Poster 98 parasitologie

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  • 1. Diagnostic de Fasciola hepatica chez Galba truncatula par PCR multiplexe Righi S 1 ., Benakhla A. 1 , Mekroud A. 2 , Ouchene N. 1 , Sedraoui S. 1 1- Institut des Sciences Vétérinaires, Centre Universitaire d’El Tarf, El Tarf, Algérie 2 - Institut des Sciences Vétérinaires, Université de Constantine. Constantine, Algérie 2011 Parasitologie Parasitology Poster 98
  • 2. Résumé La fasciolose à Fasciola hepatica , est l’une des parasitoses les plus répandues dans le monde, elle affecte principalement les ruminants domestiques et est responsable de pertes économiques importantes (saisies de foie) ainsi qu’une diminution des performances zootechniques (Mage, 1988 ; 1989). De nombreux outils de diagnostic sont utilisés pour dépister la maladie chez l’hôte définitif, cependant les méthodes relatives à la détection de l’infestation naturelle chez le mollusque reposent essentiellement sur l’écrasement, la dissection microscopique, l’observation de l’émission cercarienne. Ainsi des prévalences de l’infestation naturelle de G. truncatula dépistées par observation sous loupe binoculaire allant de 0,3% à 10,4% ont été relevées dans trois régions (Jijel, Constantine et El Tarf) (Mekroud, 2004). Une méthode plus spécifique et hautement sensible (PCR) a été mise au point en utilisant une séquence d’ADN spécifique du génome de Fasciola sp. (Kaplan et al ., 1995 ; Caron et al ., 2007). Cette technique a été optimisée par l’utilisation d’un protocole d’extraction d’ADN novateur, rapide et peu onéreux ainsi que par la mise en place d’un contrôle interne (PCR multiplexe) permettant d’éliminer les résultats faux négatifs (Caron et al , 2011) . La présente étude a pour but l’utilisation d’une PCR multiplex e afin d’établir pour la première fois sur base moléculaire la prévalence de F. hepatica chez G. truncatula en Algérie. Introduction La fasciolose à Fasciola hepatica est une importante parasitose qui sévit largement en Algérie ainsi, la wilaya d’El Tarf est considérée comme une région endémique lourdement touchée par cette affection. La détection de l’infestation naturelle par Fasciola hepatica de l’hôte intermédiaire représenté en Algérie par Galba truncatula est traditionnellement basée sur les méthodes microscopique. Nous développons dans ce travail l’utilisation pour la première fois de la PCR multiplexe pour le diagnostic de l’infestation naturelle des mollusques prélevés dans la région d’El Tarf. Deux primers ont été utilisés pour amplifier à la fois le fragment d’ADN de 124 pb (paire de base) spécifique de Fasciola sp et la séquence ITS2 de mollusque (± 500pb). Une mise en lots a été réalisée dans l’analyse des mollusques (75 lots). L’étude a concerné 722 mollusques récoltés dans des habitats typiques (fossés de route, mares, cours d'eau et falques) au niveau de cinq localités dans la wilaya d’EL Tarf et sur les 722 mollusques, la bande du contrôle interne n’a pas pu être amplifiée pour 24 mollusques, ils ont donc été exclus pour le calcul des différentes prévalences. La prévalence de l’infestation a été estimée à 10,74 % (75/698). Les limnées de grandes tailles ont été les plus infestées
  • 3. Matériels et méthodes
    • A. Région d’étude
    • La wilaya d’El Tarf (Figure n° 1) se situe à l’extrême Nord-Est de l’Algérie. Elle est constituée de deux ensembles nettement différenciés au Nord et au Sud. La partie Nord se caractérise surtout par des plaines alluviales. La structure du sol est argilo sableuse et le climat est sub-humide à humide chaud. La partie Sud est constituée d’un relief plus important. Le sol est de nature argileuse rouge peu perméable. Le climat est humide à humide frais.
    • La wilaya d’El Tarf possède un complexe humide formé de plusieurs lacs, oueds et barrages.
