Mikroskope & Mikroben, von den Anfängen bis zur Super Resolution Mikroskopie

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Der Artikel zeigt erstmals Super Resolution Mikroskopie-Aufnahmen von Molekülen in Bakterien und Viren. …

Der Artikel zeigt erstmals Super Resolution Mikroskopie-Aufnahmen von Molekülen in Bakterien und Viren.
Überall lauern Mikroorganismen, manchmal auch „Mikroben“ genannt, die Gesundheit und Leben von Menschen, Tieren und Pflanzen bedrohen. Zu den „Mikroben“ werden oft auch als ebenfalls submikroskopisch kleine Krankheitserreger die Viren gezählt, z.B. als Verursacher von Grippe, Gelbfieber, Pocken, AIDS, oder bestimmten Formen von Krebserkrankungen.

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  • 1. Erschienen in: Karlheinz Sonntag (Hg.) „Viren und andere Mikroben: Heil oderPlage? Zum 100. Todestag von Robert Koch“, S. 99 – 135. UniversitätsverlagWINTER Heidelberg (2011).“Mikroskope und Mikroben“Christoph CremerKirchoff-Institut für Physik und Institut für Pharmazie und MolekulareBiotechnologie/BioQuant, Universität HeidelbergÜberall lauern Mikroorganismen, manchmal auch „Mikroben“ genannt, dieGesundheit und Leben von Menschen, Tieren und Pflanzen bedrohen. Es handeltsich dabei um mikroskopisch kleine Lebewesen, die als einzelne Individuen mitbloßem Auge nicht zu erkennen sind. Beispiele sind Bakterien, die für dieMenschheitsgeißeln Pest, Cholera oder Syphilis verantwortlich sind. Zu den„Mikroben“ werden oft auch als ebenfalls submikroskopisch kleine Krankheitserregerdie Viren gezählt, z.B. als Verursacher von Grippe, Gelbfieber, Pocken, AIDS, oderbestimmten Formen von Krebserkrankungen.Warum sind diese „Feinde der Menschheit“ jahrtausendelang unentdeckt geblieben?Zwar wussten die Ärzte schon lange, dass bestimmte Krankheiten unter geeignetenUmweltbedingungen auftraten. Man wusste auch um den Zusammenhang zwischendem Auftreten bestimmter Tiere, z.B. Ratten, und todbringenden Krankheiten wie derPest. Aber das waren Korrelationen, keine direkten Beobachtungen.Warum hat in vielen Jahrhunderten medizinischer und wissenschaftlicher Tätigkeitkein einziger Arzt oder Naturforscher einzelne Mikroben sehen können?Heute wissen wir: Sie sind zu klein: Die typische Größe eines Bakteriums liegt imMikrometerbereich (1 µm = 1/1000 mm). Die kleinste mit bloßem Auge sichtbareStruktureinzelheit („optische Auflösung“ genannt) ist hingegen um die 100Mikrometer, also rund 100x größer als ein einzelnes Bakterium. Dies bedeutet, dassdiese einfach nicht sichtbar waren. Noch mehr gilt dies von den Viren. Mit typischenAbmessungen von 0.05 Mikrometer bis 0.1 Mikrometer sind sie rund tausendmalkleiner als die kleinste mit bloßem Auge sichtbare Struktureinzelheit.Mikroben wie Bakterien und Viren sind also viel zu klein, um ohne Instrumentesichtbar zu sein. Dies liegt an der Organisation unseres Sehvermögens: Ein Objektwird nach den Gesetzen der Optik durch die Augenlinse auf der Retina abgebildet.Damit zwei Punkte eines Gegenstandes getrennt voneinander wahrgenommenwerden können, müssen sie unterschiedliche Sehzellen treffen. Daraus ergibt sicheine kleinste sichtbare Struktureinzelheit oder die oben genannte Auflösung von ca.100 µm oder 0.1 mm. 1
  • 2. Daher war die Menschheit den aufgrund ihrer Mikrogrößen unsichtbaren Mikrobenfast hilflos ausgeliefert: Ein gnadenloser Feind mit Tarnkappe hat leichtes Spiel.Um sich gegen Mikroben wirksam wehren zu können, ist es notwendig, ihnen dieseTarnkappe zu entreißen. Dann kann man sehen, wo sie sich aufhalten, wie sie sichvermehren, welche Wirkungen bestimmte Abwehrmaßnahmen haben usw. DieFundamentalmethode hierzu wurde in optischen Systemen gefunden. Im einfachstenFall bestehen sie aus einer einzigen Linse, wie sie jeder als Lupen kennt. Sieerlauben es, vergrößerte Abbildungen kleiner Objekte zu gewinnen. Damit wird derAbstand der einzelnen Bildpunkte auf der Retina größer, verschiedene Sehzellenwerden getroffen; der kleinste Abstand von zwei Punkten des Gegenstandes, der aufder Retina verschiedene Sehzellen aktiviert, bestimmt die so erreichbare Auflösung.Optische Systeme zur Vergrößerung des Bildes von Gegenständen gab es bereitsseit Jahrtausenden; so sollen schon altorientalische Könige und römische Kaiserüber geschliffene Edelsteine als Lupen verfügt haben, mit deren Hilfe sieKleingeschriebenes besser lesen konnten. Aber auch die Glastechnik und dieHerstellung der zur Halterung erforderlichen Mechanik waren seit drei Jahrtausendenso weit fortgeschritten, dass der Bau von stark vergrößernden Linsensystemen,Mikroskopen, technisch möglich gewesen wäre. Doch hatte daran offenbar niemandein Interesse, mit fatalen Folgen für die Gesundheitsgeschichte der Menschheit.Dies änderte sich erst vor ein paar hundert Jahren, mit dem Bau erster starkvergrößernder optischer Systeme Ende des 16. und Beginn des 17. Jahrhunderts.Wohl nicht zufällig geschah diese Erfindung in Italien und in den Niederlanden, wodie Textilindustrie blühte; Mikroskope erlaubten erstmals eine eingehende Analyseder Qualität von Wolle und Tuch, einer Grundlage des damaligen „Wohlstands derNationen“. Das erste allgemein verbreitete Werk über die Mikroskopie veröffentlichtejedoch 1665 ein englischer Physiker. Robert Hooke, der Sekretär der Royal Societyin den Jahren 1677-1682, beschrieb in seiner „Micrographia or some physiologicaldescriptions of minute bodies, made by magnifying glasses with observations andinquiries thereupon" Beobachtungen, darunter mikroskopische Untersuchungen überdas Gewebe der Pflanzen. Dort entdeckte er kleine Struktureinheiten, „cells“, von„cellulae“. In der damaligen Weltwissenschaftssprache, dem mittelalterlichen Latein,bezeichnete „cellula“ ein leeres Kämmerchen. Die fundamentale Bedeutung dieser„Kämmerchen“ blieb jedoch noch für weitere rund 170 Jahre im Dunkeln.Die frühen Mikroskopiker des 17. Jahrhunderts beobachteten nicht nur Wolle, Tuch,Kork, kleine Lebewesen in Wassertropfen oder Spermien. Der zusammen mit RobertHooke berühmteste von ihnen, der Niederländer Antonie van Leeuwenhoek (1632 –1723) war der erste, der mithilfe seines einfachen, nur aus einer einzigen - sehrkurzbrennweitigen und daher stark vergrößernden - Linse bestehenden Mikroskopseinzelne Bakterien nicht nur für sich beobachtete, sondern dieses Wissen auchmitteilte (Abb. 1).Die von Leeuwenhoek erzielte optische Auflösung, also die kleinste noch erkennbareStruktureinzelheit, gemessen als der kleinste noch erkennbare Abstand von zweiObjektpunkten, lag bereits bei wenigen Mikrometer. Das reichte, um unter günstigenBedingungen einzelne Zellen und sogar einzelne Bakterien sehen zu können. 2
