MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS (Cromatografia de papel, Cromatografia de camada delgada, Cromatografia de coluna, Cromatografia gasosa, Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC)
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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Cromatografia de papel,
Cromatografia de camada delgada,
Cromatografia de coluna,
Cromatografia gasosa,
Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC)

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS (Cromatografia de papel, Cromatografia de camada delgada, Cromatografia de coluna, Cromatografia gasosa, Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC) MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS (Cromatografia de papel, Cromatografia de camada delgada, Cromatografia de coluna, Cromatografia gasosa, Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC) Presentation Transcript

  • Universidade Federal do Pará Instituto de Ciências da Saúde Faculdade de Farmácia Química Farmacêutica Experimental II Amanda de Almeida Cíntia Quaresma Eunice Oliveira Juliana Hernandez Tammy Reymão Thiago Paixão
  • Introdução Cromatografia: É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes em duas fases. Uma das fases permanece estacionária, enquanto outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fase de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais desses compostos. Thiago
  • Introdução Cromatografia: Chrom = cor + graphe = escrever O processo não é totalmente dependente da cor, mas em alguns casos pode basear a identificação dos constituintes separados. Separação Identificação Quantificação Thiago
  • Introdução Cromatografia – Breve Histórico O botânico russo Mikhael Tswett em 1906 utilizou o termo cromatografia pela primeira vez, para descrever a separação de um extrato vegetal, utilizando colunas de vidro recheadas com partículas sólidas, arrastando os componentes com éter de petróleo. A época moderna da cromatografia iniciou em 1930, quando Kuhn e Lederer, aperfeiçoaram as experiências do botânico russo, separando e identificando as xantófitas da gema do ovo, usando coluna preenchida com carbonato de cálcio pulverizado com fase estacionária e éter de petróleo com fase móvel. Thiago
  • Introdução Cromatografia – Breve Histórico 1938 – Izmailov e Schraiber reintroduziram a CCD em análises de produtos farmacêuticos, contudo permaneceu subutilizada, até o desenvolvimento do método de aderir sólido ao suporte, atribuido a Kirchner, e do método de preparar placas, descrito por Stahl. 1941 - Martin e Synge desenvolveram a cromatografia por partição (líquido-líquido), que fundamentou o surgimento da CLAE e CG. Eles receberam em 1962 prêmio Nobel de química pelo método desenvolvido. 1941 – Hesse e colaboradores desenvolveram a cromatografia gássólido, a partir da separação de dois ácidos graxos sob valor de 100 °C, arrastando sobre a sílica com dióxido de carbono. Thiago
  • Introdução Cromatografia – Breve Histórico 1952- Martin e James descreveram a cromatografia gás líquido; 1954 – Ray desenvolve o detector por condutividade térmica; 1958 – Pretorius e colaborares, juntamente com McWilliams e Dewar, desenvolveram o detector de ionização em chama; 1958 – Golay introdiziu as colunas capilares em análises por cromatografia de alta eficiência; “Estes avanços ampliaram o poder analítico da cromatografia, tornando-a o método analítico de separação e determinação mais usado do mundo” Thiago
  • Introdução Classificações da Cromatografia: 1. Quanto a forma física: 1.1. Fase estacionária depositada em uma superfície planar 1.2.1 Cromatografia planar 1.2. Fase estacionária depositada em um tubo cilíndrico 1.1.1. Cromatografia em coluna Tipos Tamanho Preparativa 6-50 mm Analíticas 2-6 mm Microdiâmetro 1-2 mm Capilares < 1 mm Thiago
