Enfermedades de camaron_Litopenaeus vannamei

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Enfermedades de camaron_Litopenaeus vannamei

  1. 1. GUÍA TÉCNICA PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS PROGRAMA CYTED ÁREA DE AGROALIMENTACIÓN RED II-D: Red Vannamei Editores: Vielka Morales Q. Jorge Cuéllar-Anjel Autores: María José Almanza Abud Margherita Anna Barracco Jorge Cuéllar-Anjel Donald V. Lightner Emiko Shinozaki Mendes Alitiene Moura Lemos Pereira María Soledad Morales Covarrubias Carlos Pantoja Luciane María Perazzolo Rafael Diego Rosa Agnés Saborio Coze Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira
  2. 2. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos La presentación y disposición en conjunto de: GUÍA TÉCNICA - PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE CAMARONES PENAEIDOS son propiedad de los editores. Ninguna parte de esta obra puede ser reproducida o transmitida, mediante ningún sistema o método, electrónico o mecánico (incluyendo fotocopiado, la grabación o cualquier sistema de recuperación y almacenamiento de información), sin consentimiento por escrito de los editores. Derechos reservados: © 2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel (507) 6671-8936 (507) 6616-0756 email: vielkamorales2003@yahoo.com email: jocuan@gmail.com Panamá Primera edición en español Hecho en Panamá ISBN: 978-9962-661-02-3 Esta obra se citará de la siguiente manera: Todo el libro: Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2008. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp. Ejemplo para citar un capítulo: Pantoja, C. y D.V. Lightner. 2008. Enfermedades virales pp. 55-114. En: Morales, V. y J. CuéllarAnjel (eds.). 2008. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp. Diseño e impresión: New Concept Publications, Inc. (507) 226-7694 Panamá Daniel Ho - Fotografías de portada, contraportada, páginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254 ii
  3. 3. AGRADECIMIENTOS Los editores agradecen la colaboración de Reinaldo Morales y Hugo Pérez Athanasiadis, por la traducción preliminar del portugués al español, de varios capítulos del libro, así como a Roberto Chamorro (Licencia de intérprete público autorizado del Ministerio de Gobierno y Justicia de Panamá, Resolución Nº 28, de 8 de marzo de 1984) por la revisión y perfeccionamiento de los documentos traducidos. De igual manera por la revisión y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (Métodos Moleculares), Dra. Margherita Barracco (Parámetros Inmunológicos), Dr. Carlos Pantoja y Kenneth W. Hasson (Parásitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. María del Pilar Moyano (Métodos de Diagnósticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones de texto). iii
  4. 4. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos IN MEMORIAM ELPIDIO BELTRAME, el hombre incansable y luchador por la camaronicultura en la región, hoy no se encuentra con nosotros, no obstante, su recuerdo permanecerá por siempre en el corazón de todos los que tuvimos la suerte de trabajar a su lado. El Grupo Técnico Asesor (GTA) de la Red Vannamei del CYTED y los autores de esta Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarla a nuestro amigo, hermano y compañero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en el GTA de la Red Vannamei, con aportes de grandes ideas y colaboración desinteresada para sino también en el resto de los países iberoamericanos que conforman esta importante familia CYTED. Gracias por tu contribución a una actividad que seguirá dando respuestas en la generación de empleos y divisas a diferentes países de iberoamerica. iv
  5. 5. PRÓLOGO La camaronicultura tiene sus inicios en la década del ‘60 incrementándose rápidamente en la del ‘70, surgiendo como una de las fuentes de mayores ingresos de divisas por sus elevadas producciones. En la actualidad y según estudios de la FAO, aún especies del género Penaeus (también llamado Litopenaeus). a enfermedades que se reportaron desde la aparición del Taura en los años 93-94 y el Síndrome de la Mancha blanca en los años 98-99, afectando grandemente las producciones y dando como resultado el cierre de muchas empresas, pérdidas de empleos y por ende de ingresos. La industria ha tenido que ir implementando innovaciones tecnológicas y mejoramiento en el manejo de los cultivos de camarón, observándose una lenta recuperación en sus producciones y en la productividad. Sin embargo, con la expansión territorial de esta actividad y el desarrollo de técnicas situación actual en los temas de enfermedades, haya querido compartir sus conocimientos y experiencias de muchos años, a través de esta importante Guía Técnica de Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, diseñada para productores, técnicos, estudiantes una herramienta útil y práctica en su actividad diaria. Como regente de un sector que vela por el desarrollo de las actividades acuícolas en la República de Panamá, nos sentimos honrados de poder expresar la importancia de en Iberoamérica. GUILLERMO A. SALAZAR N. Ministro de Desarrollo Agropecuario Panamá, 2008 v
  6. 6. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos vi
  7. 7. INTRODUCCIÓN El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) ámbito iberoamericano y carácter horizontal. En el marco del CYTED, hay una serie de acciones dentro de las cuales se encuentran las Redes Temáticas, que son asociaciones de grupos de I+D pertenecientes a entidades públicas o privadas de al menos seis países miembros del Programa y cuyas actividades En este caso en particular, la Red denominada FORO PARA LA GESTIÓN DE CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍAS SOBRE EL CULTIVO DE PENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI de la industria camaronera de los países iberoamericanos que se dedican a la actividad. Entre los objetivos logrados por la Red, están las siguientes: constitución de un foro regional de convergencia para los grupos de investigación, productores y sector estatal; fomento de la investigación interdisciplinaria que coadyuva al desarrollo tecnológico en temas relativos al L. vannamei; la promoción en el intercambio de información el establecimiento de un sistema de información electrónico de divulgación periódica, el cual facilitó la transferencia de conocimientos; organización de actividades de de investigación; la ayuda a la consolidación de grupos de investigación y desarrollo, lo mismo que la interacción con los diferentes grupos, a través de redes o foros nacionales y miembros del sector productivo, quienes participaron en las actividades que coordinó la red. Entre los temas de mayor énfasis durante el desarrollo de las actividades de la red, están los relacionados con la genética, buenas prácticas de manejo y, patología e la red: www.mida.gob.pa/CYTEDVANNAMEI. Como última actividad de la red, estuvo la realización de un curso teórico-práctico internacional sobre la patología e inmunología del camarón L. vannamei, donde para el cierre de la red, los facilitadotes del curso acordaron contribuir con el desarrollo de cada capítulo a ellos asignados para la publicación de esta guía, la cual servirá de herramienta básica para estudiantes, empresas y entidades estatales que se dedican a la camaronicultura. Este compromiso desinteresado de parte de cada uno de ellos, es uno de los mejores aportes que quedará plasmado en las acciones que vienen desarrollándose la coordinación de la Red Vannamei. A los autores, amigos y compañeros les extendemos un cordial agradecimiento por toda su colaboración. VIELKA MORALES Q. Coordinadora Red Vannamei vii
  8. 8. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos viii
  9. 9. ÍNDICE DE CONTENIDO Prólogo v Introducción vii Reseñas de los editores y autores xi Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo (Jorge Cuéllar-Anjel) 1 1.1 Anamnesis 2 1.2 Examen clínico 2 1.3 Microscopía Directa 5 1.4 Montajes en Fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) 8 1.5 Bacteriología 18 1.6 Histología 22 1.7 Pruebas con anticuerpos 29 1.8 Métodos moleculares 31 1.9 Capítulo 1 Parámetros inmunológicos 39 1.10 Microscopía electrónica de transmisión 45 1.11 Bioensayos 47 1.12 Capítulo 2 52 Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 55 2.1 Principales enfermedades y métodos de diagnóstico 58 2.2 Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV) 62 2.3 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, WSSV) 70 2.4 Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV) 79 2.5 Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, YHV) 87 2.6 Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV) 92 2.7 Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los cultivos de camarones brasileños (Alitiene Moura Lemos Pereira, Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira) 96 2.8 Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) 104 2.9 Capítulo 3 106 Enfermedades Bacterianas (María Soledad Morales-Covarrubias) 117 3.1 Vibriosis sistémica 120 3.2 Erosión bacteriana del caparazón 122 3.3 Síndrome de Zoea II 124 ix
  10. 10. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos 3.4 Enfermedad de luminiscencia 126 3.5 (NHP-B) Necrosis del hepatopáncreas bacteriana 126 3.6 3.7 130 Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 3.8 Capítulo 4 131 134 Enfermedades por Parásitos (Jorge Cuéllar-Anjel) 135 4.1 Gregarinas 137 4.2 Microsporidios 142 4.3 Haplosporidios 147 4.4 Epicomensales 148 4.5 Metazoarios 154 4.6 Capítulo 5 156 Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donald Lightner) 159 5.1 Micosis 161 5.2 Fusariosis 164 5.3 Capítulo 6 167 Inmunología del Camarón (Margherita Anna Barracco, Luciane María Perazzolo y Rafael Diego Rosa) 169 6.1 Sistema Inmune de los Crustáceos 172 6.2 Inmunoestimulantes 202 6.3 Parametros hemato-inmunológicos como indicadores de salud 204 6.4 Conclusiones y Perspectivas 209 6.5 Capítulo 7 211 Buenas Prácticas De Manejo En La Camaronicultura (Agnés Saborío Coze y María José Almanza) 225 7.1 Código de Conducta para una camaronicultura responsable 229 7.2 Objetivos de un Código de conducta 229 7.3 Buenas Prácticas de Manejo 230 7.4 Características de las Buenas Prácticas de Manejo 230 7.5 Buenas Prácticas de Manejo en Laboratorios de larvas 231 7.6 Buenas Prácticas de Manejo en granjas camaroneras 231 7.7 Buenas Prácticas de Manejo en plantas procesadoras 241 Glosario 243 7.8 x 242