  • 3. Abb. 1. Links: Leeuwenhoeks Mikroskop. Das "Mikroskop" Leeuwenhoeks besteht aus einerbikonvexen Linse, die zwischen zwei Metallplätchen fixiert ist. Das biologische Objekt wirdauf der Spitze einer Nadel befestigt und kann mit Hilfe einiger Schrauben in den Fokus derLinse gebracht werden. Der Beobachter führt die der Nadelspitze abgewandte Seite derLinse unmittelbar vor sein Auge. (1) Das gebrauchsfertige Instrument von hinten; (2) und (3)zeigen Details der mechanischen Teile zum Justieren des Objekts; (4) zeigt einenschematischen Längsschnitt. Aus [1].Rechts: Zeichnungen von Bakterien aus dem Zahnbelag Leeuwenhoeks. (Quelle:Wikipedia).Wegen ihrer Bedeutung für die Naturwissenschaften, die Technik und die Medizinwird die Mikroskopie allgemein als eine der wichtigsten Entdeckungen in derGeschichte der Menschheit angesehen. Antonie van Leeuwenhoek hat sie zwar nichterfunden, aber zu einer ersten Vollkommenheit geführt. Leider hat er das Geheimnisseiner damaligen „Supermikroskope“ mit ins Grab genommen; aber auch abgesehendavon bestand kein großes Interesse von Seiten der Fachleute, sich mit den vonLeeuwenhoek gefundenen Kuriosa und ihren Konsequenzen für die Bekämpfung vonInfektionskrankeiten auseinanderzusetzen. Warum sollte man das auch tun? Dazuhätte man erst einmal wissen müssen, dass so winzige Gebilde irgendeineBedeutung für den Menschen haben. Ihr Vorkommen im Zahnbelag war dafür nochkein Beweis. Hinzu kam, dass die Mikroskope dieser Zeit vielfältigste technischeProbleme hatten, die scharfe, klare Beobachtungen der Mikrowelt außerordentlicherschwerten.Bakterien wurden erst wieder im 19. Jahrhundert systematisch beobachtet, alsmehrlinsige, robuste und „bedienungsfreundliche“ Mikroskopsysteme mit bessererBeleuchtung und guten Korrekturen von Linsenfehlern gebaut werden konnten.Abb. 2 zeigt ein Mikroskop des Jenaer Botanik-Professors Matthias Schleiden; esstammte aus einer optischen Werkstätte in Paris, damals wie heute eine der Zentreneuropäischer Wissenschaft. 3
  • 4. Abb. 2. Beispiel für ein Hochleistungsmikroskop von Matthias Schleiden. Links: Skizze eineszusammengesetztes Mikroskops der Pariser Firma Oberhäuser aus einer Publikation vonSchleiden (1855); zitiert nach [1]. Rechts: Abbildung eines Oberhäusermikroskops (1849/50)aus der Mikroskopsammlung der University of California Berkeley (Photo C.Cremer).Die nutzbare optische Auflösung solcher Mikroskope betrug ca. 1µm oder 1/1000Millimeter. Dies war zwar noch nicht wesentlich besser als das was Leeuwenhoek170 Jahre früher schon erreicht hatte. Aber ein Vergleich der beiden Mikroskope(Abb. 1 und 2) zeigt große Unterschiede in der praktischen Brauchbarkeit: Statt einerwinzigen einzelnen Linse, die man sich ganz nahe ans Auge halten musste, benutzteSchleiden ein mehrlinsiges System, mit dessen Hilfe man das Objekt starkvergrößert bequem durch ein Okular betrachten konnte; statt einem auf einer Spitzenotdürftig befestigten Objekt mit einer „wackeligen“ Haltemechanik (wenn auch inden besseren Modellen Leeuwenhoeks aus Silber gefertigt) zum freihändigen Haltengab es bei Schleiden ein robustes Stativ aus Stahl, das solide auf einem Tisch standund in dem das Objekt und sein Abstand zur Frontlinse des Mikroskops präzise undstabil eingestellt werden konnte; statt das Objekt mit einem einlinsgen„Minimikroskop“ irgendwie ins Tageslicht zu halten und zu hoffen, dass dieBeleuchtungsstärke und –Richtung ausreichend und passend war, gab es beiSchleiden ein Lichtsammelsystem, um das Objekt optimal beleuchten zu können,entweder von unten im Durchlicht, oder von oben im Auflicht. Die mechanischeStabilität wurde durch einen mit Blei gefüllten Sockel unterstützt (bei heutigen„Supermikroskopen“ dienen dazu tonnenschwere Steintische). Um eine präziseScharfeinstellung zu erreichen, wurde ein Federmechanismus verwendet. Ein 4
  • 5. plankonkaver Beleuchtungsspiegel ermöglichte eine Durchlichtbeleuchtung desObjekts von unten; eine Sammellinse ermöglichte eine Auflichtbeleuchtung vonoben. Die Präparate befanden sich bei diesem Mikroskop auf Objektträgern ausGlas, die mit Stahlfedern auf dem Objekttisch angeklemmt wurden, ganz wie beiheutigen konventionellen Systemen. Damit gehörten solche Mikroskope wohl zumBesten, was in der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts an hochauflösender Optik zuhaben war.Dank dieser und anderer „wissenschaftlichen Kleinigkeitskrämerei“ (wie Schleidenselbst es ironisch nannte), insbesondere auch der Entwicklung von Fixierungs- undFärbemethoden, war es nun mit derartigen Mikroskopsystemen in der ersten Hälftedes 19. Jahrhunderts möglich geworden, biologische Mikrostrukturen und sogarBakterien unter Bedingungen zu beobachten, die systematisch angelegteForschungen ermöglichten.Eine der ersten epochalen Entdeckungen, die auch für unser Thema von größterBedeutung sind, war die auf solchen Mikroskopbeobachtungen basierendeBegründung der Zelltheorie durch Schleiden und Schwann (Abb. 3).Abb. 3: Links: Mikroskop-Abbildung von pflanzlichem Zellgewebe aus Schleiden(1838);Rechts: Mikroskopabbildung von tierischem Zellgewebe aus Schwann (1839).Aus [1]Schwann und Schleiden waren nicht die ersten, die in Geweben von Lebewesensolche merkwürdigen Mikrogebilde mit distinkten Struktureigenschaften beobachtenkonnten. Im Gegensatz zu den Beobachtungen von Leeuwenhoek und Hookeverband Schleiden seine Beobachtungen von „cellulae“ jedoch mit einerInterpretation, die den Beginn der modernen Biologie, Medizin, Hygiene undMikrobiologie markiert. In seiner epochalen Arbeit von 1838 (Abb. 4) postulierteSchleiden: „Jede nur etwas höher ausgebildete Pflanze ist aber ein Aggregat vonvöllig individualisierten, in sich abgeschlossenen Einzelwesen.“Diese Formulierungen erinnern an eine von Goethe bereits drei Jahrzehnte früherniedergeschriebene Vision: „Jedes Lebendige ist kein Einzelnes, sondern eineMehrheit; selbst insofern es uns als Individuum erscheint, bleibt es doch eineVersammlung von lebendigen selbständigen Wesen, die der Idee, der Anlage nachgleich sind“ . Schleiden war Jurist wie Goethe, Professor an der jahrzehntelang unterGoethes Oberaufsicht stehenden Universität Jena und Direktor des von Goethe dort 5
  • 6. stark geförderten botanischen Gartens. Die Vermutung liegt nahe, dass der BotanikerSchleiden auch dessen 1817 publizierte Schriften zur Morphologie der Pflanzenkannte, die diese bereits 1807 formulierte Idee zur Grundstruktur des Lebendigenenthält. Nun wird die Zelle zur zentralen Idee des Lebens. Was jedoch bei Goetheein ganz allgemeines, ursprünglich von makroskopisch sichtbaren Blätternausgehendes Konzept war, das wurde bei Schleiden und Schwann zu einemmikroskopischen Ausgangspunkt der Lebenswissenschaften.Einige Jahre später (1854/1855) zog der Arzt Rudolf Virchow die für die weitereEntwicklung von Biologie und Medizin entscheidende Konsequenz „omnis cellula ecellula“, jede Zelle stammt von einer anderen Zelle ab: „Der menschliche Körper setztsich, wie alle organischen Körper, aus feinen Elementen zusammen, von denenjedes in letzter Instanz auf eine einzige Zelle und ihr Wirkungsgebiet zurückgeführtwerden kann.“ Folglich können Krankheiten vielfach auf Änderungen von Zellenzurückgeführt werden, auch auf solche, bei denen ’Mikroben’ beteiligt sind. So gibtes von Virchow eine Veröffentlichung (1885) mit dem Titel „Der Kampf von Zellenund Bakterien“; auf einem Kongress nannte er die Kenntnis der Bakterien, verglichenmit der Kenntnis der Zellen, „ein anderes, nicht geringeres, vielleicht sogarwichtigeres Produkt der wissenschaftlichen Bemühungen unserer Zeiten“ (zitiert nachH. Schipperges, Rudolf Virchow [2003]). Es kommt also auf beides an, eine bessereKenntnis der Zellen und der Mikroben, sowie ihrer Wechselwirkungen.Abb. 4. Titelseite aus Schleidens Arbeit von 1838 zur Begründung der ZelltheorieAus [1]. 6
