1. Molecular analysis of microbiota
associated with peri-implant
diseases
Afya Sahib Diab Al-Radha, Abhi Pal b, Andre Philip
Pettemerides c, Howard F. Jenkinson
Por: Laura Segura Muñoz
Biología Molecular
Medicina 3er semestre
UPB

2. INTRODUCTION
In this article, you will reach the
correct diagnosis of the bacteria
that cause diseases of peri-
implant. There are two major
diseases: peri-implant and peri-
implantitis mucosis, the latter
causing bone loss caused by
stress and / or bacteria.

3. INTRODUCTION
Studies will be used primarily for PCR and DGGE, which help
determine the type of bacteria staying there (differentiated
as the genetic material and its molecular weight), and
further, the more bacteria associated with the disease, to
offer patients this a more specific diagnosis.

4. PERI-IMPLANTE
A las personas con perdida dental
se les ofrece una alternativa de
implante. La mucosa alrededor del
sitio del implante se conoce como
Peri-implante, en la cual se puede
dar crecimiento bacteriano por
falta de higiene principalmente y
también por la profundidad del
sitio de implante.

5. MICROBIOTA
La microbiota hace referencia a la flora
bacteriana normal que tenemos en las
diferentes partes del cuerpo, en especial
las zonas húmedas.
La microbiota tiene una relación
simbiótica con el hospedero,
antagonismo microbiano
(Lactobacilos).
Es de las mas complejas y
heterogéneas.
Puede verse alterada con la llegada de
bacterias oportunistas, causando
biofilm.

6. PCR
Método para amplificar una secuencia de DNA para
poder estudiarla posteriormente, se realiza antes de
la DGGE.

7. DGGE
Electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente
Es un método de rastreo molecular, por el cual se
desnaturaliza en DNA, pasando de una doble cadena a una
sencilla por método químico.
El punto de desnaturalización aumentará con el tamaño de la
secuencia de nucleótidos y por los nucleótidos de la
secuencia (suele ser altos en G y C).

8. DGGE
Electroforesis en gel desnaturalizante en
gradiente
Es en gradiente para que se de la desnaturalización de
todos los fragmentos, aun los que tienen energía de
Gibbs mas negativa.
Cada banda representa diferentes especies microbianas,
ya que actúa como un cebador identificando los rRNA 16S
bacterianos pudiéndolos diferenciar uno a uno.

9. RELACIÓN
La microbiota oral se puede ver afectada por el ingreso de
bacterias en el área de peri-implante, dichas bacterias pueden
causar estrés en exceso hasta producir perdida ósea. Por tal
motivo se pide exámenes de PCR y DGGE, para identificar cada
una de las bacterias involucradas, para poder ofrecer un mejor
tratamiento y detectar a tiempo y posible daño a nivel óseo.

10. GENERAL OBJETIVE
The aim of this study was to identify bacteria associated
with peri-implant diseases using Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE) as a method for microbio- logical
assessment.

11. MATERIALES Y METODOS
MUESTREO:
Todos los 22 sujetos dieron su
consentimiento informado, con la
aprobación del Comité de Ética (FCE)
de la Facultad de Medicina y
Odontología de la Universidad de
Bristol
Ninguno de los sujetos que
participaron en el estudio habían
recibido tratamiento para la
enfermedad peri-implante.

12. MATERIALES Y METODOS
Ninguno de los sujetos tenía una condición médica que
requiere el uso de antibióticos locales, antibióticos
sistémicos o fármacos anti-inflamatorios, o de agentes anti-
microbianos, dentro de los últimos 3 meses.
Malestar y / o con enfermedad infecciosa en el momento del
muestreo, el embarazo o la lactancia se consideraron como
criterios de exclusión de la investigación.

13. MATERIALES Y METODOS
TOMA DE MUESTRA
El sitio de implante fue aislado utilizando rollos de algodón para
evitar la contaminación con saliva. Entonces, la placa supragingival
se eliminó, y la placa se obtuvo de la parte más profunda del surco
implantes utilizando una cureta estéril.

14. MATERIALES Y METODOS
EXTRACCION DEL DNA:
1. Las muestras se descongelaron y se mezclaron en vortex
antes de ser centrifugados.
2. Se eliminó el sobrenadante y el ADN extraído a partir de
precipitado en suspensión usando GenElute bacteriana de
ADN genómico Kit (Sigma-Aldrich) según las instrucciones
del fabricante.

15. MATERIALES Y METODOS
PCR PARA EL DGGE:
Amplificación del DNA por la
PCR usando los diferentes
componentes y usando agua
pura para el marcador
negativo.