  11. 11. RESEÑAS DE LOS EDITORES VIELKA MORALES Q. Coordinadora Red Vannamei-CYTED vielkamorales2003@yahoo.com Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración, técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica. Consultora para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Ha participado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos. JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá jocuan@usa.net Médico Veterinario, Máster en Microbiología. Experiencia de 18 años en las áreas de cultivo de camarón marino Litopenaeus vannamei; diseño y montaje de laboratorios de patología de camarones (microbiología, histopatología y biología molecular); docencia universitaria en pregrados y postgrados así como investigación aplicada en Producción, Patología, Inmunología y Nutrición de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarón (larvicultura, engorde y maduración) mediante clínica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco, microbiología, histopatología y biología molecular); conferencista en Congresos Internacionales; miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustáceos para las Américas. Ha tenido desempeño laboral en Ecuador, Colombia y Panamá. RESEÑA DE LOS AUTORES MARÍA SOLEDAD MORALES COVARRUBIAS Centro de Investigaciones en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental México, marisol@ciad.mx Maestría y Doctorado en Patología de crustáceos, Licenciatura en Biología Pesquera Investigadora en el área de acuicultura y manejo ambiental del CIAD. Sus principales trabajos cursos en sanidad acuícola y colabora en un programa de transferencia tecnológica, capacitación y consultoría en histopatología de crustáceos, con diferentes países de América Latina. JORGE CUÉLLAR-ANJEL Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Aguadulce, Coclé, República de Panamá jocuan@usa.net La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores” xi
  12. 12. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos AGNÉS SABORIO COZE Universidad Centroamericana (UCA) Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos Managua, Nicaragua. cideauca@gmail.com la Global Alliance Aquaculture para plantas de proceso, granjas de acuicultura y laboratorios. en temas relacionados a la zonas costeras. Elaboración y gestión de proyectos acuícolas. Asistencia Técnica, capacitación y extensión a comunidades costeras. Docente universitaria. Consultora. Relaciones de trabajo con cooperantes de USA, JICA, UE, Universidades y Centros de Investigación como Universidad de Rhode Island, Universidad de Florida, Universidad de como ACRA, GVC, OIKOS entre otras, las Naciones Unidas (FAO) y el Banco de Desarrollo Interamericano. Coordinadora de Redes Internacionales. Directora de Acuicultura. Directora de Centro de Investigación. MARÍA JOSÉ ALMANZA ABUD Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos Universidad Centroamericana (UCA) Managua, Nicaragua almanzaabud@gmail.com Máster en Ciencias Ambientales, Licenciada en Ecología y Recursos Naturales, curso de la Universidad Hawai Hilo. Responsable del área de Físico-química de agua del Laboratorio divulgación y Coordinador de Investigaciones del CIDEA. CARLOS PANTOJA Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología Universidad de Arizona Tucson, Estados Unidos cpantoja@u.arizona.edu Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México). Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigador asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales áreas de trabajo son patología morfológica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero. xii
  13. 13. DONALD V. LIGHTNER Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología Universidad de Arizona Tucson, Estados Unidos dvl@u.arizona.edu PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Licenciatura en Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades infecciosas, virología, histología, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos, nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultoría a la industria camaronicola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero. MARGHERITA ANNA BARRACCO Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil barracco@mbox1.ufsc.br Doctorado en Inmunologia de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesora Titular de Biología Celular, con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y Biotecnología. Investigadora en el área de inmunología de crustáceos y moluscos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a infecciones, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en invertebrados acuáticos, con énfasis en camarones y bivalvos marinos. LUCIANE MARÍA PERAZZOLO Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil luciane@ccb.ufsc.br Maestría en Inmulogía de Crustáceos y Doctorado en Vitelogénesis de Peces. Profesora Asociada de Biología Celular, con participación en el programa de Postgrado en Acuicultura. Investigadora en el área de inmunologia de crustáceos de interés para la acuicultura, con implicaciones en la sanidad. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a las infecciones, caracterización bioquímica y molecular de proteínas inmunes efectoras y/o reguladoras, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de las condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones. xiii
  14. 14. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos RAFAEL DIEGO ROSA Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG), Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA), Florianópolis, SC, Brasil rddr@gmail.com Maestría en Biotecnología aplicada a la acuicultura y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en la inmunología de crustáceos y moluscos bivalvos, en especial en los péptidos antimicrobianos producidos por estos animales. ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRA Embrapa Meio-Norte, Parnaíba, PI, Brasil, alitiene@cpamn.embrapa.br Tecnóloga en Acuicultura, con Maestría y Doctorado en Acuicultura. Investigadora de la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Coordinadora del Núcleo de Investigación en Pesca y Acuicultura da Embrapa Meio-Norte. Responsable por el Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos (LAPOAq). Participa de La Red de Investigación en Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades. Responsable por proyectos en patología, diagnóstico y monitoreo sanitario de camarones cultivados. EMIKO SHINOZAKI MENDES Universidade Fed. Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil esmendes@dmv.ufrpe.br Médica Veterinaria, con Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Doctorado en enfermedades tropicales. Profesor Asociado del Departamento de Medicina Veterinária, y en los programas de pós-grado en Veterinária y de los Recursos Pesqueros y Acuicultura, ambos de la Universidad Federal Rural de Pernambuco. Responsable por el Laboratorio de la Salud de los Animales Acuáticos (LASAq) y Coordinadora actual de la Red de la Investigación en Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades, actuando principalmente en el área de la microbiología. TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRA Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, CE, Brasil cgesteira@labomar.ufc.br Bióloga con maestría en Zoología por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhD en Biología por la Universidad de New Brunswick – Canadá. Trabaja en el área de histología y en histopatología de camarones peneídos. Realiza investigaciones en el área de patologías de crustáceos marinos. Es responsable por la cátedra de Patología de Organismos Marinos y Estuarinos y directora de postgrado a nivel de maestría en el Curso de Ciencias Marinas Tropicales. Es miembro activo de la World Aquaculture Society (WAS) del Consejo Regional de Biología y de la Asociación Brasileña de Patología de Organismos Acuáticos (ABRAPOA).Participa de la “Red de Camarones Marinos del Nordeste” – RECARCINE, subred Enfermedades. xiv
  15. 15. Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
  16. 16. Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Jorge Cuéllar-Anjel Director del Departamento de Patología e Investigación Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Coclé, Panamá Introducción Con base en las principales técnicas utilizadas en la actualidad para determinar enfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos básicos y métodos que sirven como herramienta para realizar diagnósticos y detectar agentes etiológicos en estos crustáceos de gran importancia comercial en la economía mundial. Aunque algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no consiste en una prueba de laboratorio como tal, sino en la interpretación que hace el especialista con base en sus conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio. serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. A Pasos para el diagnóstico: oscuro, con montajes en fresco de tejidos teñidos o sin coloraciones, barridos o montajes en fresco de tiras fecales) sedimento y otros organismos acuáticos) anticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en inglés) o anticuerpos monoclonales (MAbs por sus siglas en inglés) - Sondas de ADN en pruebas de hibridación dot blot directamente con muestras frescas de tejido o con ADN extraído in situ con cortes
  17. 17. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la presencia del patógeno 1.1 Anamnesis diagnóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita Durante esta visita, el técnico debe recopilar la información histórica previa a instalaciones, presencia de animales foráneos al sistema como perros, aves, roedores o vacas, alteraciones en el régimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios en los procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos químicos o biológicos en el cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa o en otras conocidas y, toda aquella información pasada o presente relacionada directa o indirectamente con la población en cuestión. Debe llevarse un registro de esta información obtenida en la empresa, para estudios de correlación con los hallazgos obtenidos en el examen clínico y en las pruebas de laboratorio complementarias que se harán luego de la visita de campo. 1.2 Examen clínico Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalaciones deben evaluarse las unidades de producción (tanques o estanques) que presenten problemas. Se deben realizar capturas de camarones in situ y hacer una revisión individual de animales, para formarse una idea aproximada de la proporción del problema: qué tanta población está afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afecciones observadas en los organismos enfermos y qué tipo de enfermedad puede estar causando el brote. los camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sino seleccionados por presentar alguna manifestación de enfermedad. Con base en los hallazgos de esta valoración clínica, es factible en algunos casos hacer un diagnóstico de enfermedades, está afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermos en exámenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia del profesional especialista en sanidad acuícola. Cuando se eligen camarones que presenten La captura o colección de camarones para realizar un examen que busca determinar la presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mínimo de estrés durante la manipulación de los animales. 2
  18. 18. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Si el examen clínico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y los camarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilización debe hacerse en recipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), con adecuada aireación y teniendo una densidad baja (para evitar el estrés). Si los camarones van a permanecer un período de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, deben tener buena aireación y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27ºC mediante la adición de bolsas con hielo (selladas). animales moribundos, descoloridos, con comportamiento anormal o que presenten otras anormalidades macroscópicas con las cuales se sospeche de una enfermedad. Las principales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante una valoración clínica, son las siguientes: o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos: Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalencia de una enfermedad en una población, los camarones deben ser tomados al azar (no Pantoja. 3
