Similaridade genética entre indivíduos e populações distintas

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Similaridade genética entre indivíduos e populações distintas

  1. 1. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008 SIMILARIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS E POPULAÇÕES DISTINTAS DE COPO-DE-LEITE (Zantedeschia aethiopica (L.) SPRENG) ATRAVÉS DE MARCADORES RAPD GABRIELA FERREIRA NOGUEIRA1, LUCIANO VILELA PAIVA2, GUILHERME ARAÚJO LACERDA3, MICHELE BUENO MOURA PEREIRA4, EVÂNIA GALVÃO MENDONÇA5, PATRÍCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA6, RENATO PAIVA7RESUMOO copo-de-leite (Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) é bastante apreciado pela beleza eversatilidade sendo utilizado tanto como flor de corte na composição de arranjos floraisquanto em paisagismo. O objetivo deste trabalho foi o estudo da similaridade genética entreindivíduos e populações de copo-de-leite a partir de três origens de cultivo distintas através demarcadores moleculares RAPD. As três origens abordadas foram: Casa de Vegetação noSetor de Paisagismo do DAG/UFLA, denominada Viveiro (V), Mercado Municipal de Lavras(MM) e Casa de Vegetação do município de Montes Claros (MC). O DNA foi extraído apartir de folhas novas, utilizando-se protocolo CTAB para as reações de PCR-RAPD. Umamatriz fenotípica composta de 0 e 1 foi montada, sendo 0 a ausência de banda e 1 a presença.A representação simplificada das similaridades foi realizada pela construção de dendogramaspelo método de agrupamento UPGMA. Dentre os 32 primers inicialmente testados para asreações de RAPD, 27 primers foram selecionados por apresentarem amplificação de pelomenos um produto com padrão adequado (presença ou ausência). Pode-se observar aocorrência de um forte agrupamento das plantas do Mercado Municipal de Lavras e MontesClaros. Esta similaridade sugere um parentesco entre estas origens, sendo consideradasplantas de porte alto em relação as plantas do viveiro. O índice de Shannon demonstrou quequanto maior a diversidade genética, menor a similaridade genética de acordo com oagrupamento UPGMA. O polimorfismo RAPD observado em copo-de-leite possibilitou adiferenciação entre 30 plantas provindas de diferentes locais de cultivo.Palavras-chave: Araceae, diversidade genética, agrupamento UPGMA, índice de Shannon.INTRODUÇÃO O gênero Zantedeschia (Araceae), consiste em oito espécies e duas seções, todas Sul-africanas. A seção Zantedeschia é caracterizada pela presença de um rizoma tuberoso econsiste nas espécies Z. aethiopica e Z. odorata (SINGH et al., 1996). O copo-de-leite(Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) é bastante apreciado pela beleza e versatilidade sendoutilizado tanto como flor de corte na composição de arranjos florais quanto em paisagismo. A flor é apreciada e considerada como símbolo da pureza desde os tempos maisantigos. A propagação pode ser feita através de sementes, divisão de touceiras ou por cultura1 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Agricultura, E-mail: gabi_bioufla@hotmail.com2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: luciano@ufla.br3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:guilherme.lacerda@posgrad.ufla.br4 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:michellebmoura@bol.com.br5 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:evaniafloresta@hotmail.com6 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Agricultura, E-mail: pdeolivei@ufla.br7 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:renpaiva@ufla.br 328
