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Virus
VIROLOGÍA
1- INTRODUCCIÓN
     1.1 Características generales de los virus
     1.2 Agentes infecciosos subvirales
     1.3 Acción de los agentes físicos y químicos

2- CLASIFICACIÓN

3- TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

4- MÉTODO DE CULTIVO
     4.1 Animales de experimentación
     4.2 Huevos embrionados
     4.3 Cultivos tisulares
             4.3.1 Cultivos celulares
                       A- Cultivos celulares primarios
                       B- Cultivos de células diploides
                       C- Líneas celulares
              4.3.2 Cultivos de órganos

5- MÉTODOS DE IDENTIFICACION

6- DIAGNÓSTICO

7- PRINCIPALES VIRUS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS
HUMANOS

     A) VIRUS ADN
                 1) Virus Herpes Simple (VHS)
                 2) Virus varicela-Zoster (VVZ)
                 3) Virus de Epstein-Barr (VEB)
                 4) Virus de la Hepatitis B

     B) VIRUS ARN
                 1) Virus del resfriado común     2) Virus de la rubéola
                 3) Virus de la gripe             4) Virus del sarampión
                 5) Virus de la parotiditis       6) Virus de la rabia
                 7) Virus del SIDA                8) Virus de la hepatitis A, C, D, E



                                          2
1- INTRODUCCIÓN

      La virología es la rama de la biología que estudia los virus.
      La virología es una ciencia joven dentro de la Microbiología, pues
prácticamente su historia se remonta al siglo XX. En 1933 Stanley cristaliza el
virus de mosaico del tabaco. Pero es a partir del descubrimiento del microscopio
electrónico cuando se empiezan a estudiar los virus.
      Las características peculiares de los virus han generado una especialización
dentro del laboratorio de microbiología.
      Los virus los podemos encontrar infectando y produciendo patología en todos
los seres vivos: bacterias (bacteriófagos), plantas y animales. Los virus que afectan
al hombre, se encuentran dentro de los agentes que producen con mayor
frecuencia infecciones agudas, y en la actualidad se conocen mas de 500, pudiendo
producir desde enfermedades banales como el resfriado común, hasta síndromes
de extrema gravedad como el SIDA.

1.1Características generales de los virus

        Son agentes submicroscopicos, subcelulares y filtrables que consisten en un
ácido nucleico envuelto por una cubierta proteica protectora (cápside), que puede a
su vez estar rodeada de una membrana lipoproteína. El ácido nucleico de un virus es
solo de un tipo, ADN o ARN, a excepción de los oncornavirus, que, además de su
ARN, pueden contener pequeñas cantidades de ADN.
        No poseen mecanismos biosintéticos ni generadores de energía, por tanto,
la replicación vírica requiere la participación activa de la célula huésped (son
parásitos intracelulares obligados). La replicación es un mecanismo particular, en
virtud del cual el ácido nucleico del virus orienta el metabolismo de la célula hacia
la síntesis de sus propios componentes, que en una primera parte se forman por
separado, y posteriormente se integran para formar la partícula completa del virus.
El ácido nucleico suministra la información para programar en la célula la síntesis
de sus componentes.
        Forman pues, un grupo de seres que se diferencian claramente de los
demás microorganismos, tanto en su estructura como en sus características
fisiológicas.
        El tamaño de las partículas víricas (viriones) se encuentra, en general, entre
20 y 300 nm. El único modo de visualizarlas es el microscopio electrónico.

Morfología y estructura

Los componentes estructurales de un virión son:
       a) Un núcleo central de ácido nucleico (nucleoide)
       b) Una cubierta proteica protectora (cápside)


                                          3
c)   Una membrana externa lipoproteína (envuelta) que se encuentra solo
             en ciertos grupos víricos.
        El núcleo y la cápside se denominan nucleocápside, que puede estar desnuda
o envuelta.
        La cápside es una estructura proteica compuesta por subunidades o
capsómeros. Los capsómeros se acoplan por un proceso de auto agrupación y para
ello las subunidades proteicas se ordenan siguiendo un plan simétrico. De esta
forma pueden adquirir distintas formas geométricas, que nos sirven para
clasificarlos en 4 grupos:

   1)   Virus   con simetría icosaédrica
   2)   Virus   con simetría helicoidal
   3)   Virus   con simetría mixta o binaria
   4)   Virus   de estructura compleja y simetría no bien definida

1- Virus con simetría icosaédrica.

       Un gran número de virus se parecen a pequeños cristales de morfología
icosaédrica, posiblemente debido a que el icosaedro es el modelo mas eficaz para
formar, a base de subunidades, una estructura compacta de la máxima fortaleza y
capacidad, con la mayor economía de material genético.
       El ácido nucleico puede encontrarse aislado debajo del cápside o asociado a
proteínas básicas. En este caso forma en la parte central del virión una estructura
plegada y compacta.
       El nucleocápside, puede estar desnudo o envuelto por una envoltura de
naturaleza lipoproteína que puede estar dotada de proyecciones o especulas de
glicoproteinas. Asimismo, algunos virus desnudos como los adenovirus pueden
presentar especulas o fibras en los vértices de la partícula.
       Ejemplos de virus icosaédricos son: fago OX174, parvovirus, papovirus,
reovirus, herpesvirus y adenovirus entre otros.

2- Virus con simetría helicoidal

       El nucleocápside se representa como un tubo hueco formado por un
filamento de ácido nucleico dispuesto en espiral en el centro. Las unidades químicas
o de estructura están constituidas por numerosas moléculas de un mismo tipo de
proteína (protómeros), que se unen formando una estructura en forma de cinta que
se enrolla alrededor del ácido nucleico.


3- Virus con simetría mixta o binaria

       Algunos bacteriófagos presentan una simetría mixta, pues la cabeza tiene
simetría cúbica y la cola, helicoidal.




                                           4
4- Virus de estructura compleja y simétrica no bien definida

       En este caso, se encuentran los poxvirus, que presentan una estructura
formada por una envoltura externa compuesta por subunidades proteicas de forma
tubular, dispuestas irregularmente, que encierran una parte central en forma de
lente bicóncava, que presenta a ambos lados dos formaciones ovoides o cuerpos
laterales de naturaleza desconocida. La parte central contiene el ácido nucleico
(ADN) asociado con propinas y no se conoce con certeza el tipo de simetría.


1.2Agentes infecciosos subvirales

        Además de los virus, se han demostrado que algunas enfermedades de las
plantas, del hombre y de los animales pueden ser producidas por agentes filtrables
de tamaño muy pequeño, que presentarían algunas propiedades diferentes de los
virus. Los mas importantes son los tiroides y los virus convencionales son priones.

