Aktivita a obsah enzymu Rubisco u dřevin kultivovaných ve zvýšené koncentraci CO 2 Michala Zgarbová Experimentální biologie
Enzym Rubisco <ul><li>Ribulóza-1,5-bisfosfát karboxyláza/oxyganáza je hlavní enzym asimilující CO 2  v biosféře.   </li></...
Struktura enzymu <ul><li>Rubisco se skládá ze tvou typů podjednotek malé (S, 12–18 kDa) a velké (L, 50-55 kDa).   </li></u...
Struktura enzymu Obr. 1. Pohled shora a ze strany na enzym Rubisco izolovaný ze špenátu. Velké (tmavé) a malé (světlé) pod...
Struktura aktivního místa <ul><li>Obr. 2. Znázornění aktivního místa enzymu Rubisco. Na Lys 201 se nejprve váže molekula C...
Aktivita a obsah enzymu Rubisco <ul><li>Aktivita a obsah enzymu Rubisco jsou variabilní v závislosti na druhu a stáří rost...
Odběr rostlinného materiálu <ul><li>Rostlinný materiál byl odebírán z růstových sfér na EEP AV ČR, které se nachází na Bíl...
Extrakce enzymu Rubisco <ul><li>Obr. 3. Schéma extrakce enzymu Rubisco. Extrakce probíhá pod zeleným světlem. Ve třecí mis...
Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymu Rubisco <ul><li>Obr. 4. Schéma stanovení aktivity enzymu Rubisco spektrofoto...
Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymu Rubisco <ul><li>Pro výpočet aktivity enzymu Rubisco byl použit vzorec (Chvoj...
Stanovení obsahu a metoda standardního přídavku <ul><li>Obr. 5. Schéma postupu při měření obsahu podle Chvojkové a Bukovsk...
Výsledky <ul><li>Celková aktivita byla vyjádřena jako množství asimilovaného CO 2  na m 2  listové plochy za sekundu.  </l...
Celková aktivita-Smrk ztepilý <ul><li>Obr. 6. Grafické a statistické porovnání aktivity jehlic 2007 pěstovaných v normální...
Celková aktivita-Smrk ztepilý <ul><li>Aktivita enzymu u jehlic 2008 se v průběhu sezóny výrazně nemění.  </li></ul><ul><li...
Celková aktivita-Buk lesní <ul><li>Aktivita slunných listů v průběhu sezóny roste. </li></ul><ul><li>U varianty AC vzrostl...
Celková aktivita-Buk lesní <ul><li>Aktivita stinných listů v průběhu sezóny roste. </li></ul><ul><li>U varianty AC došlo k...
Obsah- Smrk ztepilý <ul><li>Obr. 10. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u jehlic 2007 pěstovaných v no...
Obsah- Smrk ztepilý <ul><li>Obr. 11. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u jehlic 2008 pěstovaných v no...
Obsah- Buk lesní Obr. 12. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u slunných listů buku lesního pěstovaných...
Obsah- Buk lesní <ul><li>Obr. 13. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u stinných listů buku lesního pěs...
Metoda standardního přídavku Přesnost metody standardního přídavku byla ověřena při měření koncentrace roztoku KMnO 4 , kt...
Metoda standardního přídavku <ul><li>U variant kultivovaných za vysokých  teplot mají hodnoty metod různé trendy.  </li></...
<ul><li>U variant kultivovaných v nízkých teplotách udržují hodnoty obou metod stejný trend.  </li></ul><ul><li>Hodnoty va...
Závěr <ul><li>Změny v aktivitě enzymu Rubisco během sezóny u smrku ztepilého nebyly statisticky prokazatelné.  </li></ul><...
Závěr <ul><li>Aktivita enzymu u buku lesního během sezóny výrazně roste.  </li></ul><ul><li>Listy slunné vykazují aktivitu...
Závěr <ul><li>Ověřila jsem metodu standardního přídavku, která při jednoduchém měření na manganistanu draselném dávala spo...
Zdroje <ul><li>Internetové odkazy: </li></ul><ul><li>http://www.biologie.uni-hamburg.de/lehre/bza/1rxo/e1rxoe.htm l </li><...