  • 7. Eine wesentliche Voraussetzung für die Weiterentwicklung der Mikroskopie unddamit der verbesserten Beobachtung auch von „Mikroben“ war die Herstellung vonhochwertigen optischen Gläsern mit ganz bestimmten Eigenschaften. Nur sokonnten die vielfachen Abbildungsfehler von Mikroskopen vermindert werden, die dieNutzung dieser Methoden in der biologischen und medizinischen ForschungJahrhunderte lang behindert hatten. Hierauf beruhte ganz wesentlich die Entwicklungder leistungsfähigsten Mikroskope des 19. Jahrhunderts, die die Grundlage für dierasche Entwicklung der Mikrobiologie als Wissenschaft möglich machten. Auch indiese Entwicklung sind der Jenaer Professor Matthias Schleiden und JohannWolfgang von Goethe als der für die Universität Jena zuständige „Staatsminister fürWissenschaft und Kunst“ eingebunden. Untersuchungen zur Farbenlehreveranlassten Goethe um 1825 zur Gründung einer Glashütte für Präzisionsoptik inJena, wobei er als Sponsorin Maria Pawlowna (1786 – 1859), die Gemahlin vonGroßherzog Carl Friedrich (1783 – 1853) und Schwester der Zaren Alexander I. undNikolaus I. gewinnen konnte. Über staatliche Mittel und großzügiges Sponsoringhinaus sind jedoch auch geeignete Köpfe notwendig. Auch hier hatte Goethe einegute Hand; als Direktor seiner Glashütte ernannte er seinen „Farbenassistenten“Friedrich Körner und berief ihn zum Dozenten an der Universität Jena. Dort hatteKörner einen tüchtigen Studenten mit Namen Carl Zeiss, der aus einer wahrhaftinterdisziplinären Familie mit vielen Juristen und Theologen aber auch mit tüchtigenHandwerkern stammte. Dieser gründete mit Unterstützung von Matthias Schleiden inJena eine kleine Optikwerkstätte und fing an, Mikroskope zu fertigen. Dabei spieltedie Verbindung zum wissenschaftlichen Apparatebau von Anfang an einewesentliche Rolle. Diese wurden damals nach empirischen Regeln gebaut.Jeder Physiker weiß, dass bei einer erfolgreichen Instrumentenentwicklung zurpraktischen Erfahrung die Theorie hinzukommen muss. (Man stelle sich vor, derLarge Hadron Collider im CERN oder das Hubble-Teleskop sollten durch „Pröbeln“entwickelt werden, undenkbar). Carl Zeiss war der erste, der die Bedeutung derTheorie auch für den Bau von Hochleistungsmikroskopen erkannte. Daherengagierte er 1866 den Jenaer Physiker und späteren Direktor der dortigenUniversitäts-Sternwarte Ernst Abbe (1840 – 1905). Das Ziel war, auf der Basisquantitativer numerischer Rechnungen (heute würde man das „Optik-Simulationen“nennen) die Entwicklung neuer, außerordentlich leistungsfähiger Mikroskopsystemezu ermöglichen. Die Idee war gut: Aber zunächst rechnete Abbe viele Jahre langohne Erfolg; unter heutigen Industriebedingungen oder universitärenExzellenzförderungen wäre er wohl kläglich gescheitert. Doch Abbe und Zeiss hieltendurch, und um 1880 waren die von Zeiss gebauten Mikroskope die besten der Welt. 7
  • 8. Abb. 5. Links: Ernst Abbe (1840 –1905), Professor der Physik an der Universität Jena;Partner von Carl Zeiss, später Alleininhaber der Firma; Begründer der Carl Zeiss Stiftung,der Eigentümerin der Carl Zeiss AG und der Schott AG (Quelle: Wikipedia).Neue Mikroskope von Zeiss und anderen führenden Optikherstellern ermöglichtendie Begründung der modernen Mikrobiologie. Einer der wichtigsten ’Helfer derMenschheit’ auf diesem Gebiet war Robert Koch (1843 – 1910): Die neuenMikroskope mit ganz wesentlich verbesserter Mechanik, Beleuchtung,Fehlerkorrektur und Auflösung erlaubten erstmals die detaillierte Analyse vielerbakterieller Krankheitserreger, wie Milzbrand, Tuberkulose, Cholera, Pest. Mitdiesem Wissen wurden Diagnostik, Hygiene und Therapie auf völlig neueGrundlagen gestellt; nunmehr wurde ein effektiver Kampf gegen diese Geißeln derMenschheit möglich: Die Tarnkappe war weg.Koch war sich der Bedeutung der Optik für seine Forschungen voll bewusst. Ineinem Brief an die Geschäftsleitung von Carl Zeiss aus dem Jahre 1904 schreibtder Geheime Medizinalrat:„Sehr geehrter Herr,Ich erinnere mich noch sehr gut der Zeit, als ich zum ersten Male einÖl[immersions]system in die Hand bekam… und mich von den gewaltigenFortschritten überzeugte, die der optischen Werkstätte von Carl Zeiss unterProfessor Abbe‘s genialem Beirat gelungen war…Oft habe ich später mitBewunderung der Zeiß‘schen optischen Werkstätte gedacht…Mit größter Hochachtung, ergebenstRobert Koch“Diese von Zeiss gefertigten Mikroskopsysteme hatten eine brauchbare optischeAuflösung um die 0.2 µm. Damit konnten Koch und seine Kollegen nunFormunterschiede zwischen einzelnen Bakterien gut voneinander unterscheiden,hinzu kam die Anfärbbarkeit dieser Mikroben mit geeigneten Farbstoffen. DieseTechniken trugen ganz wesentlich bei zur Diagnostik vieler von Mikrobenverursachten Krankheiten. Für seine Pionierleistungen wurde Koch im Jahre 1905mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. 8
  • 9. So gut die neuen Hochleistungsmikroskope auch waren, sie hatten ein gravierendesProblem: Struktureinzelheiten von Mikroben und ihrer oft todbringendenWechselwirkungen mit den Zellen des Körpers konnten nur erkannt werden, wenndiese größer waren als ungefähr 0,2 µm, also größer als 0,2/1000 mm. Unterhalbdieser Auflösungsgrenze war das Bild so verschwommen wie eine Zeitung ausgroßer Entfernung für das bloße Auge. Allen Verbesserungsversuchen zum Trotzkonnte diese Grenze der „konventionellen“ Lichtmikroskopie nicht überwundenwerden. Auch die besten Mikroskope von Zeiss, Leitz und anderen erlaubten keineErkennung von Struktureinzelheiten in den Bakterien (Abb. 6); bei vielenInfektionskrankheiten war es noch schlimmer, da konnte man die Existenz vonErregern nur indirekt nachweisen. Aufgrund solcher Indizien wusste man, dass diesenoch viel kleiner sein mussten als Bakterien; heute wissen wir, dass es sich dabei umViren handelt.Abb.6. Lichtmikroskopisches Bild von Bakterien bei der ‚konventionellen’ BestauflösungAus [2].Ernst Abbe hat sich intensiv mit diesem erstaunlichen und beunruhigendenPhänomen befasst und die Lösung gefunden. Offenbar handelte es sich hier nichtmehr um ein technisches Problem, sondern um eine fundamentale Grenze der mitOptik möglichen Naturerkenntnis. Im Jahre 1873 fasste er seine Erkenntnisse ineiner der berühmtesten Arbeiten der Physik zusammen. Diese enthielt so vielemathematische Formeln wie die Farbenlehre Goethes, nämlich keine einzige;dennoch war der physikalische Gehalt so brisant, dass er seitdem in jeder Physik-Grundvorlesung zur Sprache kommt. Abbe postulierte [3],„…dass….die Unterscheidungsgrenze [beim Mikroskop]…doch niemals über [denBetrag] der halben Wellenlänge des blauen Lichts um ein Nennenswerteshinausgehen wird“ 9
  • 10. Eine „halbe Wellenlänge des blauen Lichts“, das sind ungefähr 0,2 µm (0,2/1000mm) oder 200 nm in der Sprache der heutigen Physik der Nanowelt (1 nm = 1tausendstel Mikrometer = 1 Millionstel Millimeter).Allgemein gilt nach Abbe, dass der kleinste Abstand d zwischen zwei punktförmigenObjekteinzelheiten, der in irgendeinem – existierenden oder möglichen - Mikroskopnoch unterschieden (aufgelöst) werden kann, wesentlich von der Wellenlänge des λzur Abbildung verwendeten Lichts bestimmt wird (Abb. 7 rechts) Der Faktor nsinα (αist der sog. halbe Aperturwinkel) kann aus mathematischen Gründen nicht größerwerden als der Brechnungsindex n, eine optische Materialgröße, die typischerweiseum maximal 1,5 liegt; typische Werte für nsin sind be i Hochleistungsmikroskopen α1,2 bis 1,4. Damit wäre die mit irgendeinem Mikroskop mögliche Auflösung auf etwa1/3 bis 1/2 der Wellenlänge im Vakuum beschränkt; bei den üblicherweise zurBeobachtung verwendeten Lichtwellenlängen ist dies aus praktischen Gründen etwa0,2 µm.Abb. 7. Links: Das Abbe Denkmal vor der Universität Jena. Auf der Kugel befindet sich dieberühmte Formel für die Grenzen der optischen Auflösung (rechts vergrößert). PhotoC.CremerEin berühmter Zeitgenosse von Abbe in England, Lord Rayleigh, kam 1896 zu einerfast identischen Formel [4]. Im Gegensatz zu Abbe gingen seine Überlegungen abervon der Annahme aus, dass sich die Objektpunkte wie selbstleuchtende Körperverhalten, so wie es Sterne tun. Im Gegensatz hierzu hatte Abbe angenommen, dassdas Objekt das Licht in einer strukturabhängigen Weise ablenkt. Da die von demAbbe gefundene Grenze für die lichtoptische Grenze der Naturerkenntnis aber als sofundamental angesehen wurde, entspann sich eine Auseinandersetzung über diephysikalischen Grundlagen der beiden Aussagen. Gab es zwischen der um 20Jahre verspäteten Erkenntnis des Engländers Rayleigh und der des Deutschen Abbeeinen in der Physik begründeten wichtigen Unterschied? Wenn nicht, dann gebührteder Ruhm allein Abbe. Diese auch mit nationaler Leidenschaft über mehrereJahrzehnte sich hinziehenden Diskussionen fanden um 1930 ein Ende mit der 10
