Stanovení struktury neurotoxinu II vázaného na nikotin acetylcholinový receptor – přístup nukleární magnetické rezonance v...
Nukleární magnetická rezonance <ul><li>Vychází z magnetických vlastností atomových jader popsaných kvantovou mechanikou </...
MAS NMR v pevném stavu <ul><li>Vhodná metoda pro stanovení rezonancí a struktury pevných látek </li></ul><ul><ul><li>dokáz...
Nicotin acetylcholinový receptor (nAChR)  <ul><li>Nachází se v postsynaptických membránách synapsí centralního nervového s...
Nicotin acetylcholinový receptor (nAChR) <ul><li>Chemicky řízený iontový kanál reagující na ligand  </li></ul><ul><li>Sklá...
Postsynaptické neurotoxiny  <ul><li>Dvě třídy toxinů: </li></ul><ul><li>dlouhé (délka polypeptidového řetězce 66-74 zbytků...
Postsynaptické neurotoxiny <ul><li>Ustálená struktura - velký počet neurotoxinů obsahuje NTII </li></ul><ul><li>Známé 3D s...
„ Magic-angle spinning“ NMR spektroskopie látek v pevném stavu  <ul><li>Efektivní metoda pro studia struktury kvazi-immobi...
Stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr   <ul><li>Afinitu mezi dvěma molekulami (např. protein – DNA) je možné určit n...
„ Magic-angle spinning“ NMR spektroskopie látek v pevném stavu <ul><li>Na základě vazebné konstanty lze určit, že rovnováh...
Materiál a metody  <ul><li>Zisk NTII: </li></ul><ul><li>Použity buňky  E. coli   BL21 obsahující vektor exprese NTII  </li...
Výsledky a diskuze <ul><li>nAChr má dvě vazná místa pro NTII umístěná na rozhraní podjednotek α/γ a α/δ  </li></ul><ul><li...
Výsledky a diskuze <ul><li>Použitím metody stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr byl naměřen nárůst počtu vazebných ...
Závěr <ul><li>Označený NTII byl analyzován pomocí MAS NMR v pevném stavu, navázán na receptor  nAChR </li></ul><ul><li>Kom...
Literatura <ul><li>Krabben, L. et col.:  Towards structure determination of neurotoxin II bound to nicotinic   acetylcholi...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Stanovení struktury neurotoxinu ii vázaného na nikotin acetylcholinový

665 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
665
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
4
Actions
Shares
0
Downloads
2
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Stanovení struktury neurotoxinu ii vázaného na nikotin acetylcholinový

  1. 1. Stanovení struktury neurotoxinu II vázaného na nikotin acetylcholinový receptor – přístup nukleární magnetické rezonance v pevném stavu Biofyzika Seminář z biofyziky biol. membrán II Ladislav Šigut
  2. 2. Nukleární magnetická rezonance <ul><li>Vychází z magnetických vlastností atomových jader popsaných kvantovou mechanikou </li></ul><ul><li>Všechna jádra mající liché nukleonové číslo mají vlastní magnetický moment ( 1 H, 13 C, 15 N) </li></ul><ul><li>Působením vnějšího magnetického pole dochází k vysokému spektrálnímu štěpení (popsáno Zeemanovým efektem a chemickým posunem) </li></ul><ul><li>NMR látek v pevném stavu má nízké rozlišení x NMR roztoků </li></ul>
  3. 3. MAS NMR v pevném stavu <ul><li>Vhodná metoda pro stanovení rezonancí a struktury pevných látek </li></ul><ul><ul><li>dokázáno na SH3 mikrokrystalickém proteinu </li></ul></ul><ul><li>Spektra s vysokým rozlišením můžeme obdržet i u systému složeného z komplexu receptor-toxin </li></ul><ul><li>Použitý NMR vzorek se skládá z membránového preparátu nicotin acetylcholinového receptoru elektrického orgánu parejnoka kalifornského, který byl inkubován stejnoměrně 13 C-, 15 N-označeným neurotoxinem II. </li></ul><ul><ul><li>výsledky jsou podobné jako u NMR roztoků, výrazné změny pozorovány pouze pro jeden izoleucin </li></ul></ul>