  19. 19. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE EXAMEN CLÍNICO de cultivo mediante el uso de una atarraya, para ser sometidos a un examen clínico. P. vannamei sanos, enfermos y muertos observados en un recipiente de fondo blanco, después de su captura en un estanque de cultivo. Se observan algunos camarones muertos sin apéndices (pereiópodos o pleópodos), debido a que han sido canibalizados por otros camarones. P. vannamei que están siendo observados luego de haber sido capturados en un estanque de cultivo, durante caso de estos 5 camarones, no se observan manifestaciones clínicas de enfermedad. 4
  20. 20. Jorge Cuéllar-Anjel 1.3 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Microscopía Directa (Análisis en fresco) contenido gástrico. Para una evaluación sanitaria con microscopía directa, deben examinarse las muestras lo más pronto posible después del muestreo y después de la preparación del montaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible, o usar muertos frescos que han sido mantenidos en frío (refrigerados o enhielados), o camarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio de campo adecuado, debe usarse para procesar y examinar las muestras lo más cerca del sitio de muestreo. Una aplicación importante del método de microscopía, es el examen del contenido al azar en una población determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente el estómago luego de hacer una disección del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeñas. Se realiza una incisión por la línea media con las tijeras y se extrae el equivalente a una gota de contenido gástrico. Se ubica sobre una lámina portaobjetos y se añade una gota de solución salina. Se coloca luego una lámina cubreobjetos y se hace presión con la Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian los porcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y se afectando el crecimiento, así como realizar correctivos en la dieta de los animales. Los detalles relacionados con la técnica de montajes en fresco, son estudiados más 5
  21. 21. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE MICROSCOPÍA (Montajes en fresco) P. vannamei bajo observación durante un examen clínico. Nótese la presencia de una zona oscura en la parte media del cefalotórax y superior de las branquias abdominal puede deberse al tiempo que han estado fuera del agua (estrés por hipoxia). No se observan manifestaciones adicionales de enfermedad. P. vannamei en el cual se está levantando la cutícula posterior del cefalotórax, para extraer muestras del hepatopáncreas, las branquias y heces del intestino medio, a partir de las cuales se va a preparar un montaje en fresco. de un camarón P. vannamei en donde ya se han colocado bajo el cubreobjetos muestras de hepatopáncreas (izquierda) y branquias (centro). Las heces están siendo extraídas del intestino medio con la ayuda del borde de unas tijeras. 6
  22. 22. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo MÉTODOS DE MICROSCOPÍA (Montajes en fresco) camarón subadulto P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observa gran cantidad de vacuolas lipídicas (reservas de grasa) de colores amarillo y gris y con tamaños proceso de melanización (color marrón) de un una forma alargada siendo más ancho hacia la P. vannamei preparada mediante un montaje en fresco. Se observan 2 lamelas branquiales bifurcadas en su extremo (superior), las cuales presentan melanización de origen tóxico. Sin una muestra de heces de un camarón subadulto P. vannamei. Se observan dos trofozoitos de gregarina Nematopsis sp., uno de ellos con el células (centro), respectivamente. Se puede diferenciar la célula anterior (protomerito) y la célula posterior (deutomerito). Sin tinción. 7
  23. 23. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE MICROSCOPÍA DIRECTA partir de heces de una postlarva (pl-10) de P. vannamei, en la que se observan trofozoitos de la gregarina Paraophioidina sp. (probablemente P. scolecoides). Cada trofozoito está compuesto parásito tiene la particularidad de formar grupos en los cuales varios organismos se adhieren a 1.4 Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) Introducción de la enfermedad. Con el diagnóstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando se determina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sin embargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad varía en diferentes animales acuáticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaroneras y laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situación particular, la precisión esperada y la calidad de un diagnóstico pueden ser directamente afectadas por el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamiento y experiencia de la persona encargada de realizar el diagnóstico, así como por las prácticas de manejo en los sistemas de cultivo. Uno de los objetivos principales en el diagnóstico de una enfermedad de un animal etiológicos de la enfermedad se realiza (o debería realizarse) mediante la aplicación de de camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusiones de rickettsias y virus) a través de microscopía de luz e histopatología (respuesta del etiológicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones. Los agentes patógenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medio acuático no es la excepción. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientras los camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parámetros de cultivo no 8
  24. 24. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo organismos se encuentren enfermos. La gravedad dependerá del nivel de incidencia, de la prevalencia, tipo de patógeno, de su virulencia, de su patogenicidad, de la especie cultivada, de la genética de la misma (ciclo cerrado o silvestres) y el nivel de estrés de los camarones al momento de estar expuestos al patógeno. donde no existían y que en algunos casos se diseminan a las poblaciones silvestres. Análisis en fresco los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la disección del camarón en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patógenos que presenten sus órganos y tejidos. La capacitación para este tipo de análisis consta de un corto entrenamiento básico que profesionales (biólogos, ingenieros en acuicultura, médicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio. Para realizar el diagnóstico del estado de salud de una población se requiere de la selección y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de salud de los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de organismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena selección se tiene que tomar en cuenta lo siguiente: Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o para buscar la prevalencia de patógenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cual que de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra y para la prevalencia su aireación, procurando crearles el menor estrés posible y se trasladan de inmediato al laboratorio para su posterior análisis. Muestreo no aleatorio muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de alguna enfermedad o síndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten señales clínicas tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración rojiza de los pleópodos y telson o cualquier otra alteración que se observe en ellos. Los organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o procedimientos que se hayan elegido para la detección del agente causal de la enfermedad. Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico. 9
  25. 25. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos donde se observan las cuatro áreas diferentes para la toma de organismos en muestreo al azar. donde se observa la compuerta de salida para la toma de organismos en muestreo no aleatorio. Tabla 1. Selección del tamaño de muestra y cálculo del porcentaje de prevalencia de un patógeno la población 2% 5% 50 50 100 75 45 250 110 50 10% 500 20 20% 10 11 25 7 50% 5 2 7 7 10 55 10 7 1,000 140 55 27 10 1,500 140 55 27 10 2,000 145 27 10 4,000 145 27 10 10,000 145 27 10 >/= 10,000 10 40% 150 10
  26. 26. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Para la realización del análisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio en donde se tenga el siguiente material: Portaobjetos Cubreobjetos Navajas de disección Pinzas de disección Cajas de petri Pizetas Guantes Xileno Contenedores para muestras Manuales Desarrollo de la técnica: Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamaño promedio. y en el sexto segmento abdominal, como cutícula delgada (o suave), epicomensales, decoloración, coloración rojiza, melanización, ampollas y necrosis de cutícula porciones se colocan individualmente en portaobjetos limpios (no mezclar porciones), se les adiciona unas gotas de agua de mar estéril y se pone el cubreobjetos; debe procurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ello hay que realizar una leve presión sobre el cubreobjetos con la pinza de disección). Las muestras que se tomarán son: Branquias: Se toma una pequeña porción y se coloca en el portaobjetos para buscar: cambios Zoothamnium Epistylis sp, Acineta, Ascophris, Bodo Leucothrix mucor y Flexibacter sp), detritus del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos, bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusión viral en 11
  27. 27. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Hepatopáncreas: se elimina todo el exoesqueleto del cefalotórax para descubrir el (aumento de tamaño) del órgano. Con unas pinzas, se retira la membrana que cubre lista para ser analizada. Zoothamnium sp. 12
  28. 28. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo el hepatopáncreas y con un bisturí se parte por la mitad para observar la coloración se coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus, gregarinas (trofozoitos y sicigias), bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos, Intestino: el abdomen, se separa del cefalotórax, del telson y de los urópodos para facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (que coloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de agua cuerpos de oclusión de Baculovirus penaei y Monodon baculovirus. Músculo y gónadas: (especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en un estos órganos y tejidos fueron parasitados se deben observar masas de esporas de tamaño y forma uniformes. Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo primera muestra que se analiza es la del hepatopáncreas; después se estudia la muestra creas expuesto para tomar pequeña porción para su análisis. 13
  29. 29. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos adheridas al epitelio y en el lumen del intestino. observan las cápsulas de Ameson nelsoni. 14