  • 11. sogenannten Äquivalenz-Theorie, also mit der Feststellung, dass keine essentiellenphysikalischen Unterschiede zwischen Abbe und Rayleigh bestehen. Dies hatte zurFolge, dass rund ein halbes Jahrhundert lang niemand mehr daran zweifelte, dassder einzige Weg zu einer Erhöhung der Auflösung darin bestand, die Wellenlängekürzer zu machen als 0,4 µm, also kürzer als mit sichtbarem Licht möglich.Bereits Rayleigh schlug die Verwendung von ultraviolettem Licht vor, und dies wurdeauch realisiert; allerdings wird Glas im ultravioletten Bereich bei Verkürzung derWellenlänge schnell undurchsichtig, sodass die Auflösungsverbesserungen aufdiesem Wege relativ gering waren. Als wesentlich viel versprechender erwiesen sichhier zwei noch zu Lebzeiten von Abbe und Rayleigh am Ende des 19. Jahrhundertsgemachte fundamentale Neuerungen der Physik, die Entdeckung des Elektrons unddie technische Möglichkeit, Hochvakua zu erzeugen. In den Zwanzigerjahren desletzten Jahrhunderts kam dann die Entdeckung der Welleneigenschaften von Materiehinzu: Für Elektronen ergeben sich hieraus sehr kleine Wellenlängen, die Bruchteileeines Nanometer betrugen. Nach der Abbe-Formel (Abb. 7 rechts) eröffnete dies dieMöglichkeit der Konstruktion von Elektronenmikroskopen, mit denen heute in denMaterialwissenschaften optische Auflösungen bis in den atomaren Bereich möglichgeworden sind, und bis zu molekularen Dimensionen (wenige nm) bei Biostrukturen.Dank diesen auf energiereicher Strahlung basierendenUltrastrukturanalysemethoden konnten viele Geheimnisse der Nanowelt aufgedecktwerden. Jetzt konnten sogar einzelne Viren sichtbar gemacht werden, die sichaufgrund ihrer Kleinheit der lichtmikroskopischen Analyse entzogen hatten.Dennoch blieb eine Verbesserung der lichtoptischen Auflösung, also eineVerkleinerung des detektierbaren minimalen Abstandes zweier punktförmigerObjekte unter Verwendung von sichtbarem Licht, von größtem Interesse. Dafür gibtes eine große Zahl praktischer Gründe. So sind Beobachtungen von Bakterien undViren mit Elektronenmikroskopen sehr aufwendig und zeitraubend. In derMikrobiologie kommt es aber oft darauf an, Krankheitserreger routinemäßig undschnell nachzuweisen; auch in der Forschung wäre es ein großer Vorteil, z.B. dieAnheftung von Viren an Zellmembranen und ihre Beeinflussung durch Arzneimitteleinfach und schnell auf der Ebene der einzelnen „Mikroben“ analysieren zu können.Ein weiteres Problem der Elektronenmikroskopie und anderer Ultrastrukturverfahrenist die mit den kleinen Wellenlängen verbundene energiereiche Strahlung; diese istso groß, dass Beobachtungen lebender Zellen – von Ausnahmefällen abgesehen –nicht möglich ist. Sichtbares Licht hingegen wird von Zellen und Mikroben sehr vielbesser ertragen.Bereits Abbe hielt es für grundsätzlich möglich, dass eines Tages neue Methodengefunden würden, die eine lichtoptische Abbildung weit jenseits der von ihmformulierten Erkenntnisgrenze möglich machen könnten. In der oben zitierten Arbeit[3] zur Grenze der Auflösung schrieb er schon 1873, die Grenze von etwa einerhalben Wellenlänge sei nur gültig, „… so lange nicht Momente geltend gemachtwerden, die ganz außerhalb der Tragweite der aufgestellten Theorie liegen…”Fundamentale neue Entdeckungen in Physik, Optoelektronik,Informationstechnologie und Molekularbiologie ermöglichen heute die Überwindungder „Abbe/Rayleigh Grenze“ der lichtoptischen Naturerkenntnis: In der Physik istdies insbesondere die Entwicklung von Lasern im sichtbaren Spektralbereich sowievon hochsensitiven Lichtdetektoren; die digitale Bildverarbeitung auf der Basisleistungsfähiger kleiner Computer; und die immer besseren Einsichten in die optischePhysik von organischen Molekülen und anderen ’Nanoeinheiten’; in denLebenswissenschaften sind für die „superauflösende“ Lichtmikroskopie oder„Nanoskopie“ wesentlich geworden die molekulare Zellbiologie, die Entdeckung der 11
  • 12. DNA Struktur, des genetischen Codes sowie Techniken, die molekülspezifischeoptische Markierungen erlauben.Auf der Grundlage dieser neuen, von Abbe und Rayleigh nicht vorhersehbarenEntwicklungen sind in den letzten beiden Jahrzehnten eine Reihe von Methodenentwickelt worden, die bislang für absolut gehaltene Grenze der optischen Auflösungin der Lichtmikroskopie in dramatischer Weise zu überwinden, genauer gesagt zuumgehen. Seit kurzem werden diese „Nanoskopie“-Methoden auch für dieErforschung von „Mikroben“ nutzbar gemacht.Als Beispiel für eine solche ‚nanoskopische’ Überwindung der konventionellenGrenze der optischen Auflösung soll hier das Verfahren der „ LokalisationsMikroskopie“ oder „Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie“ (SPDM) näherbeschrieben werden. Ihre Anfänge reichen bis in die 1990iger Jahre zurück, als sieerstmals konzipiert und in „Proof-of-Principle“ Experimenten realisiert wurde [5-8].Lokalisationsmikroskopische Methoden haben es ermöglicht, zelluläreNanostrukturen, Bakterien und sogar Viren mit sichtbarem Licht und beiRaumtemperatur zu analysieren und damit Perspektiven eröffnet, wesentlicheFragen der molekularen Biophysik, Zellbiologie und molekularmedizinischenForschung mit wichtigen biologischen, systembiologischen und medizinischenAnwendungen angehen zu können.Der Ausgangspunkt der Überlegungen zur Überwindung der Auflösungsgrenze derkonventionellen Lichtmikroskopie (ca. 0,2 µm) sind die Überlegungen von LordRayleigh: Wie schon erwähnt, ging dieser von der Annahme aus, dass der zuuntersuchende Gegenstand aus vielen sehr kleinen ‚punktförmigen’selbstleuchtenden Objekten besteht. In der Astronomie ist das beim Licht vonSternen der Fall; in der Biologie ist eine Selbstleuchtern entsprechendeLichtemission möglich, wenn in der zu untersuchenden Biostruktur dort befindlicheMoleküle durch das Beleuchtungslicht zur Fluoreszenz angeregt werden können:Das heißt dass sie Licht einer anderen Wellenlänge aussenden als derjenigen desBeleuchtungslichtes. Jeder kennt zum Beispiel das Phänomen, dass bestimmteMaterialien, die mit ultraviolettem Licht bestrahlt werden, dann grün oder gelbaufleuchten. Auch chemische Reaktionen können zu einer ähnlichenLichtaussendung führen.Aufgrund der Wellennatur der Lichtausbreitung wird ein punktförmiges Objekt abersogar mit einem Hochleistungsobjektiv nicht als Punkt abgebildet, sondern eserscheint als kleines Scheibchen mit einem Durchmesser von etwa einer halbenWellenlänge mal dem Vergrößerungsfaktor M des Mikroskops (Abb. 8)Solange im Gesichtsfeld nur einziges punktförmiges Objekt leuchtet (Abb. 8 oben),kann seine Lage im Bild eindeutig festgestellt werden, sofern die Helligkeit desleuchtenden Scheibchens groß genug ist. Dazu braucht man nur die Position seinesGipfels zu bestimmen; aus dieser Position kann man dann Lage des punktförmigenObjekts in der Biostruktur berechnen. Rayleigh selbst hat bereits im Jahre 1895darauf hingewiesen. 12