Viroides

       Son pequeñas moléculas de ARN, que se encuentran plegadas y que
presentan una estructura secundaria particular con apareamiento intracatenario
parcial de las bases, que hace que existan regiones con ARN monocatenario
alternado con otras de ARN bicatenario, simulando asas y estando totalmente
desprovistas de cubierta proteica.
       Contienen información genética solo para su propia replicación.
       Hasta el presente solo de han demostrado en 11 enfermedades de las
plantas, como el mosaico del crisantemo, la clorosis del pepino, el exocortis de los
cítricos, etc.

Priones

       Desde hace tiempo, se conocía la existencia de enfermedades crónicas y
degenerativas del SNC de los animales y del hombre, como el scrapie o prurito
lumbar de las ovejas, el kuru o ataxia degenerativa endémica y la enfermedad de
Creutzdelt-Jakob (demencia presenil), que se podían transmitir a los animales por
inoculación de cerebro de los enfermos y que se consideraba como virosis lentas,
pero en las cuales no se había podido demostrar la presencia de virus.
       Se consiguió aislar de los enfermos unas glucoproteinas capaces de
transmitir la enfermedad a ratones y hámster, a los que denomino “priones” por
considerar que eran proteínas infecciosas de bajo peso molecular, no antigénicas,
con una gran tendencia a la agregación y que al microscopio electrónico se observan
como fibrillas de 20 x200 nm. Son resistentes alas sustancias y procedimientos


                                         5
que inactivan los virus (los rayos UV, calor, nucleasas, formol, glutaraldehido, oxido
de etileno), pero se inactivan por una solución de NaOH 0,1 molar.
         No se conoce con certeza su mecanismo de replicación, pero se considera
que por su pequeño tamaño no pueden contener la información genética necesaria
para su síntesis, sino que ésta se encuentra codificada en el ácido nucleico de la
célula huésped, que normalmente no se expresa, pero que la inyección o inoculación
de priones producirían su desrrepresión y la producción de la enfermedad.
        Su resistencia a la inactivación y falta de antigenicidad ha hecho que se
consideren como moléculas de proteínas muy pequeñas o muy protegidas por
agregación de las unidades infecciosas, que podrían ser los primeros agentes
infecciosos sin ácido nucleico, lo que aun no esta totalmente demostrado.

1.3Acción de los agentes físicos y químicos

        Los agentes que producen la inactivación de los virus actúan directamente
sobre sus componentes, en especial sobre las proteínas, lípidos o ácido nucleico del
virión.

Agentes físicos

        Temperaturas de 56 a 65ºC mantenidas durante 1 hora inactivan la mayoría
de virus, pues desnaturalizan las proteínas del cápside y de la membrana e inhiben
la fijación y descapsidación del virión. Sin embargo, existen excepciones como los
virus de la hepatitis B, los virus adenoasociados y los viriones resistentes a estas
temperaturas. La esterilización por autoclave (30 min. A 120º) o por calor seco (1
hora a 160º) destruye todos los virus.

En general los virus pueden conservarse:
   - A +4ºC (frigorífico ordinario) durante 1-2 días
   - A -30ºC (temperatura de congelación del congelador casero) durante
      algunos días, y los virus mas resistentes (enterovirus) durante largo tiempo.
   - A -70ºC (temperaturas de congelación de la nieve carbónica) durante largo
      tiempo.
   - A -196ºC (temperatura de congelación del nitrógeno liquido) durante años.

       Para evitar las perdidas de infectividad durante la conservación, se
aconseja proceder a una congelación rápida de la suspensión vírica, en un medio que
contenga sustancias protectoras, como proteínas (suero, caldo, leche) o, aun mejor,
dimetilsulfóxido.

      Por otra parte se han observado que ciertas sales a concentraciones
molares (MG, SO4Mg, SO4Na2) presentan una acción estabilizadora sobre algunas
suspensiones de virus.
      La mayoría de los virus pueden conservarse por liofilización, es decir, por
deshidratación en el vacío, a partir de la suspensión congeladora. Los virus que


                                          6
resisten la congelación pueden conservarse liofilizados durante mucho tiempo a
temperatura ambiente y, prácticamente de forma indefinida a 4ºC.
       Las radiaciones, tanto los rayos ultravioleta como las radiaciones ionizantes
(rayos X, radiaciones φ), inactivan los virus porque producen alteraciones en la
cadena de nucleótidos (roturas, formación de dimeros). Los virus con ácido nucleico
monocatenario son los mas sensibles.

Desinfectantes u antisépticos

        Los virus con envoltura de naturaleza lipoprotéica (herpesvirus,
ortomixovirus, arenavirus, paramixovirus, rabdovirus, etc.) se inactivan con
facilidad por los disolventes de las grasas como el éter, cloroformo, desoxicolato
sodico y detergentes aniónicos. Por otra parte la sensibilidad al desoxicolato
sodico explica que dichos virus se inactivan por la bilis y por lo general no sean
inefectivos por vía digestiva.
        Los virus desnudos son resistentes a la mayoría de desinfectantes que se
emplean para las bacterias, pero, en cambio, son sensibles a la acción:

          a) De los agentes oxidantes (hipocloritos, yodoforos), que a
             concentraciones elevadas 1000 ppm, inactivan la mayoría de los virus,
             incluso los de la hepatitis.

          b) Formol, que, por no alterar las propiedades antigénicas, se emplea en
             la preparación de las vacunas.

          c) Glutaraldehido y ácidos, en especial al ácido clorhídrico diluido,
             aunque existen virus acidorresistentes como los enterovirus. En el
             momento actual no se conoce ningún desinfectante de la piel, o
             antiséptico, que sea eficaz sobre los virus.

       En la desinfección ambiental, hay que tener presente que la eficacia del
cloro depende de la cantidad de materia orgánica, por esto, se aconseja aumentar
la dosis de cloro en las estaciones de depuración de aguas potables y en la
desinfección de productos patológicos que la contienen en abundancia (orina,
heces, exudados) o sustituir el cloro por el formol o el ácido clorhídrico diluido.

1.4Interferón

        El interferón esta constituido por un grupo de proteínas sintetizadas por
las células en respuesta a la acción de virus. Su propiedad mas importante es la de
inhibir la replicación intracelular de los virus en las células, pero, además, se han
demostrado otras propiedades biológicas sobre el huésped, como la acción
inhibidora sobre el crecimiento de las células normales y malignas, y las acción
estimulante sobre la fagocitosis y moduladora de la respuesta inmune.




                                         7
El interferón es un producto muy activo, pues la dosis para el hombre es
solo de algunos microorganismos de proteína pura, lo que supone una actividad
semejante a la de algunas hormonas.
       Presenta una acción inespecífica y de amplio espectro, pues inhibe el
proceso de replicación de diversos virus no relacionados, virus ADN y ARN
(inespecificidad vírica). Sin embargo, solo puede sintetizarse en células de la
misma especia o especies relacionadas, de manera que el interferón activo para el
hombre debe ser necesariamente producido en células humanas o de primates
(especificidad celular)
       En el curso de la desinfección el interferón aparece precozmente, presenta
su máxima acción en células y tejidos cercanos al lugar de producción, aunque no
esta descartado que también puede actuar en órganos alejados y su acción se
mantiene durante poco tiempo.
       Se supone que en circunstancias naturales interviene en la recuperación y
restablecimiento de las infecciones víricas.
       Se ha empleado por vía tópica en el tratamiento de la queratitis herpetica,
y por vía general en la profilaxis de algunas virosis respiratorias (adenovirus,
resfriado común y gripe), para el tratamiento del herpes zoster, varicela, rabia y
hepatitis B, y para prevenir las infecciones por citomegalovirus en transplantes
renales o de bazo.



