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Utilizzo della tecnica di sequenziamento genico per l’analisi del polimorfismo 158V/F del recettore Fcgamma Receptor 3A, possibile marcatore genetico di risposta al farmaco biologico anti-CD20 Rituximab nei pazienti con artrite reumatoide.
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"Analisi di farmacogenetica per l'ottimizzazione dei farmaci biologici nei pazienti con artrite reumatoide"
Laureando: Turello Gabriele
Relatore: Bandiera Antonella
Correlatore: Fabris Martina

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  1. Anno Accademico 2010-2011 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE Curriculum: Biologia e Tecnologie Cellulari e Molecolari "ANALISI DI FARMACOGENETICA PER L’OTTIMIZZAZIONE E L’UTILIZZO DEI FARMACI BIOLOGICI NEI PAZIENTI CON ARTRITE REUMATOIDE" Laureando: Turello Gabriele Relatore: Bandiera Antonella Correlatore/i: Fabris Martina 1
  2. Utilizzo della tecnica di sequenziamento genico per l’analisi del polimorfismo 158V/F del recettore Fcgamma Receptor 3A, possibile marcatore genetico di risposta al farmaco biologico anti-CD20 Rituximab nei pazienti con artrite reumatoide. 1. Introduzione. L’artrite reumatoide è una malattia infiammatoria cronica sistemica e autoimmune ad etiologia sconosciuta, caratterizzata da una poliartrite simmetrica che colpisce le articolazioni sinoviali. E’ una malattia invalidante ad elevato costo sociale che riduce l’aspettativa di vita del malato. (1) 1.1. Epidemiologia. L’incidenza della malattia raggiunge il picco massimo tra i 35 e i 50 anni e riguarda principalmente le donne, in un rapporto 4:1 rispetto agli uomini. Circa 0.4-1% della popolazione viene colpito dall’artrite reumatoide: in Italia sono circa 300 mila le persone affette, a livello mondiale invece sono circa 10 milioni. (1) L’infiammazione colpisce principalmente le articolazioni sinoviali, ma anche organi e apparati non scheletrici come la cute, l’occhio, il polmone, il rene, il cuore, le arterie. Il coinvolgimento delle articolazioni è simmetrico e le più colpite sono le articolazioni dei polsi e delle dita delle mani, seguite da quelle di collo, spalle, gomito, anca, ginocchio, caviglia, piedi. I sintomi sono vari tra i soggetti affetti, ma si riscontra generalmente dolore e rigidità mattutine per circa 30 minuti seguiti poi da sintomi di più lunga durata. La malattia induce infine un invecchiamento precoce del sistema cardio-vascolare e ciò contribuisce a ridurre le aspettative di vita dell’individuo affetto.(1) 1.2. Etiologia e Patogenesi. La causa non è del tutto conosciuta in quanto la genesi della malattia è multifattoriale. Essenziale è una predisposizione genetica che induce un’alterata risposta immunitaria a determinati agenti ambientali (virus, batteri, ecc.) causando 2
  3. l’innesco di reazioni infiammatorie definite ‘a catena’ che non possono essere controllate dallo stesso sistema immunitario: l’infiammazione tende a mantenersi, distaccandosi però dalle cause che l’hanno provocata. Tale auto mantenimento è favorito da tre citochine: Tumor Necrosis Factor-alfa, Interleuchina 1 (IL-1) e IL-6. Da un punto di vista genetico e molecolare, le sequenze che possono influenzare la malattia si trovano soprattutto all’interno degli antigeni di classe II, HLA DR4 (coi sottotipi DW4, DW14, DW15) e DR1; il rischio di contrarre la malattia è 4-5 volte superiore nei soggetti che li esprimono. (2) Questi codificano per la parte mediana della sponda dell’alfa elica del MHC di classe II, cioè la zona che accoglie il peptide antigenico e che viene interessata dal riconoscimento del T-cell receptor. Non si conosce la natura dell’agente trigger, ma si pensa che possa essere un microrganismo patogeno (patogeni batterici o virali), un superantigene (legano il complesso MHC di classe II da un lato e il recettore dei linfociti T dall’altro) o un autoantigene (coinvolti invece nel mantenimento e nella cronicizzazione del processo morboso), (1). Stimolando il sistema immunitario, l’agente scatenante porta a mantenere una risposta infiammatoria disfunzionale e rivolta verso il self anche quando non è più presente in sede articolare o sistemica. La malattia così evolve indipendentemente dallo stimolo antigenico iniziale e la sinovite si auto mantiene con l’attivazione di sinoviociti di tipo 1 (simil-macrofagici) e di tipo 2 (simil-fibroblasti). Queste cellule costituiscono la sinovia, una membrana di origine mesenchimale che riveste internamente la cavità articolare; essa secerne inoltre il liquido sinoviale che lubrifica l’articolazione e nutre la cartilagine. (1) In corso di artrite reumatoide il sistema immunitario attacca la membrana sinoviale delle articolazioni diartrodiali causando l’infiammazione della sinovia che va incontro a iperplasia e ipertrofia: essa prolifera e produce fluido in eccesso così che l’articolazione si gonfia e diviene dolorante. Successivamente subiscono dei danni anche la cartilagine e l’osso subcondrale. 3