  • 13. Abb. 8. Grenzen der Auflösung in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie.Oben: Das von einem ‚punktförmigen’ Objekt (z.B. Molekül) erzeugte Beugungsbild (x,yKoordinaten der Bildebene, senkrechte Koordinate: Intensität (Farbkodiert, dunkel rot =Intensität 1). Aus [9].Normalerweise besteht ein Gegenstand aber aus sehr vielen einzelnen leuchtenden‚Punkten’. Zum Beispiel können viele organische Moleküle durch chemischeProzesse oder durch Lichtanregung zur Aussendung von ’Fluoreszenzphotonen’angeregt werden. Solange der Abstand d zwischen den Objektpunkten so groß ist,dass die von ihnen gebildeten Beugungsscheibchen sich nicht überlappen (Abb. 8oben), solange kann die Lage jedes Beugungsscheibchens und damit die Lage derzugehörigen Moleküle im Gegenstand getrennt von den anderen bestimmt werden:Alle Objektpunkte zusammen ergeben ein maximal aufgelöstes Bild desGegenstandes, d.h. die Information über die räumlichen Beziehungen derObjektpunkte zueinander.Was geschieht aber, wenn die Objektpunkte einander so nahe kommen, dass dievom abbildenden Mikroskopsystem gebildeten Beugungsscheibchen einander zuüberlagern beginnen ? Rayleigh argumentierte, dass zwei solche selbstleuchtendenObjektpunkte nur dann noch voneinander unterschieden und damit ihre Positionenbestimmt werden können, wenn die Maxima (Gipfel) der beidenBeugungsscheibchen noch getrennt voneinander bestimmt werden können. Ausgeometrischen Gründen (zwischen den beiden ‚Gipfeln’ muss eine Senke vorhandensein) ist dies dann gegeben, wenn das Maximum des zweitenBeugungsscheibchens in das Minimum des ersten fällt (Abb. 8 unten). Daraus ergibtsich eine kleinste noch trennbare („auflösbare“) Distanz von ca. einer halbenWellenlänge, also etwa dem Durchmesser eines einzelnen Beugungsscheibchens. 13
  • 14. Da die Größe der Beugungsscheibchen aber nicht wesentlich kleiner gemachtwerden kann als etwa eine halbe Wellenlänge, also ca. 0,2 µm, erschien diehierdurch gegebene Grenze der optischen Auflösung mit sichtbarem Licht aus denGrundeigenschaften des Lichts zu folgen und damit unüberwindbar.Alle diese Überlegungen beruhen auf der Annahme, dass sich die beidenBeugungsscheibchen überlagern. In der konventionellen Lichtmikroskopie tun siedas auch. Was aber wäre, wenn es irgendwie gelänge, die Positionen von jedemBeugungsscheibchen unabhängig vom anderen zu messen ?In der Lokalisationsmikroskopie/SPDM kann dieses Problem auf verschiedene Weisegelöst werden.Abb. 9: Prinzip der Lokalisationsmikroskopie.a) Drei im Abstand von jeweils 50 nm liegende ‚punktförmige’ Objekte derselbenspektralen Signatur (z.B. derselben Farbe); b) Das von ihnen erzeugte Beugungsbild;c) Intensitätsverteilung durch das Zentrum von b); d) Drei im Abstand von jeweils 50nm liegende Objekte mit verschiedenen spektralen Signaturen B, G, R (z.B. Blau,Gelb, Rot); e) optisch isolierte Beugungsbilder von B,G,R; g) Intensitätsverteilungdurch das Zentrum der einzelnen optisch isolierten Beugungsbilder von B, G, R.Nähere Erläuterung im Text. Aus [9, 17], nach [6].Die Abb. 9 zeigt schematisch das Prinzip der Lokalisationsmikroskopie. Man stellesich zunächst drei ‚punktförmige’, mit derselben spektralen Signaturselbstleuchtende Punkte (z.B. Moleküle mit derselben Fluoreszenzfarbe) vor, dievoneinander einen Abstand von nur 50 Nanometer (0,050 µm) haben, also viermalkleiner als die konventionelle Grenze der optischen Auflösung von ca. 200 14
  • 15. Nanometer = 0,2 µm (oben links, a). Von jedem dieser Moleküle wird aufgrund derWellennatur des Lichts durch die Mikroskopoptik (bei gleichmäßiger Beleuchtung desObjekts) ein Beugungsscheibchen mit einem Durchmesser von etwa 200 nm x M (MVergrößerungsfaktor) erzeugt; bei derselben spektralen Signatur überlagern diesesich in der Bildebene (oben Zentrum, b). Ein Intensitätsquerschnitt durch die Mittedieses ‚Beugungsbildes’ (oben rechts, c, nach Division durch M) gibt eineHelligkeitskurve, die sich aus der Überlagerung der drei von den drei Molekülengebildeten einzelnen Beugungsscheibchen ergibt; diese ist fast identisch mit derdurch ein einziges Molekül erzeugten. Es ist also hier nicht mehr möglichfestzustellen, wo die drei Moleküle im Bildfeld genau lokalisiert sind, und welchenAbstand sie voneinander haben.Hat jedes der eng benachbarten Moleküle jedoch eine verschiedene „spektraleSignatur“ B,G,R – sie leuchten z.B. mit verschiedenen Farben Blau, Gelb, Rot - (b),so wird eine Orts- und Abstandsbestimmung der einzelnen Moleküle möglich: In (e)oben ist das Beugungsscheibchen gezeigt, das durch das in (d) links gelegeneMolekül mit der spektralen Signatur B entsteht; dabei wurde angenommen, dass dieEmissionen der beiden Moleküle mit Markierung G,R nicht zu demBeugungsscheibchen von B beitragen, für den in diesem Falle verwendeten Detektoralso „dunkel“ sind. Es ist offensichtlich, dass sich der Mittelpunkt dieserBeugungsverteilung mit einem Lokalisierungsfehler bestimmen lässt, der wesentlichkleiner ist als der Durchmesser der Beugungsverteilung. Diese Überlegungen lassensich nun für die „optisch isolierten“ Beugungsbilder der beiden anderen Moleküle mitden spektralen Signaturen G und R wiederholen: In (e) Mitte wird das von Gerzeugte Beugungsscheibchen gezeigt; in diesem Falle wurde angenommen, dasses „optisch isoliert“ von B und R abgebildet wurde. In (e) Unten wird das von Rerzeugte Beugungsscheibchen gezeigt; in diesem Falle wurde angenommen, dasses „optisch isoliert“ von den beiden anderen (B und G) registriert wurde. Da nun dieEinzelpositionen der drei Objekte B,G,R (z.B. drei Moleküle mit den spektralenSignaturen B,G,R) in der Objektebene auf einfache Weise berechnet werden können(Division durch den Vergrößerungsfaktor M des Mikroskopsystems), lassen sichdaraus z.B. die Lagekoordinaten/Abstände in der Objektebene nach dem Pythagorasberechnen, selbst wenn diese erheblich kleiner sind als die konventionelleAuflösungsgrenze der Lichtmikroskopie. Dies aber bedeutet, dass mit diesemVerfahren Objekteinzelheiten ‚aufgelöst’ (d.h. voneinander unterschieden) werdenkönnen, die wesentlich kleiner sind als die konventionelle Grenze der lichtoptischenAuflösung. Da dieses lokalisationsmikroskopische Verfahren aufPräzisionsdistanzmessungen von Objekten geeigneter spektraler Signatur beruht,wurde es von uns als Spektrale Präzisions Distanz Mikroskopie(SPDM) bezeichnet[6].In den obigen Überlegungen zur Überwindung der konventionellen Auflösungsgrenzewurde unter dem Begriff ‚spektrale Signatur’ jede Objekteigenschaft verstanden, diees erlaubt, die für die Lokalisationsmikroskopie erforderliche optische Isolation derBeugungsscheibchen durchzuführen. Dies kann zum Beispiel mithilfe vonverschiedenen Fluoreszenzemissionsspektren (‚Spektralfarben’) realisiert werden. Ineiner Zusammenarbeit mit dem Chaim Sheba Medical Center/Israel konnten wirbereits vor mehr als zehn Jahren die grundsätzliche experimentelle Realisierbarkeitund biomedizinische Anwendbarkeit der Lokalisationsmikroskopiemethode/SPDMzeigen [7]. Distanzen in Zellkernen von Leukämiepatienten konnten bis zu einemAbstand von ca. 30 nm, also ~ 1/16 der verwendeten Anregungswellenlänge 15