2. CLASIFICACION

        Durante mucho tiempo, los virus se han clasificado atendiendo al huésped
que se desarrollan, sus tropismos tisulares, a su epidemiología o a los cuadros
clínicos que producen, siempre muy diversos. Pero a medida que se ha progresado
en el conocimiento de su estructura y composición química, se ha podido elaborar
una clasificación más racional, basadas en sus propiedades físico-químicas, que el
Comité Internacional de Taxonomía ha ido perfeccionando progresivamente.

Según el huésped

       Atendiendo al huésped en que se desarrollan, se pueden establecer cuatro
grandes grupos de virus (taxa) según afecten específicamente a los vertebrados ,
invertebrados, plantas o bacterias, y debe añadirse un quinto grupo para aquellos
virus capaces de afectar a mas de una clase de huésped.

Epidemiología

Según la vía y mecanismo de transmisión se pueden dividir en:

   -   Virus respiratorios: aquellos que ingresan y se desarrollan primariamente en
       las vías respiratorias. Comprenden los ortomixovirus, paramixovirus,
       coronavirus y rinovirus.


                                        8
-   Virus entéricos: aquellos que ingresan y se desarrollan primariamente en el
       tubo digestivo. Comprenden los enterovirus, adenovirus, reovirus y virus de
       la hepatitis.

   -   Arbovirus: virus que afectan a diversas especies de animales y también al
       hombre y se caracterizan en que en su transmisión intervienen diversos
       artrópodos hematófagos.       Comprenden las familias de los togavirus,
       rabdovirus y el genero arbivirus de los reovirus.

Clínica

      Se dividen según que produzcan infecciones generalizadas o localizadas, y,
en este caso, según el órgano o sistema predominantemente afectados, como el
SNC, aparato respiratorio, piel, mucosas, conjuntiva, hígado y glándulas salivares.

Físico- química

       Esta clasificación se basa en las características del virión, ácido nucleico y
proteínas del cápside:

   1- En el virión se consideran su morfología y estructura, en especial la forma y
      tamaño, la presencia de envoltura, la simetría del cápside, el numero de
      capsómeros y el diámetro de la espiral de ribonucleoproteinas.

   2- En el ácido nucleico, se tiene en cuenta el tipo de ac nucleico, peso
      molecular, continuo o segmentado…etc.

   3- En las proteínas de la cápside se considera fundamentalmente se numero.

      La clasificación y nomenclatura de los virus que afectan al hombre, de
acuerdo al Comité de Taxonomía de Virus (1982)



3- TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

3-1 Toma de muestras

       Antes de la inoculación es necesario efectuar una serie de operaciones
preliminares que son de importancia fundamental, pues de su correcta ejecución
depende muchas veces el éxito del aislamiento. Se debe seleccionar la muestra que
tenga mayores probabilidades de contener el virus (secreciones respiratorias,
heces, LCR, orina, etc.) y obtenerlas en el momento oportuno, especialmente en los




                                         9
comienzos y fase aguda de la enfermedad (menos de 5 días), pues, mas adelantes
con la aparición de AC es cada vez mas difícil.
        Además, suele ser aconsejable la obtención de 3 a 10 ml de sangre
coagulada en la fase aguda de la enfermedad, separando el suero y conservándola
(por lo menos a -20ºC) para posible referencia en las pruebas serológicas, si mas
tarde se demuestra que puede ser de utilidad.
        Existen algunas reglas sencillas relacionadas con la recogida de las
muestras. Para las gasas, torundas y otras muestras que pueden desecarse durante
el transporte al laboratorio es necesario un medio de transporte de virus (MTV).
Generalmente se utiliza solución fisiológica tamponada con proteína como
estabilizador, a la que se añaden antibióticos, como penicilina o vancomicina,
gentamicina y anfotericinaB, para eliminar el crecimiento bacteriano y fúngico. El
caldo de infusión de ternera, 1% de albúmina sérica bovina y leche de vaca,
ligeramente desnatada, constituyen alternativas utilizables. En la actualidad se
dispone de diversos medios de transporte comerciales.
La toma de muestra debe ser selectiva:


Síndromes respiratorios

        El punto de recogida primario de las muestras son las vías respiratorias.
Para la recogida de frotis faríngeos se utilizan torundas de algodón, rayón o
dracon. Las muestras nasofaríngeas se obtienen insertando en la nasofaringe un
escotillón flexible, dejándolo durante 1 minuto. Los métodos alternativos incluyen
aspirados o lavados nasofaríngeos. También resultan para detectar citomegalovirus
en pacientes inmunodeprimidos.


Síndromes del sistema nervioso central

       En los pacientes con meningitis o encefalitis se deben obtener heces,
muestras de la garganta y LCR. Si se sospecha la existencia de paperas, las
muestras de orina también pueden tener valor.
       De 5 a 10 g de heces, recogidas en un frasco con tapón de rosca, se
prefieren para el aislamiento de enterovirus, pero esto puede retrasar la iniciación
del trabajo mientras se espera que el paciente defeque. Una alternativa útil
consiste en la obtención de un frotis rectal, sumergido en MTV.
       En los enfermos en quienes se sospecha una encefalitis por herpes simple
suele ser necesario hacer una biopsia cerebral para poder establecer un
diagnostico cronológico y exacto.
       El LCR, de 1 a 3 ml, se recoge en un tubo estéril y se conserva sin otro
procesamiento hasta su inoculación.

Exantemas y enantemas




                                        10
Se deben obtener muestras por medio de torundas de la garganta o
rectales; además, cualquier lesión ulcerada debe frotarse directamente con la
torunda y ésta se coloca en MTV.
        Si están presentes lesiones vesiculares o ampollares, pueden ser aspiradas
por medio de una jeringa de insulina o un tubo capilar, se coloca el contenido en
MTV y a continuación se enjuaga el tubo o jeringa con MTV. También puede
frotarse la base de la lesión y colocar la torunda en el mismo vial de MTV. Las
pequeñas lesiones pueden liberarse cuidadosamente de su cubierta. Con frecuencia
es útil conseguir muestras de varias lesiones y juntarlas en un solo vial de MTV
para conseguir un aumento de los virus obtenidos. En caso de sospechar sarampión,
parotiditis o rubéola deben recogerse muestras de orina.