    Figure n°1  : Présentation de la wilaya d’El-Tarf . B. Les mollusques ( Galba truncatula ) Les échantillons de mollusques retenus pour l’étude ont été pris au niveau de cinq localités dans la wilaya d’El-Tarf (Boutheldja, Lac des oiseaux, El Matrouha, El Guergour et Oued El Hout). Les prélèvements ont été réalisés dans des biotopes typiques (mares temporaires, cours d’eau, fossés de route et flaques). Nous avons utilisé pour la récolte des limnées la technique des quadrats (1 m2) soit par chasse à vue soit en utilisant le passoir. La méthode des quadrats consiste à collecter les mollusques présents au niveau du sol, la végétation ou dans l’eau dans un périmètre de 1 m2 pour chaque habitat ( Mekoud, 2004). Les mollusques ont été rincés avec de l’eau et mis par la suite dans des tubes étiquetés contenants de l’alcool à 70° pour conservation. La densité des mollusques pour chaque habitat a été notée en comptant sur 3 m2 pris au hasard et en établissant par la suite la moyenne. (Tableau n° 1) Tableau n°1  : Valeurs concernant les habitas prospectés, effectifs de limnées ainsi que le taux d’infestation par Fasciola hepatica. 21,95 35 5 41 Oued El Hout 14,10 36 14 80 EL Matrouha 13,24 96 64 323 Lac des oiseaux 6 143 7 101 El Guergour 5,08 44 33 177 Boutheldja Taux d’infestation (%) Densité des limnées (l/m2) Superficie totale des habitats (m²) Nombre de limnées Prélevées Région
  • 4.
    • C. Extraction d’ADN de Mollusques
    • L’extraction d’ADN a été effectuée en utilisant du Chelex ® (Biorad, Nazareth Eke). Chaque mollusque a été broyé dans 100 µl d’une solution chelex® à 5%. Les broyas ont été ensuite incubés pendant une heure à 56 °C et 30 minutes à 95 °C puis centrifugé à 13 000 tr/mn pendant 7 minutes. L’ADN a été mesuré au nanodrop et le surnageant a été par la suite récupéré et stocké à
    • -20°C.
    • Des lots ont été réalisés en regroupant l’ADN de 10 mollusques à raison de 1µl d’ADN pour chaque mollusque et ce en vue de réduire le nombre de PCR.
    • D. La PCR Multiplexe
    • La PCR Multiplexe utilisée dans notre travail a été précédemment décrite (Caron et al ., 2011). L’ADN de 722 mollusques a été amplifié par la technique PCR Multiplexe à l’aide d’un appareil PCR et d’un kit (Tac PCR Master Mix, Qiagen). Cette dernière amplifie à la fois le fragment d’ADN de 124 pb (paire de base) spécifique de Fasciola sp . (Kaplan et al ., 1995 ; Caron et al ., 2007) et la séquence ITS2 de mollusque (± 500pb).
    • La séquence ITS2 a été utilisée comme contrôle interne pour détecter les éventuelles inhibitions de la PCR.
    • Les amorces utilisés sont respectivement : Fsh1 (sens) 5'-GAT-CAA-TTC-ACC-CAT-TTC-CGT-TAG-TCC-TAC-3' et Fsh2 (antisens) 5'-AAA-CTG-GGC-TTA-AAC-GGC- GTC-CTA-CGG-GCA-3' correspondent aux deux extrémités de 30 paires de base (pb) d’un fragment d’ADN de 124 pb spécifique de Fasciola sp. et News2 (sens) 5’-TGT-GTC-GAT-GAA-GAA-CGC-AG-3’ et Its2Rixo (antisens) 5’-TTC-TAT-GCT-TAA-ATT-CAG-GGG-3’ pour l’ITS 2 (Almeyda-Artigas et al ., 2000; Bargues et al ., 2001).
    • Notons que ces mollusques ont été tous mesurés sur papier millimétré avant d’être analysés par PCR Multiplexe. Ils ont ainsi été répartis en quatre classes de taille de 3 à 4,9 mm, de 5 à 6,9 mm, de 7 à 8,9 mm et en dernier les mollusques d’une taille supérieure à 9 mm.
    • E. L’électrophorèse
    • Après amplification, une électrophorèse a été réalisée sur un gel d’agarose à 2% préparé dans du tampon TAE contenant du bromure d’ethidium. Le rouge de crésol est utilisé pour visualiser le front de migration. L’électrophorèse est effectuée sous une tension de 90V, puis le gel est visualisé sous UV et photographié.
