplean anticuerpos monoclonales de tipo IgG1, loscuales poseen mayor avidez y especificidad que los anticuerpospoliclonales u otras clases de anticuerpos monoclonales (porejemplo, IgG3 e IgM) (Ferrari et al., 1999; Weiret al., 2000;Quintero-Betancourt et al., 2003). Estas observaciones fueronconfirmadas en muestras ambientales utilizando dos clasesdiferentes de anticuerpos monoclonales (IgG1 e IgM) marcadoscon isotiocianato de fluoresceína. La aplicación del anticuerpomonoclonal IgG1 (EasyStain, BTF Precise Microbiology, Australia)produjo mucho menos fluorescencia de trasfondo y la unión delanticuerpo a los (oo)quistes fue más específica que con elanticuerpo IgM (WaterborneInc, New Orleans, EEUU). Ladistinción fue más evidente en muestras de agua que conteníanaltos niveles de microalgas y partículas minerales (Quintero-
  8. 8. Betancourt et al., 2003). La Tabla III describe los diferentesanticuerpos disponibles comercialmente para la detección deCryptosporidium y Giardia en muestras clínicas y ambientales.Tabla IIIAnticuerpos disponibles comercialmente para la deteción deCryptosporidiumy Giardiaen muestras cl ínicas y ambientalesEn Australia fue desarrollado un método para la detección yenumeración selectiva de ooquistes de Cryptosporidium que aplicacitometría de flujo con activadores fluorescentes capaces declasificar células según la fluorescencia y el tamaño (Veseyet al.,1997). Este método (Ferrari et al., 2000) mejora sustancialmente elproceso de detección, especialmente cuando se utilizananticuerpos monoclonales de tipo IgG1 conjugados con ITFC(CRY104- ITFC) y ficoeritrina (CRY104-PE). Los anticuerposmonoclonales conjugados con estos fluorocromos facilitan lavisualización de muestras ambientales bajo el microscopio, ya quese disminuye la fluorescencia inespecífica.En Francia se desarrolló un equipo automatizado (ChemScan RDI,Chemunex, France) que utiliza amplificación de luz por emisiónestimulada de radiación (Laser) capaz de localizar de maneraespecífica ooquistes de Cryptosporidium y diferenciarlos departículas y otros microorganismos inespecíficos (Rushtonet al.,2000).Para la detección de ooquistes de T. gondii y C. cayetanensis nose han desarrollado aun anticuerpos fluorescentes, sin embargolos ooquistes de ambos protozoarios son capaces de emitirfluorescencia (autofluorescencia) al ser excitados con luzultravioleta (Lindquistet al., 2003). Este procedimiento facilita lavisualización de las estructuras parasitarias bajo el microscopio defluorescencia. No obstante, el procedimiento es muy tedioso,sobre todo cuando se trata de muestras ambientales en las cualesestán presentes microalgas y materiales inertes capaces de emitirfluorescencia similar a los ooquistes. La tinción ácido-resistente,particularmente usada para el diagnóstico de Cyclospora enheces, tampoco se recomienda para la detección del ooquiste enambientes acuáticos, debido a que muchas veces no permite nisiquiera la identificación correcta de ooquistes en muestrasclínicas (Marshall et al., 1997; Mota et al., 2000).