Síndromes oftalmológicos

       Las muestras de secreciones de la conjuntiva se recogerán con un hisopo
estéril mojado con solución de Hanks o solución salina, frotando con éste la
conjuntiva palpebral. Se debe hacer una toma por cada ojo de forma
independiente, y se introduce en MTV. Los raspados cornéales y conjuntivales
deben realizarse por un oftalmólogo.

Otras muestras:

-Orina

       Suele ser una buena fuente de cultivo para infecciones congénitas o
adquiridas debidas a citomegalovirus, cistitis hemorrágica aguda asociada con
adenovirus. En ocasiones los virus de la parotiditis también pueden detectarse en
la orina hasta después de 2 semanas del inicio de la enfermedad. Las muestras
obtenidas del chorro medio, 5 a 10ml, se prefieren y han de transportarse lo más
pronto posible al laboratorio. Algunos laboratorios prefieren, en caso de que existe
una espera de diversas horas ante de procesar la muestra, la alcalinización de la
orina hasta pH de 7.

-Líquido pleural, lavados traqueo bronquiales, líquido articular, etc

      Se recogen en recipientes estériles sin otro tratamiento antes del
transporte.

-Sangre

       En general no suelen llevarse a cabo hemocultivos para los virus, sin
embargo, vale la pena considerarlo en algunas circunstancias como cuando se
sospechan infecciones por citomegalovirus en pacientes inmunodeprimidos, en caso
de fiebres hemorrágicas víricas, y en determinadas infecciones por arbovirus. Los
resultados de estos cultivos es muy bajo. También se pueden realizar intentos de



                                        11
aislamiento en el suero o en material leucocitario de muestras de sangre
heparinizadas o citratadas.

-Material de biopsias

       Se colocará el tejido en un frasco estéril con cierre de rosca. En general de
1 a 3 gr. de tejido son suficientes. Si sólo se pueden conseguir piezas muy pequeñas
del tejido, deben colocarse en un vial de MTV para evitar que se sequen.

-Especimenes post-mortem.

      Se deben obtener con instrumentos estériles, a fin de prevenir
contaminaciones, y tratarse del mismo modo que los tejidos de biopsias.

-Semen

       Es una buena muestra para aislar Cytomegalovirus. Se introducen 1-2 ml en
MTV.

3.2 Transporte de las muestras

        Cuanto más rápido se envíe una muestra al laboratorio, mayores serán las
posibilidades de aislamiento de los agentes virales. No dejar nunca una muestra a
temperatura ambiente o en la estufa de incubación. Si no se va a procesar
inmediatamente,     lo     mejor   es    mantener     las   muestras     refrigeradas
aproximadamente entre 2 y 8ºC, pero no congeladas. La congelación sólo debe
efectuarse si ha de existir un retraso de 1 día o más entre la recogida y el
tratamiento de las muestras.
        El transporte al laboratorio de la muestra refrigerada, se puede realizar de
distintos modos, que incluyen la utilización de cajas selladas de hielo en recipientes
aislados, hielo en bolsas, o si las distancias que hay que recorrer son cortas, se
colocarán los recipientes con las muestras en una caja con hielo triturado. Cuando
la congelación no se puede evitar, se debe realizar una congelación instantánea de
la muestra. Se pueden agregar citoprotectores como el sorbitol cuando es
necesario congelar la muestra, pero aún así las condiciones de congelación y
descongelación deben ser muy rígidas.
        Debemos de tener en cuenta que las muestras que tienen que remitirse por
vía aérea o por correo deben estar marcadas adecuadamente como material
infeccioso y embaladas correctamente de acuerdo con las normas vigentes. Las
muestras transportadas localmente deben cerrarse cuidadosamente y colocarse en
bolsas de plástico selladas.



4- MÉTODOS DE CULTIVO




                                         12
Los virus sólo se desarrollan en el interior de células vivas. Para su
aislamiento y cultivo se han utilizado diversos procedimientos.

4.1 Animales de experimentación

        La inoculación de virus en los animales de experimentación puede producir
una enfermedad con lesiones características. Es el método más antiguo para aislar
y conservar los virus. Los poliovirus por inoculación intracerebral al mono pueden
producir un cuadro paralítico y el virus de la gripe por instalación nasal al hurón, un
cuadro febril benigno. Pero debido a su elevado costo, a la presencia de virus
latentes y por presentar dichos animales una respuesta inmunitaria, los métodos de
inoculación se emplean cada vez menos y quedan reducidos a la inoculación
intracerebral de ratones adultos y lactantes para el aislamiento del virus de la
rabia, togavirus y algunos virus Coxsackiea. Sin embargo, los animales se utilizan en
investigaciones experimentales sobre virus oncogénicos, sobre la patogenia e
inmunidad de las virosis y para la obtención de antisueros.

4.2 Huevos embrionados

       Presentan la ventaja de ser animales bacteriológicamente estériles, con
escaso riesgo de virus latentes y sin producir respuesta inmunitaria. Los virus se
pueden inocular en la cavidad alantoidea (virus de la gripe), y es posible obtener así
el crecimiento en toda la membrana corioalantoidea, en la cavidad amniótica, o sea
directamente en las vías respiratorias del embrión (virus de la gripe y de la
parotiditis), o en el saco vitelino (virus del herpes). Para esto se practica un
agujero en la cáscara de huevos embrionados de 7 a 14 días de incubación y se
inyecta el inóculo en el líquido que baña la membrana que se desea infectar. El
desarrollo del virus se manifiesta por la muerte del embrión (virus de la parotiditis
y del herpes) o la producción de hemaglutininas (ortomixovirus). También pueden
inocularse directamente en la membrana corioalantoidea y detectarse su desarrollo
por la aparición de lesiones características, como ocurre en los poxvirus y
herpesvirus. En la actualidad, el empleo de huevos embrionados ha quedado
limitado al cultivo de los poxvirus y sobretodo del virus de la gripe (ortomixovirus),
tanto para su aislamiento como para la producción de vacunas.

4.3 Cultivos tisulares

       Aunque los cultivos de tejidos o de células se conocen desde hace tiempo, no
han podido utilizarse de manera sistemática para el desarrollo de los virus, hasta el
descubrimiento de los antibióticos que han permitido evitar las contaminaciones
bacterianas.
       Las células pueden cultivarse a partir de fragmentos de tejidos (cultivos
tisulares), de células aisladas o disociadas (cultivos celulares) o de cortes de
órganos que conservan su arquitectura (cultivos de órganos). En la actualidad, los
cultivos celulares constituyen el método de elección para el desarrollo de la



                                          13
mayoría de virus, y se utilizan los cultivos de órganos para el aislamiento de virus
de difícil desarrollo o en casos especiales.