Děkuji za pozornost
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Zgarbová bc p prezentace

559

Published on

0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total Views
559
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Zgarbová bc p prezentace

  1. 1. Aktivita a obsah enzymu Rubisco u dřevin kultivovaných ve zvýšené koncentraci CO 2 Michala Zgarbová Experimentální biologie
  2. 2. Enzym Rubisco <ul><li>Ribulóza-1,5-bisfosfát karboxyláza/oxyganáza je hlavní enzym asimilující CO 2 v biosféře. </li></ul><ul><li>Katalyzuje nejen reakci CO 2 s ribulóza-1,5-bisfosfátem-karboxylázová aktivita, ale i vazbu O 2 na tento substrát-oxygenázová aktivita. </li></ul>
  3. 3. Struktura enzymu <ul><li>Rubisco se skládá ze tvou typů podjednotek malé (S, 12–18 kDa) a velké (L, 50-55 kDa). </li></ul><ul><li>Velké podjednotky obsahují aktivní centrum, mají katalytickou aktivitu. Malé podjednotky ovlivňují strukturu enzymu a jeho aktivitu. </li></ul><ul><li>Nejrozšířenější forma Rubisco (Form I-L8S8) byla nalezena u většiny chemoautotrofních bakterií, cyanobakterií, hnědých řas a u všech typů vyšších rostlin. </li></ul>
  4. 4. Struktura enzymu Obr. 1. Pohled shora a ze strany na enzym Rubisco izolovaný ze špenátu. Velké (tmavé) a malé (světlé) podjednotky jsou uspořádány v kruhu (červená a zelená), modře je znázorněn substrát ribulóza-1,5-bisfosfát (RuBP). V neaktivním stavu je aktivní místo enzymu odkryto. Po navázání substrátu dojde k jeho zakrytí. http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/fo24_1/e1rxoe.htm
  5. 5. Struktura aktivního místa <ul><li>Obr. 2. Znázornění aktivního místa enzymu Rubisco. Na Lys 201 se nejprve váže molekula CO 2 (activateur, červená). Poté je na tento karbamát lysinu navázán Mg 2+ (Mg, zelená). RuBP (sucre, oranžová) se ke kationtu váže svou keto a přilehlou hydroxo skupinou. </li></ul><ul><li>http://web.vscht.cz/spiwokv/enzymologie/RUBISCO.pdf </li></ul>
  6. 6. Aktivita a obsah enzymu Rubisco <ul><li>Aktivita a obsah enzymu Rubisco jsou variabilní v závislosti na druhu a stáří rostliny, endogenních a exogenních faktorech jako je koncentrace O 2 , CO 2 , intenzita FAR, teplota, pH a mnoho dalších. </li></ul><ul><li>V této bakalářské práci se zabývám vlivem dlouhodobě zvýšené koncentrace CO 2 na buk lesní ( Fagus sylvatica ) a smrk ztepilý ( Picea abies ). </li></ul>
  7. 7. Odběr rostlinného materiálu <ul><li>Rostlinný materiál byl odebírán z růstových sfér na EEP AV ČR, které se nachází na Bílém kříži v Moravsko-Slezských Beskydech. </li></ul><ul><li>Odebíraly se vždy vzorky z prostředí s normální ( ambient -AC) a zvýšenou ( elevated -EC) koncentrací CO 2 . </li></ul><ul><li>Byla stanovena čerstvá hmotnost (f.w., mg) a projekční plocha(A, cm 2 ) jednotlivých vzorků. </li></ul><ul><li>Vzorky byly nasvíceny odpovídající FAR po dobu 10 minut a do analýzy zmraženy v tekutém dusíku. </li></ul>
  8. 8. Extrakce enzymu Rubisco <ul><li>Obr. 3. Schéma extrakce enzymu Rubisco. Extrakce probíhá pod zeleným světlem. Ve třecí misce smícháme vzorek rostlinného materiálu, základní roztok a chemikálie pro extrakci (PVP-polyvinylpyrolidon, DTT-dithiothreitol, KHCO 3 - hydrogen uhličitan draselný). Homogenát se centrifuguje, vzniklý supernatant se použije ke stanovení aktivity a obsahu enzymu Rubisco. </li></ul>