  9. 9. La detección de quistes de E. histolytica en ambientes acuáticosresulta igualmente tediosa cuando se utilizan tinciones diseñadaspara la detección de quistes en muestras clínicas de heces, talescomo la solución de lugol (Healy y Ravdin, 1988), ya que laabundancia de microalgas de morfología y tamaño similar a losquistes dificulta la diferenciación bajo el microscopio de luz. Afinales de los años 90 se desarrolló un anticuerpo monoclonal parala detección específica de quistes de E. histolytica en muestras deheces (Walderichet al., 1998); sin embargo, este anticuerpo no seencuentra disponible comercialmente. Hasta ahora, no haytrabajos sobre la aplicabilidad de este u otros anticuerposmonoclonales para la detección de quistes de Entamoeba enmuestras ambientales. Más aun, son escasos los trabajospublicados sobre presencia de E. histolyticayotros protozoariosintestinales (Blastocystishominis, Balantidiumcoli e Isospora belli)en aguas, a pesar de haber sido demostrada su asociación conbrotes epidémicos de enfermedades gastrointestinales enhumanos (Karaniset al., 2007).ConclusiónLa aplicación de métodos de detección de protozoarios patógenosen aguas ha sido fundamental en el esclarecimiento de aspectosque son importantes para entender la transmisión de protozoosisintestinales a través de ambientes acuáticos. Los nuevos sistemasde concentración (filtración y purificación) permiten recuperarselectivamente los (oo)quistes facilitando de esta manera elmétodo subsecuente de detección. No se incluye en esta revisiónlas técnicas moleculares y cultivo celular, las cuales han permitidoidentificar modos de transmisión y fuentes de contaminación de losparásitos protozoarios intestinales Cryptosporidium y Giardia queconstituyen hoy en día junto con otros protozoarios emergentes(Cyclospora, Toxoplasma) problemas de salud pública en elmundo entero. Estos métodos y su importancia para ladeterminación de riesgos de salud pública serán cubiertos en unarevisión aparte.Aun queda por establecerse el papel del agua en la transmisión delas protozoosis intestinales causadas por E. histolytica, B.hominis,B. coli, I. belli. De allí que el potencial de transmisión de losprimeros protozoarios mencionados sea mayor en países dondelos sistemas convencionales de tratamiento de aguas parasuministro y aguas de desecho son inadecuados o inexistentes.Los parásitos unicelulares microsporidios que eran consideradosprotozoarios patógenos son incluidos actualmente dentro delphylum de los hongos, por ello no forman parte en esta revisión.No obstante su potencial de transmisión a través del ambienteacuático ha sido identificado y comprobado y por ello hoy en díase aplican los principios de los métodos de detección paraCryptosporidium y Giardia. En Venezuela y otros países deAmérica Latina son muy limitados los estudios sobre parásitosprotozoarios en ambientes acuáticos y la disponibilidad demétodos de detección de protozoarios entéricos en estosambientes proporciona la estrategia científica requerida en estos
  10. 10. países para enfrentar algunos de los desafíos que representan lospatógenos entéricos en aguas.REFERENCIAS1. Alarcón de Noya B, Noya O, Ruiz R, Colmenares C, Losada S,Contreras R, Bruces A, Certad G, Hernán A, Sierra C, Toro J,Chacón N, Cesari I (2003) Prevalencia de las parasitosisintestinales y esquistosomosis en comunidades del área centronorte de Venezuela. Bol. Malariol. SaludAmb. 43: 21-30. [ Links ]2. Anónimo (1999) Standard Operating Protocol for the Monitoringof Cryptosporidiumoocysts in Treated Water Supplies to SatisfyWater Supply (Water Quality) (Amendment) Regulations 1999, SINº 1524. [ Links ]3. Aramini JJ, Stephen C, Dubey JP, Engelstoft C, Schwantje H,Ribble CS (1999) Potential contamination of drinking water withToxoplasma gondiioocysts. Epidemiol. Infect.122: 305-315. [ Links]4. Arcay L, Bruzual E (1993) Cryptosporidium en ríos deVenezuela: encuesta epidemiológica de una población humana yfauna en convivencia. Parasitol. al Día17: 11-18. [ Links ]5. Ashbolt NJ (2004) Microbial contamination of drinking water anddisease outcomes in developing regions. Toxicology 198: 229-238[ Links ]6. Belosevic M, Guy RA, Taghi-Kilani R, Neumann NF, Gyürék LL,Liyanage LRJ, Millard PJ, Finch GR (1997) Nucleic acid stains asindicators of Cryptosporidiumparvumoocysts viability. Int JParasitol27: 787-798. [ Links ]7. Benenson MW, Takafuji ET, Lemon SM, Greenup RL, Sulzer AJ(1982) Oocyst-transmitted toxoplasmosis associated with ingestionof contaminated water. N. Eng. J.Med.307: 666-669. [ Links ]8. Betancourt WQ, Rose JB (2004) Drinking water treatmentprocesses for removal of Cryptosporidium and Giardia. Vet.Parasitol.126: 219-234. [ Links ]9. Bowie WR, King AS, Werker DH, Isaac-Renton JL, Bell A, EngSB, Marion SA (1997) Outbreak of toxoplasmosis associated withmunicipal drinking water. Lancet350: 173-177. [ Links ]10. Campbell AT, Robertson LJ, Smith HV (1992) Viability ofCryptosporidium parvumoocysts: correlation of in vitro excystationwith inclusion or exclusion of fluorogenic vital dyes. Appl. Env.Microbiol.58: 3488-3493. [ Links ]11. Carey CM, Lee H, Trevors JT (2004) Biology, persistence anddetection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidiumhominisoocyst. Water Res. 38: 818-862. [ Links ]
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