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Universidade Federal do Pampa
Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas
Trabalho de Conclusão V
RETHINKING MICROBIAL D...
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~ 5%
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1. Introdução Geral
1) dificuldade em simular ...
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1.1. - Estimativa da diversidade microbiana
1. Intr...
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1.3. Sequenciadores de nova geração
1. Introdução G...
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16S primer
A
Bacterial DNA
16S primer
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Barcode
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1.3. Crescimento do número de sequências no RPD II ...
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- Se o número de sequências não é representativo em um
ambiente, os resultados obtidos podem não ser válidos e
confiáveis;...
- Demonstrar que o nível de esforço amostral obtido em análises
de comparação de comunidades microbianas pode produzir
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2. Material e Métodos
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2. Material & Metódos
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2.1. Processamento de sequênc...
2. Material & Metódos
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2.2. Análises de Bioinformáti...
2. Material & Metódos
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2.3. Abordagens baseadas em t...
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2.2. Abordagens baseadas em t...
Comparação entre comunidades microbianas
ACP - Qualitativo ACP - Quantitativo
Análise de Coordenadas Principais (ACP)
3. Resultados
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5. Conclusão
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- Abordagens baseadas na informação fi...
5. Conclusão
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Agradecimentos:
- Ao CNPq, pela bolsa de Iniciação
Científica;
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Rethinking microbial diversity analysis in the high throughput sequencing era

  1. 1. 1 Universidade Federal do Pampa Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas Trabalho de Conclusão V RETHINKING MICROBIAL DIVERSITY ANALYSIS IN THE HIGH THROUGHPUT SEQUENCING ERA Acadêmico: Leandro Nascimento Lemos Prof. Dr. Luiz Fernando Wurdig Roesch - Orientador São Gabriel-RS 2011 L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51
  2. 2. L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51
  3. 3. ~ 5% L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 1. Introdução Geral 1) dificuldade em simular inúmeras condições ambientais em meios de cultura. 1.1. - Estimativa da diversidade microbiana a) Anomalia de Placas
  4. 4. L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 1.1. - Estimativa da diversidade microbiana 1. Introdução Geral b) Técnicas independentes de cultivo de micro-organismos
  5. 5. L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 1.3. Sequenciadores de nova geração 1. Introdução Geral … ACGTGACTGAGGCTAG CTAGACTACTT TATATATATACGTCGT C ACTGATGACTAGATTA ACTGATTTAGATACCT TGATTTTAAAAAAATA Primeira Geração Segunda Geração Terceira Geração
  6. 6. L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 16S primer A Bacterial DNA 16S primer B Barcode primer B Barcodes 16S rRNA primer Sample A Barcode 1 Sample B Barcode 2 Sample C Barcode 3 Sample D Barcode 4 Sample A Sample B Sample C Sample D ModifiedfromHoffmannetal.(2007)Nucl.Acid.Res.
  7. 7. L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 1.3. Crescimento do número de sequências no RPD II e SILVA 1. Introdução Geral -> Maior crescimento a partir de 2007 (Roesch et al., 2007).
  8. 8. L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 http://biology.uoregon.edu/people/BOHANNAN/pics/Microbes.jpg Grande diversidade a) O solo apresenta a maior diversidade microbiana do ambiente terrestre. O número de sequências é de fundamental importância para obtenção de resultados confiáveis.
  9. 9. - Se o número de sequências não é representativo em um ambiente, os resultados obtidos podem não ser válidos e confiáveis; - O número de sequências necessários em cada tipo de abordagem pode variar de acordo com o teste aplicado e a diversidade de cada ambiente. Hipótese: L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51
  10. 10. - Demonstrar que o nível de esforço amostral obtido em análises de comparação de comunidades microbianas pode produzir resultados distintos; - Determinar quais os tipos de análises e inferências mais eficientes quando temos disponível um número pequeno ou grande de sequências obtidos por plataformas de sequenciadores de nova geração. Objetivos: L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51
  11. 11. 2. Material e Métodos L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 5
  12. 12. 2. Material & Metódos L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 2.1. Processamento de sequências, simulação de comunidades microbianas e análises de Bioinformática Eliminação de sequências de baixa qualidade trim.pl Simulação de comunidades microbianas hipotéticas r_s_q.pl 500 500 500 500100 500 1000 5000 10000 20000
  13. 13. 2. Material & Metódos L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 2.2. Análises de Bioinformática
  14. 14. 2. Material & Metódos L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 2.3. Abordagens baseadas em táxons (taxon-based approaches) Alinhamento de sequências (Algoritmo de Needleman-Wunsch) Greengenes Mothur Agrupamento de sequências para formação de Unidades Taxonômicas Operacionais 3 e 20% de dissimilaridade Mothur campo1 campo2 campo3 UTO1 4 8 19 UTO2 2 2 1 UTO3 0 1 34
  15. 15. 2. Material & Metódos L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 2.2. Abordagens baseadas em testes de hipóteses ( hypothesis testing approaches) Agrupamento de sequências CD-HIT Construção de uma árvore filogenética MUSCLE Comparação de comunidades microbianas UNIFRAC
  16. 16. Comparação entre comunidades microbianas ACP - Qualitativo ACP - Quantitativo Análise de Coordenadas Principais (ACP)
  17. 17. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) Análise de Cobertura = representatividade
  18. 18. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?)
