Autor: Jana Široká Vedoucí práce:  RNDr. Petr Pečinka, CSc Ostravská Univerzita Přírodovědecká fakulta
Úvod <ul><li>Elektrochemické metody lze použít při detekci poškození DNA (řetězcových zlomů a poškození bazí) a k detekci ...
Adsorpčně-desorpční děje <ul><li>Adsorpčně-desorpční děje dávají vzniknout tzv. tensametrickým (kapacitním) signálům, kter...
<ul><li>Obr. 1: tenzametrické píky  </li></ul><ul><li>a) nadšroubovicové kovalentně uzavřené kružnicové DNA neobsahující v...
Cíle: <ul><li>Izolace plasmidové DNA s vhodnými sekvencemi pro přímé poškození cukr-fosfátové páteře a pro poškození bází ...
Izolace DNA <ul><li>Plasmid BlueSkript byl získán z bakterií izolací pomocí kolonek Quiagen. </li></ul><ul><li>Podstatou i...
Poškození DNA <ul><li>Byl zjišťován vliv manganistanu draselného a hydroxylových radikálů (vzniklých Fentonovou reakcí (Cu...
Výsledky <ul><li>Koncentrace KMnO 4  (mM) </li></ul><ul><li>K  24  12  6  4  2  1  0,5    K  1  0,5  0,25  0,1  0,05  0,02...
<ul><li>Obr. 4: Modifikace  DNA  KMnO 4 ; plasmid pBS (75mg/ml) ve fosfátovém pufru </li></ul><ul><li>Obr.  5 :  Modifikac...
<ul><li>Obr. 6: Modifikace DNA KMnO 4 ; plasmid pBS (57.5mg/ml) ve fosfátovém pufru </li></ul>
<ul><li>Obr. 7: Modifikace DNA hydroxylovými radikály , plasmid pBS ve fosfátovém pufru </li></ul><ul><li>Obr. 8: Modifika...
<ul><li>Obr. 9: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; plasmid pPGM1 (60mg/ml) v pufru Tris-HCl </li></ul><ul><li>Obr. 10:...
<ul><li>Byl potvrzen vliv KMnO 4  na strukturu plasmidové DNA - tvorba řetězcových zlomů. Elektrochemická detekce poškozen...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Detekce poškození DNA pomocí elektrochemických metod

760 views
656 views

Published on

Autor: Jana Široká
Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc

Ostravská Univerzita
Přírodovědecká fakulta

Published in: Education
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
760
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
8
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Detekce poškození DNA pomocí elektrochemických metod