  • 5. Résultats
    • A. Résultats de la PCR Muliplexe
    • Les résultats de la PCR multiplexe effectuée sur 75 lots (722 mollusques) ont montrés une prévalence de l’ordre de 46,66 % pour les lots (35/75 lots étaient positifs). Sur les 722 mollusques, la bande du contrôle interne n’a pas pu être amplifiée pour 24 mollusques, ils ont donc été exclus pour le calcul des différentes prévalences.
    • Pour les 35 lots positifs, 75 mollusques se sont révélés porteurs de F. hepatica ce qui montre un taux d’infestation global de 10,74 %. (figure n° 2)
    Figure n°2: Gel d’électrophorèse obtenu suite à la PCR multiplexe: (M) poids moléculaire; (1), (4), (5), (7), (8), (9), (10) limnées négatives; (2), (3), (6) limnées positives; (C-) control négatif; (C+) control positif
  • 6.
    • B. Prévalence en fonction des régions  
    • Les prévalences obtenues en fonction des régions vont de 5,08 % à 21,95 %. Dans la région de Boutheldja, la prévalence observée est de 5,08 % ; 6 % pour la région d’El Guergour ; 13,24 % pour le Lac des oiseaux ; 14,10 % pour El Matrouha et enfin 21,95 % pour Oued el hout.
    • C. Prévalence en fonction de la taille des mollusques
    • Les résultats de l’infestation des mollusques en fonction de la taille n’ont pas montré des différences significatives pour les trois premières classes de taille. Nous avons noté des taux d’infestation de l’ordre de : 10,66 % pour les mollusques de taille comprise entre 3 et 4,9 mm, 9,87 % pour les mollusques de taille comprise entre 5 et 6,9 mm, 10,34 % pour les mollusques de taille comprise entre 7 et 8,9 mm. Par contre le taux d’infestation le plus élevé (30,43 %) a été noté sur les mollusques dont la taille était de 9mm et plus.
  • 7. Discussion et conclusion
    • L’utilisation du Chelex ® pour l’extraction d’ADN de mollusques a montré plusieurs intérêts. En effet, cette résine chélatante de forte affinité pour les ions métalliques polyvalents a permis d’obtenir de l’ADN amplifiable en un temps très court et à moindre coût et sans utilisation de solvant toxique. Ce qui n’est pas le cas de la technique classique utilisant le phénol/chloroforme et la protéinase K. (Caron et al., 2008 ; Garcia Gonzalez et al ., 2004). Cette technique d’extraction d’ADN est ainsi idéale pour traiter des effectifs importants.
    • C’est la première fois que la prévalence de F. hepatica chez G. truncatula a été obtenue par la technique PCR multiplexe en Algérie. Cette dernière a été utilisée du fait de l’élimination possible des résultats faux négatifs par l’interprétation de la présence ou absence de la bande du contrôle interne.
    • La PCR multiplexe a permis de mettre en évidence un taux d’infestation par F. hepatica s’élevant à 10,74 % dans la région d’El Tarf. Cette prévalence est inférieure à celle notée dans la région de Boutheldja en 2008 (18,64 %) obtenue par la PCR classique (Righi et al ., 2009). Cette différence de prévalences obtenues dans les deux études peut être expliquée par le fait que dans le présent travail, l’effectif de mollusques analysés est plus important, l’échantillonnage a été effectué au niveau de différents biotopes et les prélèvements ont été réalisés pendant les mois de janvier, février et mars comparativement à la première étude réalisée en 2008 où les auteurs ont travaillé sur un seul échantillon et de plus prélevé au mois d’avril (période où l’infestation naturelle des mollusques est importante).
    • néanmoins, il faut noter que l’infestation globale des différentes régions reste en dessous du taux réel de l’infestation de la wilaya de El-Tarf, étant donné que non seulement, les animaux sont conduits en élevage extensif au niveau des différentes régions prospectées dans ce travail mais que également cette wilaya humide est connue comme l’une des wilayates les plus lourdement touchée par la fasciolose et que les pertes occasionnées par cette dernière, ne sont pas négligeable au niveau des abattoirs.
    • Les résultats obtenus sur l’infestation des mollusques en fonction de la taille ont montré globalement une infestation plus marquée chez les limnées mesurant 9mm et plus avec une prévalence de 30,43%, les limnées appartenant aux autres classes de taille ont montré une prévalence sensiblement identique pour les mollusques de taille comprise entre 3 et 4,9mm, entre 5 et 6,9mm et entre 7 et 8,9mm. Nos résultats corroborent ceux obtenus par (Kaplan et al. , 1997).