  19. 19. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) Florida - 5%; Antártica - 15%; Mauna Ulu - 9.3%; Pu'u Puai bare - 12.4%; – Era esperado um número maior de sequências compartilhadas; – Mesmo conjunto de dados. a) indivíduos únicos ou compartilhados;
  20. 20. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) Florida - 48%; Mauna Ulu - 59%; Pu'u Puai bare - 47%;
  21. 21. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) – ---> Amostras com uma baixa cobertura não apresentam resultados confiáveis ao ser aplicado Diagramas de Venn; – ---> É necessário uma alta cobertura (> 90%);
  22. 22. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) ---> Aumento da diversidade com o aumento do número de sequências em uma amostra; a) Índices de diversidade = comparação e caracterização de comunidades microbianas
  23. 23. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?)
  24. 24. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) ---> Sem mudanças significativas.
  25. 25. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) ---> Sem mudanças significativas.
  26. 26. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) ---> Sem mudanças significativas.
  27. 27. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) b) Estimador de riqueza = Chao1
  28. 28. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.1. Abordagens baseada em táxons (Quantas sequências são necessárias?) – ---> Chao1 não apresenta resultados confiáveis quando aplicado numa base de dados com um pequeno número de sequências.
  29. 29. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.2. Abordagens filogenéticas (Quando devem ser usadas?) – a) amostras aleatórias com a mesma intensidade amostral (4 – amostras de 500 sequências para cada ambiente); – b) amostras aleatórias com o aumento da intensidade amostras (100, 500, 1.000, 5.000, 10.000 e 20.000) – c) amostras aleatórias com o aumento da intensidade amostral (100, 500 e 20.000) para comparação de três ambientes.
  30. 30. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.2. Abordagens filogenéticas (Quando devem ser usadas?)
  31. 31. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.2. Abordagens filogenéticas (Quando devem ser usadas?) – ---> (A) - 10.000 sequências são necessárias para formação de agrupamento; – ---> (B) - Formação de agrupamentos a partir de 500 sequências.
  32. 32. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.2. Abordagens filogenéticas (Quando devem ser usadas?) – ---> (A) e (B): sem formação de agrupamentos.
  33. 33. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.2. Abordagens filogenéticas (Quando devem ser usadas?) – ---> Limitação: as amostras poderiam ser muito similares, devido a uma mesma origem de base de dados; – – ---> Qual o nível de cobertura para comparar comunidades microbianas de ambientes distintos?
  34. 34. 3. Resultados L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 3.2. Abordagens filogenéticas (Quando devem ser usadas?) – (A) e (B) baixa cobertura = ambientes distintos (escala continental)
  35. 35. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Cobertura; b) Ambiente a ser analisado.
  36. 36. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Cobertura; Com base nos resultados de cobertura (51 - 81%) era esperado que o número de Unidades Taxonômicas Operacionais entre as amostras fosse relativamente alto. É necessário ter uma cobertura (> 90%) para a aplicação dos Diagramas de Venn
  37. 37. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Cobertura; – Um grande porcentagem de espécies estão presentes em um número pequeno.
  38. 38. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Normalização do número de sequências;
  39. 39. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Normalização do número de sequências;
  40. 40. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Chao1 = apenas com intensidade amostral alta
  41. 41. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Chao1 = apenas com intensidade amostral alta
  42. 42. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? a) Baixa cobertura e abordagens filogenéticas
  43. 43. 4. Discussão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 Realmente precisamos de milhares de sequências para avaliar a diversidade microbiana? b) Ambientes similares I) ACP - quantitativo = 500 sequências II) ACP = qualitativo = 10.000 sequências
  44. 44. 5. Conclusão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51 - Abordagens baseadas na informação filogenética são de extrema importância para a comparação de comunidades microbianas do solo com alta ou baixa cobertura; - Abordagens baseadas em Unidades Taxonômicas Operacionais são úteis para detectar mudanças em UTOs específicas, mas é necessário uma alta cobertura.
  45. 45. 5. Conclusão L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51
  46. 46. 46 Agradecimentos: - Ao CNPq, pela bolsa de Iniciação Científica;
  47. 47. 47 Universidade Federal do Pampa Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas Trabalho de Conclusão V RETHINKING MICROBIAL DIVERSITY ANALYSIS IN THE HIGH THROUGHPUT SEQUENCING ERA Acadêmico: Leandro Nascimento Lemos Prof. Dr. Luiz Fernando Wurdig Roesch - Orientador São Gabriel-RS 2011 L.N. Lemos et al. / Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 42–51
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