  30. 30. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Tabla 2. Formato de reporte para el análisis en fresco. No ________________________ Procedecia. ____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _______________ ______________________________ No. de muertos._____________ No. de examinados. ________________________________ ______________ Peso promedio. __________ ________ Actividad de los camarones Contenido del intestino Presencia de heces en forma de cadena o discontinua coloración Presencia de epibiontes, bacterias y hongos en el camarón Deformidades en el rostrum, antenas abdomen, telson, urópodos y pleópodos Apéndices rotos Melanización (color café claro) Presencia de gregarinas en todos sus estadíos Coloración anormal Características de la cutícula Presencia de masa de bacterias y cantidad de lípidos Coloración Presencia de gregarinas en todos sus estadíos. Presencia de epibiontes Masas melanizadas de hemocitos Nódulos de bacterias en las lámelas branquiales Micosis (hifas, conidios) MÚSCULO Cuerpos de inclusión de WSSV Materia orgánica Color Presencia de melanización y necrosis Microsporidios Síndrome del encalambramiento 15
  31. 31. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Tabla 3. Guía general para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infección, infestación y síndrome (Lightner, 1996). GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS 0 No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito o epicomensal. No presentan lesiones características de síndromes. 1 2 encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas lesiones características del síndrome. Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, características del síndrome. Incremento en la mortalidad si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento). Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan lesiones moderadas a severas, características del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento (cuando existe tratamiento). 4 Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal. Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy letal con altas mortalidades. Tabla 4. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la deformación tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Morales-Covarrubias, 2004). GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS 0 No presentan signos de deformación tubular (0). No presentan lesiones características de síndromes. 1 Presencia muy baja de deformación tubular (1-5/campo/organismo). Se observan muy poco desprendimiento celular. 2 campo/organismo). Presencia de hemocitos y formación de nódulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento. Se observa la presencia alta de deformación tubular (11-20/ campo/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas, formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento. organismo). Se observan severas lesiones como melanización, 4 hemolíticos y presencia de granulomas. Muy letal con altas mortalidades. 16
  32. 32. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo infestación por gregarinas utilizando análisis en fresco. GRADO DE SEVERIDAD 0 1 2 SIGNOS CLÍNICOS No presentan signos de infección por el parásito (0). No presentan lesiones causadas por el parasitismo. Presencia muy baja del parásito (1-15/intestino/organismo). Se observan muy pocas lesiones causadas por el parasitismo como ganismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas por los hemocítico Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento. Se observa la presencia alta del parásito (51-100/intestino/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento. 4 Se observa gran cantidad del parásito (mas de 100/intestino/organismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismo Muy letal con altas mortalidades. Tabla 6. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la infestación por epicomensales en lamelas branquiales. GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS 0 No presentan signos de infección por protozoario (0). No presentan lesiones causadas por epicomensales. 1 Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lámela/organismo). Se observan muy pocas lesiones causadas por los epicomensales, organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas 2 de n’odulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se toman las medidas de corrección. Se observa la presencia alta de protozoarios (10-20/lámela/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por los mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se toman medidas de corrección 4 Se observa gran cantidad del parásito (mas de 20). Se observan tración hemocítica, melanización multifocal y necrosis. Muy letal con altas mortalidades. 17
  33. 33. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Objetivo. tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, así como en agua para / de cultivo. Descripción. La bacteriología es un conjunto de métodos que se utiliza como apoyo en el diagnóstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de la enfermedad está relacionada con presencia de bacterias patógenas en el agua de cultivo o dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentes medios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmente patógenas. Metodología. dependerá de si la captura es aleatoria o, de si se escogen sólo animales enfermos para de muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriología, deben estar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriológica con camarones muertos, debido a que los resultados estarán sesgados por los cambios autolíticos (postmortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos, así como su crecimiento. Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriológico, se deben tener previamente 15 libras de presión (121°C) durante quince minutos. Las asas de platino se esterilizan hipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estéril hasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito. La toma de muestra para análisis bacteriológico tanto de agua de transporte de nauplios como de los mismos nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momento de recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma de muestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: la entrada del tanque y en el centro del mismo. colador pequeño de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol 70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente esterilizado y agregando una cantidad conocida (en mL) de agua de mar estéril o solución salina estéril para la dilución del macerado. desinfectar el área de punción (seno cardíaco –dorsal– o seno hemolinfático –ventral–) con trozos de algodón impregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 mL) nueva y estéril que tenga aguja hipodérmica (muy delgada), se extraen al menos 100 μL 18
  34. 34. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo de la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianos (anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100 selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (género Vibrio), aunque también crecen especies bacterianas de los géneros Pseudomonas, Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras. Para cultivos tripticasa soya) y Agar Marino. Una vez se inoculan los 100 μL de muestra sobre el agar elegido y en condiciones extiende circularmente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipo Seguidamente se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperatura o se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lámina portaobjetos, habiéndola diluido antes en solución salina estéril hasta obtener un grado de 0.5 en la del género Vibrio se observarán como bacilos Gram negativos bipolares. cual existen métodos de observación directa (a trasluz) o utilizando un equipo especial Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones (bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos (antibiogramas), para establecer qué productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas bacterias aisladas. Una vez determinado el antibiótico más efectivo, se puede realizar una prueba para medir la concentración mínima inhibitoria (MIC) de dicho antibiótico, referencia para la medicación de la población afectada de camarones. 19
  35. 35. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA utilizada durante la siembra de muestras de camarones, agua o sedimento en medios de cultivo, para evitar la contaminación con bacterias presentes tos equipos están dotados con entradas de agua, gas y sistemas de vacío, así como luz blanca y luz ultravioleta. utilizado para esterilizar elementos, materiales y reactivos que se utilizan presión producida por vapor de agua, lo que eleva la temperatura a 121ºC, a la cual se exponen los materiales por 15 minutos. 20
  36. 36. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA anticoagulada de un camarón P. vannamei en alcohol cerca del medio de cultivo, para procurar tener un ambiente estéril alrededor de la zona una micropipeta graduada volumétricamente, será esparcido por todo el medio utilizando una el cual se observa crecimiento de bacterias Sucrosa positiva (colonias amarillas). La muestra pertenece a hemolinfa de un camarón P. vannamei y fue incubada durante 24 horas a de las bacterias predominantes. colonias en los platos Petri donde se presentan crecimientos bacterianos. Cada colonia procede de una bacteria, la cual constituye una unidad 21
  37. 37. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos 1.6 Histología Objetivo cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo reproductores. Descripción de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades. Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado. La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el diagnóstico. Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales) adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son Metodología para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones 22
  38. 38. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Para la realización de un estudio histológico en camarones, se requiere de un obtener láminas de óptima calidad, las cuales permitan nitidez óptica en la organización celular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio. Fijación. Corresponde a la preservación de los tejidos en las mismas condiciones estructurales y morfológicas del momento de la muerte del camarón, lo cual como ya se ser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deberá reemplazarse a los 15 días Consiste en eliminar la mayor parte del agua 12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol Bloqueo. bloque. Los moldes plásticos disponibles para bloqueo, permiten además servir como base para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrótomo). Corte. de tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en este equipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le da Recuperación del corte. agua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50ºC aprox.), la cual puede contener una pequeña concentración de gelatina neutra. Las tiras se expanden al entrar en contacto con el agua caliente y así se elige la que presente una estructura más completa del tejido en cuestión. Separada de los segmentos no deseados mediante el uso de un pincel delgado, la porción seleccionada es recuperada con una lámina 23