  1. 1. Autor: Jana Široká Vedoucí práce: RNDr. Petr Pečinka, CSc Ostravská Univerzita Přírodovědecká fakulta
  2. 2. Úvod <ul><li>Elektrochemické metody lze použít při detekci poškození DNA (řetězcových zlomů a poškození bazí) a k detekci elektroaktivních látek interagujících s DNA. </li></ul><ul><li>Elektrochemická aktivita DNA je odvozena od elektrochemických vlastností jejích stavebních prvků. </li></ul><ul><li>Měřením na rtuťových elektrodách lze sledovat i malé změny ve struktuře dsDNA. Tyto změny se na elektrochemické odezvě projevují kvantitativně (změnou intenzity jednotlivých píků) i kvalitativně (různé formy DNA poskytují píky při různých potenciálech). </li></ul>
  3. 3. Adsorpčně-desorpční děje <ul><li>Adsorpčně-desorpční děje dávají vzniknout tzv. tensametrickým (kapacitním) signálům, které mohou poskytnout informace o vlastnostech DNA na povrchu elektrody. </li></ul><ul><li>Molekuly DNA jsou záporně nabité a při vložení negativního potenciálu na elektrodu dochází k jejich elektrostatickému odpuzování, které může mít za následek jejich desorpci nebo reorientaci. Přitom se mění diferenciální kapacita elektrodové dvojvrstvy a objevují se tensametrické píky. </li></ul>
  4. 4. <ul><li>Obr. 1: tenzametrické píky </li></ul><ul><li>a) nadšroubovicové kovalentně uzavřené kružnicové DNA neobsahující volné konce (pík 1 odpovídá adsorpci/desorpci částí molekul DNA adsorbovaných prostřednictvím cukrfosfátové páteře) a </li></ul><ul><li>b) poškozené DNA (pík 3 odpovídá odvinutým úsekům DNA adsorbovaným prostřednictvím bází). </li></ul><ul><li>(Čs. čas. fyz. 56, 2006) </li></ul><ul><li>Charakter odezvy závisí na tom, které složky molekul DNA se adsorpčně-desorpčních dějů účastní. Úseky DNA, které jsou na povrchu elektrody adsorbovány prostřednictvím negativně nabité cukr-fosfátové páteře, podléhají segmentální desorpci okolo potenciálu  1,1 V (pík 1), distortované oblasti dvoušroubovice okolo -1,2 V (pík 2). Účastní-li se adsorpce molekul DNA na elektrodovém povrchu zbytky bází, dochází k desorpci při potenciálech kolem  1,3 V (pík 3). </li></ul>
  5. 5. Cíle: <ul><li>Izolace plasmidové DNA s vhodnými sekvencemi pro přímé poškození cukr-fosfátové páteře a pro poškození bází DNA </li></ul><ul><li>Modifikace izolované DNA genotoxickými látkami. K detekci poškození DNA použít elektrochemické postupy. </li></ul><ul><li>Srovnání citlivosti elektrochemických a elektroforetických metod při detekci poškození DNA. </li></ul>
  6. 6. Izolace DNA <ul><li>Plasmid BlueSkript byl získán z bakterií izolací pomocí kolonek Quiagen. </li></ul><ul><li>Podstatou izolace je alkalická lýze a oddělení nerozpustné buněčné frakce s chromozomální DNA od vodné frakce, ve které je rozpuštěna plasmidová DNA. Vodná frakce je nanesena na kolonu. Kladné náboje v koloně interagují se záporně nabitými NK a zadrží je. Z kolony jsou nežádoucí biomakromolekuly jsou vymyty pufrem. Eluce DNA je provedena pufrem o vyšší iontové síle než je promývací pufr. </li></ul><ul><li>Pro odstranění zbytků proteinů byla použita fenol-chloroformová extrakce, kde fenol slouží jako denaturační činidlo a chloroform slouží k odstranění zbytků fenolu. </li></ul>
  7. 7. Poškození DNA <ul><li>Byl zjišťován vliv manganistanu draselného a hydroxylových radikálů (vzniklých Fentonovou reakcí (CuCl 2 + H 2 O 2 ) na DNA. Vzorky byly připravovány v objemu 20  l ve fosfátovém nebo Tris-HCl pufru (0,02M). </li></ul><ul><ul><li>Manganistan draselný je silné oxidační činidlo, které reaguje s thyminem a také způsobuje řetězcové zlomy. </li></ul></ul><ul><ul><li>Hydroxylové radikály reagují s bázemi i se zbytky deoxyribóz a jejich působením vznikají řetězcové zlomy. </li></ul></ul><ul><li>Vzorky byly inkubovány 30 minut při 37°C, poté byly přesráženy octanem sodným a etanolem a rozpuštěny ve 20  l 0,2 M NaCl. </li></ul><ul><li>Detekce poškození byla prováděna gelovou elektroforézou a AC voltametrií na HMDE. </li></ul>
  8. 8. Výsledky <ul><li>Koncentrace KMnO 4 (mM) </li></ul><ul><li>K 24 12 6 4 2 1 0,5 K 1 0,5 0,25 0,1 0,05 0,02 0,01 </li></ul><ul><li>Obr . 3 : Modifikace DNA v závislosti na koncentraci KMnO 4 </li></ul>Obr . 2 : Izolace DNA; dráhy: 1. bakteriální lyzát před nanesením na kolonu, 2. vzorek prošlý ekvilibrovanou kolonou, 3. a 4. promývací frakce, 5. eluovaná DNA, 6. 1kb žebřík 1 2 3 4 5 6 ocDNA scDNA
  9. 9. <ul><li>Obr. 4: Modifikace DNA KMnO 4 ; plasmid pBS (75mg/ml) ve fosfátovém pufru </li></ul><ul><li>Obr. 5 : Modifikace DNA KMnO 4 ; plasmid pBS (34.5mg/ml) ve fosfátovém pufru </li></ul>
  10. 10. <ul><li>Obr. 6: Modifikace DNA KMnO 4 ; plasmid pBS (57.5mg/ml) ve fosfátovém pufru </li></ul>
  11. 11. <ul><li>Obr. 7: Modifikace DNA hydroxylovými radikály , plasmid pBS ve fosfátovém pufru </li></ul><ul><li>Obr. 8: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; závislost výšky píků na koncentraci CuCl 2 ; plasmid pBS ve fosfátovém pufru </li></ul>
  12. 12. <ul><li>Obr. 9: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; plasmid pPGM1 (60mg/ml) v pufru Tris-HCl </li></ul><ul><li>Obr. 10: Modifikace DNA hydroxylovými radikály; závislost výšky píků na koncentraci CuCl2; plasmid pPGM1 (60mg/ml) v pufru Tris-HCl </li></ul>
  13. 13. <ul><li>Byl potvrzen vliv KMnO 4 na strukturu plasmidové DNA - tvorba řetězcových zlomů. Elektrochemická detekce poškození při vyšších koncentracích KMnO 4 nebyla možná. </li></ul><ul><li>U vzorků modifikovaných hydroxylovými radikály docházelo k nárůstu obou píků se zvyšující se koncentrací CuCl 2 . </li></ul><ul><li>U vzorků, které byly připravovány ve fosfátovém pufru, se objevilo jen velmi malé zvýšení píku 3 oproti píku 1. Použití fosfátového pufru pravděpodobně zpomaluje reakci. </li></ul><ul><li>U vzorků připravovaných v pufru Tris-HCl v nejvyšších koncentracích došlo k viditelnému zvýšení píku 3, který odpovídá ocDNA. </li></ul><ul><li>Srovnání metod: elektrochemická metoda je rychlejší než elektroforetická. Zdá se, že je také mnohem citlivější ke změnám ve struktuře DNA. </li></ul><ul><li>Signál může být ovlivněn vedlejšími interakcemi látek s elektrodou. </li></ul>

×