       4.3.1 Cultivos celulares

       El descubrimiento efectuado por Enders de que los virus eran capaces de
desarrollarse en cultivos de células aisladas o disociadas ha constituido el método
fundamental para el desarrollo de los virus.
       Los cultivos de células aisladas en medios artificiales son muy inestables, de
manera que los cultivos primarios de células animales, al cabo de pocos pases o
cultivos secundarios, mueren. En ocasiones pueden seleccionarse células, que
conservan su morfología, carácter diploide, y mantienen su capacidad de
crecimiento, lo que permite obtener una cepa de células diploides, que al cabo de un
número limitado de pases puede morir o dar lugar a algunas células muy alteradas
en cuanto a morfología y dotación genética, que presentan la propiedad de crecer
más rápidamente de manera continua y regular; son las líneas celulares. Estos tres
tipos de cultivos celulares son los más utilizados en virología.

       A – Cultivos celulares primarios

        Consisten en el cultivo de células aisladas procedentes de tejidos normales.
Si se tratan tejidos u órganos del hombre o del animal con tripsina, las células del
tejido se separan o disgregan obteniéndose suspensiones de células aisladas, que,
una vez lavadas y contadas, se pueden sembrar en tubos o matraces que contengan
un medio de cultivo adecuado. Las células sedimentan, se adhieren al vidrio y se
multiplican (alrededor de una división diaria) formando islotes de crecimiento que
se extienden progresivamente hasta que entran en contacto, momento en el que se
inhibe su crecimiento (fenómeno de inhibición por contacto), formando una capa
monocelular en la pared del tubo o matraz, que constituye el sustrato sobre el que
se desarrollarán los virus. Los cultivos se mantienen cambiando el medio dos o tres
veces por semana y, cuando están muy desarrollados, se añade al cultivo tripsina,
obteniéndose células aisladas, lo que permite iniciar un nuevo pase (cultivos
secundarios). Los cultivos de células de riñón de mono y de diversas células
embrionarias (fibroblastos de embrión de pollo, células renales de embrión humano
y células amnióticas humanas) son los más empleados.
        Es el método más costoso, pero las células presentan un amplio espectro de
sensibilidad.

       B – Cultivos de células diploides

       Se observó que el cultivo de tejidos embrionarios humanos permitía
seleccionar en algunos casos cepas de fibroblastos que podían multiplicarse
durante 50-100 pases, sin perder su carácter diploide, es decir, conservando su
cariotipo normal. Su sensibilidad a los virus es mayor que la de las células
adaptadas (cepas WI-38 y MRC-5).



                                           14
Presentan la ventaja de no llevar virus latentes, como las células primarias
de origen animal, ni estar infectadas por micoplasmas. Se emplean para el
aislamiento de los virus de la varicela, rinovirus, citomegalovirus, etc.

       C – Líneas celulares

        En el curso del tiempo se ha conseguido adaptar células al cultivo indefinido
in vitro, de manera que se pueden pasar de tubo a tubo de cultivo, sin tener que
recurrir al tejido u órgano del que proceden. Las células adaptadas han
experimentado una mutación en virtud de la cual presentan caracteres semejantes,
cualquiera que sea su procedencia.
        Son de aspecto epitelial, su dotación de cromosomas es variable (aneploide)
y su sensibilidad a los virus está muy limitada (poliovirus, virus Coxsackiea B,
adenovirus, virus respiratorio sincitial, de la rubéola y del herpes).
        En la actualidad existen numerosas líneas de células adaptadas que pueden
proceder de células neoplásicas derivadas de carcinomas humanos (cepas Hela*,
KB, HEp-2) o normales, como las líneas de células renales de mono (Vero, LLC-
MK2), hámster (BHK-21) y conejo (RK-13).

       4.3.2 Cultivos de órganos

        Recientemente para el aislamiento de algunos virus de difícil cultivo se han
utilizado cultivos de órganos. Son cortes de órganos embrionarios, que en un medio
adecuado pueden mantener su estructura y funciones durante un corto período de
tiempo. Se han empleado cultivos de tráquea embrionaria para el aislamiento de
coronavirus y otros virus respiratorios y de intestino embrionario para los
coronavirus intestinales y algunos rotavirus.

Factores a tener en cuenta en la conservación de medios de cultivo celulares:
        Los medios de cultivo celulares una vez preparados deben conservarse
congelados. La actividad celular puede ser mantenida a temperaturas de -70ºC
durante meses, y a -196ºC (con nitrógeno líquido) durante años.
        Estos productos deben ser fraccionados en partes alícuotas adecuadas, en
tubos de plástico estériles, debidamente identificados con la fecha, número de
lote y producto de que se trate.
        Las sucesivas congelaciones y descongelaciones de éstos van en detrimento
del medio, y la manipulación excesiva aumenta el riesgo de contaminación.
        Antes de ser congelados se les suele añadir un agente crioprotector como
glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO). Reducen la pérdida de electrolitos
intracelulares, y reducen la cantidad de agua disponible para la formación de
cristales de hielo, con lo que protegen las células durante la congelación y
descongelación.
        Se recomienda una congelación lenta de la suspensión celular. Descender la
temperatura de 1-3ºC por minuto, esto se logra introduciendo los viales a congelar
en un envase de poliestireno, rellenándolo con algodón.



                                         15
La descongelación debe ser rápida para evitar el daño celular.
       A estos medios de cultivo se les deben de añadir una serie de componentes
sólo antes de ser utilizados.

5- MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN

      Después de que las muestras son inoculadas en el cultivo celular apropiado,
se incuban a 35-37ºC. La multiplicación del virus en estos cultivos puede
reconocerse por manifestaciones diversas:

   1) Por su efecto citopático (ECP)

   Los virus pueden producir diversas alteraciones de las células y del cultivo
monocelular, que muchas veces son características. A nivel celular se pueden
observar:
   - Alteraciones nucleares (adenovirus, herpesvirus)

   -   Alteraciones citoplásmicas (picornavirus, poxvirus)

   -   Alteraciones de la envoltura, con fusión de las células vecinas, formación de
       sincitios o policariocitos (virus respiratorio sincitial y del sarampión)

   -   Aparición de cuerpos de inclusión, que pueden acompañar o no las
       alteraciones anteriores.

    En la capa monocelular se observa que las células alteradas se redondean y
retraen, pueden llegar a despegarse del vidrio del tubo o matraz, y su distribución
puede ser difusa o en focos aislados. La observación de estas lesiones puede
efectuarse ya en fresco en el propio tubo o matraz de cultivo celular o en
preparaciones teñidas, proporcionando datos de interés para la identificación del
virus.
    El virus del Herpes simple es uno de los más frecuentemente aislados en los
laboratorios, y tras su inoculación se observa que:

   -   Alrededor del 60% de los cultivos presentan ECP dentro del primer día.

   -   Alrededor del 75-80% muestran ECP durante el segundo día.

   -   Alrededor del 91-98% muestran ECP durante el 5, 16 y 19 días.

   2) Por la aparición de hemaglutininas o de Ag fijadores de complemento.

   Estos sólo aparecerán en el medio, si éste ha sido infectado por un virus que
induce a la célula parasitada la formación de estos Ag.