  • Introdução Classificações da Cromatografia: 2. Quanto a fase móvel: 2.1. Gás inerte: cromatografia gasosa 2.2. Líquido: cromatografia líquida 2.3. Vapor pressurizado: cromatografia supercrítica 2.2.1. Cromatográfica líquida em coluna  Clássica: em colunas de vidro, onde a fase móvel e deslocada sobre a fase estacionaria pela força da gravidade;  Alta eficiência: em colunas metálicas, onde a fase móvel é deslocada por pressões elevadas, obtidas com auxilio de uma bomba de alta pressão. Thiago
  • Introdução Classificações da Cromatografia: 3. Quanto a polaridade das fases: 3.1. Cromatografia gasosa: fase móvel inerte, separação ocorre devido às interações das molécula da amostra com a fase estacionária; 3.2. Cromatografia líquida (planar e coluna); 3.2.1. Cromatografia de fase normal: fase estacionária é mais polar do que a fase móvel 3.2.2. Cromatografia de fase reversa: fase móvel é mais polar do que a fase estacionária. Thiago
  • Introdução Mecanismo de interação: Adsorção: CDD, CGS, CLS, CSS Interação entre o sólido e fase móvel, devido a presença de grupos ativos em sua superfície. A dessorção do soluto ocorre por volatilidade (CG) ou solubilidade na fase móvel (CL ou CSS) Thiago
  • Introdução Mecanismo de interação: Absorção: CP, CGL, CLL Fase estacionária é um líquido ocorre por absorção ou partição e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componente da amostra na fase estacionária. A volta dos componentes a fase móvel depende de sua volatilidade (fase móvel gasosa) ou de sua solubilidade (fase móvel líquida) Thiago
  • Introdução Mecanismo de interação: Troca iônica: A fase estacionária é constituída por um suporte onde são adicionados grupos ionizáveis: Grupos carregados positivamente, retendo ânions e grupos carregados negativamente retendo cátion. A fase móvel é uma solução iônica com propriedades tamponantes compatível. Thiago
  • Introdução Mecanismo de interação: Bioafinidade: Grupos com especificidade biológica, quimicamente ligados ao suporte. Podem ser antígenos, substratos ou lectinas, que retiram da fase móvel somente os componente complementares, os anticorpos, enzimas ou açúcares, respectivamente. Thiago
  • Introdução Mecanismo de interação: Exclusão: Thiago
  • Cintia
  • Cromatografia de Papel  Técnica simples;  Pequena  Boa quantidade de amostra; capacidade de resolução,  Separação e identificação de compostos polares, como antibióticos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons metálicos. Cintia
  • Cromatografia de Papel É classificada como de partição líquido-líquido; Separação e distribuição depende da solubilidade; Geralmente água é utilizada como fase móvel e papel (celulose) como fase estacionária. Cintia
  • Cromatografia de Papel  A forma mais simples de CP é a cromatografia ascendente (por capilaridade). Cintia
  • Cromatografia de Papel Cintia
  • Cromatografia de Papel Mistura de componentes coloridos; Misturas incolores. Cintia
  • Cromatografia de Papel  Procedimento Cintia
  • Cromatografia de Papel  A análise qualitativa de uma substância realizase através da cor da mancha e de seu fator de retardamento, Rf, determinado através da expressão: Rf = da/ds Rf= fator de retenção; da= distância (cm, mm) percorrida pela substância; ds= distância (cm, mm) percorrida pela fase móvel. Cintia
  • Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Histórico  1889, Beyerinck - sólidos em camada delgada sobre vidro;   1938, Izmailov e Schraiber - análise de produtos farmacêuticos; 1956, Stahl – preparação de placas com reprodutibilidade. Definição: Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura através da distribuição destes entre duas fases (móvel e estacionária). Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD   Fase estacionária sólida e fase móvel líquida; A fase estacionária é constituída de sílica G (fase normal) ou sílica C18 (fase reversa); Fase Normal: polaridade da FE > FM Fase Reversa: polaridade da FE< FM  Tammy A fase móvel é constituída de solventes polares, apolares ou mistura de ambos (ex: água, etanol, metanol, clorofórmio, diclorometano, hexano, etc.)