16. MATERIALES Y METODOS
DGGE
Luego de la PCR, los fragmentos se
somenten a DGGE, para indentificar cada
uno de los microorganismos presentes en la
muestra.
Los cebadores abrazadera GC fueron
confirmados en el apoyo de la amplificación
por PCR de 16S rDNA, productos a partir de
DNA extraído de una variedad de
patógenos periodontales, incluyendo
Treponema denticola y forsythia Tannerella.

17. MATERIALES Y METODOS
SECUENCIA DE LOS PRODUCTOS
DGGE
Las bandas fueron extirpadas y
luego estraidas del gel para
rectificar la prueva usando de
nuevo la PCR utilizando los mismos
cebadores de DGGE.
99% de identidad se utilizó como
punto de corte para la
identificación positiva de una
especie bacteriana. El número
promedio de pares de bases (pb)
utilizados para el análisis de la
secuenciación fue de 116 pb.

18. MATERIALES Y METODOS
ESPECIES PCR ESPECIFICA
Se realizó usando cebadores específicos de especie dirigidos a
regiones específicas en Aa, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, o Staphylococcus aureus. Los productos de PCR se
separaron a través de agarosa al 1,5%, se tiñeron. Por lo menos dos
bandas independientes obtenidos para cada PCR específica de la
especie se cortaron de los geles y se secuenció para confirmar las
especies auténticos.

19. RESULTADOS
El porcentaje global de éxito secuencias obtenidas fue del
68,2%, que van del 43% al 100% por tema, y ​aproximadamente
26 especies fueron identificadas.
Los porcentajes de las diferentes especies bacterianas se
muestra en la figura. 1, en esta figura la presencia de más de
una cepa bacteriana de la misma especie en una muestra se
registró como una sola incidencia.

20. RESULTADOS

21. RESULTADOS
Figura 1: Estos resultados sugieren que
Fusobacterium spp., Prevotella spp., Y
Porphyromonas spp., Contribuyeron a las
bacterias más frecuentemente
identificados utilizando 16S rDNA y DGGE.

22. RESULTADOS

23. RESULTADOS
figura. 2. Estos datos muestran
diferencias en las especies en una
base de paciente específico. De un
total de 252 bandas, 36 (14,2%) fueron
identificados como Fusobacterium
spp., El 11,4% Prevotella spp. y el 5,9%
Porphyromonas spp.
Más de la mitad de las bandas de
bacterias pertenecían a la altamente
patógena (rojo) y patógenos
(naranja).

24. RESULTADOS

25. RESULTADOS
Figura 3: Correlaciones de bacterias diferentes con
profundidad de la bolsa (PD), mostró el porcentaje más alto
de patógenos (rojo y naranja grupo) bacterias (82%) en los
bolsillos más superficiales (<3 mm). Disminuyo con la
profundidad de la bolsa en aumento (51%), pero aumentó de
nuevo (63%) para los bolsillos más llenos.
Otro factor notable fue la relación positiva entre los
porcentajes de bacterias altamente patógenas (rojo grupo)
con profundidad de la bolsa.

26. RESULTADOS

27. RESULTADOS
Figura 4: relación con el índice gingival (GI), donde el
porcentaje de bacterias del grupo rojo aumentó con
mayor puntuación GI. Porcentaje de naranja bacterias
del grupo disminuyó con la mayor puntuación de GI.

28. RESULTADOS

29. RESULTADOS

30. DISCUSSION
Scientific Theory Result
25. Quirynen M. et al. In successful dental implants, No, because Streptococcus is the largest,
plaque is mainly composed of is present but not in the highest quantities
26. Romeo E. Et al. Gram-positive cocci e.g.
Streptococcus.25,26
6. Mombelli A. The more pencentage of Yes, he results presented here suggested
pathogenic bacteria are red that the percentage of pathogenic
and orange groups. bacteria (red and orange groups) in
infected implants was about 40% of the
analysed bands.
35. Leonhardt A However, implant success rates Yes, because If the patiene maintains a
can be increased to 95% if the good oral hygiene level, the pathogenics
patient maintains a good oral bacterias are no reproduced.
hygiene level.
36. Leonhardt A Staphylococci, enteric species, Yes, the staphylococci stay in a results.
and yeasts have also been
found in failing implant
microbiota.

31. CONCLUSIONS
1. The use of PCR with DGGE,
gives us a clear diagnosis of the
type of bacteria accumulate in
the peri-implant region.
2. Is necessary to know what are
the bacteria involved in order to
give a more specific treatment
and more effective.

32. CONCLUSIONS
3. Hygiene plays a fundamental
role in implant patients and to
help prevent bacterial
proliferation.
4. The bacterial flora microbiota
is specific to each person in
humid areas, in this case the
mouth, when the entry of other
bacterial diseases causing
altered microbiota in peri-
implant region.

33. MAPA CmapTools

34. GRACIAS!!