  39. 39. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos portaobjetos, en la cual quedará adherida de manera permanente y sobre la cual se hará Tinción. y medio de montaje. Una vez teñidas las láminas histológicas, se sellan utilizando una gota de medio de montaje sobre el tejido y un cubreobjetos para proteger la muestra permanentemente. Los tiempos para cada paso pueden ser consultados en Lightner, Los colorantes (o tinciones) son sustancias químicas complejas, a menudo de cuando la propiedad de tinción está en el radical ácido de la sal neutra; tal es el caso del citoplasma y en este caso las estructuras teñidas con colorante ácido son llamadas de las membranas por efecto de la hematoxilina y, el citoplasma de color rosado por efecto de la eosina. Los tejidos se tiñen para aumentar el contraste natural y hacer más evidentes los diversos componentes celulares, tisulares y material extrínseco. Además de los órganos o tejidos, ofreciendo una buena diferenciación. celulares, como el ácido periódico de Shiff (PAS) que resalta de rojo magenta el citoplasma utiliza la tinción de Groccott ya que contienen sales de plata. Aunque las tinciones para hongos suelen tener sales de plata, también se utilizan para detectar bacterias como espiroquetas (Levaditi) y bacilos ácido-alcohol resistentes (Zihel-Neelsen). Otras tinciones (rickettsias), Kinyoun (bacterias ácido-alcohol resistentes), McManus´PAS (glicógeno y Montaje. se deshidrata el corte con alcoholes a concentraciones crecientes, pasando después de alcohol absoluto a una solución de agente aclarante. Posteriormente, se coloca una gota de bálsamo de Canadá (medio de montaje) y se cubre con el cubreobjetos dejándose ser observado a través de un microscopio óptico. Lectura e interpretación. Una adecuada interpretación de un corte observado al microscopio óptico, depende de factores como el plano del corte, la tinción utilizada y tridimensional de células, tejidos y órganos a partir de cortes bidimensionales. La tinción es también fundamental ya que debe ser elegida correctamente con base en 24
  40. 40. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo funcional, es importante establecer las correlaciones entre estructura y función de lo observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estáticas del corte en histopatológicos, que la observación sea hecha por un ojo entrenado en patología y, en tener láminas preparadas con gran acierto y que ofrecen excelente calidad óptica bajo el microscopio, si quien las examina no tienen habilidad para diferenciar tejidos sanos de órganos o tejidos con lesiones. Durante la preparación de los cortes histológicos, pueden presentarse alteraciones conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en el empleo de sustancias en la preparación del tejido, defectos en la cuchilla que se traducen en muescas en la preparación, contaminación de los colorantes o, errores de montaje como pliegues. MÉTODO DE HISTOLOGÍA P. vannamei. La solución que se está inyectando el cambio de color del hepatopáncreas que pasó de amarillo (normal) a anaranjado, por efecto observa el uso indispensable de guantes para la utilizada para la manipulación de muestras que Se observa un vidrio de seguridad en el frente, a través del cual se pueden ver las muestras que se manipulan y el cual protege la cara de cuenta con fuente de agua para lavado de elementos o partes del cuerpo en donde haya 25
  41. 41. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE HISTOLOGÍA donde se hace la deshidratación de los tejidos y se (2 vasos con termostatos, de color blanco ubicados a tejido y permite realizar cortes con el micrótomo sin que se deformen por el paso de la cuchilla. es ubicado en un cassette plástico y cubierto con cassette (blanco) con un corte de cefalotórax (anaranjado) siendo montado en la base móvil de un micrótomo, antes 26
  42. 42. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo MÉTODO DE HISTOLOGÍA se han obtenido con el micrótomo, son puestas expande con el calor y se elige el mejor corte, capturándolo con una lámina portaobjetos y ubicándolo sobre esta en la posición en la cual y eosina, en la cual se agregan los colorantes a los tejidos para obtener el contraste entre las diferentes células y entre las distintas partes de utilizados para la tinción de rutina, donde se puede apreciar la canasta con láminas siendo inmersa en eosina. histológicos de un camarón juvenil P. vannamei, un corte longitudinal de cefalotórax (C), uno transversal de abdomen (A) y uno longitudinal 27
  43. 43. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos MÉTODO DE HISTOLOGÍA corazón de un camarón subadulto P. vannamei. Se observa la válvula aórtica de un animal sano de un camarón subadulto P. vannamei. Se diferentes tipos de células y con un lumen en el centro. No hay evidencia de lesiones que sugieran presencia de una enfermedad de un camarón juvenil P. vannamei, con Los principales hallazgos histopatológicos son pérdida de la arquitectura de la zona afectada. 28
  44. 44. Jorge Cuéllar-Anjel 1.7 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Pruebas con anticuerpos Objetivo. enzyme linked immunosorbant assay) es una prueba rápida de laboratorio, en la cual un anticuerpo conocido se une a un antígeno (viral o Descripción. rápida (en algunos casos sólo tarda 1 hora), de buena sensibilidad y adaptable a un gran o monoclonales. Metodología. sensibilidad de pruebas enzimáticas simples, usando anticuerpos o antígenos acoplados que son reconocidos por un anticuerpo o para detectar anticuerpos que reconocen un antígeno. 1) cobertura de los pozos de la microplaca con el antígeno; 2) bloqueo de todos los anticuerpos a los pozos de la microplaca; 4) adición de anticuerpos conjugados con una enzima; 5) reacción de un substrato con la enzima para producir un producto coloreado, sandwich los pozos con 100 μL del antígeno diluido. Se incuba toda la noche a 4ºC y se lava el antígeno no adherido en la microplaca mediante golpes suaves. Luego se llenan los pozos con agua destilada y se vacían de nuevo con un golpe suave; se repite esto 2 veces mencionó anteriormente y se agregan 100 μL de las muestras diluidas en los respectivos y negativo y, si es necesario, una curva estándar. Se incuba por 1 hora a temperatura ambiente y se repite luego el paso del lavado. Luego se prepara la dilución apropiada del segundo paso del anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano (los anticuerpos deben ser titulados para buscar obtener una dilución óptima). Se deben agregar luego 100 μL del anticuerpo del segundo paso a los pozos y se 29
  45. 45. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos del substrato y se agregan 100 μL a los pozos, incubando luego a temperatura ambiente MÉTODO DE PRUEBAS CON ANTICUERPOS Y PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS (ESPECTROFOTOMETRÍA) y se agrega el antígeno complementario. anticuerpo contra el mismo antígeno, marcado substrato, produce color cuya intensidad es proporcional a la cantidad de antígeno presente anticuerpos y en mediciones de parámetros inmunológicos de camarones. Son montadas en la cantidad existente de un antígeno de interés. independiente o conectado a un computador para almacenar 100 ensayos y 20 microplacas 30
  46. 46. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo La hibridación es una de las principales metodologías que se utiliza actualmente en los nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la reacción antígenoanticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se emplean in vitro y que se la detección de agentes patógenos en muestras de animales afectados, son: dot blot, hibridación in situ en investigación más que en diagnóstico. De éstas, las que presentan mayor sensibilidad y Dot blot Objetivo. Detección de patógenos (ej.: virus) en una muestra de tejido de camarón, mediante el reconocimiento de la presencia de su ADN a través de un proceso de lisis (ruptura) celular, extracción del ADN, hibridación y revelado. Descripción. dot blot es una técnica de hibridación en la cual el ADN se ubica directamente sobre una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Su nombre se debe a que sobre la membrana involucra sondas genéticas en su procedimiento, las cuales son pequeños fragmentos de ADN (oligonucleótidos), que son complementarios de regiones que nos interesan en el ADN que se está buscando en una muestra (ej.: virus). De esta manera, si en una muestra problema se produce la hibridación entre la sonda y el ADN viral, se puede concluir que el virus en cuestión se encuentra presente. Las sondas genéticas para camarones son marcadas utilizando moléculas como la biotina o la digoxigenina, las cuales son luego detectadas mediante enzimas como la fosfatasa alcalina, produciendo una reacción colorimétrica y de esta manera detectable por el ojo humano. Las Metodología. dot blot en camarones, inicia con una muestra de hemolinfa o de otro tipo de tejido de un animal sospechoso de una enfermedad (ej.: virus WSSV). Cabe que se va a buscar. La muestra es macerada mecánicamente con un tampón (buffer) de lisis, con lo cual se busca romper las células y permitir la salida de las moléculas de ADN hacia la solución del macerado. Luego, una cantidad de macerado (inferior a una gota) es puesta sobre una 31
  47. 47. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos cadenas de la doble hebra y luego se coloca la sonda previamente calentada. Dicha sonda ha Se incuban las muestras con la sonda y si esta encuentra regiones del ADN viral que y C-G), se produce anillado o hibridación (unión entre la sonda y el ADN viral), que es una molécula estable de ADN híbrida de doble cadena. Luego de incubar, se realiza un lavado y se agregan anticuerpos anti-digoxigenina, que han sido previamente marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Si la sonda está presente fosfatasa alcalina y produce una reacción colorimétrica. La intensidad del color morado que se produce, es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (partículas virales de WSSV en el caso de este ejemplo). Hibridación in situ (HIS) Objetivo. Los patógenos o enfermedades en camarones que pueden ser detectados en la actualidad Descripción. manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Al igual que en el caso de la hibridación dot blot dentro de una muestra de tejido. A diferencia que el dot blot igual que en la histología) sobre una lámina portaobjetos, pero en este caso la lámina debe la aplicación de la sonda y los demás componentes para la detección genómica de un agente Metodología. in situ en camarones, se inicia a partir de un positivamente. formaldehído y se lava con un buffer. Se aplica entonces la solución de hibridación y se incuba en la muestra, en este momento se realiza el anillado o hibridación que como ya se explicó en 32
