Your SlideShare is downloading. ×
Blat de moro_de_laboratori
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply

Blat de moro_de_laboratori

495

Published on

Published in: Health & Medicine
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
495
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
1
Actions
Shares
0
Downloads
1
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Carla BadiaLaura MontonNatàlia Muñoz Maria Vilà
  • 2. INTRODUCCIÓEn aquest treball us volem presentar la pràctica, realitzada allaboratori de Biotecnologia Vegetal Aplicada de l’EscolaTècnica Superior d’Enginyeria Agrària de la Universitat deLleida, sobre el processament de les mostres d’ADN perconèixer la seva qualitat i la possibilitat de posteriorsaplicacions en el camp de la transgènesi. L’ADN, o àcid desoxirribonucleic, és la molècula que conté la informació genètica de tots els éssers vius, amb excepció d’alguns virus.
  • 3. Guió del procediment de la pràctica:1.Procés d’extracció d’ADN:- Lisi inicial de les cèl·lules de la mostra.- Separació del ADN de la resta de molècules de la cèl·lules.2. Anàlisi de la mostra d’ADN per conèixer el seu estat:- Electroforesi- Transil·luminador3. Aplicació de diverses tècniques relacionades amb la transgènesi a la mostra en bon estat.
  • 4. 1.EXTRACCIÓ D’ADN
  • 5. 1. Prenem les mostres (fulles de blat de moro) i lescongelem en nitrogen líquid. -A partir d’una fulla de blat de moro, tallem 4 fragments que aproximadament pesessin uns 20 grams. -Els emboliquem amb paper d’alumini per tal de tenir la mostra controlada i evitar que s’esmicolin, quan les posem en Nitrogen líquid.Tallant i pesant les mostres pertal de que mesurin aprox. uns20 grams.
  • 6. - Aboquem una certa quantitat de nitrogen líquid del tanc gran a un petit bidó per poder treballar amb més comoditat. Hem de vigilar de no tocar el nitrogen líquid perquè ens podríem cremar.Tanc de nitrogen líquid - Col·loquem les 4 mostres dins del bidó i les hi deixem durant un minut. Bidó de nitrogen líquid
  • 7. 2. Triturem les mostres congelades amb l’ajuda d’unmorter, i en presència de nitrogen líquid, fins a obteniruna pols fina. -Amb l’ajuda d’unes pinces agafem les mostres de l’interior del bidó. -Les desemboliquem i en posem una a cada morter. Morter i espàtula Traient les Desembolicant mostres del bidó una mostra
  • 8. - Afegim nitrogen líquid dins del morter junt amb la mostra i el comencem a triturar. Cal afegir nitrogen al morter cada cop que s’hagi evaporat per tal que no es degradi l’ADN.Triturant les fulles de blatde moro amb el nitrogenlíquid. - Cal repetir l’operació anterior fins que la mostra quedi totalment una pols fina.
  • 9. 3. Transferim la pols a un tub i hi afegim tampód’extracció. - Amb una espàtula de metall, passem la pols que tenim al morter cap al tub.Passant la pols del morter al tub.- Amb una pipeta afegim tampód’extracció al tub on ja hi tenim la polstransferida.El tampó d’extracció és una solució que conté detergents i sals, entrealtres compostos, que provocaran la disrupció de les membranescel·lulars i el trencament de les cèl·lules de la mostra.
  • 10. 4. Barregem bé la mostra i la deixem en agitació. - Barregem bé la mostra amb el tampó d’extracció. Per tal que quedi tot ben barrejat, utilitzem l’aparell que es veu en la fotografia.Barrejant la mostra. - Un cop barrejat, ho deixem en agitació durant 10 minuts. En agitació durant 10 minuts.
  • 11. 5. Incubem els tubs a 65ºC durant 10 minuts.- Després de 10 minuts en agitació,posem els tubs a la incubadora a 65ºCdurant 10 minuts.- La temperatura de la incubadora esregula segons la temperatura del’aigua que hi ha, i els tubs esmantenen al bany maria. Incubadora amb els tubs.- La temperatura elevada agilitza el procés de disrupció cel·lular.
  • 12. 6. Realitzem una extracció amb fenol-cloroform.- Aquest procediment permet retirar lesproteïnes de la mostra, juntament ambaltres restes cel·lulars. Fenol-cloroform que vam utilitzar a la pràctica El fenol-cloroform desnaturalitza les proteïnes que s’han alliberat a la dissolució amb el trencament de les cèl·lules, i que podrien lligar-se a l’ADN o degradar-lo, en el cas d’alguns enzims.