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD  As placas utilizadas podem ser de folha de alumínio (manufaturadas na indústria) ou de vidro (preparadas no próprio laboratório); Vantagens: • Uniformes e homogêneas; • Promovem melhor separação dos componentes.  Vantagens: • Baixo custo; • Fácil preparo. É necessário ativá-las em estufa antes da aplicação, afim de remover água e interferentes. Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Como ocorre:  Durante a corrida, os componentes da mistura são distribuídos entre a FM e a FE e cada um deles é retido seletivamente pela FE, conforme a velocidade com que passam pela mesma. Isso resulta em alturas diferentes para cada componente.  A cuba deve estar saturada com vapores da fase móvel, para que ocorra boa migração dos componentes da mistura. Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Fator de retenção (Rf):  Partindo do princípio de que um composto percorre sempre a mesma distância em relação a frente do solvente, o fator de retenção é a razão entre estes deslocamentos.  É utilizado para auxiliar a identificação de substâncias, comparando o Rf obtido com o Rf padrão. Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Revelação do cromatograma: É necessário proceder esta etapa quando os componentes migrados são incolores. Para tal, utiliza-se alguns reagentes para torná-los visíveis.  Podem ser biológicos. Físicos: Luz UV utilizados reveladores Químicos: Dragendorff (alcalóides) NP-PEG (flavonóides) FeCL3 (comp fenólicos) Rev. Universal (vapor de iodo) físicos, químicos ou Biológicos: Enzimas, Antibióticos e Substratos. Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Exemplos: Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Aplicações:  Estudos preliminares orgânico; dos componentes de um extrato  Investigação de casos de envenenamento e ingestão de estimulantes por atletas;  Estudos de reações químicas intermediários estáveis;  Análise  Análise quanto à presença de da pureza de compostos; da eficiência cristalização. de processos de destilação e Tammy
  • Cromatografia em Camada Delgada -CCD Vantagens:  Fácil execução;  Rapidez;  Menor trajeto da fase móvel ;  Baixo custo;  Versatilidade. Desvantagens:  Difícil reprodutibilidade;  Difícil determinação precisa do Rf. Tammy
  • Eunice
  • Cromatografia em coluna • Citada como o mais antigo procedimento cromatográfico • Utilizada para Isolamento de produtos naturais • Purificação de produtos de reações químicas • Fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas.
  • Cromatografia líquida clássica • Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, de diâmetros variados; • possuem uma torneira em sua extremidade inferior. • Esses cilindros são preenchidos por um adsorvente • colocado na coluna diretamente ou suspendido em um solvente adequado.
  • Adsorventes mais utilizados Sílica e alumina Suporte para fase estacionária líquida Líquida: separação por adsorção Sólida: separação por partição
  • Cromatografia em Coluna • A fase estacionária é mantida em um tubo estreito e a fase móvel, forçada através do tubo sob pressão ou por gravidade. • A substância a ser separada ou analisada é colocada na coluna parte superior e o eluente é vertido após. • A adição de sílica deve ser feita com a torneira semiaberta. • O adsorvente é adicionado lentamente à coluna fixada na posição vertical de modo a se obter uma compactação uniforme.
  • Cromatografia de Coluna • A velocidade na qual um composto passa pela coluna depende da polaridade da fase estacionária • solvente utilizado como eluente. • Se o composto é mais atraído pela fase estacionária do que pelo solvente, ele migrará mais lentamente da coluna. • composto tiver maior afinidade pelo solvente ele migrará mais rapidamente da coluna
  • O êxito da cromatografia de coluna • solvente adequado • É possível visualizar a separação dos componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna • Através da luz ultravioleta • necessário o acompanhamento da separação dos componentes pela técnica de cromatografia em coluna delgada (CCD).
  • Amanda
  • Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG? Para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver pelo menos parcialmente nesse gás. Misturas cujos volumes sejam voláteis e termicamente estável. Amanda
  • Cromatografia Gasosa Cromatógrafo a gás Amanda
  • Cromatografia Gasosa Instrumentação Gás de arraste Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra apenas a carrega através da coluna. Requisitos: INERTE - Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO - Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos:  H2O, DCE) O2 (oxida / hidrolisa algumas FE; incompatíveis com  Hidrocarbonetos (ruído no sinal de DIC) Amanda
  • Cromatografia Gasosa Instrumentação Injetores  Parte do cromatógrafo a gás onde a amostra é introduzida ― Vaporiza amostra (solvente + compostos alvo) ― Mistura vapor com fase móvel (gás de arraste) ― Transfere vapor para dentro da coluna  Dispositivos de Injeção ― Injetores para colunas empacotadas ― Injetores capilares ― Válvulas de amostragem de gás Amanda
  • Cromatografia Gasosa Instrumentação Injetores 1. Septo (silicone) 2. Alimentação de gás de arraste 3. Bloco metálico aquecido 4. Ponta da coluna cromatográfica Amanda
  • Cromatografia Gasosa Colunas: Definições básicas A coluna é a essência do sistema cromatográfico, pois é nela que ocorrerá a separação dos componentes da amostra.  Fase estacionária (suporte sólido e fase líquida)  Tubo (material, comprimento e diâmetro)  Colunas empacotadas e capilares Amanda