  • 16. vermessen werden. Die optische Auflösung war somit um den Faktor 200/30 ~ 7besser, als dies selbst mit den besten Mikroskopen von Abbe und Koch möglichgewesen wäre.Mit dem hier beschriebenen SPDM Verfahren können im Prinzip molekularaufgelöste Abbildungen von Nanostrukturen gewonnen werden, sofern diewesentliche Grundbedingung, die ’optische Isolation’, erfüllt werden kann: Diesbedeutet, dass der Abstand zwischen zwei Molekülen derselben spektralen Signaturmindestens so groß sein muss wie der Durchmesser D des Beugungsscheibchensdividiert durch den Vergrößerungsfaktor M des Mikroskopsystems.Allerdings ist die Anzahl der in einem Beugungsscheibchen befindlichen Moleküle,die aufgrund von Farbunterschieden im Fluoreszenzemissionsspektrum gleichzeitiggetrennt von einander detektiert werden können, relativ gering (derzeit < 10). Einegroße Anzahl von spektralen Signaturen ist jedoch in vielen Fällen erforderlich, umgenaue Informationen über die Gestalt von Biostrukturen, z.B. in Bakterien, oder vonViren zu erhalten. Über die bisher genannten spektralen Signaturen („Farben“)hinaus gibt es jedoch noch weitere Möglichkeiten, auch eng benachbarte Molekülevoneinander lichtoptisch zu unterscheiden.Dieses zunächst unüberwindlich scheinende Problem konnte in den letzten Jahrengelöst werden; nun ist es möglich, in einer einzigen Zelle bis zu vielen tausendspektralen Signaturen für die Lokalisationsmikroskopie nutzbar zu machen.Die Grundidee solcher Ansätze ist es, die zeitliche Dimension konsequentauszunutzen:Beispielsweise könnte man die Beugungsscheibchen von ganz eng zusammenliegenden, nur in einer einzigen Farbe leuchtenden Moleküle auch dannvoneinander trennen, wenn diese Moleküle ihre Leuchtkraft zeitlich verändernwürden, wie das bei Leuchttürmen geschieht, oder in der Astronomie bei Supernova-Ausbrüchen. Diese unterscheiden sich nicht nur in der Farbe ihrer Lichtemission;sondern sie können während einer bestimmten Zeitspanne leuchten, also sich ineinem Hell-Zustand befinden; außerhalb dieser Zeiten leuchten sie nicht, sie sind ineinem Dunkel-Zustand. Nicht nur Farben können also als eine spektrale Signaturherangezogen werden, sondern auch Hell-Zustände und Dunkelzustände. Aussolchen Hell-und Dunkelzuständen verschiedener Farbstoffmolekülen kann dann einhochaufgelöstes Bild aufgebaut werden, gemäß einer schon vor 200 Jahren voneinem Jenaer Naturforscher ausgesprochenen Leitidee:„Nunmehr behaupten wir, wenn es auch einigermaßen sonderbar klingen mag, daßdas Auge keine Form sehe, indem Hell, Dunkel und Farbe zusammen alleindasjenige ausmachen, was den Gegenstand vom Gegenstand, die Teile desGegenstandes voneinander fürs Auge unterscheidet. Und so erbauen wir aus diesendreien die sichtbare Welt.“ (J.W. Goethe, Entwurf einer Farbenlehre, 1808).Bei der Anwendung dieser Idee in der heutigen Lokalisationsmikroskopie muss mandafür sorgen, dass der Abstand von zwei Molekülen einer bestimmten Farbe im Hell-Zustand so groß ist, dass sich die beiden Beugungsscheibchen derselben Farbewährend der Aufnahmezeit im Detektionssystem (z.B. einer CCD Kamera) nichtüberlappen. In den letzten Jahren wurden derartige auf dem SPDM Grundkonzeptder Lokalisationsmikroskopie beruhende Ideen von verschiedenen Gruppen (u.a. ander Harvard University, der Universität Heidelberg, dem Howard Hughes MedicalInstitute, der Maine University, dem Max-Planck-Institut Göttingen) experimentellrealisiert, wobei unterschiedliche Markierungs- und Aufnahmemethoden zum selben 16
  • 17. Ziel führten [8-20]: Einer optischen Superauflösung, die um ein Vielfaches besser warals die von Abbe und Rayleigh postulierten Grenzen.Auf der Grundlage der langjährigen Erfahrungen in der Entwicklungsuperauflösender lichtmikroskopischer Methoden konnten wir in unsererArbeitsgruppe am Heidelberger Kirchhoff-Institut für Physik zeigen, dass die obenskizzierte Lokalisationsmikroskopie/SPDM auf der Grundlage der Induktioneinmaliger„Lichtblitze“ unter bestimmten ’photophysikalischen’ Bedingungen auch fürviele „ganz gewöhnliche“ Farbstoffmoleküle realisiert werden kann [15 – 20]. SolcheMoleküle verhalten sich also in Punkto Lichtemission analog zu ihren makrokosmischgroßen „Schwestern“, den Supernova-Sternen: Sie leuchten für kurze Zeit so starkauf, dass ihre Position aufgrund des Lichtblitzes festgestellt und in einePositionskarte eingetragen werden kann. Dann endet diese Lichtaussendungplötzlich, und sie verschwinden im Dunkeln. Tritt in ganz kleiner Entfernung von derPosition der ersten „Supernova“ ein weiterer Lichtblitz auf, so wird dessen Positioneiner zweiten Supernova (in der Lokalisationsmikroskopie einem zweiten Molekül)zugeschrieben. Abb. 10 zeigt eines der in unserer Arbeitsgruppe am Kirchhoff-Institutfür Physik auf der Grundlage des SPDM Konzepts gebauten „Nanoskope“. DerAufbau hat mit ’klassischen’ Mikroskopen wie dem in Abb. 2 gezeigten vieleGemeinsamkeiten: Auch hier ist ein massives Stativ zur Erhöhung der mechanischenStabilität essentiell. Der durch das Okular blickende Beobachter ist hier jedoch durcheine hochempfindliche CCD-Kamera ersetzt (ähnlich wie bei modernenFotoapparaten), mit der die Lichtblitze von einzelnen Molekülen detektiert werdenkönnen; statt des Sonnenlichts dienen Laser zur Beleuchtung des Präparats. Hinzukommt ein weiteres, ganz wesentliches Element, leistungsstarke Computer zurSpeicherung und Auswertung der von der CCD-Kamera registrierten Bilder: Um eine‚superaufgelöste’ Abbildung zu erhalten, werden typischerweise Informationen ausmehreren tausend Einzelbildern benötigt.Abb. 10: Ansicht eines der am Kirchhoff-Institut für Physik entwickelten„Lokalisationsmikroskope“ [15 – 18] (Photo C.Cremer) 17
  • 18. Derzeit wird in unserer Arbeitsgruppe am Heidelberger Kirchhoff-Institut mit SPDMeine lichtoptische Auflösung (2D) zellulärer Nanostrukturen von etwa 10 – 20 nm(0.010 – 0.020 µm) realisiert. Die Bestauflösung bei solchen zellulären Strukturenentspricht etwa 1/50 der eingesetzten Laserwellenlänge, oder dem Durchmessereines einzelnen größeren Proteins, oder 1/1000 Durchmesser eines Zellkerns. EinBeispiel wird in Abb. 11 gezeigt: Während bei konventionellerFluoreszenzmikroskopie (optische Auflösung ~ 200 nm = 0,2 µm) sich eine ehergleichmäßige „Färbung“ des Zellkerns ergab, wurden bei Verwendung vonLokalisationsmikroskopie (SPDM) in diesem ‚optischen Schnitt’ rund 120.000einzelne Proteine lokalisiert [18]. So gewonnene Molekülverteilungen können nun mitMitteln der theoretischen Polymerphysik quantitativ analysiert und mit numerischenModellvorstellungen verglichen werden [20]. In Abb.12links werden einzelneMoleküle der Verpackung der DNA im Kern einer menschlichen Zelle sichtbargemacht. Einzelne Moleküle im Abstand von nur 17 nm (= 0.017 µm = 0.000 017mm) sind noch deutlich voneinander getrennt. In Abb. 12rechts wurde dasselbeVerfahren auf Moleküle der Zellmembran angewandt, mit ähnlichen Ergebnissen.Gegenwärtig können wir derartige Bilder mit fast molekularer Auflösung von ganzenZellen in etwa einer Minute gewinnen, was auch erste SPDM -Aufnahmen vonlebenden Zellen erlaubt hat. Kameras mit höherer Aufnahmefrequenz sollten eineReduktion der für mehrere tausend Einzelbilder benötigten Gesamtaufnahmezeitenauf wenige Sekunden ermöglichen; neue, derzeit mit Kollegen aus der Informatik inEntwicklung befindliche Computerprogramme werden die Auswertungszeit bis zumfertigen Nanoskopie-Bild auf ähnlich kurze Zeiten reduzieren. Durch Kombinationvon SPDM mit einem weiteren in unserer Arbeitsgruppe entwickeltenNanoskopieverfahren, der Spatially Modulated Illumination (SMI) Mikroskopie ist esuns kürzlich gelungen, eine dreidimensionale (3D) Auflösung zellulärerNanostrukturen von ca. 40 – 50 Nanometer zu verwirklichen [16]. 18