  48. 48. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo la técnica de dot blot, es una unión entre la sonda y fragmentos del genoma viral o bacteriano, que forma así una molécula estable. calentamiento previo de la muestra para desnaturalizar el ADN baculoviral de doble cadena Posteriormente las muestras deben ser sometidas a varios lavados con buffers distintos y luego se aplican los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina. Se incuban y posteriormente se hacen nuevos lavados con soluciones buffer. Se aplica la solución de desarrollo y se frena luego la reacción cuando sea ya necesario de acuerdo con criterios colorimétricos, lavando con soluciones buffer y después con agua Bismark Brown Y substituto). Sin dejar secar la muestra en este momento (y en ninguno de los procesos anteriores), se pone una gota de medio de montaje sobre el tejido y se cubre con una laminilla o lámina cubreobjetos. Se deja secar y se observa luego en un microscopio de campo oscuro, para detectar depósitos intracelulares de precipitado negro o azul oscuro y/o alguna citopatología infectados por el agente viral o bacteriano. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Objetivo. polymerase chain reaction que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del muestras de camarones o de organismos relacionados. Descripción. primers complementarios con la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de las cadenas que permite obtener hasta un millón de copias de un solo fragmento en pocas horas. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de kits. 33
  49. 49. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas complementarias) y los la reacción. pueden dar resultados falsos positivos, por lo que el material y las soluciones a emplear deben ser muy cuidadosamente manipulados y almacenados. Metodología. La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación del cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). Durante la replicación, las dos cadenas se separan y una enzima especializada llamada polimerasa, hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par de cadenas hijas. de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN, llamados nucleótidos o es el cofactor MgCl2 ingredientes para copiar ADN en un microtubo de ensayo. La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización, la plantilla la temperatura de la mezcla se baja hasta 55ºC durante 20 segundos para que los cebadores la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadores, deben renovarse al cabo de unos copias de ADN. (cDNA), molécula que es un ADN de doble cadena y, por consiguiente, susceptible de ser La polimerasa utilizada actualmente es termoestable, no se inactiva por las elevadas Thermus aquaticus 34
  50. 50. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminación. PCR en tiempo real (real time PCR, Q-PCR) Objetivo. Descripción. tradicional reacción en cadena de la polimerasa. Para llevar a cabo la detección en tiempo real de un genoma de interés, existen varios métodos pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN (sonda) forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa, quencher válida esta técnica, requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas condiciones, utilizado un par de iniciadores (primers), los cuales proporcionan con frecuencia una sensibilidad procedimientos consumen una cantidad de tiempo considerablemente menor comparados electroforesis en geles de agarosa, seguidos por la tinción con bromuro de etidio y, de nuevo, Metodología. cantidad que dobla de ciclo en ciclo. Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por longitud de onda elegida para la muestra. 35
  51. 51. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos A partir de este momento, la señal dobla de ciclo en ciclo. Se observará aparecer en el concentración inicial de ADN. PRUEBAS MOLECULARES - DOT BLOT WSSV sobre una membrana de nitrocelulosa. Cada cuadro pequeño (1 cm2) corresponde a un camarón. La intensidad de la mancha morada en cada cuadro, es proporcional a la cantidad de ADN viral presente en las células analizadas muestras con severidad baja (círculo amarillo), media (círculo PRUEBAS MOLECULARES - HIBRIDACIÓN IN SITU de estómago de un camarón juvenil P. vannamei infectado con el virus WSSV. La sonda reaccionó fuertemente con el ADN viral presente en los cuerpos de inclusión intranucleares, mediante la prueba de hibridación in situ utilizando una sonda de ADN marcada con digoxigenina. La coloración obtenida es producto de la reacción 36
  52. 52. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo PRUEBAS MOLECULARES – PCR utilización de un kit comercial con base en soluciones de lisis celular. Nótese el uso de puntas de micropipeta protegidas con la micropipeta y el paso de ADN viral de una muestra a otra (contaminación cruzada). elementos que se utilizan dentro de la cámara, no deben salir diferentes tipos de muestras o para diferentes tipos de agentes patógenos. de poder (derecha), que permiten la migración del ADN continuo. Después de este proceso, las muestras migradas en el gel, están listas para ser observadas en un visor de luz realizar mediante un comando computarizado programable, muchos ciclos a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos. 37
  53. 53. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos PRUEBAS MOLECULARES – PCR para revelar la presencia de bandas de ADN, producto de la transiluminador de luz ultravioleta. La columna de la izquierda posee un marcador de peso molecular; las columnas siguientes de guantes por parte del operario, mientras manipula el gel de agarosa para ser puesto sobre el transiluminador. blancas que se observan en éstas, corresponden a resultados PRUEBAS MOLECULARES – PCR EN TIEMPO REAL (termociclador); a su derecha una fuente de poder, luego una CPU para el procesamiento de los datos suministrados por el termociclador y a la derecha el módulo de visualización (monitor) para la observación de los resultados que se van obteniendo en cada ciclo y en tiempo real. tiempo real. Se observa un panel de control con comandos (botones) verdes y azules para la programación del equipo, así como una pequeña pantalla para visualizar la información correspondiente a la programación y al avance de los ciclos de Cada línea de color corresponde a una muestra analizada y al control utilizado. La columna de la derecha indica la cantidad aproximada de copias de ADN que se encuentra en cada muestra. 38
  54. 54. Jorge Cuéllar-Anjel 1.9 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Parámetros inmunológicos razón, sólo se hará en éste capítulo una mención general de las principales técnicas inmunológicas, como herramientas para el diagnóstico de enfermedades en camarones. La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite evaluar y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo están relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a la invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que entran en contacto con los animales. Los principales parámetros inmunes de los camarones que se pueden medir en la hemolinfa, son los siguientes: Hemograma: los hemocitos constituyen la barrera celular del sistema inmune, que total o diferencial de los hemocitos en la hemolinfa, para establecer una relación entre los valores obtenidos y las condiciones de salud de los camarones examinados (o de sus poblaciones de origen). Para realizar un hemograma, se extrae hemolinfa con un correspondientes a la dilución con el anticoagulante y la profundidad y área de la cámara utilizada. Los resultados se dan en hemocitos (totales, granulares, semigranulares o hialinos) por cada mm de hemolinfa. Los valores promedio de hemocitos totales/ mm más frecuentes en camarones preadultos sanos, se encuentran entre 25.000 y propias del camarón (muda, sexo y edad) y del medio de cultivo (temperatura, salinidad y oxígeno disuelto, entre otras), ya que éstas afectan los valores obtenidos en los conteos de hemocitos. Concentración de proteínas plasmáticas: este parámetro es utilizado para evaluar el plasmáticas totales está compuesto por hemocianina (pigmento extracelular que transporta el oxígeno a los tejidos del camarón). Por esta razón, cambios importantes en la concentración de la hemocianina, afectan directamente los valores obtenidos para proteínas plasmáticas. Adicionalmente, la concentración de las proteínas plasmáticas Cuando el camarón está infectado, puede haber una lisis celular y destrucción de sus tejidos afectados, lo que genera un aumento en la concentración proteica de la poder utilizar este parámetro inmunológico como un verdadero criterio para conocer el estado sanitario de los camarones. Para determinar las proteínas plasmáticas totales en una muestra de hemolinfa de camarón, se pueden utilizar métodos de rutina como el de De manera general, el nivel de proteínas plasmáticas totales en camarones, se determina a partir de muestras de suero. Luego de extraer la hemolinfa, se deja coagular a 4ºC por al menos 12 horas y luego se centrifuga para recuperar el suero. Se agrega un 39
  55. 55. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos volumen de suero a una microplaca y se hace reaccionar con el reactivo del método utilizado. De esta manera se obtiene la formación de un complejo coloreado el cual concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra, a partir de una curva de calibración con una solución stock Capacidad de hemoaglutinación: con este método es posible determinar las condiciones sanitarias de los camarones, mediante la medición de la capacidad de las proteínas lipopolisacáridos), presentes de manera natural en la hemolinfa. Sus funciones incluyen reconocer y aglutinar cuerpos invasores. Por comodidad, se usan en los ensayos eritrocitos de diferentes mamíferos, por ser células extrañas al camarón y, sobretodo, por ser células estudio de estas proteínas y sus mecanismos de reconocimiento, comienza a ser una herramienta muy potente para las estrategias de selección de animales genéticamente resistentes a enfermedades. La actividad hemoaglutinante de la hemolinfa, podría constituirse en un indicador de salud y de adaptación del camarón, ya que por ejemplo existe una relación directa entre los títulos de hemoaglutinación y la calidad reproductiva de los machos (índice de espermatogénesis). Igualmente, la sensibilidad de la actividad hemoaglutinante ante el estrés, demuestra que los títulos de hemoaglutinación pueden ser usados tanto como indicadores sanitarios, como de adaptación de los animales a sus condiciones de vida. La prueba de hemoaglutinación se realiza utilizando eritrocitos humanos o de otros mamíferos (principalmente de roedores que son particularmente aglutinación y el título aglutinante. Cuanto mayor es el título, mayor será la cantidad de Actividad de la fenoloxidasa: la enzima fenoloxidasa (PO por sus siglas en Inglés), se crucial en la cascada inmunológica que se activa cuando es reconocida una substancia como cuerpo extraño (antígeno). La PO se encuentra en forma de enzima inactiva inactiva es exocitada de los hemocitos hacia el plasma del camarón y es convertida en serin-proteasa. Las reacciones que culminan con la transformación de proPO en PO y con la subsecuente melanización, son consideradas como un componente que integra in vitro, se ha observado que el paso de proPO a PO se produce incubando la muestra L-DOPA como sustrato. La determinación de la actividad de la PO, permite tener una idea de la capacidad de respuesta inmune de un camarón, frente a la presencia de agentes patógenos en el organismo. Para su medición, se parte de la reacción en la que se utiliza suero de los camarones o un lisado de sus hemocitos, que son la fuente de la enzima PO nm y puede ser detectada espectrofotométricamente con un lector de microplacas. Actividad antibacteriana de los hemocitos por la producción de intermediarios reactivos de oxígeno (fagocitosis): en condiciones normales, las células fagocíticas de los camarones se encuentran en estado inactivo. La presencia de partículas extrañas sobre 40