  • Cromatografia Gasosa Colunas: Definições básicas Amanda
  • Cromatografia Gasosa Colunas: Definições básicas Vantagens Desvantagens • Mais econômica • Se o material de enchimento não for colocado na coluna de forma compacta e uniforme, os espaços vazios resultantes funcionarão como câmaras de diluição da amostra. Empacotadas • Maior capacidade de carga • Maior quantidade de amostra • Menor eficiência • Análise mais lenta Capilares • Maior comprimento => maior eficiência • Capacidade de processamento da amostra inferior. Satura • Separação de misturas complexas rapidamente. • Análise mais rápida • Menor quantidade de amostra • Maior separação Amanda
  • Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Analises isotérmicas  Amostras com PE elevado não eluem  Primeiros picos: agudos, pouco resolvidos  Posteriores: baixos, largos, muito resolvidos Amanda
  • Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Analises com Programação de Temperatura  Determinação das condições de analise, inclusive isotérmicas  Tempo de analise reduzido  Limite de detecção e precisão da medida do pico são melhorados  Velocidade de injeção não precisa ser tão rápida  Transformações químicas dos componentes instáveis são minimizadas Amanda
  • Cromatografia Gasosa Principais detectores utilizados em CG 1. Detector de condutividade térmica (TCD): universal Medida baseada na condutividade térmica de um filamento de W ― Não é destrutivo ― Não compatível com gases oxidantes ― Menos sensível ― Importante para substâncias que não geram sinal em outros detectores, como CO2 Amanda
  • Cromatografia Gasosa Principais detectores utilizados em CG 2. Detector por ionização em chama (FID): seletivo – universal Medida baseada na variação de uma corrente devido à influência de íons e elétrons formados numa chama de H2/ar ― Destrutivo ― Resposta apenas a compostos orgânicos Amanda
  • Cromatografia Gasosa Principais detectores utilizados em CG 3. Detector de captura eletrônica (ECD): seletivo ― Não destrutivo ― Medida baseada na variação de uma corrente de “elétrons lentos” devido à afinidade dos organohalogenados por elétrons. Provenientes da interação de uma fonte radioativa com o gás carregador (3H ou 63Ni) Elétrons são capturados pelos sítios halogenados - APLICAÇÃO IMPORTANTE: determinação de resíduos de pesticidas Amanda
  • Cromatografia Gasosa Análise Qualitativa Identificação individual das espécies contidas na amostra Aplicações qualitativas Determinação da identidade da amostra propriamente dita Fontes de Informações Qualitativas  Retenção – uso de dados de retenção para sua identificação  Detecção – detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluidas. Amanda
  • Cromatografia Gasosa CG: Considerações CG - TÉCNICA RELATIVAMENTE SIMPLES MAS: • Exige escolha cuidadosa da configuração instrumental (injetor, coluna, detector); • Condições instrumentais devem ser otimizadas (vazão do gás, temperatura, ...). USANDO DETECTORES NÃO DESTRUTIVOS: • O eluato ainda pode ser reanalisado • acopla-se à saída do detector um outro instrumento • Ex: GC-MS (Espectrômetro de massas como “detector”) • Medida baseada na razão massa-carga das substâncias que saem da coluna → confirmação de resultados e aumento da sensibilidade. Amanda
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) O que é? É uma técnica utilizada para separar e determinar espécies em uma grande variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. Como funciona? É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel (solvente) que é eluída sobre altas pressões. “Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, com alta resolução, eficiência e sensibilidade”. Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Química Forense (metabólitos de drogas) Bioquímica (proteínas, aminoácidos, esteroides) Ciências ambientais Alimentos (corantes artificiais, aflatoxicinas, aditivos, antioxidantes) Farmacologia (fármacos) Toxicologia (pesticidas) Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Mecanismo Juliana Requer somente que a amostra seja solúvel na F.M. F.E. é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel por alta pressão.
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Esquema do CLAE FASE MÓVEL F.E Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Coluna (Fase estacionária) -Aço inoxidável 316 tratado; -O comprimento das colunas variam de 10-30 cm; -Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitável; portanto, até centenas de separações individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Colunas curtas e com paredes espessas a fim de evitar deformidades com a alta P F. E. (poder de retenção): sílica > amino > diol > ciano Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Coluna (Fase estacionária) Classificação pela polaridade: Cromatografia em FASE NORMAL: Cromatografia em FASE REVERSA: A fase estacionária é muito polar. A fase estacionária é de baixa polaridade Sílica gel Sílica ligada a C18 Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Cromatografia em FASE NORMAL: Polaridade Juliana
  • Juliana Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Pré-coluna (Guard column) Instalada entre o injetor e a coluna; (Devem ser substituídas regularmente) Função: -Remover partículas; -Remover substâncias que teriam forte interação com a coluna; -Remover substâncias que possam precipitar quando em contato com a F.M. e F.E.; De forma geral, AUMENTAM A VIDA ÚTIL DAS COLUNAS.