  2. 2. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008de tecidos. Além das inflorescências, as folhas do copo-de-leite também estão sendoutilizadas em arranjos. (ALMEIDA & PAIVA, 2003). De acordo com Yao et al. (1994), Zantedeschia aethiopica exibe herança plastidialbiparental com base na evidência polimórfica do comprimento de fragmentos de restrição,porém estudos sobre a similaridade genética entre indivíduos de uma mesma variedade sãoincipientes. Em um trabalho de suscetibilidade, Z. aethiopica se demonstrou mais resistente quecultivares de seção Aestivae ao patógeno Erwinia carotovora subsp. carotovora (SNIJDER etal., 2004). O que justifica a necessidade de estudos genético-moleculares aprofundados dessaespécie de interesse ornamental. O mercado de plantas ornamentais está em crescimento tanto no Brasil como nomundo, o que traz a necessidade da melhoria da qualidade de mudas (DONINI et al., 2005).Devido ao fato do copo-de-leite apresentar mudas de várias procedências e variedades, comoflores verdes e brancas, tornam-se necessários a sua distinção quanto à origem de seusindivíduos e populações. O objetivo deste trabalho foi o estudo da similaridade genética entre indivíduos epopulações de copo-de-leite a partir de três origens de cultivo distintas através de marcadoresmoleculares RAPD.MATERIAL E MÉTODOSMaterial Foram utilizados neste estudo 10 indivíduos de cada população (origem), sendo estesescolhidos inteiramente ao acaso. As três origens abordadas foram: Casa de Vegetação noSetor de Paisagismo do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras,denominada Viveiro (V), Mercado Municipal de Lavras (MM) e Casa de Vegetação domunicípio de Montes Claros (MC).MétodosExtração e quantificação do DNA Para análise do DNA o material biológico, folhas jovens foram coletadas,identificadas e acondicionadas em saco plástico com gelo e transportadas ao LaboratórioCentral de Biologia Molecular – UFLA. O material foi armazenado em freezer a -80 ºC, até omomento da extração. O DNA foi extraído das folhas novas, utilizando-se protocolo CTABcom adaptações descritas por Ferreira & Grattapaglia (1995). Cerca de 1g de folhas jovensforam maceradas com pistilo e almofariz de porcelana contendo N2 líquido, até a obtenção deum pó fino. Em seguida, o pó foi transferido para microtubos resfriados em N2 líquido eadicionou-se 800 µL de tampão de extração CTAB (2% de CTAB, 100 mM de Tris (pH 8,0),20 mM de EDTA (pH 8,0), 1,4 M de NaCl). Logo em seguida, foi adicionado 2 µL de β-mercaptoetanol a 65ºC em banho-maria por 60 min. A primeira extração dos ácidos nucléicosfoi realizada com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), separando-se a fase orgânica daaquosa por centrifugação a 18000 x g por 5 min, e coletando-se o sobrenadante. À fase aquosano novo tubo foram feitas mais uma extração com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), paraa eliminação de impurezas. A precipitação das moléculas de ácidos nucléicos, contidas nasolução aquosa recuperada após centrifugação com clorofórmio, foi feita pela adição deacetato de sódio 3M (NaAc pH 4,6): isopropanol frio, previamente mantido em freezer a –20°C, na proporção 1:10. Os microtubos foram mantidos em geladeira por um períodomínimo de 30 min. Após precipitação do DNA centrifugou-se novamente por 3 min a 18000 xg a uma temperatura de 20ºC, descartando o material em seguida. A este precipitadoacrescentou-se 300 µL de etanol 70% gelado, e em seguida foi feita uma centrifugação a 329
  3. 3. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 200818000 x g por 3 min a temperatura ambiente. O precipitado formado foi seco em câmara defluxo laminar para secar. Posteriormente, os ácidos nucléicos foram solubilizados em 100 µL de tampão TE (1mM de Tris e 0,1 mM EDTA), e quantificados com o auxílio do fluorímetro Hoeffer DQ 200.Para igualar as diferentes concentrações de DNA a 10 ng/mL, foram feitas, para todos osgenótipos, diluições em tampão TE de acordo com a expressão: Vol TE em µL = [(volume daamostra * concentração da amostra) – (10* volume da amostra)]/10. A partir de então, asamostras se apresentaram totalmente adequadas para as reações de PCR-RAPD.Amplificação via RAPD Moléculas de DNA foram isoladas das 30 plantas utilizadas no trabalho, sendotestados diferentes primers RAPD (série Operon) visando à diferenciação molecular entre osindivíduos. O volume final de cada reação de amplificação foi 12 µL