  4. In questa situazione i polimorfonucleati si spostano nel liquido sinoviale e linfociti T, B e plasmacellule (PCs) formano a livello della sinovia un tessuto simil linfonodale. E’ dunque evidente come l’artrite reumatoide sia scatenata e si perpetui sostenuta da meccanismi che coinvolgono sia l’immunità innata (monociti/macrofagi, polimorfonucleati, cellule NK), sia quella adattativa (linfociti T e B). 1.3. Ruolo dei linfociti B e caratteristiche immunologiche. La maturazione dei linfociti B è dovuta alla formazione di microstrutture linfoidi che promuovono interazioni intercellulari nella sinovia e/o in altri tessuti extralinfonodali. Una volta differenziati, i linfociti B svolgono il ruolo di Antigen Presenting Cell (APC) per i linfociti Th CD4+; modelli murini hanno dimostrato che, in mancanza di linfociti B, i linfociti T nella sinovia non riescono a indurre artrite. (3) In corso di artrite la produzione di autoanticorpi sottolinea il contributo offerto dai linfociti B nella patogenesi della malattia. (4) L’artrite reumatoide causa quindi un’anomala proliferazione di cellule B con produzione di anticorpi: in particolar modo viene prodotto il fattore reumatoide (FR), ma sono anche importanti gli anticorpi antipeptidi citrullinati (anti-CCP). Questa situazione causa così uno sbilanciamento dell’equilibrio citochinico con un incremento della sintesi di citochine proinfiammatorie (TNFalfa, IL-6, IL-1beta). (vedi fig.1). IL-6 IL-17 Fig. n°1: Squilibrio delle citochine in corso di AR. 4
  5. Il FR è un autoanticorpo prodotto dalle PCs di linfonodi, milza e membrana sinoviale. Esso reagisce con il frammento Fc delle IgG andando a formare degli immunocomplessi patogenetici con la cooperazione del complemento. Il complemento viene infatti attivato da tali immunocomplessi FR-IgG (il FR può essere una IgG, una IgM o anche IgA ma riconosce sempre l’Fc di una IgG) che vanno ad innescare la risposta infiammatoria che porta al danno articolare. Esso è presente nel 70-80% dei pazienti ed è associato ad una prognosi più grave. (1) Gli anti-CCP (APF, AFA, AKA) sono degli autoanticorpi che agiscono nei confronti di proteine che contengono citrullina, un aminoacido modificato derivato dall’arginina tramite l’azione di deaminazione dell’enzima PAD, peptidil-arginin deiminasi. La citrullina agisce come uno stimolante antigenico che induce la produzione di anti-CCP da parte dei linfociti B. Gli anti-CCP hanno lo stesso livello di sensibilità del FR, ma una specificità più elevata e si positivizzano molto precocemente nel corso dell’evoluzione della malattia (5). 1.4. Terapia convenzionale e farmaci biologici. L’impiego di farmaci permette in corso di AR di attenuare la flogosi, rallentare la progressione del danno articolare e sistemico, prevenire la deformità e limitare la grave disabilità che la malattia può portare. La terapia farmacologica dell’AR si basa su due diversi tipi di farmaci, quelli tradizionali e quelli biologici. I farmaci tradizionali consistono in farmaci sintomatici come i FANS e in molecole impiegate in un trattamento ‘di fondo’ della malattia definite DMARDs (disease-modifying anti-rheumatic drugs). I FANS vengono utilizzati con funzione analgesica e antinfiammatoria per ridurre nel lungo termine la flogosi articolare e la rigidità mattutina se somministrati alla sera. I farmaci DMARDs vengono impiegati non appena la diagnosi della malattia è certa, ma hanno degli effetti collaterali notevoli come alterazioni negli enzimi citolitici epatici e epatotossicità. (1) 5
  6. Per i pazienti resistenti alle comuni linee guida terapeutiche e per una patologia aggressiva o in rapida ripresa, sono disponibili da circa 15 anni i farmaci biologici. (6) Tali farmaci sono strutturalmente simili a normali proteine presenti nell’organismo e determinano immuno-depressione. Essi riproducono i meccanismi naturali e fisiologici di inibizione dell’infiammazione, per esempio bloccando l’azione delle citochine pro-infiammatorie coinvolte nella patogenesi dell’AR (vedi fig. n° 2). Fig n°2: Ruolo delle citochine nell’artrite reumatoide. Il gruppo più numeroso è quello composto dagli antagonisti del TNFα (il TNFα rappresenta una citochina proinfiammatoria espressa ad alti livelli nella sinovite reumatoide e chiave nella patogenesi dell’AR), tra cui si annoverano: Infliximab: anticorpo monoclonale chimerico (composto da una parte umana e una murina) IgG, riconosce e lega in modo irreversibile il TNF sia solubile (riducendone 6
  7. la concentrazione in circolo) che legato al suo recettore, mediando così la distruzione per apoptosi della cellula che lo esprime con un meccanismo anticorpo-dipendente. Adalimumab: presenta la stessa attività e la medesima morfologia di Infliximab, ma la sua struttura è totalmente umanizzata. Etanercept: è una proteina di fusione, composta dal dominio extracellulare di legame del recettore di tipo 2 del TNF legato al frammento Fc di una IgG1 umana. Lega il TNF solubile in modo reversibile. Fig. n° 3: Meccanismo d’azione di Infliximab, Adalimumab e Etanercept. 7
  8. C’è poi l’ Anakinra, un analogo del recettore antagonista dell’IL-1, che riduce l’attività biologica dell’IL-1 antagonizzandone il legame con il suo recettore. L’IL-1 è una citochina prodotta da monociti, macrofagi e sinoviociti specializzati che svolge un ruolo pro-infiammatorio molto importante in corso di AR, promuovendo in particolare la liberazione di metallo-proteasi, danneggiando così la cartilagine articolare e l’osso. Di più recente introduzione e molto promettente è il Tocilizumab, la cui attività si esplica nei confronti di un’altra citochina chiave per la flogosi e la proliferazione B cellulare in AR, l’IL-6. Molto utile in AR è anche l’Abatacept, analogo del CTLA4 che colpisce l’attivazione T cellulare. Fig. n°4: Meccanismo d’azione dei farmaci biologici. Infine uno fra i più efficaci e largamente utilizzati da ormai quasi 10 anni è sicuramente il Rituximab, un anticorpo monoclonale con attività B depletiva. I farmaci biologici hanno cambiato il corso dell’AR poiché si sono dimostrati molto efficaci anche laddove i farmaci tradizionali avevano fallito, pur presentando dei 8