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Cuidados com a coluna (F.E.)  Manter a coluna sempre tampada; Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos;  Usar pré-coluna (guard column);  Usar solventes ultrafiltrados;  Pré-tratamento das amostras deve considerar eliminação de partículas e impurezas que possam ser adsorvidos;  Obedecer faixa de pH em que a F.E. é estável;  Eliminar sais, tampões e aditivos de F.M. antes de armazenar a coluna. Juliana
  • Juliana Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Bombas de alta pressão Permitem vencer a resistência à passagem da F.M. exercida pelas partículas da F.E. ‐ Função: proporcionar fluxo constante e reprodutível de F.M. a todo o sistema. CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS: ‐ Fluxo precisos e exatos, vazão contínua e livre de pulsações; ‐ Resposta rápida a alterações no fluxo e composição da F.M. ‐ Pressão máxima: 700 atm (6.000 psi - libras/polegadas quadradas) ‐ Maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio, peek, teflon ‐ Inércia química a solventes comuns, resistência a corrosão; ‐ manutenção simples.
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Solventes (Fase móvel) Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)  Eluição Isocrática: Mesma composição de fase móvel durante a eluição. Único solvente na F.M. Ex: Metanol/água 80:20 (v/v) Gradiente: Composição da fase móvel varia durante a eluição. É uma mistura de solventes ou a mudança de solvente com o tempo. Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes funções químicas ou na padronização. Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Sistemas de Introdução de Amostras (INJETORES) O método mais empregado de introdução da amostra em cromatografia líquida é baseado em um sistema com alça de amostragem. Frequentemente as alças intercambiáveis estão disponíveis para permitir a escolha do volume da amostra de 5 a 500 µL. válvula de 6 pórticos (orifícios) Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Detectores Função do detector: identificar a presença de substâncias de interesse que estejam eluindo da coluna cromatográfica, proporcionando uma identificação e quantificação continua dos componentes da amostra. Característica desejáveis: O detector deve ser pequeno e compatível com a vazão de líquido. O detector a ser empregado vai depender da natureza da amostra. Juliana - alta sensibilidade e baixo limite de detecção - ampla faixa de linearidade - confiável e reprodutível -fácil de operar e manter -informação qualitativa e quantitativa -não destruição do soluto -insensibilidade a mudanças na FM e de T - resposta rápida e cte a alterações das [ ] dos solutos -baixo nível de ruído
  • Juliana Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Tipos de detectores -Detectores baseados na absorção de luz UV/VIS (mais amplamente empregados - radiação ultravioleta (190 - 400 nm) ou visível (400 - 800 nm); -Detector no UV/VIS com arranjo de fotodiodos (DAD) (a bsorbância de uma amostra pode ser determinada em todos os λ de modo Simultâneo) -Detectores baseados na fluorescência (> sensibilidade UV ) -Detectores baseados no espalhamento da luz -Detectores baseados no índice de refração -Detectores eletroquímicos (+utilizado para fluídos corpóreos e produtos naturais) -Espectrômetro de massas (HPLC‐MS/MS)
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Tipos de CLAE  Cromatografia de alta eficiência por partição (a fase estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel) Cromatografia líquida com fase ligada Retido por meio de ligações químicas Cromatografia líquido-líquido O líquido é imobilizado por adsorção física  Cromatografia de alta eficiência por adsorção A fase estacionária, nesse caso, é a superfície de um sólido polar finamente dividido. Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Tipos de CLAE Cromatografia por troca iônica Cromatografia por exclusão e por tamanho Cromatografia por afinidade Cromatografia quiral Juliana
  • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Vantagens x Desvantagens F.E. é utilizada várias vezes Alto Custo do equipamento Versatilidade Alto custo de manutenção do Tempo reduzido de análise equipamento Alta resolução Necessita de experiência do Análise qualitativa operador Resultados quantitativos Detectabilidade Automação Juliana