contendo 3 µL de DNA(10 ng/µL) , 1,2 µL Tris-HCl pH 8,4 (20 nmol/L), 0,24 µL de dNTPs (10 µmol/L), 1,8 µL doprimer RAPD (10 µmol/L) correspondente e 0,6 unidades (U) de enzima Taq DNApolimerase. As reações de amplificação foram realizadas em termociclador modelo Mastercycler(Eppendorf, Hanburg, Germany), utilizando-se um programa com desnaturação inicial a 95ºCpor 1 min, seguido por desnaturação 94 ºC por 10 segundos, anelamento a 36ºC por 30segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos. Os passos da desnaturação, anelamento eextensão foram repetidas 34 vezes e, em seguida, a reação foi finalizada por uma extensão a72ºC por 7 min. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose 1,2% (m/v),com eletroforese a 100 V em tampão TAE (0,001 mol/L; EDTA pH 8,0; 0,04 mol/L ta pH8,0; 0,02 mol/L ácido acético) por um período de 1 a 2 h. Após a eletroforese o gel foi corado em solução de brometo de etídio (0,5 µg/mL)por 20 min, lavado em água corrente por 10 min, sendo visualizado sob luz ultravioleta efotografado no equipamento EDAS 290 (Kodak®). Somente foram consideradas as bandasmonomórficas e polimórficas que se apresentaram de forma consistente e reproduzível nosgéis de agarose.Análise dos dados RAPD Para determinar a freqüência de banda para cada indivíduo, foi feita uma análisecuidadosa das fotografias dos géis. Através desta foi montado uma matriz fenotípicacomposta de 0 e 1, sendo 0 a ausência de banda e 1 a presença.Similaridade genética A representação simplificada das similaridades foi realizada pela construção dedendogramas pelo método de agrupamento UPGMA – Unweighted Pair-Group Method,Arithmetic Average (SNEATH & SOKAL, 1973).Índice de diversidade genética O índice de Shannon foi obtido com o software PopGene32 (Version 1.31) (YEH etal., 1999).RESULTADOS E DISCUSSÃO Dentre os 32 primers inicialmente testados para as reações de RAPD, 27 primersforam selecionados por apresentarem amplificação de pelo menos um produto com padrãoadequado (presença ou ausência). Foram obtidas bandas RAPD polimórficos e monomórficasentre os indivíduos avaliados. Das bandas obtidas o polimorfismo foi presente em 62,96%(Figura 1). Os fragmentos amplificados variaram de 1 a 11 locos polimórficos. 330
  4. 4. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008Figura 1. Eletroferograma de gel de agarose 1,2%, corrido a 100 V por 90 min, obtido a partir dos produtos da amplificação por RAPD com o primer OPU 11. A seta indica o padrão de banda considerada no trabalho. Com o propósito de avaliar o poder de discriminação dos marcadores RAPD, combase nas similaridades genéticas obtidas, procedeu-se uma análise de agrupamento UPGMAque resultou no dendograma (Figura 2), onde os genótipos estudados foram separados em 24grupos.Figura 2. Dendograma UPGMA para representação dos 30 indivíduos de copo-de-leite (Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) em função de similaridades genéticas entre elas calculadas, a partir de 53 bandas RAPDs. Onde n = número do indivíduo, temos as populações: Viveiro (Vn), Montes Claros (MCn) e Mercado Municipal (MMn). Pode-se observar a ocorrência de um forte agrupamento das plantas do MercadoMunicipal de Lavras e Montes Claros, sendo que as plantas MM7 e MM8 podem serconsideradas clones já que não há diferença genética entre elas. Esta similaridade sugere umparentesco entre estas origens, sendo consideradas plantas de porte alto em relação às plantasdo viveiro. Para a confirmação da diversidade genética entre as populações estudadas de copo-de-leite avaliou-se o índice de Shannon (SHANNON & WEAVER, 1949) (Tabela 1).Demonstrando assim que, quanto maior a diversidade genética pelo índice, menor asimilaridade genética de acordo com o agrupamento UPGMA. Foi possível observar que a 331