  4. 4. Nicotin acetylcholinový receptor (nAChR) <ul><li>Nachází se v postsynaptických membránách synapsí centralního nervového systému a nervosvalových ploténkách (motorických ploténkách) </li></ul><ul><li>Nervosvalová ploténka </li></ul><ul><li>1: zakončení neuronu, 2: mitochondrie, 3: váčky s mediátorem, 4:biomembrána </li></ul><ul><li>svalového vlákna, 5: štěrbina ploténky (převzato z Jelínek, Zicháček (1998)) </li></ul>
  5. 5. Nicotin acetylcholinový receptor (nAChR) <ul><li>Chemicky řízený iontový kanál reagující na ligand </li></ul><ul><li>Skládá se z pěti homologních podjednotek se stechiometrií α 2 βγδ </li></ul><ul><ul><li>každá o velikosti cca. 200 zbytků na extracelulární straně </li></ul></ul><ul><ul><li>4 membránu překlenující segmenty </li></ul></ul><ul><ul><li>intracelulární segmenty různých délek </li></ul></ul><ul><li>Má kationt-selektivní pór, který se otevře po navázání </li></ul><ul><li>acetylcholinu </li></ul><ul><li>Dvě vazebná místa lokalizována na α podjednotkách (Obr.) </li></ul><ul><li>poblíže styčných ploch podjednotek </li></ul><ul><li>Kompetitivně blokována působením α-neurotoxinů </li></ul>
  6. 6. Postsynaptické neurotoxiny <ul><li>Dvě třídy toxinů: </li></ul><ul><li>dlouhé (délka polypeptidového řetězce 66-74 zbytků) </li></ul><ul><li>krátké (60-62 zbytků) </li></ul><ul><li>Neurotoxin II (NTII) </li></ul><ul><li>v jedu asijské kobry Naja oxiana </li></ul><ul><li>patří do skupiny krátkých toxinů (61 zbytků) </li></ul>Struktura NTII v roztoku určená pomocí NMR roztoků
  7. 7. Postsynaptické neurotoxiny <ul><li>Ustálená struktura - velký počet neurotoxinů obsahuje NTII </li></ul><ul><li>Známé 3D struktury </li></ul><ul><li>Způsoby pozorování interakce neurotoxinu s receptorem: </li></ul><ul><ul><li>„ cross-linking“ experimenty zkoumajícími propojení molekul </li></ul></ul><ul><ul><li>elektronová paramagnetická rezonance (EPR) </li></ul></ul><ul><ul><li>fluorescence </li></ul></ul><ul><ul><li>NMR analýza roztoků* </li></ul></ul><ul><li>Vysoká afinita neurotoxinů k nAChR a specifita </li></ul><ul><ul><li>neurotoxiny jako nástroj při popisu struktury a funkce receptoru </li></ul></ul><ul><li>* Při vazbě na analog α-podjednotky nAChR ukázala analýza změny ve struktuře toxinu </li></ul>
  8. 8. „ Magic-angle spinning“ NMR spektroskopie látek v pevném stavu <ul><li>Efektivní metoda pro studia struktury kvazi-immobilních biomolekul </li></ul><ul><li>Jestliže je sesbírán dostatečný počet molekul s korigovanou strukturou, je možné vypočítat strukturu </li></ul><ul><li>Dva předpoklady: </li></ul><ul><ul><li>dostupnost izotopicky značených proteinů (toxinů s 13 C-uhlíkem a 15 N-dusíkem </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>umožněno rekombinantní expresí NTII u Escherichia coli </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>strukturní homogenita daného místa vzorku, která ovlivňuje rozlišení spektra </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>nAChR vazebné místo slouží jako matrice </li></ul></ul></ul>
