Este documento describe los aptámeros, que son oligonucleótidos de ADN o ARN que se unen a blancos moleculares con alta afinidad y especificidad. Los aptámeros se generan mediante un proceso llamado SELEX y se han utilizado para una variedad de aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Aunque los aptámeros tienen algunas limitaciones como su corta vida media, existen estrategias para mejorar su estabilidad y potencial terapéutico.

1. Aptámeros
Juan David Ospina Villa
M en C en Biomedicina Molecular
juando12358@gmail.com

2. Grandes problemas de la
humanidad

3. Challenges of Antibacterial Discovery. 2011, 24:71-109.
Los medicamentos se están agotando

4. La era genómica
Post-genómica

5. Estrategia actual en el desarrollo de
medicamentos
Bibliotecas químicas
>100.000 compuestos
DOCKING

6. SELEX
(evolución sistemática de ligandos por
enriquecimiento exponencial)
Tuerk and Gold (1990)Ellington y Szostak (1990)
ssDNA ssRNA
Bibliotecas de
oligonucleótidos
(10*13)

9. Aptámero latín “Aptus” = apto o que encaja

10. Premio Nobel- Medicina 2009
Carol Greider Jack Szostak Elizabeth Blackburn
"for the discovery of how chromosomes are
protected by telomeres and the enzyme telomerase".

11. Primera terapia en base a RNA “other small structural RNAs could
be exploited as a new approach for inhibiting proteins and enzymes”
• Factor de von Willebrand (vWF)
• Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
• Factor de crecimiento endotelial-vascular (VEGF)
• E-selectina
• Antígeno de membrana especifico de próstata (PSMA)
• Factor nuclear kB (NFkB)
• Tenacina-C

12. Primeros usos de los
aptámeros
• Peptidos biologicamente activos y proteinas
solubles
(Jellinek et al., 1993, Ruckman et al., 1998, Williams et al.,
1996, Proske et al., 2002)
• Se unen a nucleótidos
(Sassanfar and Szostak, 1993, Meli et al., 2002)
• Blancos complejos como receptores de
membrana y vasos sanguíneos
(Ulrich et al. 1998, Blank et al. 2001)

13. ¿Como funciona?

14. Tonelli, RR. et al 2013

16. Debilidades de los aptámeros
Corta vida media debido a la
degradación de nucleasas
presentes en el suero
5’ 3’
Extremos 5’ y 3’ son
susceptibles a
exonucleasas

17. ¿Es ahora el momento?
• Mejoras químicas en la síntesis de oligonucleótidos
aumentan su estabilidad y su farmacocinética.
(Trujillo et al., 2007, Ni et al., 2011)

18. Estructura 3D única
Kd= nM ó pM
Anticuerpos químicos
• También llamados “Anticuerpos químicos”
• Mas eficientes que los ligandos e inhibidores
naturales

19. Hernández, FJ. Hincapié, JA. 2011
Ventajas y desventajas

20. Como resolver las limitaciones
de los aptámeros
• Los aptámeros pueden ser optimizados para la actividad y
persistencia fisiológica durante la selección o durante la
relación estructura-actividad y estudios de química medica
realizados después de su descubrimiento
• La adición de conjugados como polietinel-glicol o colesterol
puede incrementar su vida media (horas/días vs minutos)
• Modificaciones químicas incorporadas a los azucares o
enlaces fosfodiester inter-nucleótido potencia su resistencia a
nucleasas
• La protección por propiedad intelectual están a punto de
expirar
Keefe, AD. Et al. 2010

21. Degradación de los aptámeros
Alarga la vida media
de los aptámeros
Protegen al aptámero de la
degradación por endo y
exonucleasas
Lakhin, AV et. al, 2013

22. Excreción de los aptámeros por
filtración renal
Los aptámeros
tienen entre 5-
15 kDa
PEG
PEG o colesterol
aumentan entre
20-40 kDa
30-50kDa

23. Control de la duración de la
acción
• Degradación
• Participación en procesos
metabólicos
• Excreción renal
• Etc…
Los antídotos pueden ser una
solución para controlar la duración
de la acción terapéutica

24. Interacción del aptámero con
blancos intracelulares
Transfección de células
con un vector de expresión
que tiene promotor U6
Transfección de células
con un vector de expresión
que tiene promotor tRNA
Intrámeros
(concentración del aptámero
a nivel intracelular)
PSMA

25. Generación de aptámeros
usando proteínas no purificadas
Cell-SELEX
Aptámeros específicos
contra proteínas no
conocidas
Biomarcadores,
diferenciación de células
tumorales…etc

26. Reacciones cruzadas
DNA polimerasa β DNA polimerasa κ
La adición de pasos de selección negativa con
moléculas estructuralmente similares disminuye
enormemente las reacciones cruzadas
Pool de RNAs

27. Generación automática de
aptámeros
• CE-SELEX: electroforesis capilar (una ronda)
• NECEEM: electroforesis capilar sin equilibrio de
mezclas en equilibrio (1-2 días)
CE-SELEX NECEEM-SELEX

28. Métodos para la selección de
aptámeros

29. Hernández, FJ. Hincapié, JA. 2011
Aptámeros en fase clínica
* f – 2'-fluoronucleotide, m – 2'-O-methylnucleotide y se adicionó PEG 40kDa

30. Infecciones parasitarias
Alta prevalencia en países
subdesarrollados
Alta resistencia a los
antiparasitarios y muchos
efectos secundarios
Bajo costo y facilidad para su
aplicación

31. Leishmaniasis
L.infantum
H2A y
H3
KMP-11
•Baja actividad
biológica
•Dificultad para
llegar a la proteína
blanco
(Bhattacharyya et al., 2002). (Moreno et al., 2003).
Leishmaniasis
visceral
Pubmed 3.000 artículo “aptamer” 10 son en parásitos

32. Tripanosomiasis
T.brucei
Enfermedad
Del sueño
VSG
(Lorger et al., 2003) Degradación
en suero
(Ulrichetal.2004)
Proteína
variante
ISGsSELEX in vivo
Son engullidos a
los lisosomas
T.cruzi
Células de
riñón de mono
LLC-MK
70%
reducción
(Alves and Colli, 2008)

33. Malaria
Plasmodium spp
malaria
P.falciparum
(Niles et al., 2009)
Hemozoína
(Hematina +
proteínas)
PfEMP1
(Barfod et al., 2009)
Promisorios
para ser
probados
in vivo

34. Tonelli, RR. et al 2013

35. Intrámeros
B52
Splicing
WT y
sobre-exp.
Drosophila melanogaster
Intrámero especifico contra
B52
D.Melanogaster
B52WT
D.Melanogaster
B52Shi, H. et al 1999

36. Intrámeros
Thiel, WH. et al. 2012

37. Conclusiones
• Pueden usarse tanto en diagnóstico como en terapéutica
y como biomarcadores
• Cada tipo celular difiere de otro por las moléculas que
expone en la superficie celular
• Se puede interferir a diferentes niveles en el crecimiento,
viabilidad y proliferación de los parásitos
• Los aptámeros obtenidos in vitro deben ser validados
in vivo
• Poderosa herramienta para el estudio de la función de
proteínas y esclarecimiento de funciones en grandes
maquinarias proteicas
• Pueden hacerse modificaciones que mejoren la
técnica con las herramientas que tenemos a mano

38. Salvarsán 606 Ehrlich 914