   3) Hemadsorción.



                                          16
Es la fijación de los glóbulos rojos en la membrana de las células infectadas. Se
presenta con los virus hemaglutinantes y es debida a la presencia de la
hemaglutinina en la membrana de las células.

   4) Fenómeno de interferencia.

       Las células infectadas por un virus no citopático pueden presentar un
aspecto normal, pero no son sensibles a la súper infección por un virus que
produzca acción citopática; el primer virus bloquea el desarrollo del segundo e
interfiere en él.
       EJEMPLO: El virus de la rubéola infecta el riñón primario de mono verde
africano y se reproduce bien en él; sin embargo, no tiene lugar ECP ni
hemadsorción. La presencia del virus de la rubéola se demuestra mediante la
incubación de los cultivos de las células infectadas durante 7 ó más días, y
añadiendo a continuación otro virus “estimulante”, del que se sabe que infecta los
cultivos celulares y produce ECP. Si el virus estimulante no logra causar ECP, es
probable que esté presente el virus de la rubéola y que haya interferido en la
replicación del segundo virus (probablemente por la producción de interferón).

   5) Detección directa del virus por microscopía electrónica

   6) Inhibición metabólica

   Las células infectadas por el virus no son capaces de metabolizar un sustrato
de glucosa, esto se aprecia mediante la colocación de un indicador de pH como Rojo
Fenol y observando que no vira de color por la no acidificación del medio de cultivo.

   7) Métodos inmunológicos

   -Inmunofluorescencia directa e indirecta, detectando la presencia del virus o
sus Ag en las células mediante el empleo de un suero inmune marcado con
sustancias fluorescentes.

   -Métodos inmunoenzimáticos

   -Reacciones de fijación de complemento

    La identificación del virus aislado se realiza en dos etapas; en primer lugar, se
efectúa el diagnóstico provisional de familia o de grupo basándose en el cuadro
clínico del enfermo, el animal o el tipo de células, en que se ha desarrollado el virus
y la manifestación visible de su crecimiento (apartados 1 al 4 y 6). La identificación
final o el diagnóstico de certeza se efectúa por pruebas serológicas utilizando
como Ag el virus aislado.




                                          17
6- DIAGNÓSTICO

       Los métodos de diagnóstico de las infecciones producidas por virus pueden
dividirse en dos grandes grupos: métodos directos basados fundamentalmente en
el aislamiento del virus de los productos del enfermo y métodos indirectos
dirigidos a la demostración de un aumento del título de Ac en el curso de la
enfermedad. Como estos métodos suministran por lo general resultados tardíos,
han surgido técnicas de diagnóstico rápido, que se están desarrollando en la
actualidad.

   A) Métodos de aislamiento

    Constan de tres etapas: toma de muestras, inoculación e identificación del virus
aislado.

   B) Métodos serológicos

    Se basan en la demostración de un aumento del título de Ac durante el curso de
la enfermedad. Para interpretar debidamente los resultados de las reacciones
serológicas deben tenerse en cuenta las fechas del comienzo de la enfermedad y
de obtención del suero, así como el intervalo entre los dos sueros.
    También se puede efectuar el diagnóstico de presunción de infección reciente
con una sola muestra de suero determinando los Ac ligados a las IgM, que son los
que aparecen primero en la infección y desaparecen rápidamente. Se utiliza
especialmente en el diagnóstico de las infecciones congénitas (rubéola,
citomegalovirus), pues, como las IgM maternas no atraviesan la placenta, su
hallazgo en la sangre del cordón es significativa de infección reciente.

   Las reacciones serológicas más empleadas en virología clínica son:

   1) Reacción de neutralización (búsqueda de Ac neutralizantes)

   2) Reacción de fijación de complemento (busco Ac fijadores de complemento)

   3) Reacción de inhibición de la hemoaglutinación. Algunos virus presentan la
       propiedad de aglutinar los hematíes de diversas especies de animales,
       propiedad que puede ser inhibida específicamente por los Ac existentes en
       el suero de los enfermos.

   4) Otras técnicas: Inmunodifusion (ID) y Contrainmunoelectroforesis (CIE)




                                        18
C) Métodos de diagnostico rápido

      Recientemente se han desarrollado métodos de diagnostico mas rápidos, que
permiten obtener el resultado en el mismo día de la obtención de la muestra.

   1. Microscopia electrónica. Observación directa de la morfología del virion
        mediante examen de la muestra al microscopio electrónico por el método
        de tinción negativa.

   2. Inmunofluorescencia (IF). Se empieza a utilizar el diagnostico rápido de la
        virosis. Pero que exige un equipo costoso y personal especializado. Se utiliza
        en centros especializados.

   3. Inmunoanalisis:
         − Radioinmunoanalisis (RIA)
         − Enzimoinmunoanalisis (EIA) y en especial ELISA.

        Ambas técnicas se están utilizando en el diagnostico de las virosis, para la
        detección tanto de Ag. Como de Ac (IgG e IgM).

   4.   Inmunocromatografia.

   5. PCR o sonda genética.



7. PRINCIPALES VIRUS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS



     A) VIRUS SIMPLE (VHS)

       Como todos los miembros de la familia Herpesviridae. Producen infecciones
latentes, capaces de reactivarse, con o sin lesiones que sirven de fuente de
infección para individuos susceptibles. Existen dos tipos: VHS-1 y VHS-2,
presentando el primero mayor tropismo por lesiones por encima de la cintura,
encefalitis, infecciones oculares y en algunos casos infección diseminada. Esta muy
distribuido por todo el mundo y la infección suele ser bastante leve. El VHS-2 se
encuentra principalmente en los genitales, trasmitiéndose por vía venérea y
produciendo mayor parte de las infecciones generalizadas en el neonato.

        El diagnostico se puede realizar con tinción de Wright o Giemsa de células
raspadas de lesiones herpéticas, para observar las características células gigantes
multinucleadas. También se puede cultivar. Los métodos serologicos son de escasa
utilidad.




                                          19
B) VIRUS VARICELA-ZOSTER (VVZ)

        Pertenece a la familia Herpesviridae.
        La varicela y el herpes zoster representan diferentes manifestaciones
clínicas de un mismo virus, el VVZ. La varicela es mas frecuente en niños y se
caracteriza por fiebre y exantema vesicular diseminado. Constituye la infección
primaria y muestra una prevalencia estacional (fin del invierno – primavera). La
reactivación producirá el herpes zoster, que aparecerá normalmente en adultos y
sin distribución estacional, consistiendo en una inflamación de las raíces dorsales
de los nervios raquídeos o de los ganglios sensitivos craneales. Frecuentemente
aparece cuando hay una disminución de la inmunidad.
        El diagnostico de la infección por este virus suele ser de tipo clínico, pero
en ocasiones puede ser importante la confirmación por el laboratorio
(inmunodeprimidos, gestación) existiendo distintos métodos:
            − Serologia: Elisa
            − Cultivo celular.



