Câmara de neubauer
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Câmara de neubauer Câmara de neubauer Document Transcript

  • UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTAunesp “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO Aula Prática 5: Contagem de células de leveduras em câmara de NeubauerUma das formas mais comuns de se determinar a viabilidade de células de levedura é através do usoda câmara de Neubauer, também conhecida como hemacitômetro.A câmara de Neubauer consiste de uma lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâminanormal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio,percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que juntos formam umquadrado maior.Pode-se notar que estes quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério paraescolha do quadrante onde serão contados as células, seja o tamanho dos células a seremquantificados. Assim, usualmente, células muito pequenas são contados no quadrante C, as detamanho intermediário no quadrante B, enquanto células grandes são contados no quadrante A. A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C)são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamínula (especial para ser usada na câmara deNeubauer) a distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obterum volume de 0,1 mm3 em cada quadrante.A técnica de coloração consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra),adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno ou eritrosina). As células com altaatividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ãocoloridas de azul (azul de metileno) ou rosa (eritrosina). A porcentagem ou o número de célulasviáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a câmara deNeubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm 2 de área;
  • UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTAunesp “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLAROa lâmina é coberta com uma lamínula,que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10 -4 cm3 ou0,1 mm3 .0.1 mm3 – 0.0001 cm3 – 0.0001 mL ou 10-4 mLProcedimento1- Transferir 1 mL para um tubo de ensaio e adicionar 1 mL da solução de eritrosina.3- Agitar a mistura.4- Colocar a lamínula na Câmara de Neubauer e com auxílio da pipeta Pasteur,coleta-se umapequena alíquota da suspensão preparada e deposita-se em um dos canais laterais ao campo central,a amostra, até que todos os canais interligados estejam completos.5- Levar ao microscópio óptico e com a objetiva de 40X, fazer a contagem das células nos campos :6- Escolher o quadrante que irá contar as células.6- Marcar o número de células viáveis (células que não se colorem com eritrosina) e célulasinviáveis (rosa).Como proceder a contagem:Regras de contagem: 1) Conte as células usando o quadrado grande do centro. 2) Conte as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando as linhas superiores e as linhas à direita. 3) Conte cerca de 200 à 250 células antes de determinar o número/cm3No quadrante C - contar o número de células em 5 sub-quadrantes (c) de C, os 4 dos cantos eo sub-quadrante central.Exemplo: 210 células em 5 quadrados médios (cada um medindo 0,2 x 0,2 mm). Quantas células hápor cm3?210/5 = 42 células/quadrado médio42 x 25 = 1050 em 0,1 mm31050 x 104 = 10.500.000 ou 1,05 x 107 cels/cm3% de viabilidade= (células vivas x 100)/ (células vivas + células mortas)% de brotamento = (brotos x 100)/ (vivas+mortas)% de viabilidade dos brotos = (brotos x 100)/ (brotos vivos + brotos mortos)