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Expressão da β glucuronidase (gus) na transformação genética
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Expressão da β glucuronidase (gus) na transformação genética

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  • 1. XVII CONGRESSO DE PÓS-GRADUAÇÃO DA UFLA I ENCONTRO DE ENGENHARIA DE SISTEMAS IV WORKSHOP DE LASER E ÓPTICA NA AGRICULTURA 27 a 31 de outubro de 2008EXPRESSÃO DA β-GLUCURONIDASE (GUS) NA TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE Coffea arabica L. CV. RUBI in vitro VIA Agrobacterium tumefaciens GUILHERME ARAÚJO LACERDA1, LUCIANO VILELA PAIVA2, ANTONIO CHALFUN-JUNIOR3, BRENDA OLIVEIRA E SILVA4, EVÂNIA GALVÃO MENDONÇA5RESUMOO presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório Central de Biologia Molecular daUniversidade Federal de Lavras. Foram utilizados explantes foliares e calos oriundos deplântulas de Coffea arabica L. cv. Rubi obtidas a partir de embriões zigóticos imaturos invitro, cultivadas em sala de crescimento. A agrobactéria, contendo o plasmídio com aconstrução 35S GUS NOS, foi inoculada em meio YEP líquido com o antibiótico kanamicina(50 mg L-1) a 28ºC overnight sob agitação constante (200 RPM). Após este período, 100 µLda cultura acima foi colocada em tubo Falcon contendo 3 mL de meio YEP (sem antibiótico)a 28ºC overnight, sob agitação constante (200 RPM). Posteriormente a Densidade Óptica(D.O.) foi mensurada em 0,94-1,16 nm. A inoculação e co-cultura dos explantes procederam-se sendo os explantes foliares cortados em aproximadamente 0,5 cm2 e colocados em contatocom a cultura bacteriana 2 minutos sob agitação. Após o contato com a bactéria os explantesforam lavados em água destilada estéril e levemente secos em papel toalha estéril. Osexplantes foram co-cultivados com a bactéria por 3 dias sendo colocados em meio PM(Teixeira et al., 2004) acrescido de TIMENTIN 300 mg/mL. A eficiência da transformaçãofoi avaliada após os 30 dias de co-cultivo dos explantes com a agrobactéria através do ensaiohistoquímico de expressão da β-glucoronidase (GUS). Para a análise os explantes foramincubados em tampão de reação contendo: 10mM Na2EDTAH2O, 0,1% Triton X-100, 0,1MNaH2PO4, 0,5M K3Fe(CN)6, e 250 µg.mL-1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-glucuronic acid (X-GLUC, Inalco-USA). A reação foi incubada por 24 horas a 37º C. Depois de decorrido otempo de reação, as amostras foram transferidas para etanol 70%, para retirar a clorofila detecidos verdes e permitir uma melhor visualização da coloração azul. A avaliação daexpressão GUS foi feita com o auxilio do estereoscópio com máquina fotográfica acoplada, asimagens foram registradas digitalmente e gravadas. A eficiência de expressão foi de 10% domaterial podendo estar relacionada ao alto período de co-cultivo. Os experimentos ainda estãoem andamento e a confirmação definitiva da transformação através da técnica de southernblot será confirmada após a regeneração dos explantes.Palavras-chave: transgenia, expressão transiente, in vitro, explante foliar, biotecnologia1 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:guilherme.lacerda@posgrad.ufla.br2 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Química, E-mail: luciano@ufla.br3 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal, E-mail:chalfunjunior@ufla.br4 Universidade Federal de Lavras, Departamento de Biologia, E-mail: brendinha13@hotmail.com5 Universidade Federal de Lavras, Laboratório Central de Biologia Molecular, E-mail:evaniafloresta@hotmail.com 108

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