ISOLASI DNA & RFLP      Kelompok 5
• Khoirunnisa’ (0911310016)  • Lelyta Damayanti (0911310017)    • Yosia Arauna (0911310028)• Yulinar Risky Karaman (091131...
LATAR BELAKANG o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas diguna...
LATAR BELAKANG o Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing, tes paternitas, forensic dan diag...
RUMUSAN MASALAH1.   Apakah yang dimaksud dengan teknik RFLP?2.   Bagaimana tahapan – tahapan teknik RFLP?3.   Salah satu t...
TUJUAN1.    Untuk mengetahui pengertian dari teknik RFLP2.    Untuk mengetahui tahapan – tahapan teknik RFLP3.    Untuk me...
MANFAAT• Pemetaan genetik• penentuan mutasi• Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa  individu yang dianalisis maupun k...
Isolasi DNA dr Organ Hewan               0,1 gr organ hewan  Homogenat                   Supernatan  Supernatan           ...
0,1 gr organ                                      Homogenat   hewanDihomogenasi dgn mortar pd kondisi             dingin• ...
Homogenat                         SupernatanDimasukkan tabung eppendorf steril (+) 300 µL PCI  divortex sebentar• Memisah...
Supernatan                        SupernatanDimasukkan tabung eppendorf steril              baru  (+) 300 µL CI  divortex...
Supernatan                             PeletDimasukkan tabung eppendorf steril              baru    (+) amonium asetat  (...
Pelet                              PeletDiambil, (+) ethanol 70% (bolak-balik)• Resuspensi Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, ...
Pelet                     DNADikeringkan dlm inkubator (55°C, 5               mnt)• Mengawetkan/mengambil DNA       (+) 20...
RFLP (Restriction Fragment  Length Polymorphism)  Thinwall                            10 µL DNA hasil PCR                 ...
Hasil Dan Pembahasan
Pembahasan• Pada foto hasil praktikum terlihat bahwa band  yang dihasilkan terlihat mengelompok karena  konsentrasi DNA ya...
Prinsip Kerja• Secara garis besar, prosedur AFLP dipilah  menjadi tiga tahap pokok:• Pemotongan (digesti) oleh enzim restr...
Troubleshooting• Hasil yang didapatkan dari isolasi DNA tiap  spesimen tdak sama, mungkin tersebut terjadi  pada saat homo...
Kelebihan dan Kekurangan• Teknik RFLP memiliki beberapa kelebihan,• tidak memerlukan pengetahuan atau data  tentang sekuen...
Enzim RestriksiEcoRI (diucapkan "eko R satu") adalah enzim  yang diisolasi dari endonuklease strain E. coli.  Dalam biolog...
HindIII (diucapkan "Hin Dee Tiga") adalah tipe II  spesifik situs enzim restriksi deoxyribonuclease  terisolasi dari Haemo...
Exon 23 PARP 1 Mus musculus
Basa Hasil pemotongan EcoR1
Kesimpulan• Analisis Restriction fragment length  polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik  pertama yang secara luas d...
saran• Untuk melakukan RFLP perlu diberi  kesempatan pada mahasiswa untuk  melakukan praktikum secara lengkap
Tabm prak
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Tabm prak

1,535 views

Published on

Published in: Education
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
1,535
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
8
Actions
Shares
0
Downloads
41
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Tabm prak