  • 13. 7. Tractament amb RNAsa durant una hora a 37ºC.Ribonucleasa, més coneguda com RNAsa, és unenzim (nucleasa) que catalitza la hidròlisi dARN encomponents més petits. Poden classificar-se enendonucleases i exonucleases, i comprenen diversessubclasses dins de les classes denzims EC 3.18. Repetim l’extracció amb fenol-cloroform perretirar l’enzim RNAsa de la mostra. Obtindrem unasolució aquosa on hi haurà bàsicament ADN idiverses sals.
  • 14. 9. Afegim isopropanol a la solució aquosa.- L’ADN no és soluble en alcohol i, per tant, l’addició d’isopropanolprovoca la precipitació d’aquest. Quan precipita, les diferentsmolècules d’ADN de la mostra s’agrupen formant un aglomerat que,si hi ha prou quantitat, es fa visible amb un color blanquinós. Afegint l’isopropanol.
  • 15. L isopropanol és un alcohol incolor, inflamable, amb una olor intensa.És molt miscible amb l’aigua. La seva fórmula química semidesenvolupada és H3C-HCOH-CH3. És l’exemple més senzilld’alcohol sencundari, on el carboni del grup de l’alcohol està unit alsaltres dos carbonis. És un isòmer del propanol.L isopropanol s’utilitza molt en la neteja de les lents d’objectiusfotogràfics i contactes d’aparells electrònics, ja que no deixa marquesi és de ràpida evaporació.La seva obtenció es dóna per mitjà de l’oxidació del propè amb àcidsulfúric o per hidrogenització de l’acetona. Fórmula química de l’ isopropanol
  • 16. 10. Efectuem una etapa de rentat amb una soluciód’etanol al 70% per tal de retirar part de les salsassociades a l’ADN.11. Retirem l’etanol i diluïm l’ADN en el volumd’aigua que desitgem.12. Agafem l’ADN precipitat amb l’ajuda d’unapipeta, i el dissolem en el volum d’aigua quedesitgem.
  • 17. 2. ANÀLISI DE LAMOSTRA DE DNA:ELECTROFORESI
  • 18. Tècnica de l’electroforesi Consisteix en introduir una mostra del nostre ADN en un gel porós (gel d’agarosa) sota l’influencia d’un camp elèctric que provocarà el desplaçament de les molècules d’ ADN a través del gel. Les molècules d’ADN estan carregades negativament, de manera que es desplaçaran cap al pol positiu. Totes les molècules d’ ADN tenen la mateixa càrrega per unitat de mida, i per tant el seu desplaçament a través del gel depèn del tamany de la molècula. En acabar l’electroforesi tindrem un gel on es trobaran separades les diferents molècules d’ ADN segons la seva mida, distribuïdes en diferents bandes. Per dur a terme una electroforesi, primer cal preparar el gel i les mostres:
  • 19. Preparació del gel d’agarosa L’agarosa és un polímer que a temperatures elevades es troba en estat líquid i quan es deixa refredar adquireix una consistència gelosa. Agafem agarosa en pols i el tampó TBE i afegim aigua destil·lada. Posem la mostra al microones per tal d’escalfar-la a uns 50-60ºC, per obtenir-ne una consistència líquida. Afegim el bromur d’etidi: El bromur d’etidi es lliga a l’ADN tot intercalant-se amb les bases dels àcids nucleics, i produeix fluorescència de color taronja - vermell en exposar-se a la llum ultraviolada, cosa que permet detectar la presència de l’ADN dins el gel en passar la mostra resultant de l’electroforesi pel transil·luminador.
  • 20.  El deixem refredar una mica, procurant que encara no agafi consistència gelatinosa. Omplim el motlle en el que es dura a terme l’electroforesi. Quan el gel ha adquirit la consistència gelatinosa, omplim la cubeta amb buffer d’electroforesi, que és l’encarregat de donar unes condicions òptimes per tal de que les molècules d’ADN puguin córrer a través del gel. Pesant la pols d’agarosa. Barrejant l’agarosa, el tampó i l’aigua destil·lada, en calent.
  • 21. Preparació de les mostres Per preparar les mostres barregem l’ADN amb tampó de càrrega, cosa que permet que la mostra caigui directament al pou, quan és injectada en el gel, i que en canvi no es dissolgui amb el buffer d’electroforesi. Preparem cinc mostres de les quals dos estan formades per ADN no transgènic, dos per ADN convencional i la última per un marcador de pes molecular. EL MARCADOR DE PES MOLECULAR És una dissolució que conté una barreja de molècules d’ADN amb unes mides determinades, de manera que després de lelectroforesi formen un patró de bandes concret que ens serveix per conèixer la mida de les bandes de les nostres mostres mitjançant la comparació de les mostres