     B) VIRUS DEL EPSTEIN BARR (VEB)

      Pertenece a al familia Hervesviridae.
      Es uno de los virus humanos mas ubicuos, cuya infección primaria es posible en
la primera infancia, aumentando su seroprevalencia hasta el 60-70% en jóvenes y
alcanzando el 80-90% en adultos. El síndrome clínico mas frecuente es la
mononucleosis infecciosa, que puede presentarse con fiebre, adenopatías,
faringitis, y linfocitosis con linfocitos atípicos, siendo característica de adultos
jóvenes. El VEB también se ha asociado a carcinoma nasofaringeo y al linfoma de
Burkitt.
      En cuanto al diagnostico de este virus, aunque existen algunas líneas celulares
susceptibles de ser infectadas, lo mas utilizado es la serologia. La prueba mas
habitual es la de Paul Bunnell o detección de Ac heterofilos, ya que es muy sencilla
y presenta una buena sensibilidad. También se pueden utilizar métodos de ELISA e
inmunofluorescencia, para al detección de marcadores específicos del virus como el
Ag de capside (VCA), Ag precoz (EA) o Ag nuclear (EBNA)



     C) VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB)

       Pertenece a la nueva familia Hepadnaviridae. Con gran importancia socio-
sanitaria y de distribución mundial. Se calcula que en el mundo hay unos 350
millones de portadores del virus, de los que unos 350.000 desarrollaran cirrosis
hepática o carcinoma hepatocelular, que son las complicaciones mas importantes
que puede causar.




                                         20
4.1 Estructura antigénica

       Se distinguen una serie de estructuras del virus que dan lugar a los
marcadores serologicos. En primer lugar, el Ag de superficie del virus HbsAg o
antigeno Australia, que es un marcador de infecciosidad y esta codificado por el
gen S. Su correspondiente anticuerpo HbsAc o anti-Hbs confiere inmunidad. A
continuación, esta el antigeno del core o nucelocapside, HbcAg, codificado por el
gen C y que no se detecta libremente en sangre, pero si su correspondiente
anticuerpo, llamado HbcAc y que es un buen marcados epidemiológico ya que suele
mantenerse de por vida. Además si se determina la IgM frente al core (IGM-
HbcAc), se obtiene el marcador mas fiable de hepatitis B aguda. Por ultimo, se
encuentra el antigeno soluble, el HbeAg y su correspondiente anticuerpo, HbeAc
que se va a utilizar como marcadores de pronostico de la enfermedad pues se
correlacionan con el nivel de replicación del virus. Además, en el virus
distinguiremos su genoma (ADN) y una polimerasa.
       El virion completo recibe el nombre de partícula de Dane, ya que existen
formas incompletas en sangre (HbsAg).

4.2    Infección por VHB

       La mayor parte de las infecciones son subclínicas y únicamente se detectan
en controles serologicos. Asimismo, la mayor parte de las infecciones sintomáticas
son autolimitadas y se resuelven en menos de 6 meses. En cuanto a la lesión
hepática puede ser nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (0,25%). La
sintomatología clínica es similar a la hepatitis A, con fiebre, mialgias, fatiga,
ictericia, anorexia, dolor de cabeza, o dolor en epigastrio acompañado de una
aumento de las transaminasas y hepatomegalia. El periodo de incubación es de 60
-110 días y puede haber erupción maculopapular y urticaria.
Entre el 5-10% de las infecciones se hacen persistentes y pueden mantenerse de
por vida. En la mayor parte de las ocasiones, la función hepática y la histología se
mantienen normales, siendo por tanto un portador asintomático, pero en otras
ocasiones dan lugar a síndromes designados como hepatitis crónica persistente
(HCP) y hepatitis crónica activa (HCA). La HCP es menos progresiva que la HCA,
que puede ser mas grave y desembocar en cirrosis.
       En la evolución de la enfermedad, la respuesta inmunitaria juega un papel
importante.

4.3    Epidemiología

      La hepatitis B esta ampliamente distribuida por todo el mundo, pero existen
áreas hiperendemicas, de endemia media y baja. Nuestro país perteneces al
segundo grupo.
      El único reservorio importante en el hombre.




                                        21
Aunque la sangre y los productos sanguíneos son la fuente de infección
mejor documentada, también se han detectado HbsAg en heces, orina, bilis,
lagrimas, semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y
sangre de cordón. Pero solo se ha demostrado experimentalmente la transmisión
con sangre, saliva y semen. Siendo las vías mas importantes de la transmisión del
virus, la parenteral, y el contacto sexual. Esta claramente demostrado que el virus
difunde también mediante utensilios y materiales de hospitales de uso intimo, por
contacto con las musocas. De modo que el personal sanitario, los familiares de
portadores crónicos y otros grupos de riesgo corre un mayor riesgo de contraer la
infección.
        La llamada transmisión vertical, del VIHB tiene gran importancia, no solo
por la posibilidad de que se infecte el neonato, sino también por la gran frecuencia
de evolución hacia el estado de portador crónico.

4.4    Diagnostico

       Es necesario el diagnostico de laboratorio que es fundamentalmente
serologico. Además, el VHB requiere un control serologico posterior ya que, como
ya se ha expuesto, la persistencia de HbsAg durante 6 meses implica el estado de
portador crónico.
       En función de los Ag y Ac que se detecten, se puede especular sobre el
estadio de la infección. Ejemplo, si a partir de los 6 meses de la infección se
detectan niveles altos de HbsAg siendo indetectable el AntiHBs, persistiendo la
presencia de AntiHBc y detectándose el HbeAg, estas personas son
potencialmente infecciosas para otras, y puede evolucionar a una hepatitis crónica
persistente, o a hepatitis crónica activa, que puede progresar en cirrosis.
       De ahí la importancia ante un caso comprobado de hepatitis B, un control
serologico exhaustivo, para ver su pronostico individual, y la evolución de la
enfermedad.

4.5    Prevención

       La mejor medida para combatir las infecciones virales es la prevención,
sobre todo en el caso del VHB, por el riesgo que conlleva de cronicidad. Teniendo
en cuenta que es un virus muy contagioso.
       En la actualidad se dispone de medidas eficaces de inmunidad activa y
pasiva. En cuanto a la inmunización pasiva se cuenta con una gammaglobulina
hiperinmune eficaz en situaciones de pre y postexposicion, siendo este ultimo caso
el mas utilizado. La inmunización activa se realiza mediante la administración de
una vacuna, en principio obtenida de concentrados de plasma y actualmente
mediante ingeniería genética (obteniéndose el HbsAg de levaduras).
       La vacuna produce respuesta inmunitaria en un 90-95% de la población
normal, y en la actualidad se llevan a cabo programadas de vacunación en grupos de
riesgo: personal sanitario, familiares o personas que conviven con portadores
crónicos, pacientes en diálisis, hijos nacidos de madres HbsAg positivo.