  9. limiti. I problemi principali dell’utilizzo dei farmaci biologici sono il loro costo molto elevato, i possibili effetti collaterali e l’efficacia variabile condizionata da differenze genetiche, responsabili dal 20 al 95% di questa variabilità. 1.5. Rituximab. RTX è un anticorpo monoclonale chimerico (umano-murino) di classe IgG1 costituito da catene pesanti di tipo γ e catene leggere k. Il target del farmaco è rappresentato dall’antigene cellulare CD20 espresso sulla superficie dei linfociti B (pre-B e B maturi, non PC). La molecola CD20 espressa sulla superficie dei linfociti B favorisce l’attivazione dei linfociti B e la regolazione della loro crescita, contribuendo alla gestione del flusso transmembrana dello ione calcio. Figura n° 5: Struttura molecolare di RTX. V = regione variabile; C = regione costante. E’ stato utilizzato inizialmente nella terapia dei linfomi non-Hodgkin (NHL) a cellule B (7). Da qualche anno viene impiegato in malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico (LES), l’AR e la Crioglobulinemia mista HCV-relata.(8) Il trattamento a base di Rituximab prevede l’eliminazione dei linfociti B CD20+ dal 9
  10. sangue periferico e dalle aree di flogosi, limitandone la funzione di APC per i linfociti T e la produzione di macrofagi.(9) I linfociti B sono coinvolti nella presentazione ai linfociti T di un repertorio antigenico responsabile della perdita di tolleranza verso epitopi self. RTX elimina questi cloni di linfociti B, auspicando la maturazione di nuove cellule prive di predisposizione all’autoreattività. La deplezione linfocitaria dovuta a RTX riduce i livelli di anticorpi circolanti sensibilmente ed in modo selettivo tramite due meccanismi noti: favorisce una citotossicità complemento-mediata e anticorpo-mediata e induce l’apoptosi. (10) La funzione B-depletiva di RTX prevede l’induzione di: - citotossicità anticorpo-mediata (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), - citotossicità complemento-mediata (CDC, complement-dependent cytotoxicity), - citotossicità complemento-dipendente cellulo-mediata (CDCC, complementdependent cell-mediated cytotoxicity); - apoptosi; - fagocitosi FcγRII/CD32-dipendente. Le reazioni di tipo ADCC coinvolgono granulociti neutrofili e eosinofili e i fagociti mononucleati, in particolar modo le cellule Natural Killer (NK). In queste reazioni i linfociti B CD20+, opsonizzati da RTX, vengono riconosciuti e lisati da cellule NK grazie alla presenza, sulla superficie cellulare, del recettore per il frammento Fc FcγR3A (11), un recettore Fcγ a bassa affinità. Le IgG permettono di distinguere le cellule da lisare e, saturando il recettore FcγR3A, attivano le cellule NK che sintetizzano e secernono citochine , come il TNF-α e l’INF-γ, e degranulano. Le citochine prodotte mediano la risposta infiammatoria. (12) 10
  11. RITUXIMAB LINFOCITA B CD20+ Figura n°6: Riconoscimento del linfocita B ricoperto da RTX da parte di cellule NK CD16/FcγRIIIa+. Le reazioni di tipo CDCC invece prevedono l’opsonizzazione tramite richiamo ed interazione con proteine complementari definite opsonine. La presenza sulla superficie cellulare di opsonine e anticorpi favorisce la fagocitosi della cellula opsonizzata da parte di monociti e macrofagi con l’ausilio del recettore FcγR3A, di altri FcγR e dei recettori per il complemento. (11-12) Figura n°7: Prospetto riassuntivo dei diversi meccanismi d’azione finora conosciuti di RTX. 11
  12. Nel caso in cui invece Rituximab attivi la via classica del complemento attraverso il legame del frammento Fc con un componente della cascata (C1q), allora la reazione in questione viene chiamata CDC ed è illustrata in figura n°8. (12) C3 CONVERTASI C5 CONVERTASI RITUXIMAB MAC Figura n°8: Meccanismo d’azione della via classica del complemento. Nel sangue periferico, a causa di una maggiore esposizione a RTX, sono più spesso coinvolte le vie dipendenti dal complemento (via classica e CDCC) e dagli anticorpi (ADCC), mentre tali meccanismi sono meno rappresentati in ambito linfonodale o al di fuori dei tessuti linfoidi. (12) 1.6. Farmacogenetica. E’ lo studio dell’associazione tra varianti genetiche di determinati geni e risposta ai trattamenti farmacologici. Si basa sull’identificazione di polimorfismi SNP (single nucleotide polymorphism) a carico di geni coinvolti nella risposta farmacologica. 12
  13. Fig. n° 9: Prospetto di uno studio di Farmacogenetica. Per polimorfismo SNP si intende una variante nucleotidica presente nella popolazione in almeno due diversi fenotipi, di cui il più raro con una frequenza di almeno 1-2%. Dal confronto della frequenza degli SNP presenti in pazienti in cui il farmaco è efficace con quella in pazienti in cui è inefficace è possibile identificare gli SNP associati ad una risposta ad un determinato farmaco (vedi fig. 9). La farmacogenetica ha quindi un’applicazione pratica in quanto in base a dei test genetici è possibile individuare la terapia migliore per il paziente. La determinazione degli SNP prevede innanzitutto l’estrazione del DNA da un prelievo di sangue periferico o altro campione biologico, quindi l’analisi del genotipo può essere eseguita attraverso diverse tecniche, le principali sono: - Amplificazione genica per PCR, taglio differenziale con enzimi di restrizione e corsa elettroforetica; - Amplificazione mediante real-time PCR con primer allele-specifici; - Sequenziamento genico diretto o su amplificato. 13
