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CBI学会チュートリアルセッション
2013-10-28

NGSデータ解析入門
ーSNP解析~癌ゲノム解析までー

セッション1: 実験条件編
株式会社ジナリス
竹田 綾
CBI学会2013チュートリアル NGSデータ解析入門(実験条件編) 配布資料
Outline
セッション1:実験条件編
• 次世代シーケンシングのトレンド
• 次世代シーケンシング解析に共通のステップ
• シナリオ(癌ゲノムExome解析)
→ Wet解析担当者とのやりとり
→ データ解析に影響する実験条件
セッション2:解析ツール編
• マッピング〜SNP解析まで ツール選びのポイント
• NGSデータ蓄積・管理システムGenaGenomeManager
Oct 2013

http://flxlexblog.wordpress.com/2013/10/01/developments-in-next-generation-sequencing-october-2013-edition/
注目度大!Next“次世代”シーケンサー
• Qiagen GeneReader
– Intelligent Bio-System “Max-Seq Genome Sequencer”
– 20-400M reads/flowcell, 20 flowcell (independent)
– 2Gb/flowcell, up to 12 samples on each

• GnuBIO
–
–
–
–

Beta version start shipping in April
Sequence by Hybridization
target reseq (50 genes ~$200, <3.5hrs)
Read length ~1000bp, 1.2Gb/run, $50,000

• Oxford Nanopore GridION & MinION
– MinION Access Program starting late Nov. 2013
– DNA-seq, smallRNA, protein, small molecule,
RNA-seq
最新のNGSニュースはGOクラブトピックスへ:http://genaport.genaris.com/GOC_topics.php
年別統計 (2013/10/27)
1200000

Run Data Counts
Total

1000000
800000
600000
400000
200000
0

2005

2006

2007

2008

http://cell-innovation.nig.ac.jp/public/contents/sra_stat.html

2009

2010

2011

2012

2013
シーケンサー種別統計(Run数)(2013/10/26)
1,183,417 runs total
Illumina
Roche
41%

SOLiD
PacBio

49%

CG
IonTorrent
Helicos

Sanger
Other
8%

0% 0%

0% 0%

1% 1%

http://cell-innovation.nig.ac.jp/public/contents/sra_stat.html
AB SOLiD PI System

Ion Torrent Proton

AB SOLiD 4hq System

Complete Genomics

454 GS 20

Illumina Genome Analyzer

PacBio RS

AB SOLiD 4 System

Illumina Genome Analyzer II

454 GS FLX

AB SOLiD 3 Plus System

AB SOLiD System 2.0

454 GS FLX Titanium

Illumina HiSeq 2000

Ion Torrent PGM

Illumina Genome Analyzer IIx

AB SOLiD System 3.0

AB 5500 Genetic Analyzer

Illumina HiScanSQ

454 GS FLX+

AB 5500xl Genetic Analyzer

454 GS

Helicos HeliScope

Illumina HiSeq 1000

AB SOLiD System

Illumina MiSeq

Illumina HiSeq 2500

454 GS Junior

シーケンサー別 約2ヶ月間のRun数増加率

70.0%

60.0%

50.0%

40.0%

30.0%

20.0%

10.0%

0.0%
主なアプリケーション
• 新規ゲノム配列決定
• リシーケンシング解析(再配列決定)
多型・変異解析
• ターゲットリシーケンシング
エキソンなど特定領域のみの配列決定
• アンプリコンシーケンシング
特定領域部分について多検体を同時配列決定
細菌叢解析(16SrRNA)
• メタゲノム解析
環境中の微生物を一斉解析
• ChIP-Sequencing (ChIP-Seq)
(Chromatin Immunoprecipitation)
タンパク質が結合するDNAを免疫沈降して網羅的に配列決定
• トランスクリプトーム解析
発現遺伝子の網羅的解析
http://cell-innovation.nig.ac.jp/public/contents/sra_stat.html
次世代シーケンシング解析に共通のステップ

サンプル調製

・抽出法
・抽出量
・ターゲット配列濃縮
・全ゲノム増幅
・完全長cDNA
・均一化処理
etc.

シーケンシング

・シーケンサー機種
・リード長
・ライブラリー
− fragment (FR)
− paired end (PE)
− mate-pair (MP)
・解析量
etc.

データ解析
(Bioinformatics)

・参照配列の有無
・アセンブリー/マッピング
・解析プログラム
・解析パラメータ
・出力データ形式
・ビューワー
etc.

サンプル調製・シーケンシングの条件によって、
データ解析の手法を変える必要がある。
本日のモデルケース:シナリオ

“

癌2サンプルのExomeデータ
です。変異の比較解析をお
願いします!