  5. 5. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008população do Viveiro apresenta o maior índice de diversidade e que os desvios padrõesapresentados para as estimativas de similaridade indicam níveis similares de diversidadegenética entre as populações. Os valores de diversidade genética encontrados estão próximosaos encontrados para espécies arbóreas onde, Lacerda et al. (2001) observaram valores deShannon variando de 0,301 a 0,367 para Plathymenia reticulata. Torezan et al., (2005)obtiveram Índice de Shannon igual a 0,410 para indivíduos adultos de Aspidospermapolyneuron. Tais comparações revelam forte evidência de que existem níveis altos devariabilidade genética intrapopulacional.Tabela 1. Variações na diversidade das populações de copo-de-leite (Zantedeschia aethiopica (L.) Spreng) relacionando o índice de Shannon a similaridade genética. (*) Desvio padrão. Populações Índice de Shannon Similaridade Genética Viveiro 0,5098 (0,2415*) 0,68 Montes Claros 0,4333 (0,2786*) 0,89 Mercado Municipal 0,3650 (0,3096*) 0,90 A obtenção de marcadores associados às plantas ornamentais de interesse é bastantedesejável, uma vez que poucos estudos são feitos no intuito de identificar estas plantas. Noentanto, deve ser ressaltado que os estudos realizados neste trabalho visaram apenas à préviadistinção de 30 plantas como clones ou não, estudos mais detalhados com outras espécies dogênero, com um maior número de indivíduos e populações devem ser realizados. Porém asinformações a respeito da variabilidade genética disponível deverão facilitar o trabalho demelhoristas de plantas ornamentais.CONCLUSÃO O índice de Shannon demonstrou que quanto maior a diversidade genética, menor asimilaridade genética de acordo com o agrupamento UPGMA. O polimorfismo RAPDobservado em copo-de-leite possibilitou a diferenciação entre 30 plantas provindas dediferentes locais de cultivo. Com estes resultados foi observado que os indivíduos presentes no Viveiro nãoseriam clones propagados de uma única touceira devido a alta divergência genética entre elese destes das populações do Mercado Municipal e Montes Claros.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASALMEIDA, E. F. A.; PAIVA, P. D. O. Floricultura – 2. Cultivo de copo-de-leite. Editora:UFLA. Lavras, MG. 28p. 2003.DONINI, L. P.; FERREIRA-MOURA, I.; GUISSO, A. P.; SOUZA, J. A. de; VIÉGAS, J.Preparo de lâminas foliares de Aráceas ornamentais: desinfestação com diferentesconcentrações de hipoclorito de sódio. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 72, n.4, p. 517-522, out./dez., 2005.FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores RAPD eRFLP em análise genética. Brasília: Embrapa-CENARGEN, 1995. 220p.LACERDA, D. R., ACEDO, M. D. P., LEMOS FILHO, J. P. e LOVATO, M. B. Geneticdiversity and struture of natural populations of Plathymenia reticulata (Mimosoideae), atropical tree from the Brazilian Cerrado. Molecular Ecology, Queensland, v. 10, n. 5, p.1143-1152, 2001. 332
  6. 6. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008TOREZAN, J. M. D.; SOUZA, R. F.; RUAS, P. M.; RUAS, C. F.; CAMARGO, E. H.;VANZELA, A. L. L. Genetic variabilithy of pré and post-fragmentation cohorts ofAspidosperma polyneuron Muell. Arg. (Apocynaceae). Brazilian Archives of Biology andTechnology, Curitiba, v. 48, n. 2, p. 171-180, Apr/June 2005.SHANNON, C. E.; WEAVER, W. The mathematical theory of communication. Universityof Illinois Press, Urbana, 1949.SNEATH, P. H.; SOKAL, R. R. Numerical Taxonomy: the principles and practice ofnumerical classification. W. H. Freeman, San Francisco, 1973.SINGH, Y.; BAIJNATH, H.; VAN WYK, A. E. Taxonomic notes on the genus ZantedeschiaSpreng. (Araceae) in southern Africa. Southern African Journal Botany, Grahamstown, v.62, p. 321–324, 1996.YAO, J. L.; COHEN, D.; ROWLAND, R. E. Plastid DNA inheritance and plastome-genomeincompatibility in interspecific hybrids of Zantedeschia (Araceae). Theoretical and AppliedGenetics, Berlin/Heidelberg, v. 88, p. 255–260, 1994.YEH, F. C.; YANG, R.; BOYLE, T. PopGene VERSION 1.31, 1999. Disponível em: <http://www.cbiot.ufrgs.br/programas/Windows/Biologia_molecular/PopGen32/> Acesso em03 de set de 2008. 333

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