  14. 1.7. Il polimorfismo 158V/F dell’ FCγR3A. Tra i meccanismi immunologici utilizzati da Rituximab per promuovere un’azione citotossica il più studiato è quello anticorpo-dipendente cellulo-mediato (ADCC) che per essere attuato richiede la presenza di recettori leucocitari distribuiti sulla superficie cellulare capaci di riconoscere e legare la frazione Fc di IgG-RTX (FCγR) e di stimolare l’attivazione in senso citotossico del leucocita coinvolto (11). Esistono 3 classi di FCγR (FCγR1, FCγR2, FCγR3) appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline. Vengono codificate nell’uomo da 5 geni mappati sul cromosoma 1 (13). Alcuni di questi geni presentano un polimorfismo allelico determinante la formazione di isoforme con differenti proprietà recettoriali che a volte possono essere coinvolte nell’induzione di una maggiore suscettibilità alle infezioni o alle malattie autoimmuni. Caratteristiche morfologiche delle tre classi di recettori: - FCγR1: presenta una struttura multimerica trans membrana costituita da catene alfa per il legame con il frammento Fc delle IgG e catene gamma contenenti una regione di trasduzione del segnale denominata ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) (13). - FCγR2: viene codificato in due forme (A e B) a diversa funzione biologica. FcγR2A è un recettore transmembrana di tipo monomerico con una singola catena gamma contenente una sequenza ICAM, mentre FCγR2B si compone di una singola catena con dominio extracellulare simile a FCγR2A e con dominio intracellulare contenente una regione ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif). - FCγR3: presenta una struttura multimerica transmembrana costituita da catene alfa per il legame con il frammento Fc delle IgG e catene gamma contenenti una sequenza ITAM. Si trova sulla superficie di diversi gruppi di leucociti e si presenta in due forme: FcγR3A e FcγR3B. 14
  15. Il recettore FCγR3A viene espresso preferenzialmente da macrofagi, NK e linfociti T attivati. Il legame recettore-Ig media una serie di funzioni cellulari (fagocitosi, clearance degli IC, degranulazione, ADCC, rilascio di citochine, regolazione della produzione anticorpale). Nel corso degli anni sono state identificate due varianti alleliche: - FCγR3A 48L/R/H: il dominio distale extracellulare del recettore presenta in posizione 48 un residuo di arginina (R) o istidina (H) al posto di un residuo di leucina (L); la forma 48H aumenta la suscettibilità nei giovani adulti ad infezioni virali (14). - FCγR3A 158V/F: il dominio transmembrana prossimale del recettore presenta in posizione 158 un residuo di valina (V) o di fenilalanina (F), corrispondente alla situazione di un nucleotide T con G in posizione 559. In questa sede è contenuto il sito di legame per le IgG. Gli omozigoti 158VV legano con maggior affinità il frammento Fc delle IgG1 e IgG3 rispetto ai 159FF; i soggetti eterozigoti 158V/F presentano un’affinità di legame intermedia (15). La VAL in posizione 158, determinando una maggiore affinità di legame FcγR3A-Fc IgG, sarebbe responsabile di un’attivazione più significativa delle cellule NK. L’ FCγR3A è quindi importante nel meccanismo d’azione del RTX ed è per questo motivo che si è infatti studiato il suo polimorfismo nell’ambito della farmacogenetica del RTX in diverse patologie. (11,16, 17) Si è osservato che la capacità delle cellule NK-158VV o NK-158FF di riconoscere o legare IgG1 e IgG3 sembra essere indipendente dalla variante allelica in posizione 48: per questo motivo si ritiene che il legame con il frammento Fc sia influenzato unicamente dal polimorfismo 158V/F. (15) Inoltre è stata evidenziata la presenza di alte concentrazioni di FcγR3A nel siero di pazienti AR ad indicare che macrofagi e NK sono attivati durante le diverse fasi della 15
  16. malattia. E’ infatti possibile rilasciare in circolo il recettore (sFcγR3A) solo dopo attivazione delle cellule che inizialmente lo esprimono in superficie. (18) E’ infine stata cercata una correlazione in corso di artrite reumatoide con la suscettibilità alla malattia e con la severità delle manifestazioni cliniche. Il genotipo VV viene over-espresso all’interno della popolazione AR rispetto ai controlli sani. I risultati del lavoro riconoscono la correlazione tra FcγR3A-158VV e il rischio di sviluppare una forma di AR grave, soprattutto in soggetti di sesso maschile. (19) Queste conclusioni non trovano conferma in un’ulteriore analisi in cui è stato individuato invece che la suscettibilità alla malattia sembra correlata all’associazione tra FcγR3A-158V e FcγR2A-131H. (20) Ad ogni modo è stato allo stesso tempo evidenziato come il recettore FcγR2A non sempre si comporti come fattore di rischio genetico per l’aggressività dell’AR(11), mentre il recettore polimorfico FcγR3A è evidentemente implicato come fattore di rischio, come confermato dai lavori menzionati. L’analisi del polimorfismo 158V/F dell’FCγR3A presenta delle problematiche tecniche abbastanza importanti dovute essenzialmente all’elevata omologia di sequenza con gli altri membri della famiglia dell’FcγR, che competono per l’amplificazione genica e interferiscono con la successiva analisi. In uno studio preliminare, i ricercatori del Laboratorio di Reumatologia, sede del presente lavoro di tesi, avevano utilizzato una metodica precedentemente pubblicata che prevedeva l’amplificazione genica e la successiva analisi genotipica mediante digestione con un enzima di restrizione. Mediante questa metodica i risultati erano però di difficile interpretazione nei casi di eterozigosi e omozigosi VV. Per questo motivo in diverse fasi hanno modificato la metodica, giungendo infine a scegliere come ottimale la tecnica di sequenziamento genico, impiegata appunto in questo studio. 16