  9. 9. Stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr <ul><li>Afinitu mezi dvěma molekulami (např. protein – DNA) je možné určit na základě vazebné konstanty (poměr vázaných a nevázaných molekul) </li></ul><ul><li>Metoda stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr měří afinitu mezi dvěma molekulami využitím filtru ( nitrocelulózový papír) </li></ul><ul><li>Proteiny mají převážně pozitivní náboj </li></ul><ul><li>Na filtr se váže pouze protein a komplex protein - DNA – vyhodnotí se procentuální zastoupení vázané složky (DNA může být značena radioaktivními izotopy) </li></ul><ul><li>Po provedení několika měření se odečte střední hodnota z křivky závislosti procentuálního zastoupení vázané složky na koncentraci peptidu </li></ul>
  10. 10. „ Magic-angle spinning“ NMR spektroskopie látek v pevném stavu <ul><li>Na základě vazebné konstanty lze určit, že rovnováha mezi volným a vázaným stavem toxinu je silně posunutá směrem k stavu s navázaným receptorem </li></ul><ul><li>Nadbytečný NTII může být tedy odstraněn vymytím bez snížení signifikantního počtu obsazených vazebných míst receptoru </li></ul>
  11. 11. Materiál a metody <ul><li>Zisk NTII: </li></ul><ul><li>Použity buňky E. coli BL21 obsahující vektor exprese NTII </li></ul><ul><li>Byly pěstovány při 28°C za určitých podmínek </li></ul><ul><li>Genová exprese byla indukována zvýšením teploty na 37°C </li></ul><ul><li>Zisk komplexu neurotoxin-receptor: </li></ul><ul><li>Byla získána suspenze membrán bohatých na nAChR receptory z elektrické tkáně T. californica jak již bylo řečeno </li></ul><ul><li>Po přidání roztoků a aditiv (Triton X-100 aj.) byla suspenze inkubována v NTII a následně třikrát centrifugována po dlouhou dobu při vysokých otáčkách </li></ul>
  12. 12. Výsledky a diskuze <ul><li>nAChr má dvě vazná místa pro NTII umístěná na rozhraní podjednotek α/γ a α/δ </li></ul><ul><li>V membráně bohaté na receptory nejsou obě vazebné místa plně přístupné kvůli těsnému sbalení podjednotek receptoru nAChR </li></ul><ul><li>Postup vedoucí ke zvýšení přístupnosti k vazebným místům NTII je užitečný pro zvýšení koncentrace značených vázaných složek ve vzorku </li></ul><ul><li>Pružnost membrán se zvýší aplikací Tritonu X-100 a tím se zvýší počet dostupných vazebných míst </li></ul>
  13. 13. Výsledky a diskuze <ul><li>Použitím metody stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr byl naměřen nárůst počtu vazebných míst o 50% po přidání dílu Tritonu na 0,02 objemových procent </li></ul><ul><ul><li>místo NTII použit jeho homolog [ 125 I]Bgtx (značený izotopem 125 I) </li></ul></ul><ul><li>Vyšší koncentrace vedou ke zvýšení počtu vazebných míst, ale zároveň k výraznému zvýšení počtu solvatovaných receptorů </li></ul><ul><li>Pro NMR spektroskopickou analýzu byly tedy nakonec využity vzorky s průměrnou vazebnou stechiometrií 1,5 molekuly toxinu na každý receptor </li></ul>
  14. 14. Závěr <ul><li>Označený NTII byl analyzován pomocí MAS NMR v pevném stavu, navázán na receptor nAChR </li></ul><ul><li>Komplex toxin-receptor byl zkoumán ve svém nativním membránovém prostředí </li></ul><ul><li>1D a 2D NMR spektra pevného stavu ukázala, že NTII byl v definovaném prostředí nejspíše zajištěném vazebnými kapsami receptoru </li></ul>
  15. 15. Literatura <ul><li>Krabben, L. et col.: Towards structure determination of neurotoxin II bound to nicotinic acetylcholine receptor: a solid-state NMR approach , FEBS Letters 564 (2004) 319-324 </li></ul><ul><li>Jelínek J., Zicháček, V.: Biologie pro gymnázia, 327 stran [Nakladatelství Olomouc, Olomouc, 1998] [ISBN 80-7182-050-4] </li></ul>

×