  1. 1. ISOLASI DNA & RFLP Kelompok 5
  2. 2. • Khoirunnisa’ (0911310016) • Lelyta Damayanti (0911310017) • Yosia Arauna (0911310028)• Yulinar Risky Karaman (0911310030) • Putrika Suryandari (0911310057)
  3. 3. LATAR BELAKANG o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA o RFLP merupakan marker yang sangat dapat dipercaya dalam analisis linkage dan breeding dan dapat ditentukan dengan mudah jika karakter terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot. o RFLP digunakan sebagai marker molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi. o Untuk dapat melakukan RFLP, maka perlu dilakukan proses isolasi DNA. o Isolasi DNA adalah perusakan atau pembuangan dinding sel yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim.
  4. 4. LATAR BELAKANG o Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing, tes paternitas, forensic dan diagnostik hereditas penyakit o Melihat banyaknya manfaat yang didapat dari RFLP untuk keperluan penelitian maupun diagnosa suatu penyakit, maka sangat perlu dilakukan praktikum Teknik Analisis Biomolekular tentang proses atau tahapan RFLP secara keseluruhan.
  5. 5. RUMUSAN MASALAH1. Apakah yang dimaksud dengan teknik RFLP?2. Bagaimana tahapan – tahapan teknik RFLP?3. Salah satu tahapan teknik RFLP adalah isolasi DNA. Apakah yang dimaksud isolasi DNA?4. Bagaimana proses atau tahapan isolasi DNA?5. Enzim restriksi apakah yang digunakan dalam teknik RFLP?6. Bagaimana sisi pemotongan enzim restriksi yang dipakai dalam teknik RFLP?7. Apakah manfaat teknik RFLP dalam bidang kedokteran hewan?8. Apakah kerugian atau kelemahan dari teknik RFLP?
  6. 6. TUJUAN1. Untuk mengetahui pengertian dari teknik RFLP2. Untuk mengetahui tahapan – tahapan teknik RFLP3. Untuk mengetahui pengertian dari isolasi DNA4. Untuk mengetahui proses atau tahapan isolasi DNA5. Untuk mengetahui macam – macam enzim restriksi yang digunakan dalam teknik RFLP6. Untuk mengetahui sisi pemotongan enzim restriksi yang dipakai dalam teknik RFLP7. Untuk mengetahui manfaat teknik RFLP dalam bidang kedokteran hewan8. Untuk mengetahui kelemahan dari teknik RFLP
  7. 7. MANFAAT• Pemetaan genetik• penentuan mutasi• Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis maupun kesamaan spesies• Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah• Dapat memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter• Dapat memilah-milah komponen genetik dari karakter kuantitatif• Dapat menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik• Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi adanya heterozigositas• Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada tingkat spesies, populasi
  8. 8. Isolasi DNA dr Organ Hewan 0,1 gr organ hewan Homogenat Supernatan Supernatan Pelet Pelet DNA
  9. 9. 0,1 gr organ Homogenat hewanDihomogenasi dgn mortar pd kondisi dingin• Menghomogenkan, menghancurkan• Dingin  agar DNA tidak rusak (menjaga) (+) 0,5 mL buffer lysis  campur• Menghomogenkan• (+) buffer  mejaga kondisi fisiologis
  10. 10. Homogenat SupernatanDimasukkan tabung eppendorf steril (+) 300 µL PCI  divortex sebentar• Memisahkan protein & DNA• MenghomogenkanDisentrifus v=13000 rpm (10 mnt, 4°C)• Memisahkan molekul berdasarkan berat jenis & gravitasi
  11. 11. Supernatan SupernatanDimasukkan tabung eppendorf steril baru (+) 300 µL CI  divortex sebentar• Memisahkan protein & DNA• MenghomogenkanDisentrifus v=13000 rpm (10 mnt, 4°C)  diulang 1x lagi• Memisahkan molekul berdasarkan berat jenis & gravitasi
  12. 12. Supernatan PeletDimasukkan tabung eppendorf steril baru (+) amonium asetat  (+) 1 mL ethanol absolut (bolak-balik)• Presipitasi DNA Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, 4°C)• Memisahkan materi berdasarkan berat jenis & gravitasi
  13. 13. Pelet PeletDiambil, (+) ethanol 70% (bolak-balik)• Resuspensi Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, 4°C)• Memisahkan berdasarkan berat jenis & gravitasi
  14. 14. Pelet DNADikeringkan dlm inkubator (55°C, 5 mnt)• Mengawetkan/mengambil DNA (+) 20-50 µL TE buffer  disimpan pd freezer (-20°C)
  15. 15. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Thinwall 10 µL DNA hasil PCR 2 µL buffer enzim dimasukkan 2 µL enzim restriksi 6 µL ddH2O  agar gel di mix gentle lurus/rata diinkubasi (37°C, semalam) diinkubasi (70°C, 10 mnt)  u/ stop reaksi (agar enzim rusak) disimpan dlm freezer Hasil
  16. 16. Hasil Dan Pembahasan
  17. 17. Pembahasan• Pada foto hasil praktikum terlihat bahwa band yang dihasilkan terlihat mengelompok karena konsentrasi DNA yang digunakan terlalu tinggi sehingga tidak menampilkan hasil yang baik saat ditampilkan dalam foto• Semakin terang warnanya maka semakin banyak DNA nya yang terkandung… Hal it dapat dilihat pada T1,T2,M7,M8
  18. 18. Prinsip Kerja• Secara garis besar, prosedur AFLP dipilah menjadi tiga tahap pokok:• Pemotongan (digesti) oleh enzim restriksi dan penempelan (ligasi) adapter• Perbanyakan (amplifikasi) selektif atas potongan-potongan DNA• Analisis hasil amplifikasi lewat elektroforesis gel
  19. 19. Troubleshooting• Hasil yang didapatkan dari isolasi DNA tiap spesimen tdak sama, mungkin tersebut terjadi pada saat homogenisasi awal.• Hasil dari RFLP menujukkan hasil yang berbeda pada uji kuantitas yaitu pengukuran dengan spektrofotometri.
  20. 20. Kelebihan dan Kekurangan• Teknik RFLP memiliki beberapa kelebihan,• tidak memerlukan pengetahuan atau data tentang sekuens DNA genom yang akan dianalisa,• hanya memerlukan sampel DNA dalam jumlah yang sedikit,• teknik ini dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel DNA,• penanda yang dihasilkan lebih dapat dipercaya dan hasil pengulangan lebih baik jika dibandingkan dengan RAPD.• Kekurangan dari RFLP adalah penanda DNA yang dihasilkan hanya bersifat dominan.
  21. 21. Enzim RestriksiEcoRI (diucapkan "eko R satu") adalah enzim yang diisolasi dari endonuklease strain E. coli. Dalam biologi molekuler digunakan sebagai enzim restriksi. Ini menciptakan ujung lengket dengan overhang akhir 5 . Urutan asam nukleat tempat pemotongan enzim GAATTC, yang, sebagai urutan komplementer adalah CTTAAG, memiliki simetri rotasi.
  22. 22. HindIII (diucapkan "Hin Dee Tiga") adalah tipe II spesifik situs enzim restriksi deoxyribonuclease terisolasi dari Haemophilus influenzae yang membelah urutan DNA pada AAGCTT Pembelahan urutan antara hasil AA dalam overhang 5 pada DNA yang disebut sticky end: 5-A | A G C T T-3 3-T T C G A | A-5
  23. 23. Exon 23 PARP 1 Mus musculus
  24. 24. Basa Hasil pemotongan EcoR1
  25. 25. Kesimpulan• Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA.• Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
  26. 26. saran• Untuk melakukan RFLP perlu diberi kesempatan pada mahasiswa untuk melakukan praktikum secara lengkap

×