  17. 2. Scopo della tesi. Il presente lavoro di tesi si prefigge come obiettivo quello di compiere tramite il sequenziamento genico un’analisi del polimorfismo 158V/F del recettore FcγR3A per verificare la possibile sua funzione come marcatore genetico di risposta al farmaco biologico anti-CD20 Rituximab nei pazienti affetti da artrite reumatoide. 3. Materiali e metodi. 3.1. La reazione di sequenziamento genetico: chimica e tecnologia. Nel campo del sequenziamento del DNA esistono due metodi: il metodo di Maxam e Gilbert, basato sulla degradazione chimica del DNA e il metodo di Sanger, definito ‘a terminazione di catena’. Negli esperimenti condotti nel presente lavoro di tesi è stata utilizzata la metodica di Sanger. La tecnica si basa sul prematuro termine della sintesi di DNA in seguito all’inserimento di dideossinucleotidi terminatori (non contengono il gruppo ossidrilico al 3’) che verranno marcati con fluorofori per essere resi visibili dal detector dello strumento analizzatore (una tecnica alternativa prevede la marcatura dei primer al posto della marcatura dei terminatori). I frammenti di Sanger sono prodotti mediante amplificazione lineare di una piccola quantità di DNA stampo utilizzando i normali cicli termici della PCR. La sintesi del DNA richiede un primer specifico complementare al filamento da sequenziare, la DNA polimerasi, una miscela costituita dai 4 dNTP e da ddNTP (a concentrazione 1:100 rispetto al corrispondente dNTP). Al termine della reazione la miscela contiene una popolazione di filamenti di nuova sintesi che hanno in comune l’estremità 5’ ma che differiscono in lunghezza poiché la loro sintesi è stata bloccata in diverse posizioni al 3’. Questi frammenti verranno poi separati ed identificati tramite elettroforesi capillare svolta da un sequenziatore automatico. Tale metodica è stata supportata dal programma ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer e prevede l’utilizzo del BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit della 17
  18. Applied Biosystems. Questo kit fornisce una mix contenente già la DNA polimerasi, i dNTPs e i ddNTP terminatori. Il primer è invece stato progettato in modo specifico per il gene di interesse (FCGR3A) ed è il seguente: 5'-CCC CAA AAG AAT GGA CTG AA-3’ Ciascun ddNTP presenta un marcatore fluorescente BigDye (diclororodamina) costituito da un colorante accettore diclororodamina (emissione variabile) e da un donatore fluorescente (emissione a 490 nm) che costituiscono un sistema di trasferimento di energia a singola molecola. I coloranti sono 4, uno per ogni dideossinucleotide; ciascuno ha uno spettro di emissione diverso dall’altro. La massima eccitazione di ogni colorante è quella della fluoresceina (donatore) e lo spettro di emissione è quello della rodamina (accettore). Fig. n° 10: Spettro di emissione delle rodamine Fig. n°11: formula chimica dei marcatori fluorescenti BigDye. 18
  19. L’intensità e la lunghezza d’onda delle emissioni fluorescenti vengono captate durante l’elettroforesi quando i frammenti di DNA, eccitati dalla luce laser, passano davanti ad un rilevatore. La sequenza di DNA è determinata da un software in grado di interpretare le misure di fluorescenza registrate dal rilevatore e di elaborarle opportunamente. Le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso (per confronto con una matrice già impostata) con aree proporzionali all’intensità di emissione. La fluorescenza viene così individuata grazie all’elettroforesi che può essere di due tipi: elettroforesi su gel oppure capillare. La tecnica utilizzata in questo lavoro prevedeva l’utilizzo dell’elettroforesi capillare. La separazione elettroforetica dei frammenti fluorescenti avviene in un capillare del diametro di 50nm contenente un polimero di corsa, cioè una matrice che separa i frammenti in base alle dimensioni e che viene caricata automaticamente dal sistema. I frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che corrono lungo il capillare. Tale metodica richiede campioni privi di sali, molecole cariche negativamente, proteine, detergenti e templates non marcati. E’ perciò necessaria una fase di purificazione che segue la PCR e precede il sequenziamento. I sequenziatori capillari possono presentare 96 capillari, 16 oppure uno. Il sequenziatore utilizzato in questi esperimenti è del tipo ad un solo capillare, modello Abi Prism 310. Il DNA carico negativamente entra nel capillare e migra verso il polo positivo al lato apposto del capillare. Un raggio laser eccita i fluorocromi man mano che i frammenti passano attraverso il capillare. Un sistema ottico con fotomoltiplicatore raccoglie il segnale fluorescente restituito dai fluorocromi e un software raccoglie i dati di fluorescenza e li elabora in “picchi” pseudocolorati per distinguere i 4 fluorocromi. 19
  20. L’output tipico è un “cromatogramma” che legge i tracciati fluorescenti generati dal sequenziatore e identifica le basi. Fig. n° 12: esempio di cromatogramma che mostra le basi individuate. 3.2. Le problematiche dell’analisi di sequenza. In fig. n° 13, A e B, è illustrato un esempio di reazione ben riuscita, in cui i picchi mostrano una perfetta risoluzione e consentono una facile interpretazione. Fig. n° 13-A: Raw data di una reazione ben riuscita. Fig. n° 13-B: Sequenza dei picchi di una reazione ben riuscita. 20
  21. In fig. n° 14, A e B, è illustrato invece un esempio di reazione totalmente fallita. Le cause di possibile fallimento sono molteplici e sono illustrate in tabella 1 ove si riportano anche le possibili soluzioni. Fig. n° 14-A: Raw data di una reazione fallita. Fig. n° 14-B: Reazione fallita: non presenta picchi definiti e ha un alto rumore di fondo. Tabella 1. Possibili cause di reazione fallita e soluzione: Il primer non trova sito di annealing  cambiare primer. Il DNA presenta contaminazioni di vario tipo  Preparare di nuovo il DNA. La quantità di DNA e' insufficiente  Aumentare la quantità di DNA. La quantità di primer è insufficiente  Aumentare la quantità di primer. 21