  56. 56. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo en la actividad metabólica; esta se llama choque respiratorio o metabolismo oxidativo. La transición celular de un estado inactivo a uno activo, involucra cambios característicos la producción de muchos reactivos intermediarios de oxígeno altamente tóxicos como el singlet oxygen actividad antimicrobiana en el camarón y con la destrucción de los agentes infectantes. La producción del anión superóxido puede ser medida a partir de una muestra de hemolinfa, mediante la estimulación de los hemocitos y la capacidad de este anión para reducir el nitro blue tetrazolium Actividad antibacteriana del plasma: existen en la hemolinfa del camarón diferentes de éstos en un camarón cuando se presenta el ataque de bioagresores, mayores serán las posibilidades de defensa y, por ende, de supervivencia. La prueba de la actividad antibacteriana del plasma permite medir la inhibición del crecimiento bacteriano, por la acción de péptidos que poseen propiedades microbicidas y que están presentes en la hemolinfa de los camarones. Con base en lo anterior, medir la actividad antibacteriana del plasma/suero de camarones, permite estimar la capacidad de respuesta frente a una eventual infección por bacterias. Para realizar la evaluación, se deben tener cultivos de cepas bacterianas Gram positivas y negativas en pozos de una microplaca y se hacen diluciones seriadas del plasma/suero de camarones frente a estas bacterias. Se analiza la inhibición del crecimiento bacteriano causada por el plasma diluido seriadamente y se calcula luego el título de inhibición. La medición se hace por medio de un método turbidimétrico, cuyo principio está basado en la determinación espectrofotómetrica de la turbidez causada por las suspensiones bacterianas; si la turbidez de la muestra de bacterias disminuye en presencia de plasma, sugiere destrucción bacteriana por presencia de los péptidos del cultivo control (sin plasma/suero) y del cultivo con la muestra de plasma/suero, utilizando un lector de microplacas. 2Macroglobulina plasmática: en invertebrados, se ha sugerido sistema inmune. Los inhibidores de las proteasas no sólo participan en las acciones de protección contra microorganismos patógenos, sino que también juegan un papel 2Macroglobulina plasmática, se realiza basándose en que reacciona con las proteasas sin bloquearles el sitio activo, siendo así protegidas las proteasas e impidiendo el acceso produce un compuesto de color amarillo, el cual puede medirse con un lector de 41
  57. 57. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos la presencia de compuestos microbianos en el sistema inmune puede activar directamente las funciones celulares de defensa tales como fagocitosis, melanización, encapsulación y coagulación; las proteínas reconocedoras sistema proPO de crustáceos, ha permitido demostrar la presencia de dos proteínas directamente relacionadas con la comunicación celular entre hemocitos. Una de ellas ß-1,3-Glucan Binding Protein) camarón Penaeus californiensis del sistema proPO. La otra molécula es la proteína de unión a los lipopolisacáridos de la Lipopolysaccharide Binding Protein), aglutinar bacterias. Una vez reacciona con el LPS o con bacterias, la proteína se une a los solamente después de reaccionar con los ß-glucanos y con los LPS, respectivamente. entre los inmuno-reactantes y la hemolinfa. su detección consiste en inmovilizar antígeno (dichas proteínas) en una microplaca de poliestireno, agregando luego los anticuerpos e incubando para que éstos reaccionen. presentado unión antígeno-anticuerpo, la aplicación del sustrato en presencia del anticuerpo producirá una reacción colorimétrica medible mediante espectrofotometría, método. Concentración de hemocianina en la hemolinfa: la hemocianina es una proteína presente en la hemolinfa de los camarones, responsable del transporte de por lo menos las actividades inmunológicas del camarón, ya que los hemocitos pueden convertir porciones de la hemocianina en una enzima similar a la fenoloxidasa. Adicionalmente, antigénicos desencadenen reacciones donde la hemocianina genera varias moléculas inmunorreactivas. La medición de esta proteína a partir de muestras de hemolinfa, métodos de espectrofotometría, utilizando un lector de microplacas. Concentración de óxido nítrico sintasa: criterio para medir la actividad de los hemocitos dentro de las acciones de defensa de un es altamente inestable transformándose rápidamente en nitritos (NO2) y nitratos (NO NO es extremadamente tóxico y por lo tanto altamente microbicida. Su producción por 42
  58. 58. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo puede ser analizado por quimioluminescencia, aunque debe ser liberado de la muestra se basa en la transformación del NO a NO2 y NO . Para medir la concentración total de nitratos y nitritos (NOx), se pueden usar dos métodos: la reducción química con cadmio o la reducción enzimática utilizando nitrato reductasa. Otra forma de detectar la presencia de NOS en muestras biológicas, es utilizando anticuerpos contra la proteína. Para ello se utilizan anticuerpos de conejo anti-iNOS (NOS inducible presente en los hemocitos), los cuales reconocen la NOS de camarón, probado diferentes diluciones de anti-NOS y combinaciones de conjugado anti-conejo, habiendo sido las mejores 1:1000 y 1:40000, respectivamente. Consideraciones generales sobre parámetros inmunológicos La interpretación de resultados obtenidos con todas las pruebas mencionadas sexo, estado de muda, estrés (ambiental, nutricional o séptico) y condiciones sanitarias (presencia o ausencia de enfermedad); en el agua de cultivo está principalmente la origen químico o biológico). PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS – HEMOGRAMA hemolinfa cuando se hace conteo de hemocitos. De izquierda a derecha se observa una caja con puntas de micropipeta (20-200 μL), micropipeta con volumen graduable (20-200 μL), microtubos de 1.5 mL con tapa y contador de células. P. vannamei para la extracción de hemolinfa del seno hemolinfático ventral, ubicado en la unión entre el cefalotórax y el abdomen, ventralmente. Nótese el uso de una jeringa desechable de 1 mL (tipo insulina), la cual contiene una solución anticoagulante. 43
  59. 59. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos PARÁMETROS INMUNOLÓGICOS – HEMOGRAMA anticoagulada en una cámara de Neubauer (hematocitómetro). Debido a que esta cámara posee dos campos de conteo, se pueden montar muestras de 2 animales diferentes al mismo tiempo. anticoagulada en cámara de Neubauer, utilizando un microscopio de contraste de fases y el objetivo de 40X. P. vannamei observados en cámara de Neubauer, utilizando microscopio de contraste de fases y objetivo de 40X. Se pueden observar encerradas de los tipos diferentes de hemocitos que hay reportados: granulares (G), semigranulares (S) y 44
  60. 60. Jorge Cuéllar-Anjel 1.10 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Microscopía electrónica de transmisión Objetivo. agentes patógenos o lesiones dentro de las células de tejidos afectados. Descripción. rickettsias, bacterias intracelulares y otros muy pequeños microorganismos que están el patólogo examina las estructuras internas de las células y los organelos celulares, en actividad altamente especializada y debe ser realizada por personal bien entrenado. Metodología. Las soluciones de glutaraldehído comercial generalmente vienen en concentraciones de 25%, 50% y 70%. La de 25% es grado histológico y por eso es la más utilizada para 50% y 70% se consiguen en ampollas de 5 mL. Glutaraldehído stock % activo Actividad por ampolla 25% 2.5 g/5 mL 1% 4% 6% 5 / 245 5 / 57.5 5 / 42 n/a 50% Volumen stock (mL) / Buffer requerido (mL) 70% Al igual que en muestras que se preparan para diagnóstico histopatológico, la preservación de los tejidos debe hacerse de manera rápida y a temperatura baja, para abdominal. Con tijeras de disección y por debajo de la cutícula (sin atravesar tejido blando), se debe hacer un corte longitudinal por la línea media a los dos lados, para asegurar una 45
  61. 61. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos animales vivos, la cual se debe tener a una temperatura de 4ºC. debiéndolos cortar rápidamente con una cuchilla y manteniéndolos inmersos en la solución mantener a 4ºC. Los procedimientos posteriores pueden realizarse siguiendo los protocolos estándar para en soluciones de glutaraldehído de 0.5% a 1%. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (TEM) forma de bastón, de nucleocápsides sin envoltura del virus GAP, morfología de virus, estudios de micropartículas y nanopartículas y, estructura interna de láminas delgadas. 46
  62. 62. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo Objetivo. Determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.), tóxico (toxinas químicas o biológicas) o, descartando lo evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral a camarones libres de dichos agentes patógenos. Descripción. Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones reproducir. La susceptibilidad de los camarones que se utilizan en los bioensayos, hacen referencia a la especie y talla de los animales. La manera de buscar su eventual infección es utilizando batido (macerado) de camarones enfermos y los cuales presentaban la enfermedad en los camarones susceptibles utilizados en un bioensayo, deberá corresponder al tiempo estimado de aparición de los signos clínicos en los camarones que se enferman en condiciones naturales. Metodología. Los bioensayos son pruebas de desafío, en las cuales se utiliza tejido infectante para realizar de manera experimental, una infección per os (vía oral) en (enfermos avanzados o moribundos), que hayan presentado los mismos signos clínicos de la enfermedad en cuestión y procedentes de una misma población (edad y talla similar). La capacidad infectante de este batido de tejido de camarones enfermos, depende de la carga viral o bacteriana que tenga (cantidad de microorganismos por gramo de aquellos que causan la enfermedad) y de la cantidad de tejido que se suministre a los camarones cada gramo de tejido infectante. Los camarones que van a ser infectados experimentalmente per os, deben estar libres de la enfermedad que se pretende reproducir. Para ello, deben proceder de una o estén presentando signos clínicos de ninguna enfermedad (completamente sanos). Si existen herramientas moleculares de diagnóstico para la enfermedad en cuestión, se debe someter a prueba un grupo de camarones procedentes de la población de donde Cuando el objetivo del bioensayo incluye trabajar con un patógeno desconocido y para el cual no existen en el momento pruebas de diagnóstico moleculares, los camarones Los bioensayos deben realizarse en instalaciones cerradas, con condiciones controladas y con parámetros físico-químicos estables. Los principales factores que deben mantenerse bajo control durante un bioensayo, son los siguientes: bacteriológicas apropiadas 47