    • Notons cependant, que notre échantillon est biaisé et qu’uniquement 23 mollusques sur les 722 analysés appartenaient à la classe de taille 9mm et plus.
    • Des études épidémiologiques avec des analyses PCR multiplexe effectuées sur un grand effectif seront d’une grande utilité en vue de mettre en place un programme de lutte adéquat.
  • 8. Bibliographies
    • - ALMEYDA-ARTIGAS R.J., BARGUES M.D., MAS-COMA S. ITS-2 rDNA sequencing of Gnathostoma species (Nematoda) and elucidation of the species causing human gnathostomiasis in the Americas. J. Parasitol . 2000, 86 , 537–544.
    • - BARGUES M.D., VIGO M., HORAK P., DVORAK J., PATZNER R.A., POINTIER J.P., JACKIEWICZ M., MEIER-BROOK C., MAS-COMA S. European Lymnaeidae (Mollusca: Gastropoda), intermediate hosts of trematodiases, based on nuclear ribosomal DNA ITS-2 sequences. Infect. Genet. Evol , 2001, 1 , 85–107.
    • - CARON Y., LASRI S., LOSSON B. Fasciola hepatica : An assessment on the vectorial capacity of Radix labiata and R. balthica commonly found in Belgium. Vet Parasitol , 2007, 149 , 95-103.
    • - CARON Y., RONDELAUD D., LOSSON B. The detection and quantification of a digenean infection in the snail host with special emphasis on Fasciola sp. Parasitol. Res, 2008, 103 , 735-744.
    • - CARON Y., RIGHI S., LEMPEREUR L., SAEGERMAN C., LOSSON B. An optimized DNA extractionand multiplex PCR for the detection of Fasciola sp. In lymnaeid snails. Vet. Parasitol, 2011, 178 , 93-99.
    • - GARCÍA GONZÁLEZ L. A., RODRIGO TAPIA J. P., SÁNCHEZ LAZO P., RAMOS S., SUÁREZ NIETO C. DNA extraction using chelex resin for the oncogenic amplification analysis in head and neck tumours. Acta Otorrinolaringol Esp , 2004, 55 , 139-144.
    • - KAPLAN R. M., DAME J. B., REDDY G. R., COURTNEY C. H. A repetitive DNA probe for the sensitive detection of Fasciola hepatica infected snails. International Journal for Parasitology , 1995, 25 , 601-610.
    • - KAPLAN R. M., DAME J. B., REDDY G. R., COURTNEY C.H. The prevalence of Fasciola hepatica in its snail intermediate host determined by DNA probe assay. International Journal for Parasitology , 1997, 27 , 1585-1593.
    • - MAGE C. Contribution à l’étude de la fasciolose à Fasciola hepatica L . chez les bovins allaitants dans le limousin et la cerdagne (France). Conséquences zootechniques et essais thérapeutiques, Limoges, thèses Doct. Univ. Limoges, 1988, n°3, 142 p.
    • - MAGE C. Epidémiologie de l'infestation par Fasciola hepatica chez les bovins en Limousin. Revue de Médecine Vétérinaire , 1989, 140 , 407-411.
    • - MEKROUD A. Contribution à l’étude de la distomatose à Fasciola hepatica linnaeus 1785, dans le Nord Est Algerien. Recherches sur les ruminants et le mollusque hôte, Thèse d’Etat en Sciences Vétérinaires, Université de Constantine, 2004, 299 p.
    • - RIGHI S., CARON Y., LOSSON B., BENAKHLA A. Comparaison des performances de la PCR et de la technique d’écrasement dans la détection des formes larvaires de Fasciola hepatica chez Galba truncatula dans la région d’El Tarf : Résultats préliminaires. Revue sciences et technologie , 2009, 29 , 21-24.
    Nous tenons à exprimer nos vifs remerciements au Professeur Losson Bertand et au Docteur Caron Yannick de la faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Liège (Belgique) pour leur soutien matériel, leur aide précieuse et assistance technique dans la réalisation des analyses de PCR multiplexe (Laboratoire de Parasitologie et des maladies Parasitaires). Remerciements