  9. 9. Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymu Rubisco <ul><li>Obr. 4. Schéma stanovení aktivity enzymu Rubisco spektrofotometrickou metodou. </li></ul><ul><li>Měření probíhá v metodice RATE (program VISIONpro, Velká Británie) při vlnové délce 340 nm. Metoda je založena na měření změny absorbance NADH v závislosti na rychlosti jeho oxidace. </li></ul><ul><li>Prvním měřením se získá počáteční aktivita enzymu. Po jednominutové pauze, kdy už je rychlost oxidace NADH lineární, se provede druhé měření a tím se získá celková aktivita enzymu. </li></ul>
  10. 10. Spektrofotometrické stanovení aktivity enzymu Rubisco <ul><li>Pro výpočet aktivity enzymu Rubisco byl použit vzorec (Chvojková 2003): </li></ul><ul><li>ε (NADH) molární extinkční koeficient pro λ 340 nm (6 220 mmol -1 dm 3 cm -1) </li></ul><ul><li>l tloušťka kyvety 0,5 cm </li></ul><ul><li>V objem kyvety 0,0015 dm 3 </li></ul><ul><li>∆ A změna absorbance v min -1 </li></ul><ul><li>∆ n aktivita enzymu Rubisco v kyvetě (μmol (CO 2 ) min -1 ) </li></ul>
  11. 11. Stanovení obsahu a metoda standardního přídavku <ul><li>Obr. 5. Schéma postupu při měření obsahu podle Chvojkové a Bukovské (1) a postup při metodě standardního přídavku (1+2). </li></ul><ul><li>Měření probíhá ve fixní metodice (program VISIONpro, Velká Británie). Pomocí metody pro měření obsahu (1) jsem získala absorbanci A x . Pro změření standardního přídavku jsem upravila poměr zásobního roztoku a vzorku (2). Poté jsem přidala roztok standardu o známé koncentraci c. Tak jsem získala absorbanci A. Tyto hodnoty jsem dosadila do vzorce pro standardní přídavek (Zýka a kol. 1980): </li></ul><ul><li>c x = A x c/(A - A x ) </li></ul>
  12. 12. Výsledky <ul><li>Celková aktivita byla vyjádřena jako množství asimilovaného CO 2 na m 2 listové plochy za sekundu. </li></ul><ul><li>Obsah enzymu byl přepočítán na m 2 listové plochy. </li></ul><ul><li>Byly vzájemně porovnány výsledky metody standardního přídavku a metody využívající rovnici regrese kalibrační přímky. </li></ul><ul><li>Získaná data byla statisticky ověřena pomocí T-testu a </li></ul><ul><li>F-testu a porovnána s publikovanou literaturou </li></ul><ul><li>(např.: Urban 2008, Hrstka a kol. 2005). </li></ul>
  13. 13. Celková aktivita-Smrk ztepilý <ul><li>Obr. 6. Grafické a statistické porovnání aktivity jehlic 2007 pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6). </li></ul><ul><li>Aktivita enzymu u jehlic 2007 se v průběhu sezóny výrazně nemění. </li></ul><ul><li>U varianty EC se aktivita pohybovala okolo 2,2  [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul><ul><li>U jehlic pěstovaných v AC došlo během rokuk poklesu z 2,5 na 2,4  [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul>
  14. 14. Celková aktivita-Smrk ztepilý <ul><li>Aktivita enzymu u jehlic 2008 se v průběhu sezóny výrazně nemění. </li></ul><ul><li>U varianty AC došlo k poklesu z 1,9 na 1,8  [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul><ul><li>U varianty EC se aktivita nepatrně vzrostla z 1,9 na 2,0  [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul><ul><li>Tyto změny nebyly statisticky průkazné. </li></ul>Obr. 7. Grafické a statistické porovnání aktivity jehlic 2008 pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6).
  15. 15. Celková aktivita-Buk lesní <ul><li>Aktivita slunných listů v průběhu sezóny roste. </li></ul><ul><li>U varianty AC vzrostla z původních 7,5 na 19,1  [µmol(CO 2 )/m 2 s]. </li></ul><ul><li>U varianty EC byl nárůst z původních 8,5 na 11,4  [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul><ul><li>Výraznější nárůst aktivity enzymu během sezóny jsem zaznamenala u rostlin AC . </li></ul>Obr. 8. Grafické a statistické porovnání aktivity enzymu Rubisco u slunných listů buku lesního pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6).