  63. 63. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos transparencia) recirculación, etc. con el protocolo de operación claramente comprendido por la o las personas que fecha (o condiciones particulares) para dar por terminada la prueba (ej.: luego de 2 días en los que se haya estabilizado la mortalidad). experimental, ya que este valor será el 100% de la población de partida. Con base en Los datos de mortalidad diaria deben ser observados con rigurosidad y registrados en un momento de mayor mortalidad de la prueba, entre otra información de interés. 48
  64. 64. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo BIOENSAYOS las partes superior e inferior de los tanques, se observa la tubería de aire a través de la cual se conectan las mangueras de aireación para cada uno. Los tanques de arriba están con agua y tienen mangueras de aireación y piedras difusoras en sus extremos (dentro de cada tanque). tanque de vidrio durante la realización de un bioensayo. Se observa dentro del tanque el electrodo del equipo, con el cual se obtienen datos de temperatura, salinidad y oxígeno disuelto. vannamei durante la realización de un bioensayo. Nótese la presencia de una cubierta de malla que está siendo levantada para la alimentación y la cual evita pérdida de camarones por saltos hacia el exterior del tanque o hacia otros tanques vecinos. 49
  65. 65. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos Recomendación general de desecho procedentes de pruebas de diagnóstico, así como de camarones que han contaminación de entornos acuáticos comerciales o silvestres y del propio ambiente. Apéndice Métodos para la detección de los principales agentes virales en camarones penaeidos Método WSSV IHHNV BP MBV BMN - SMV YHV* TSV PvNV - - IMNV - - - tología - - PAb / MAb - - - - - Sondas ADN / - - = método desconocido o cuya aplicación no está publicada practicada o difícilmente disponible o sensibilidad en la detección de patógenos para la mayoría de las aplicaciones patógenos Abreviaturas para los métodos LM 50 = microscopía de luz
  66. 66. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo PAb = anticuerpos policlonales MAb = anticuerpos monoclonales Métodos para vigilancia y diagnóstico de patógenos virales en camarones penaeidos Agente Vigilancia Diagnóstico histopatología WSSV histopatología, bioensayos histopatología, bioensayos Microscopía directa, histopatología histopatología SMV IMNV PvNV histopatología Sondas de ADN Sondas de ADN, histopatología, bioensayos histopatología histopatología 51
  67. 67. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos 2005. Análisis proteómico de la subunidad IsI1 de la lectina del camarón blanco del Golfo de México Litopenaeus setiferus Pacifastacus leniusculus Penaeus vannamei of Penaeus japonicus Clifford H.C. and H. L. Cook. 2002. Disease Management in Shrimp Culture Ponds (Parts 1, 2 and las principales enfermedades en camarones penaeidos cultivados en Colombia: técnicas de campo y de laboratorio para el procesamiento de muestras y el diagnóstico de enfermedades. 2001. SDS-induced Phenoloxidase Activity of Limulus polyphemus, Eurypelma californicum, and Cancer magister. 2001. Antifungal peptides are generated from the C terminus of shrimp hemocyanin in response to microbial . European Union SI&DC INCO-DC Project. June 1st. Galván. Penaeus stylirostris in relation 52
  68. 68. Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo immunological parameters in female shrimp Litopenaeus vannamei submitted to unilateral a form of immunostimulation. Aquaculture, 241: 501-515. Litopenaeus vannamei immunological parameters in the shrimp Farfantepenaeus paulensis submitted to environmental 2001. Actividad hemoaglutinante de la hemolinfa del camarón blanco Litopenaeus schmitti 2000. Litopenaeus stylirostris. Journal 2001. Litopenaeus setiferus adult males: Carcinus maenas prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial activity in haemolymph of the black tiger Penaeus monodon USDA – UCA. UCA. Managua, Nicaragua. shrimp (Penaeus californiensis defences of the edible crab, Cancer pagurus 53
  69. 69. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos World Organisation for Aniamal Health (OIE). Montajes en Fresco: 54
  70. 70. C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales 55
  71. 71. Capítulo 2 Enfermedades Virales Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner Expertos en Patología Acuática México / USA Introducción En poco menos de 40 años, la camaronicultura mundial se ha desarrollado desde sus inicios a nivel experimental hasta volverse una industria con ingresos de billones de dólares, proveyendo de empleo, directa e indirectamente, a cientos de miles de personas. Desde 1970 hasta 1990, la industria dependía completamente de la captura de postlarvas silvestres o de postlarvas producidas a partir de reproductores capturados en el océano. La mayoría de las veces, estos animales eran capturados cerca de la región en donde serían cultivados. Los sistemas de cultivo eran relativamente simples, se usaban tasas muy altas de recambio de agua y las medidas de bioseguridad eran mínimas o no existentes. En esa época se sabía de muy poco de las enfermedades del camarón y todavía menos sobre los mecanismos de defensa -humoral y celular- especialmente contra agentes virales. Había muy pocos especialistas en enfermedades de camarón y la capacidad de diagnóstico era muy pequeña en la mayoría de las regiones. El uso de antibióticos y agentes químicos era práctica común, tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como en las granjas. No fue sino hasta 1987, cuando el aumento explosivo de la industria camaronícola enfermedades ocasionadas por virus eran una de las mayores amenazas para la industria. También rápidamente se puso en evidencia que la dispersión de esas enfermedades fue el resultado del traslado sin control tanto de postlarvas como de reproductores. La industria camaronícola del presente ha sido transformada por la necesidad de un mejor control de las enfermedades. Como resultado de los cambios rápidos que comenzaron a principios de los 90’s, la dependencia de la industria sobre el suministro de postlarvas silvestres, o de postlarvas derivadas de reproductores silvestres, ha disminuido notablemente. Desde hace algunos pocos años hasta la fecha, poblaciones domesticadas de Penaeus vannamei (también llamado Litopenaeus vannamei) han reemplazado a P. monodon como la principal especie cultivada y se encuentran ya en progreso varios programas para la domesticación de otras especies. Se han descrito ya muchas enfermedades importantes y aunque se han desarrollado métodos para su diagnóstico, existen todavía algunos problemas relativos a su implementación y estandarización. Las medidas de bioseguridad aplicadas a los sistemas intensivos de cultivo se vuelven más comunes cada día. El uso de probióticos se ha vuelto también común tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como de esto, el uso de antibióticos ha disminuido y se ha vuelto más responsable. Estudios de biología molecular están ayudando a lograr un mejor entendimiento de la relación entre el camarón y los agentes patógenos que lo atacan. El resultado de todos estos avances ha sido un incremento continuo de la producción mundial de camarón cultivado.
  72. 72. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos En el futuro, se espera que la industria camaronícola mundial tenga acceso fácil a una variedad de especies domesticadas de camarón, genéticamente mejoradas y libres de los patógenos más importantes. Métodos para el diagnóstico de estas enfermedades, tanto en el laboratorio como en el campo, estarán disponibles en el mercado en forma de kits y se mejorarán los mecanismos para su estandarización. De la misma manera se espera una mejora en los métodos de bioseguridad, los cuales serán aplicados en todos los tipos de sistemas de cultivo, aunque aquellos con mayor control (sistemas intensivos y superintensivos) serán más competitivos que los sistemas más tradicionales y extensivos. En verán facilitados a través del mejor entendimiento del camarón, sus patógenos, la ecología microbiana y el uso de agentes antibacterianos y antivirales ambientalmente seguros. 2.1 Principales enfermedades y métodos de diagnóstico Las enfermedades que afectan a los camarones de cultivo incluyen síndromes con etiologías infecciosas y no infecciosas (Tabla 1 y Tabla 2). Dentro de las enfermedades infecciosas están aquellas ocasionadas por virus, bacterias, (incluyendo ricketsias), hongos, protozoarios y parásitos metazoarios y entre las no infecciosas están las de impactos ambientales, desbalances nutricionales, agentes tóxicos y desórdenes genéticos. En el caso del camarón, se cuenta con herramientas o procedimientos de diagnóstico de dos tipos. Métodos clásicos. Dependiendo del tipo de enfermedad, estos métodos pueden ser lo Métodos moleculares. y/o sensitivos, es necesario complementarlos con uno o más de los siguientes métodos moleculares. o o Hibridaciones tipo “dot blot” (en membrana de nylon). o 58 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Hibridaciones tipo in situ (en cortes histológicos).
  73. 73. C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales Tabla 1. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura del Enfermedades de origen viral WSSV (White spot syndrome virus disease) YHV (Yellow head virus disease) Enfermedades de origen bacteriano/fúngico Vibriosis - sistémica/entérica - vibriosis larvaria BMN (Baculoviral midgut gland necrosis virus disease) Otras enfermedades Epicomensales - Leucothrix mucor - Protozoarios peritrichidos Gregarinidos MBV (Monodon baculovirus disease) IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus disease) HPV (Hepatopancreatic parvovirus disease) IMNV (Infectious myonecrosis virus disease) Microsporidios Micosis larvaria Desbalances nutricionales Síndromes tóxicos Síndromes ambientales Tabla 2. Enfermedades de mayor importancia en la camaronicultura de las Américas. Enfermedades de origen viral WSSV (White spot syndrome virus disease) TSV (Taura syndrome virus disease) BP (Baculovirus penaei disease) YHV (Yellow head virus disease) IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus disease) Enfermedades de origen bacteriano/fúngico Vibriosis - sistémica/entérica. - vibriosis larvaria NHP (Necrotizing hepatopancreatitis disease) PvNV (Penaeus vannamei nodavirus disease) Epicomensales - Leucothrix mucor - Protozoarios peritrichidos Gregarinidos Espiroplasmosis HPV (Hepatopancreatic parvovirus disease) IMNV (Infectious myonecrosis virus disease) Otras enfermedades Microsporidios Micosis larvaria Desbalances nutricionales Síndromes tóxicos Síndromes ambientales Síndrome de Zoea II 59

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