  22. Il primer è stato progettato male, es. temperatura di melting troppo bassa  Progettare nuovamente il primer. Si verificano spesso anche reazioni caratterizzate da un elevato rumore di fondo, che non permette in tutta la sequenza di interpretare con elevata sicurezza il cromatogramma (vedi fig.15 ). Anche in questo caso le cause sono diverse e sono illustrate in Tabella 2. Fig. n°15: Campione che presenta rumore di fondo sufficientemente alto da causare ambiguità (N) nel riconoscimento dei picchi da parte del software. Tabella 2. Possibili cause di reazione fallita e soluzione: La quantità di DNA e' insufficiente e il segnale troppo debole  Aumentare la quantità di DNA Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione  Purificare meglio il DNA Ci sono altri templati contaminanti  Ripreparare il DNA 3. 3. L’analisi del polimorfismo 158V/F del gene FCγR3A. 3.3.1 Estrazione del DNA genomico. Il DNA genomico è stato estratto da sangue intero in EDTA utilizzando un estrattore automatizzato (Maxwell 16 System, Promega, Madison, WI, USA). Lo strumento permette l’estrazione di un massimo di 16 campioni contemporaneamente e il processo dura 45 minuti. Il kit di estrazione dedicato allo strumento fornisce per ogni campione da sottoporre a estrazione una cartuccia monouso dotata di 7 pozzetti contenenti i reagenti necessari al processo all’interno dei quali lo strumento esegue i 22
  23. vari passaggi previsti per l’estrazione. Il primo pozzetto, previsto per la dispensazione del campione da esaminare, contiene il buffer di lisi, nel secondo vi sono le biglie paramagnetiche di cattura del DNA, mentre i restanti pozzetti contengono diversi buffer per i lavaggi e l’eluizione. Il metodo si basa sul legame del DNA estratto dalle cellule alle particelle di materiale paramagnetico (MagneSil ® Paramagnetic Particles) e il successivo rilascio nel buffer finale di eluizione. Lo strumento utilizza un’ancoretta magnetica per catturare e trasportare il materiale d’interesse (DNA gnomico) legato alle particelle, eliminando mediante una serie di lavaggi le impurità. Per ogni campione da analizzare è stata dispensata nel primo pozzetto un’aliquota di 400μl di sangue periferico intero della cartuccia monouso, mentre un’aliquota di 300μl di buffer di eluizione è stata dispensata nell’idonea cuvetta. Al termine del processo le cuvette sono state estratte dallo strumento e alloggiate su un supporto magnetico capace di trattenere le particelle. Ogni campione di DNA, eluito nel proprio buffer e privo di particelle, è stato trasferito mediante una pipetta in una eppendorf da 1.5ml, preventivamente identificata. Tutte le operazioni esterne all’estrattore Maxwell 16 System sono state eseguite sotto cappa biologica al fine di evitare possibili contaminazioni del campione. I singoli campioni estratti sono stati conservati a temperatura 4°C. 3.3.2 Quantizzazione del DNA estratto. Il DNA estratto mediante metodo automatizzato è stato successivamente quantizzato; la determinazione della concentrazione dei campioni di DNA estratto è essenziale per assicurare l’efficienza del processo di amplificazione genica mediante PCR. Ogni campioni di DNA è stato quantizzato utilizzando il sistema NanoDrop messo a disposizione dal Dipartimento di Genetica dell’Università degli Studi di Udine. Tale sistema prevede la combinazione della tecnologia a fibre ottiche e delle proprietà di tensione superficiale di un’aliquota di soluzione per determinare la concentrazione del campione in maniera indipendente dalle tradizionali fonti di contaminazione, quali cuvette o capillari. Lo strumento utilizzato presenta come ulteriore vantaggio la 23
  24. possibilità di eseguire l’analisi su micro-volumi di campione d’interesse, minimizzando la perdita di materiale. La determinazione della concentrazione di DNA avviene a partire dalla lettura spettrometrica dell’assorbanza del campione d’interesse a λ=260nm. Il principio su cui il metodo si basa è dato dalla relazione esistente tra la concentrazione del campione e il valore di luce assorbita dallo stesso. La lettura allo spettrofotometro permette inoltre la determinazione della purezza dei campioni, calcolando il rapporto tra l’assorbanza a 260nm e quella a 280nm (lunghezza d’onda a cui assorbono le proteine); questo rapporto “ratio” per soluzioni contenenti DNA ha un valore prossimo a 1.8 e costituisce un indice di purezza. Scostamenti del valore del rapporto da quello definito sono indice di impurezza del DNA analizzato. Dopo aver accuratamente pulito mediante 2-3μl di acqua deionizzata le superfici ottiche dello strumento, prima di procedere alla quantizzazione di ogni campione, è stata effettuata la misura del bianco, dispensando sull’idonea superficie 1μl di buffer, lo stesso utilizzato per l’eluizione del campione. La misura del bianco permette di sottrarre dal valore finale di assorbanza, misurato sul campione eluito, il contributo alla misura derivato dai componenti il buffer. Ogni misura è stata effettuata su un volume di 1μl di soluzione di DNA dispensato sulla stessa superficie sfruttata per la determinazione del bianco. Per ogni campione lo strumento ha effettuato la misura di assorbanza a 260nm e, attraverso il software, ha fornito la concentrazione dell’acido nucleico, espressa in ng/μl, ottenuta moltiplicando il valore di assorbanza per un fattore di conversione noto. Il fattore di conversione nel caso del DNA a doppio filamento è 50. Infine è stato fornito il valore di purezza del campione ottenuto dal rapporto dei valori di assorbanza a 260 e 280 nm. 3.3.3. Analisi genotipica. L’analisi del polimorfismo 158V/F è stata eseguita in 2 step. Il primo step consente di ottenere il DNA da analizzare mediante l’amplificazione PCR (reazione a catena 24
