Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1

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Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1

  1. 1. VirologiaAno Lectivo 2010/11 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I
  2. 2. Testes imunológicos  Baseiam-se em reacções antigénio-anticorpo:  Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar especificamente a um epítopo de um antigénio.  Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2
  3. 3. Anticorpo  Cadeias de glicoproteícas :  Cadeias leves  Cadeias pesadas  Região constante – local de activação de outros elementos dos S. Imune;  Região variável – local de ligação ao antigénioAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 3
  4. 4. Anticorpo Tipos de anticorpos  Policlonais Obtidos a partir de diferentes clones de células;  Monoclonais Obtidos a partir de um único clone de plasmócitosAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 4
  5. 5. Classes de anticorpos no Homem Imunoglobulinas Características IgG Principal Ig sérica Envolvida na activação do complemento e na opsonisação IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda) Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados IgA Presente no soro, secreções e mucosas Tem funções de opsonização. IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como receptor de antigénios. Funções pouco definidas. IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e eosinófilos. Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 5
  6. 6. Antigénio Epítopo  Região do antigénio que reage com o anticorpo  Possibilidade de reacções cruzadas  Pequenas alterações na estrutura do antigénio, entre outras factores, podem afectar profundamente a ligação com o anticorpoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 6
  7. 7. Aplicabilidade  Papel importante: Diagnóstico Monitorização Tratamento  Tipo de amostra varia consoante o que estamos a pesquisarAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 7
  8. 8. Técnicas de Imunologia  Reacções Imunoenzimáticas  ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)  ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)  Imunoflurescência  Imunocromatografia  ImunoHisto/Citoquímica  Análise Proteínas: Western BlotAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 8
  9. 9. Reacções ImunoenzimáticasAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 9
  10. 10. ELISA Baseia-se numa reacção imunoenzimatica com detecção final em espectrofotometria  Permite determinar a concentração do analito  Calcular curva de calibração – interpolar a concentração da molécula a quantificarAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 10
  11. 11. Tipos de ELISA Sandwich 1. Poços revestidos com anticorpo especifico 2. Formação de complexos 3. Ac Secundário (conjugado com a enzima) 4. Adição do substrato 5. Medição por espectofotometriaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 11
  12. 12. Tipos de ELISA Indirecto 1. Poços revestidos com antigénio especifico 2. Formação de complexos 3. Ac conjugado com enzima 4. Adição do substrato 5. Medição por espectofotometriaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 12
  13. 13. Tipos de ELISA Competitivo 1. Ac especificos incubam com a amostra Quanto 2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag maior a concentraçã 3. Ac secundário o de analito 4. Adição do substrato menor a absorvância 5. Medição por espectofotometriaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 13
  14. 14. ELISA Método automatizadoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 14
  15. 15. ELFA Reacção imunoenzimatica com detecção final em fluorescência.  Permite fazer um análise quantitativa  Curva de calibraçãoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 15
  16. 16. ELFA  Teste, geralmente, automatizado onde é necessário:  Um cone sensibilizado com Ag, serve, tanto de fase sólida como sistema de pipetagem  Uma barrete que contem os reagentes necessários para a realização da técnicaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 16
  17. 17. ImunoflurescênciaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 17
  18. 18. Imunoflurescência  Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos  O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência  A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência  Fluorocromos mais usados  Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)  RodaminaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 18
  19. 19. Imunoflurescência  Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi- quantitativa  Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.  Tipos de Imunoflourecênca  Directa  Indirecta  Anti-complementoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 19
  20. 20. Imunoflurescência Indirecta  Etapas ▫ Fixação (quando queremos pesquisar Ac as laminas vêm revestidas com o respectivo Ag); ▫ Ac primário ▫ Ac Secundário (marcado com um fluorocromo); ▫ Reagente de contrasteAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 20
  21. 21. Imunofluorescência anti-complemento  Etapas ▫ Inactivação do complemento endógeno ▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo ▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado ▫ Ac conjugado que se liga ao complemento ▫ Detecção por microscopia de fluorescênciaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 21
  22. 22. Imunofluorescência  Resultados Permite localizar o analito EX: Membrana celular Análise com o corante de contrasteAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 22
  23. 23. Imunofluorescência  Resultados Pesquisa de anticorpos: resultado positivo (fluorescência verde) Pesquisa de anticorpos: resultado negativoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 23
  24. 24. ImunocromatografiaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 24
  25. 25. Imunocromatografia  Teste qualitativo  Detecção antigénios virais ou anticorpos  Rápido e simples  Fase móvel: amostra diluida  Fase sólida: membrana revestidaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 25
  26. 26. Imunocromatografia  Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C  Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex  Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis devido às partículas de látexAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 26
  27. 27. ImunoHisto/CitoquímicaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 27
  28. 28. ImunoHisto/Citoquímica  Imunologia e citologia ou histologia  Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais, proteínas)  Diferenças de expressão de proteínas  Localização celular do antigénio  Método qualitativo (maior parte dos casos)  Quantificação relativaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 28
  29. 29. ImunoHisto/Citoquímica  Método directo  Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente com o antigénio  Método Indirecto  Ac primário que se liga ao antigénio  Ac secundário marcado enzimaticamente  Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 29
  30. 30. ImunoHisto/Citoquímica  Principio do método PO+ H2O2+ Dador de electrões  PO+ H2O2+ precipitadoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 30
  31. 31. ImunoHisto/Citoquímica  Passos importantes  Fixação (sol. Alcoólica)  Permeabilizar (detergente)  Ac primário  Ac secundário conjugado  Substrato com agente cromogénio  Corante de contrasteAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 31
  32. 32. Imunohistoquímica  ImunohistoquímicaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 32
  33. 33. Imunocitoquímica  ImunocitoquímicaAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 33
  34. 34. Análise ProteínasAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 34
  35. 35. Western Blot  SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 35
  36. 36. Western Blot  BlottingAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 36
  37. 37. Western Blot  Detecção 1. Bloqueio da membrana 2. Ac primário 3. Ac secundário conjugado 4. DetecçãoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 37
  38. 38. Western Blot  AplicaçãoAula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 38
  39. 39. VirologiaAno Lectivo 2010/11 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I

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