  • 19. Abb 11. Lokalisationsmikroskopie (SPDM) des Kerns einer Knochenmarks-Krebszelle.Links: Bei konventioneller hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie ist es nicht möglich,Einzelheiten der Verteilung der beiden fluoreszenzmarkierten Molekültypen zu erkennen.Rechts: Mit SPDM im Zweifarbenmodus konnten in dem gezeigten “optischen Schnitt”(Kernschicht von ca. 600 nm Dicke) etwa 70,000 einzelne ‚Histon’moleküle (rot) und etwa50,000 individuelle Proteine zur Regulation der Genomstruktur (grün) in einem Gesichtsfeldvon ca. 470 µm2 lokalisiert werden. Aus [18].Abb.12. Links: Lokalisationsmikroskopie (SPDM) von individuellen Histonmolekülen in einemmenschlichen Zellkern (Detail). Rechts: SPDM von individuellen Proteinmolekülen in einermenschlichen Zellmembran (Detail). Die für die Anregung verwendete Wellenlänge war 488nm. Einzelne Moleküle mit demselben Absorptions/Emissionsspektrum (’Farbe’) konntenauch in einem Abstand um die 10 nm noch klar voneinander getrennt werden. Dabei wurdenStandardfluoreszenmarker (Farbstoffe) verwendet. Aus [16,17].In einer Zusammenarbeit mit Prof. V. Sourjik (Zentrum für Molekularbiologie derUniversität Heidelberg/ZMBH) haben wir begonnen, Nanostrukturen von Bakterienzu untersuchen (Abb. 13). Im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie ist das sogar inlebenden Zellen möglich. Unser gegenwärtiger Bestwert bei derlokalisationsmikroskopischen Analyse von Biostrukturen liegt bei etwa 5 nm,entsprechend etwa 1/100 der verwendeten Wellenlänge. Verglichen mit der„konventionellen“ Auflösungsgrenze ist das eine Verbesserung um einen Faktor 40. 19
  • 20. Abb. 13. Oben: Lichtmikroskopisches Bild eines Bakterium bei der ‚konventionellen’Bestauflösung; Unten: Lokalisationsmikroskopie (SPDM) der Verteilung von einzelnenMolekülen eines bestimmten Typs dem oben abgebildeten Bakterium. Aus [2]Nanoskope und MikrobenFür unser Thema „Mikroskope und Mikroben“ bedeuten die neuen Entwicklungender superauflösenden Mikroskopie (Nanoskopie), dass nunmehr die Wechselwirkungvon Bakterien und Viren mit einzelnen Zellen auf der makromolekularen Ebene auchmit sichtbarem Licht beobachtet werden kann. So untersuchen wir derzeit inZusammenarbeit mit verschiedenen virologischen Instituten zelluläre Nanostrukturen,die sich durch Infektion mit verschiedenen Viren ergeben. In einem dieser Projektegeht es um die Wechselwirkung von Influenza-Viren (verantwortlich für verschiedeneFormen von Grippe-Infektionen) und der Zellmembran: Die Anheftung von Viren andie Zellmembran ist eine Voraussetzung für ihr Eindringen in die Zelle; ein besseresVerständnis solcher Anheftungsprozesse kann zur Entwicklung wirksamererArzneimittel beitragen. Bislang werden solche Anheftungsvorgänge hauptsächlich mitelektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Diese sind in punkto Auflösung(also Erkennung von Struktureinzelheiten) selbst der hier dargestelltenLokalisationsmikroskopie immer noch überlegen (wenn auch zur Zeit nur noch umeinen Faktor 2 - 3 und nicht mehr um einen Faktor 100). Es ist jedoch sehr schwierig,in so hoch aufgelösten Elektronenmikroskopischen Bildern Viren zu finden, die sichgerade an die Zellmembran anheften, also gewissermaßen den Virus „in flagranti“ zuerwischen. Bei der Lokalisationsmikroskopie ist das sehr viel einfacher. Eine solcheInspektion kann im Prinzip in wenigen Minuten durchgeführt werden. Wenn maneinigermaßen sicher sein darf, Viren im Moment der Anheftung identifiziert zu haben,dann lohnt es sich viel mehr, auf diese Stelle die mühseligen Prozeduren derhöchstauflösenden Elektronenmikroskopie anzuwenden.In einem anderen Projekt geht es darum, die Auswirkungen einer Vireninfektion aufdie Genexpression zu untersuchen, also die vireninduzierte Bildung von bestimmtenProteinarten. Das ist zum Beispiel von Interesse in der Immunologie.Aber ist es möglich, mit den oben beschriebenen superauflösendenLichtmikroskopieverfahren einzelne Viren direkt „scharf“ abzubilden? Zu ZeitenRobert Koch’s war es unmöglich, diese winzig kleinen Feinde der Menschheit insVisier zu bekommen. Man musste sich mit indirekten Indizien zufrieden geben, bisdie seit den 1930iger Jahren entwickelte Elektronenmikroskopie diese Lücke schloss; 20
  • 21. mit diesen Methoden konnte man einzelne Viren selbst dann noch scharf darstellen,wenn sie nur einen Durchmesser von 20 nm (0.020 µm = 0.000 020 mm) hatten. MitLichtmikroskopie unter Verwendung von sichtbarem Licht so etwas zu erreichen,schien angesichts der vielfach schlechteren optischen Auflösung von 200 nmaussichtslos. Wenn solche Viren geeignet gefärbt vereinzelt auf einen Objektträgergebracht werden konnten, dann konnte man unscharfe Schemen wahrnehmen, abernichts Genaues.In einer Zusammenarbeit mit dem Institut für Biologie der Universität Stuttgart habenwir begonnen, die Lokalisationsmikroskopie/SPDM auf die Strukturanalyse vonTabakmosaik-Viren anzuwenden. Tabakmosaik-Viren sind zylinderförmigePflanzenviren mit einer typischen Länge von 300 nm und einem Durchmesser von 18nm (0.018 µm) und einer Proteinhülle um die Nukleinsäure des Virus. Zum einensind sie für die Erforschung von Virusverursachten Pflanzenkrankheiten interessant;ein signifikanter Teil der Welternte geht auf ihr Konto. Zum anderen werden solchefür den Menschen unschädlichen Pflanzenviren aufgrund ihrer leichtenGewinnbarkeit, perfekten Symmetrie und einheitlichen Gestalt als vielversprechendeelementare Bausteine für verschiedene Anwendungen in der Nanotechnologieangesehen, zum Beispiel für die Herstellung von Batterien, oder für verbesserteSensoren. Solche Anwendungen setzen jedoch eine präzise Kontrolle der Verteilungder Viren auf den benutzten Oberflächen voraus. Mit elektronenmikroskopischenVerfahren ist dies zwar möglich, aber sehr aufwändig.Abb. 14links zeigt solche auf einer Oberfläche aufgebrachte Tabakmosaikviren nachFärbung der Hüllproteine mit einem fluoreszierenden Farbstoff bei bestmöglicherkonventioneller Auflösung (200 nm = 0,2 µm). Eine Reihe von „Flecken“ sindsichtbar, aber genauere Strukturen sind nicht erkennbar, eine Identifizierung ist nichtmöglich. Die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf dieselbe Stelle desPräparats (Abb. 14rechts) zeigt hingegen deutlich einzelne stäbchenförmige Objekte.Wie die genauere Analyse zeigte (Manuskript in Vorbereitung), stimmen dielokalisationsmikroskopisch ermittelten Strukturdaten fast haargenau mit denjenigender Elektronenmikroskopie überein, mit einer Abweichung von ca. 2 nm (0.002 µm).Abb. 14. Lokalisationsmikroskopie von Viren (Tabakmosaikviren) 21
  • 22. Links: Konventionelle lichtmikroskopische Bestauflösung. Rechts: Lokalisationsmikroskopie.Die einzelnen‚’Pünktchen’ geben den Ort einzelner Virusmoleküle an.S. Pres, M. Gunkel, R. Kaufmann, F, Geiger, S. Degenhard, C. Wege, C. Cremer, Super-resolution imaging of viruses by Spectral Precision Distance Microscopy (SPDM), Manuskriptin Vorbereitung.PerspektivenDas Anwendungsspektrum der oben skizzierten superauflösendenLokalisationsmikroskopie-Verfahren reicht derzeit von menschlichen und tierischenZellen (Zellkern, Zytoplasma, Zellmembran, Zell-Zell-Interaktionen) undPflanzenzellen bis zur superaufgelösten Abbildung einzelner Bakterien und Viren,also Objekten, deren Struktur bis vor kurzem nur der Elektronenmikroskopiezugänglich war. Einige bereits begonnene Anwendungen in der Mikrobiologie wurdenoben erwähnt.Im Folgenden sollen einige weitere – derzeit noch spekulative, aber von deroptischen Seite erstmals realisierbare - Möglichkeiten dieser und verwandterMethoden der lichtoptischen Nanoskopie in der Analyse von Bakterien und Virengenannt werden.Bakterien: Nanoskopietechniken mit molekularer Auflösung erlauben es, dieVerteilung einzelner spezifischer Molekültypen in einzelnen Bakterien zu analysieren.Da solche Verteilungen vom Bakterientyp abhängen, sollte es möglich sein,Nanoskopietechniken für eine schnelle Diagnostik der in irgendeiner kleinen Probebefindlichen Bakterienstämme zu entwickeln, selbst wenn eine solche Probe (z.B. einAbdruck von einer Oberfläche von der Größe einer Nadelspitze) eine Vielzahl vonBakterientypen enthält. Bei geeigneten Präparationsverfahren verbunden