  25. della polimerasi) del frammento genico ove si trova il sito polimorfico e la purificazione del DNA amplificato tramite il kit di purificazione NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel). Con tale metodo il DNA si lega ad una membrana di silice in presenza di sale caotropico aggiunto tramite il Binding Buffer NT. La soluzione che favorisce il legame è caricata direttamente nelle NucleoSpin Extract II Colums, delle colonne che vengono fornite già nel kit. Le contaminazioni costituite da sali e componenti molecolari solubili vengono poi rimossi tramite un semplice lavaggio con la soluzione etanolica Wash Buffer NT3. Infine il DNA puro viene eluito a basse condizioni di forza ionica con Eluition Buffer NE leggermente alcalino (5mM Tris/HCl, pH 8.5). Per l’amplificazione sono stati utilizzati i seguenti primer: forward 5'CCCTTCACAAAGCTCTGCACT-3' e reverse 5'- ATTCTGGAGGCTGGTGCTACA- 3' (21) Il programma di amplificazione inizia con 2’ di denaturazione a 94°C seguita da 10 cicli così strutturati: 20’’ a 94°C, 40’’ ad un gradiente da 62°C a 57.5°C decrescendo di 0.5°C ad ogni ciclo, 1’30’’ a 72°C. Il prodotto di PCR, un frammento di 1109kB, è stato infine controllato al trans illuminatore UV dopo elettroforesi su gel di agarosio al 2% in TBE con etidio bromuro. Quindi il DNA purificato è stato amplificato per permetterne il sequenziamento con il metodo di Sanger. La PCR di sequenza è stata fatta usando il seguente primer: 5’CCC CAA AAG AAT GGA CTG AA-3’ e un programma di amplificazione di 25 cicli così strutturati: 10’’ a 96°C per denaturazione, 5’’ a 50°C per annealing, 4’ a 60°C per estensione. I cromatogrammi relativi alle sequenze geniche sono stati analizzati utilizzando il software Chromas, scaricabile gratuitamente da internet. I cromatogrammi rappresentativi dei 3 possibili genotipi sono riportati nella figura 16. 25
  26. 158VV A) 158VF B) 158FF C) Fig. n° 16: I cromatogrammi illustrano i risultati rappresentativi dei genotipi VV (A), VF (B) e FF (C). 3.4. Caratteristiche dei pazienti analizzati. Lo studio è stato condotto su una coorte retrospettiva di 221 pazienti (84% di sesso femminile; età media 60±13; durata media della malattia 13.2±10.2 anni) con artrite reumatoide diagnosticata secondo i criteri di classificazione dell’American College of Rheumatology (ACR) (22). Tutti i pazienti hanno dato il loro consenso allo studio in base alla Dichiarazione di Helsinki e la ricerca è stata approvata dal locale Comitato Etico (Protocollo Far-Reu 001 del 06/20/2010). I pazienti sono stati arruolati presso 13 diversi centri reumatologici in Italia, che collaborano da anni con 26
  27. la Clinica di Reumatologia di Udine. Dal punto di vista sierologico i pazienti erano 160/221 (72.4%) positivi per il fattore reumatoide e 159/221 (71.9%) positivi per gli anticorpi anti-peptidi citrullinati ciclici (anti-CCP). Tutti i pazienti sono stati trattati con 2 infusioni endovena di RTX secondo il protocollo vigente (1000 mg al tempo zero e 1000 mg dopo 2 settimane) in monoterapia (11 casi) o in combinazione con Methotrexate (MTX; 175 casi) o con altri DMARDs (leuflomide, ciclosporina A o idrossiclorochina). I pazienti in oggetto rappresentavano la maggioranza dei pazienti con artrite reumatoide trattati con RTX in questi centri, seguiti per almeno 6 mesi dopo il trattamento con RTX, dal 2004 al 2011. La maggioranza dei pazienti (160/221, 72.4%) era stata precedentemente trattata con uno o più agenti anti-TNF, mentre i rimanenti casi erano non-responsivi nei confronti del solo MTX o in combinazione con altri DMARDs per almeno sei mesi. La valutazione della risposta clinica si è avvalsa dei criteri di risposta della European League Against Rheumatisms (EULAR). La risposta è stata valutata a due diversi tempi dopo il trattamento con RTX (mese +4, mese +6), che sono i tempi a cui i pazienti solitamente vengono valutati secondo le indicazioni terapeutiche vigenti. I criteri EULAR utilizzano la variazione dello score complesso di attività di malattia su 28 articolazioni (DAS28). In base a tali criteri la risposta si può suddividere in: buona, moderata e nulla. 3.3.5. Analisi Statistiche. L’associazione tra la risposta EULAR al mese +4, la risposta EULAR al mese +6 e il genotipo del polimorfismo 158V/F dell’FCγR3A (genotipi VV, VF, FF) è stata analizzata mediante tabelle di contingenza utilizzando il test esatto di Fischer. I dati sono stati analizzati con il software Instat (San Diego, CA). I risultati sono stati considerati statisticamente significativi con p < 0.05. 4. Risultati. 4.1. Risposta a RTX, risultati clinici. L’efficacia di RTX è stata verificata sia al mese +4, dove c’erano 33/212 (15.6%) pazienti con risposta buona, 121/212 (57.1%) pazienti con risposta moderata e 27