  • 22. Preparant la mostra: en la primera imatge, col·locant eltampó de carrega i en la segona les mostres d’ADN en si.
  • 23.  Procedim a introduir les mostres en el gel d’agarosa, muntem el kit d’electroforesi i el posem en funcionament durant 30 minuts aproximadament. Introduint les mostres un cop Kit d’electroforesi ja muntat ja han estat preparades en el i en ple funcionament. gel d’agarosa.
  • 24. Transil·luminador En acabar el procediment, introduïm el gel en un transil·luminador que ens permetrà obtenir una visió de les bandes d’ADN dins del gel, i posteriorment analitzem els resultats obtinguts. Introduint del motlle resultant de l’electroforesi en el transil·luminador.
  • 25. Resultats Els resultats obtinguts gràcies al transil·luminador ens permeten veure l’estat de l’ADN de les mostres. En la imatge obtinguda, podem veure que les tres primeres mostres començant per l’esquerra són molt deficients en quan a qualitat de l’ADN, ja que és una molècula que té un pes molt elevat, i per tant si queda per sota vol dir o que està degradat o que no és ADN sinó que és ARN. En les dues últimes mostres, el resultat és òptim ja que les mostres es queden a dalt, cosa que vol dir que pesen més i que per tant són mostres formades per ADN en bon estat. A partir d’aquí treballarem amb les mostres que ens han donat el millor resultat. El cas que totes ens haguessin sortit deficients, hauríem de tornar a fer l’extracció d’ADN.
  • 26. Imatge del motlle resultant del’electroforesi obtinguda amb eltransil·luminador.
  • 27. 3. APLICACIÓ DEDIVERSES TÈCNIQUESRELACIONADES AMB LATRANSGÈNESI A LAMOSTRA EN BON ESTAT
  • 28. Tècniques relacionades amb latransgènesi a la mostra en bon estatPresentem a continuació les principals opcions que tenim: Si volem comprovar si la planta, de la que hem extret l’ADN, és transgènica o no, podem fer una PCR que ens permet amplificar la seqüència d’ADN del transgen. Si dessitgem aïllar un gen "X" del genoma de la planta per exemple per caracteritzar-lo, també faríem una PCR. Per saber, en cas que es tracti duna planta transgènica, si el transgen sha integrat en un sol lloc del genoma o, si per contra, tenim diverses còpies del transgen repartides en diferents posicions del genoma de la planta, es podria realitzar un Southern Blot.
  • 29.  PCR:Reacció en cadena de la polimerasa:És una tècnica de biologia molecular desenvolupada en 1986, ambl’objectiu d’obtenir un gran nombre de copies d’un fragment d’ADNparticular. SOUTHERN BLOT: És una tècnica de biologia molecular que té com a objectiu hibridar un fragment d’una cadena d’ADN amb una sonda marcada d’ADN complementari per a facilitar la seva detecció i estudi.
  • 30. ValoracióUn cop acabat el treball, tot el grup participant coincidim en la nostra opinió:-Realitzar un treball relacionat amb els transgènics, amb una part pràcticaque, a més, ha estat realitzada en un laboratori específic, ens ha aportatuna visió molt diferent de la que teníem sobre el tema.-Després de realitzar la pràctica, recopilar les dades i fer el treball, podemdir que hem pogut gaudir d’una experiència molt interessant.-Hem treballat amb gent molt qualificada que en tot moment ha donatresposta a tots els nostres dubtes, hem après tècniques de laboratori, commanipular aparells específics i productes nocius i hem satisfet els objectiusprincipals de la nostra participació en aquest projecte.Per tot això la nostra valoració és absolutament positiva.
  • 31. AgraïmentsVolem agrair: A l’Eduard Pérez Massot i la Gemma Farré Martínez, investigadors del Grup de Biotecnologia Vegetal Aplicada de l’Escola Tècnica Superior d’Enginyeria Agrària de la Universitat de Lleida, per mostrar-nos com és la seva feina al laboratori, amb tanta dedicació i paciència, i deixar-nos-hi participar. A en Jordi Bermúdez Mas, del Departament de Ciències Fisiològiques II de la Universitat de Barcelona, que com a coordinador del projecte Investiga la Ciència de la Societat Catalana de Biologia, s’ha preocupat per atendre les nostres demandes i ha fet tot el possible per facilitar-nos la nostra participació en aquest projecte. A la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnologia (FECYT) que ha posat els mitjans econòmics per a que el projecte sigui una realitat.

×