mit derEntwicklung schneller Computerprogramme für die Auswertung könnte dieDiagnostik von der Probenentnahme bis zur Identifizierung in wenigen Minutenabgeschlossen werden. Mikroskopiegestützte Ansätze zu einer solchen Diagnostikgibt es heute schon, aber lokalisationsmikroskopische Nanoskopieverfahren würdenwegen ihrer molekularen Auflösung diese Möglichkeiten stark erweitern können. Eineder vielen Anwendungsgebiete einer solchen raschen Diagnostik bieten sich beimAufspüren von multiresistenten Keimen im Krankenhaus an. Das Anlegen vonBakterienkulturen, die Wartezeit auf die Ergebnisse würde entfallen, die damitverbundene antibakterielle Therapie könnte sofort begonnen werden.Ein weiteres potentielles Anwendungsbeispiel sind die Proteinfabriken der Bakterien,die Ribosomen; das sind ‚Biomolekulare Maschinen’ [21], auf deren Störung dieWirkung vieler Antibiotika beruht. Nanoskopietechniken könnten dazu beitragen, dieWirkung solcher Antibiotika auf ihre Zielstrukturen auf der Ebene einzelner Bakterienzu verfolgen. Zum Beispiel könnten Antibiotikabedingte Änderungen der gebildetenProtein-„Stückzahlen“ direkt mit einer bislang nicht möglichen Präzision gemessenwerden; oder es könnten sogar Antibiotikabedingte Strukturänderungen in denBakterienribosomen (und zum Vergleich in den Ribosomen der menschlichenWirtszellen) nanoskopisch bestimmt werden. Hierfür würde eine Auflösung imBereich von 1 nm (0.001 µm) benötigt. Lokalisationsmikroskopische Verfahren, diedies ermöglichen, sind gegenwärtig in Entwicklung. Bereits jetzt aber konnten wir miteiner anderen in unserer Arbeitsgruppe etablierten superauflösendenLichtmikroskopiemethode, der sog. Strukturierten Beleuchtung, den Durchmesser 22
  • 23. von Biomolekularen Maschinen der DNA Verdopplung („Replikation“) mit einemstatistischen Fehler von 1 nm bestimmen, und so die durch die Anlagerung einzelnerMoleküle induzierten Größenänderungen (wenige Nanometer) messen.Nanoskopietechniken könnten auch wichtige Informationen über die räumlicheFaltung der in einem langen DNA Strang kodierten Erbinformation des Bakteriumsund seiner Beeinflussung durch Umwelteinflüsse erlauben. Dies wäre nicht nurtheoretisch für die „Fundamental Biophysics“ von Interesse: Gelänge es, auf derBasis solcher Strukturinformationen z.B. die für die Vermehrung der Bakteriennotwendige Verdopplung ihres Genoms zu stören, dann könnte dies zur Entwicklungverbesserter Antibiotika führen, die das Wachstum der Bakterien auf der Ebene ihrerDNA Faltung behindern..Viren: Vielfältige Anwendungsperspektiven nanoskopischer Methoden ergeben sichauch bei Viren. Sie könnten die bestehenden molekularbiologischen undelektronenmikroskopischen Methoden wirksam ergänzen, z.B. bei der Analyse derBildung viraler Strukturen, der Aufnahme und des Transports von Viren in der Zelle,oder der Integration bestimmter Viren in die Erbsubstanz der Wirtszelle und derenFolgen für die Nanostruktur des Genoms. Dies wiederum könnte in Verbindung mitdem übrigen Methodenspektrum der Virologie, ergänzt auch durch die neuen vielversprechenden Möglichkeiten der theoretischen Biophysik und Computersimulationsolcher Vorgänge, hilfreich sein bei der Entwicklung antiviraler Arzneimittel. In einerder ersten Tagungen des Jubiläumsjahres 625 der Universität Heidelberg imNovember 2010 wurden solche Perspektiven thematisiert [21].DanksagungBei der Entwicklung der oben skizzierten laseroptischen Entwicklungen am Kirchhoff-Institut für Physik haben zahlreiche Diplomanden, Doktoranden, wissenschaftlicheMitarbeiter, sowie weitere Kooperationspartner mitgewirkt, denen hier sehr herzlichgedankt sei (siehe www.kip.uni-heidelberg.de). Insbesondere danke ich Herrn Dr.Paul Lemmer (Abb. 6,12,13); Dipl.-Phys. Rainer Kaufmann (Abb. 8,9,12); Dipl.-Phys.Manuel Gunkel (Abb. 11,14) und cand.phys. Sebastian Pres (Abb. 14), sowie HerrnProf. V. Sourjik (Abb. 13) und Frau Priv.-Doz. Dr. Cristina Wege (Abb. 14). DieForschungen wurden unterstützt vom Land Baden-Württemberg, der DFG, demBMBF und der EU.Literatur:[1] Cremer, T. (1985) Von der Zellenlehre zur Chromosomentheorie. Springer Verlag,Heidelberg New York.[2] Lemmer, P. (2009) Lichtmikroskopische Untersuchungen konventionell markierterPräparate weit unterhalb der Beugungsgrenze. Dissertation Fakultät für Physik, Heidelberg.[3] Abbe E. (1873): Beiträge zur Theorie des Mikroskops und ihrer mikroskopischenWahrnehmung. Archiv f. mikroskopische Anatomie 9: 411 – 468. 23
  • 24. [4] Rayleigh, L. (1896) On the theory of optical images, with special reference to themicroscope. Philosophical Magazine 42. 167-195[5] Bornfleth H et al. (1998) High precision distance measurements and volume-conservingsegmentation of objects near and below the resolution limit in three-dimensional confocalfluorescence microscopy. J. Microscopy 189: 118-136.[6] Cremer C et al.(1999) Principles of Spectral Precision Distance confocal microscopy forthe analysis of molecular nuclear structure. In: Handbook of Computer Vision andApplications (ed. B. Jähne, H. Haußecker, P. Geißler), Ch. 41., Vol. 3, Academic Press SanDiego, New York: 839-857.[7] Esa A et al. (2000) Three-dimensional spectral precision distance microscopy ofchromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region onchromosome 22 and the Philadelphia chromosome. Journal of Microscopy 199:96–105.[8] Heilemann M et al. (2002) High-resolution colocalization of single dye molecules byfluorescence lifetime imaging microscopy. Anal. Chem 74:3511–3517.[9] Cremer C. (2011) Lokalisationsmikroskopie - Lichtmikroskopie unterhalb des Abbe-Limits. Physik in Unserer Zeit 42: 21 – 29.[10] Lidke KA et al. (2005) Superresolution by localization of quantum dots using blinkingstatistics. Opt. Express 13: 7052–7062.[11] Betzig E. et al. (2006): Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at NanometerResolution. Science 313:1642–1645.[12] Hess S et al. (2006) Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence PhotoactivationLocalization Microscopy. Biophysical Journal 91:4258.[13] Egner, A et al. (2007) Fluorescence nanoscopy in whole cells by asynchronouslocalization of photoswitching emitters. Biophysical Journal 93:3285.[14] Rust M et al. (2006) Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstructionmicroscopy (STORM).Nature Methods 3: 793–795.[15] Reymann J et al. (2008):High-precision structural analysis of subnuclear complexes infixed and live cells via spatially modulated illumination (SMI) microscopy. ChromosomeResearch 16:367–382.[16] Lemmer P et al. (2008) SPDM – Light Microscopy with Single Molecule Resolution atthe Nanoscale. Applied Physics B 93: 1-12.[17] Kaufmann R et al. (2009) SPDM – Single Molecule Superresolution of CellularNanostructures. Proc. SPIE 7185 :71850J-1 – 71850J-19.[18] Gunkel M et al. (2009) Dual color localization microscopy of cellular nanostructures.Biotechnology J. 4: 927 – 938. [19] Cremer C. et al. (2010) Far field fluorescence microscopy of cellular structures @molecular resolution, In: Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy(A. Diaspro, Edit.), Taylor & Francis.[20] Bohn, M. et al (2010) Localization microscopy reveals expression dependent parametersof chromatin nanostructure. Biophys. J. 99: 1358 – 1367.[21] Structure, Dynamics and Modulation: 3rd International Conference on Viral MembraneProteins, Nov. 5-7,2010, Heidelberg. 24
  • 25. Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Christoph CremerKirchhoff-Institut für PhysikUniversität HeidelbergIm Neuenheimer Feld 227D-69120 Heidelberge-mail: cremer@kip.uni-heidelberg.de; cremer@bmm.uni-heidelberg.de 25