  16. 16. Celková aktivita-Buk lesní <ul><li>Aktivita stinných listů v průběhu sezóny roste. </li></ul><ul><li>U varianty AC došlo ke zvýšení aktivity z 4,7 na 7,7   [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul><ul><li>U varianty EC bylo zvýšení aktivity enzymu výraznější z původních 3,6 na 9,7  [µmol (CO 2 )/m 2 s ] . </li></ul>Obr. 9. Grafické a statistické porovnání aktivity enzymu Rubisco u stinných listů buku lesního pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6).
  17. 17. Obsah- Smrk ztepilý <ul><li>Obr. 10. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u jehlic 2007 pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6). </li></ul><ul><li>Obsah enzymu Rubisco u jehlic 2007 během sezóny roste. </li></ul><ul><li>U varianty EC se obsah enzymu zvýšil z původních 59,7 na 85,2 [g/m 2 ]. </li></ul><ul><li>U varianty AC se obsah v průběhu sezóny také zvýšil z 69,4 na 86,5 [g/m 2 ]. </li></ul>
  18. 18. Obsah- Smrk ztepilý <ul><li>Obr. 11. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u jehlic 2008 pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6). </li></ul><ul><li>Obsah enzymu Rubisco u jehlic 2008 během sezóny výrazně roste. </li></ul><ul><li>U varianty AC se obsah enzymu během sezóny zvýšil z 15,0 na 34,8 [g/m 2 ] . </li></ul><ul><li>U varianty EC byl tento nárůst trochu výraznější ze 17,6 na 40,1  [g/m 2 ] . </li></ul>
  19. 19. Obsah- Buk lesní Obr. 12. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u slunných listů buku lesního pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6). <ul><li>Obsah enzymu Rubisco u slunných listů během sezóny roste. </li></ul><ul><li>U varianty AC byl nárůst z původních 30,2 na 47,1 [g/m 2 ] . </li></ul><ul><li>U varianty EC se obsah zvýšil méně z původních 35,2 na 40,6 [g/m 2 ]. </li></ul>
  20. 20. Obsah- Buk lesní <ul><li>Obr. 13. Grafické a statistické porovnání obsahu enzymu Rubisco u stinných listů buku lesního pěstovaných v normální (AC) a zvýšené (EC) [CO 2 ]. Data jsou aritmetickým průměrem se stanovenou směrodatnou odchylkou výběru (n=6). </li></ul><ul><li>Obsah enzymu Rubisco u stinných listů v průběhu sezóny rostl více než dvakrát. </li></ul><ul><li>U varianty EC obsah stoupl z původních 11,0 na 21,9 [g/m 2 ]. </li></ul><ul><li>U varianty AC jsem naměřila podobné výsledky, z původních 10,3 vzrostl obsah na 21,0 [g/m 2 ]. </li></ul>
  21. 21. Metoda standardního přídavku Přesnost metody standardního přídavku byla ověřena při měření koncentrace roztoku KMnO 4 , který byl znečištěn chloridem kobaltnatým. Spektra těchto dvou látek se navzájem překrývají (Obr.14) Obr. 15 Výsledky standardního přídavku byly dány do poměru s hodnotami získanými výpočtem z kalibrační přímky pro koncentrační řadu roztoků KMnO 4 (žlutá část grafu). Byl stanoven průměr (n=8, modrý sloupec) a směrodatná odchylka výběru téměř 4 . Povšimněte si měřítka osy Y.