”
ERR035486_1.fastq.gz
ERR035486_2.fastq.gz
ERR035487_1.fastq.gz
ERR035487_2.fastq.gz
どんなサンプルですか?
解析の目的は?
• 同一患者由来のOvarian Cancer Cell line
– ERR035486:Cisplatin sensitive (post-treatment)
– ERR035487: Cisplatin resistant (relapse)

•
•
•
•

SureSelect Human AllExon Kit (Agilent)
Illumina Genome Analyzer IIx
Paired End library
各サンプルのSNVをリ
スト化し、既知SNPなどと
Read length 72 bp x 2

“

– ERR035486:53.3 M reads (6.6 Gb)
– ERR035487: 68.0 M reads (9.8 Gb)

照合しながらCisplatin
sensitivityに関わる変異
を見つけ出したい

”
gDNAからFASTQへ
サンプル調製

シーケンシング

1. 「ライブラリー調製」とは?
2. PCR issue
3. Paired End / Mate Pair
4. Whole Genome Amplification
5. Target Enrichment

データ解析
(Bioinformatics)
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/webinar/2012_illumina_techsupport_session1.pdf
ライブラリー調製: 断片化されたDNAの両端にアダプターをLigateする
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/webinar/2012_illumina_techsupport_session1.pdf
Illuminaライブラリーの構造

http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/webinar/2012_illumina_techsupport_session1.pdf
Covarisによる断片化

End Repair (平滑末端化)

‘3’にAを付与

アダプターLigation

Size selection

http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/webi
nar/2013_illumina_techsupport_session14.pdf

PCR
http://wako-chem.co.jp/siyaku/jutaku/dna_sequence/index_02.htm
サンプル調製 (その他)
RNA-seq

RNA (total RNA/mRNA)

ちょっと脱線

ChIP-seq
cells
DNA

cDNA合成

protein
架橋・抽出・断片化

断片化
免疫沈降・解離・精製
ライブラリー作製〜配列
決定

ライブラリー
作製〜配列決定

ATGCGG…

ATGCGG…

GCGGCA…

GCGGCA…
gDNAからFASTQへ
サンプル調製

シーケンシング

1. 「ライブラリー調製」とは?
2. PCR issue
3. Paired End / Mate Pair
4. Whole Genome Amplification
5. Target Enrichment

データ解析
(Bioinformatics)
2回のPCRの影響
• PCRエラー

• PCR Duplicate
– マッピングの際リファレンスの同じ箇所(5’のみ、もしくは5’と3’)に張り
付いたリードが複数あるとき、それらをPCR Duplicateとして下流の解
析から除外する場合がある。
– Single read (paired end ではない)では、Duplicate rate が高くなる
– 定量性のある解析には要注意
http://www.illuminakk.co.jp/document/pdf/webinar/2012_illumina_techsupport_session1.pdf
gDNAからFASTQへ
サンプル調製

シーケンシング

1. 「ライブラリー調製」とは?
2. PCR issue
3. Paired End / Mate Pair
4. Whole Genome Amplification
5. Target Enrichment

データ解析
(Bioinformatics)

ちょっと脱線
ライブラリー
フラグメント/シングルエンド

アダプター

DNAフラグメント

シーケンスリード

ペアエンド
Illumina Mate-pair ライブラリー
Genomic DNA

2-5 kb fragment
B
B

断片化
ビオチン化

環状化
断片化

2

1

2

1
1

1

2

2
2

1

1

1

PEシーケンス

ビオチン化
断片の濃縮

2

正常なMPリードの他に、通常のPEリード、キメラ状のリードが混入し、区別できない!
GATC (Rsal; CviQI)
CTAG (Bfal; FspBI)

40kb
Insert

Remove
Central
DNA

Rejoin

1

2
gDNAからFASTQへ
サンプル調製

シーケンシング

1. 「ライブラリー調製」とは?
2. PCR issue
3. Paired End / Mate Pair
4. Whole Genome Amplification
5. Target Enrichment

データ解析
(Bioinformatics)
GenomiPhi (GE Healthcare)

http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/genomic_amp/pdf/211401_GenomiPhi1.pdf
(Sigma)

http://www.dddmag.com/sites/dddmag.com/files/legacyimages/Articles/2008_03/DD83DIS1a.jpg
Whole Genome Amplification
from 100ng FFPE

• Use of GenomiPhi V2 (GE Healthcare)
– SNP and small indel calling
– Not ideal for breakpoint/fusion gene
detection

• Use of GenomePlex WGA2 (Sigma)
– breakpoint analysis possible at the
expense of some loss of read length
because of required adapter trimming

• Avoid if possible
– amplification of reference DNA can impact
somatic mutation calling (LOH calls)
– amplification of tumor DNA may generate
false positives
gDNAからFASTQへ
サンプル調製

シーケンシング

1. 「ライブラリー調製」とは?
2. PCR issue
3. Paired End / Mate Pair
4. Whole Genome Amplification
5. Target Enrichment

データ解析
(Bioinformatics)
Target Enrichment Methods
Hybrid Capture

http://en.wikipedia.org/wiki/Exome_sequencing

Amplicon
Hybrid Capture (in solution)
SureSelect (Agilent)
8組の制限酵素で消化
ビーズ精製と
ライゲーション

アンプリコンを用いた
ターゲットキャプチャー
Haloplex (Agilent)
ターゲット断片のPCR増幅
実験条件のまとめ
• Starting material: 5 mg gDNA from Cancer cell
line (no WGA)
• 1st PCR (library prep): 10 cycles
• SureSelect Human AllExon Kit (Agilent)
• Illumina GAIIx Paired-end library 2 x 72bp,
insert size ~155 bp
– ERR035486:53.3 M reads (6.6 Gb)
– ERR035487: 68.0 M reads (9.8 Gb)

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