  28. 58/212 (27.4%) pazienti con risposta nulla (NR); sia al mese +6 dove c’erano 53/212 (24%) pazienti con risposta buona, 102/221 (46.2%) pazienti con risposta moderata e 66/212 (29.9%) pazienti con risposta nulla (NR). 4.2. Risposta a RTX: studi genetici. La prevalenza genotipica del polimorfismo 158V/F nei pazienti con AR della presente casistica ha mostrato una distribuzione simile a precedenti serie di AR riportate in letteratura [VV: n. 38 (17.2%); VF: n. 106 (48%); FF: n. 77 (34.8%)], che a loro volta non si discostano significativamente dalla popolazione di controllo. Quindi questo polimorfismo non rappresenta un fattore di rischio per lo sviluppo di AR. (23) In contrasto con quanto precedentemente riportato (23) non è stata notata alcuna differenza nella prevalenza del genotipo VV nel confronto tra pazienti FR positivi e FR-negativi (VV: 18.1% vs 14.8% rispettivamente) o pazienti anti-CCP-positivi rispetto a anti-CCP negativi (VV: 17% vs 17.8%, rispettivamente). Come illustrato nella figura n° 17, i pazienti con il genotipo VV hanno mostrato il più alto tasso di risposta al RTX al mese +4 (fig.17 A; risposta da buona a moderata in 32/37, 86.5% dei pazienti VV) e al mese +6 (fig. 17 B; risposta da buona a moderata in 34/38, 89.5% dei pazienti VV), mentre i pazienti VF e FF hanno mostrato lo stesso tasso di risposta sia al mese 4+ (risposta buona/moderata in 69/102, 67% pazienti VF, e in 53/73, 72.6% pazienti FF; VV versus VF/FF OR 2.78, 95%CI 1.03-7.53, *p=0.043) che al mese 6+ (risposta buona/moderata in 70/106, 66% pazienti VF, e in 51/77, 66.2% in pazienti FF; VV versus VF/FF: OR 4.36, 95%CI 1.48-12.83, **p=0.0033). Da notare comunque che la percentuale di pazienti con risposta buona non differiva significativamente tra i pazienti VV (11/38, 28.8%) e i pazienti VF/FF (40/180, 22.2%). Queste associazioni sono risultate maggiormente significative nei pazienti FRnegativi (pazienti che rispondono al mese +6: 7/9, 77.8% tra i VV contro 18/54, 33.3% tra i VF/FF; OR 7, 95%Cl 1.32-37.21, p=0.023) che in quelli FR-positivi 28
  29. (pazienti che rispondono al mese +6: 27/29, 93.1% tra i VV contro 102/131, 78.6% tra i VF/FF; OR 3.7, 95%CI 0.82-16.39, p=0.12). Figura 17. Frequenza genotipica del polimorfismo 158V/F dell’FCGR3A nei pazienti con AR trattati con RTX. Il grafico a barre illustra la percentuale di 29
  30. pazienti con AR che rispondono (in modo buono o moderato) o non rispondono (NR) al RTX al mese +4 (A) e +6 (B) nei tre diversi sottogruppi genotipici del polimorfismo dell’FCGR3A. I pazienti che hanno il genotipo VV presentano un tasso di risposta significativamente più alto dei pazienti VF/FF sia al mese +4 (OR 2.78, 95%CI 1.03-7.53, *p=0.043) che al mese +6 (OR 4.36, 95%CI 1.48-12.83, **p=0.0033). 5. Conclusioni. Il trattamento con l’anticorpo monoclonale anti-CD20 RTX è una terapia molto efficace nell’artrite reumatoide ma, come anche nel caso degli altri farmaci biologici, la risposta può variare tra i diversi pazienti. L’identificazione di marcatori biologici che permettano di identificare a priori la possibilità di una risposta positiva (o negativa) ad un trattamento è un argomento molto rilevante. La possibile utilità dell’analisi del genotipo del polimorfismo 158V>F dell’FCγR3A per gestire meglio la terapia con RTX è stata spesso valutata in diverse malattie riportando in generale una significativa associazione tra i più alti tassi di risposta e la presenza dell’allele V, che è quello associato ad una maggiore affinità di legame per le IgG, come appunto è il RTX (15). Questa maggiore affinità di legame sarebbe alla base di un maggiore e più prolungato effetto biologico del RTX mediato dai meccanismi di ADCC e apoptosi nei confronti dei linfociti B. In uno studio preliminare, alcuni anni fa (24), i ricercatori del Laboratorio di Reumatologia dell’Università di Udine ove questo lavoro di tesi è stato condotto avevano già indicato in una piccola coorte (n. 57) di pazienti con AR un migliore profilo di risposta nei pazienti che possiedono il genotipo VV confrontato con i genotipi VF/FF. In questo studio preliminare i ricercatori avevano utilizzato l’amplificazione genica e la successiva analisi genotipica mediante digestione con un enzima di restrizione. Mediante questa metodica i risultati erano però dubbi nei casi di eterozigosi e omozigosi VV. Attraverso la tecnica di sequenziamento genico impiegata invece in 30
  31. questo studio è stato possibile superare queste difficoltà ed avere sempre una corretta interpretazione dei genotipi. In questo studio più approfondito e allargato ad una casistica molto estesa abbiamo confermato le precedenti osservazioni, indicando l’analisi del polimorfismo dell’FCγR3A come un potenziale utile marcatore genetico per ottimizzare la terapia con RTX nei pazienti con AR, in analogia a quanto già dimostrato in alcune neoplasie ematologiche (16). 6. Bibliografia. 1: S.Todesco, PF. Gambari.“Reumatismi infiammatori (artriti)” da “Malattie reumatiche”- III edizione 2002 Ed. McGraw-Hill, pagine 137-167. 2: Roudier J. “Association of MHC and rheumatoid arthritis. Association of RA with HLA-DR4: the role of repertoire selection” Arthritis Res. 2000;2(3):217-20. 3: Takemura S. et al. “T cell activation in rheumatoid synovium is B cell dependent” J Immunol. 2001 Oct 15;167(8):4710-8. 4: Silverman GJ, Carson DA. Roles of B cells in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2003; 5 (Suppl. 4): S1-6. 5: Amezcua-Guerra et al. “"Presence of antibodies against cyclic citrullinated peptides in patients with 'rhupus': a cross-sectional study" Arthritis Research & Therapy 2006. 6: F.Goldblatt, D.A. Isenberg. “New Therapies for rheumatoid arthritis”. Clin Exp Immunol 2005; 140:195-204. 7: G.L. Plosker, D.P. Figgit. “Rituximab – A Review of its use in Non-Hodgkin’s Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukaemia”. Drugs 2003; 63(8):803-843. 8: Isenberg DA “B cell targeted therapies in autoimmune diseases”. J Rheumatol Suppl. 2006 May;77:24-8. 31
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