  22. 22. Metoda standardního přídavku <ul><li>U variant kultivovaných za vysokých teplot mají hodnoty metod různé trendy. </li></ul>*** *** ** * * Obr. 15. Srovnání výsledků metod kalibrační přímky (modrá, kalibračka) a standardního přídavku (žlutá, přídavek). 1000 20,5 38,3±9,1 64,2±1,2 HIHT2/T3 1000 27 28,2±9,3 86,8±2,5 HIHT2/T2 1000 34 22,4±2,5 75,3±3,2 HIHT2/T1 300 31 45,4±7,1 67,3±2,8 HIHT2 300 28 57,6±19,8 82,5±2,5 HIHT FAR Teplota Přídavek Kalibračka Podmínky kultivace Obsah enzymu Rubisco [g / m 2 ]
  23. 23. <ul><li>U variant kultivovaných v nízkých teplotách udržují hodnoty obou metod stejný trend. </li></ul><ul><li>Hodnoty variant HILT a HILT/T1 získané metodou standardního přídavku jsou srovnatelné s literaturou. </li></ul>Metoda standardního přídavku *** *** * * *** Obr. 16. Srovnání výsledků metod kalibrační přímky (modrá, kalibračka) a standardního přídavku (žlutá, přídavek). 1000 35 22,3±4,9 43,4±3,5 HILT/T3 1000 33 17,6±5,4 42,4±2,7 HILT/T2 1000 27 4,8±1,9 30,6±4,3 HILT/T1 300 20 9,3±5,5 29,6±6,3 HILT 100 19 25,4±4,9 56,7±4,8 LILT FAR Teplota Přídavek Kalibračka Podmínky kultivace Obsah enzymu Rubisco [g / m 2 ]
  24. 24. Závěr <ul><li>Změny v aktivitě enzymu Rubisco během sezóny u smrku ztepilého nebyly statisticky prokazatelné. </li></ul><ul><li>Obsah enzymu Rubisco ve starších jehlicích je výrazně vyšší. </li></ul><ul><li>Zvýšení obsahu během roku je výraznější u jehlic 2008. </li></ul>
  25. 25. Závěr <ul><li>Aktivita enzymu u buku lesního během sezóny výrazně roste. </li></ul><ul><li>Listy slunné vykazují aktivitu výrazně vyšší než listy stinné. </li></ul><ul><li>Obsah enzymu v průběhu roku také výrazně roste. </li></ul><ul><li>Vyšší obsah enzymu jsem naměřila u slunných listů. </li></ul>
  26. 26. Závěr <ul><li>Ověřila jsem metodu standardního přídavku, která při jednoduchém měření na manganistanu draselném dávala spolehlivé výsledky s malou chybou. </li></ul><ul><li>Pomocí metody standardního přídavku jsem získala nižší hodnoty obsahu enzymu Rubisco než pomocí spektrofotometrické metody navržené Chvojkovou a Bukovskou. </li></ul><ul><li>Pokusy provedené na rostlinách z růstových komor na OU v Ostravě přinesly značně rozdílná data. To může být způsobeno různými podmínkami kultivace a tedy různým obsahem enzymu Rubisco u jednotlivých variant. </li></ul><ul><li>Rozdíly mezi metodou kalibrační přímky a metodou standardního přídavku jsou způsobeny látkami, které absorbují při vlnové délce 270 nm a tím mohou zkreslovat výsledky získané rovnicí regrese kalibrační přímky. </li></ul>
  27. 27. Zdroje <ul><li>Internetové odkazy: </li></ul><ul><li>http://www.biologie.uni-hamburg.de/lehre/bza/1rxo/e1rxoe.htm l </li></ul><ul><li>http://web.vscht.cz/spiwokv/enzymologie/RUBISCO.pdf </li></ul><ul><li>http://jxb.oxfordjournals.org </li></ul><ul><li>www.scicom.demon.co.uk </li></ul><ul><li>http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002/ebook.html?p=rubisco </li></ul><ul><li>http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/organic/rubisco.html </li></ul><ul><li>http://www.biochemie.upol.cz/stranky/vyuka/bch/09.ppt#10 </li></ul><ul><li>Literatura: </li></ul><ul><li>Bcp-Radka Bukovská </li></ul><ul><li>Dp-Radka Bukovská </li></ul><ul><li>Dp-Hana Chvojková </li></ul><ul><li>Jiří Kalina- Studium vlivu zvýšené koncentrace CO 2 : metodické příspěvky ke studiu fotosyntézy </li></ul>
  28. 28. Děkuji za pozornost
  1. A particular slide catching your eye?

    Clipping is a handy way to collect important slides you want to go back to later.

×