                                         22
Actualmente ya se ha incluido esta vacuna en el calendario de vacunación infantil,
aplicando tres dosis, a los 0.1 y 7 meses. Los niños que no han entrado en este
nuevo calendario, se les aplica la vacuna a los 12 años.



B) VIRUS ARN

   1. VIRUS DEL RESFRIADO COMUN

        EL agente etiológico mas frecuente del resfriado común es un Rhinovirus
perteneciente a la familia Picornaviridae. Existen al menos 100 tipos diferentes y
rara vez es necesario el diagnostico del laboratorio, para lo que se puede utilizar el
cultivo, aunque son agentes que presentan dificultades en el mismo.

   2. VIRUS DE LA RUBÉOLA

       EL agente etiológico es un Rubivirus perteneciente a la familia Togaviridae.
En 1940 en una epidemia de rubéola en Australia de el considero el responsable de
muchas malformaciones congénitas, con elevado numero de cataratas congénitas y
cegueras.
       La infección en niños o adultos suele ser benigna y autolimitada. Se
caracteriza por síntomas respiratorios superiores leves, erupción eritematosa y
linfadenopatia. En adultos jóvenes se puede complicar con artritis transitoria o
artralgias. Rara vez produce encefalitis         o púrpura trombocitopenica. Muy
importante en la infección de gestantes, sobre todo en el primer trimestre, ya que
conduce a la aparición de sordera neurosensitiva, alteraciones cardiacas,
cataratas, retraso del crecimiento y síntomas encefaliticos. La incubación dura de
14 a 21 días.
        Los métodos serologicos se utilizan para saber el estado inmunitario (IgG)
sobre todo en la gestación, ya que en un resultado positivo indica inmunización
frente al virus. También son validos para la detección de infección aguda (IgM), y
es el método a utilizar como diagnostico aunque el virus sea cultivable. Se utilizan
distintas técnicas, siendo muy utilizado el ELISA.
       Actualmente, es poco frecuente la rubéola congénita, debido a que la vacuna
de la rubéola es obligatoria, y se incluye en la triple vírica (paperas, sarampión y
rubéola), que se administra a los 15 meses y a los 11 años a todos los niños.

   3. VIRUS DE LA GRIPE

       El agente etiológico es un Inluenzavirus perteneciente a la familia
Orthomyxoviridae.
       La gripe es una infección respiratoria aguda que suele ser epidémica con
distribución estacional (noviembre a abril). La vía de transmisión es aérea, con un
periodo de incubación de 1-4 días seguido de un espectro variable                de
manifestaciones clínicas respiratorias, que puede ser grave en los ancianos.



                                         23
Además tiene gran importancia socioeconómica por la perdida de horas de trabajo
que produce. Se realizan campañas de vacunación todos los años, ya que estos virus
presentan gran variabilidad antigénica que implica que la vacuna sea activa frente
al serotipo que esta causando la epidemia. En la actualidad se dirige a ancianos o
pacientes con enfermedades broncopulmonares.
        Hay tres tipos; A, B, C, siendo los dos primeros los que causan epidemias de
importancia. Los virus influenza A se subdividen según la diferente composición
antigénica de la hemaglutinina y neuraminidasa. La nomenclatura que aconseja la
OMS comprende el tipo, el origen geográfico, el numero de cepa, el año de
aislamiento y los subtipos de hemaglutinina y neuaminidasa. Así el virus que produjo
la epidemia de 1987 s denomina S/Shangai/11/87 (H3N2).
        El diagnostico de estas infecciones suele ser de tipo clínico, estando
reservando el diagnostico de laboratorio para casos especiales o centros de
referencia, e incluye el cultivo del virus y los métodos serologicos (EIA, inhibición
de la hemoaglutinación). Para el diagnostico rápido del virus influenza se puede
utilizar la inmunofluorescencia directa en aspirados nasofaringeos, esputos o
biopsias de pulmón.

   4. VIRUS DEL SARAMPIÓN

       El agente etiológico es un Morbillivirus perteneciente a la familia
Paramyxoviridae.
       El sarampión es una enfermedad aguda, febril, exantematica, de gravedad
variable. Los rasgos característicos de sus síntomas clínicos hace posible su
diagnostico en la mayor parte de los casos sin ayuda del laboratorio. Son
patognomónicas las manchas de KopliK. Las complicaciones mas graves son
encefalitis y neumonía.
       En la actualidad han disminuido mucho los casos de sarampión, aunque sigue
habiendo brotes debido a la introducción en el calendario de vacunación oficial de
la vacuna triple vírica (paperas, rubéola y sarampión) a los 15 meses de edad y a los
11 años. En casos excepcionales se puede diagnosticar preferentemente por
métodos serologicos debido a la complejidad técnica del cultivo..

   5. VIRUS DE LA PAROTIDA O PAPERAS

       El agente etiológico es un Paramyxovirus perteneciente a la familia
Paramyxoriviridae. Las paperas son una enfermedad contagiosa aguda con fiebre
moderada de corta duración y cuyo rasgo clínico mas común es la parotiditis uni o
bilateral. Por ser tan característica la confirmación de laboratorio generalmente
es innecesaria..
       El periodo de incubación suele ser de 18 a 21 días, transmitiéndose por vía
respiratoria. El virus se excreta en saliva y orina, desde 6 días antes hasta 9
después de la inflamación de las parotidas. Entre un 25-50% de los casos pueden
ser asintomático.




                                         24
En la actualidad es de vacunación obligatoria (triple vírica), produciendo
inmunidad a largo plazo. Como complicaciones destacan las que afectan al testículo,
ovarios y SNC, y menos habitualmente al páncreas, nervios periférico, ojo y oído
interno. Para su diagnóstico se dispone de métodos serologicos (actualmente se
prefiere la detección de IgM), aunque el virus también es cultivable.

   6. VIRUS DE LA RABIA

       El agente etiológico es un Lyssavirus perteneciente a la familia
Rhabdoviridae. Enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran importancia
histórica por los trabajos de Pasteur. En nuestro país actualmente hay muy pocos
casos, pero en todo el mundo aun esta lejos de ser erradicada. De hecho, existe la
obligación de vacunar todos los perros y garos. Se puede decir que la rabia es una
zoonosis.
       El virus esta presente a menudo en la saliva de animales rabiosos,
transmitiéndose por mordeduras. Las fuentes mas comunes de infección humana
son los perros, los gatos, los zorros, los coyotes y los murciélagos.
El diagnóstico solía realizarse postmorten, mediante la observación de los cuerpos
de Negri en el asta de Ammon (hipocampo). También se puede practicar la
inoculación a ratones o métodos serologicos, pero estas técnicas están reservadas
para laboratorios muy especializados. Es importante realizarlo ante una sospecha,
ya que es una enfermedad habitualmente mortal. El diagnostico se tratara de
realizar en el animal que ha mordido al hombre.

   7. VIRUS DEL SIDA (VIH)

       Es un virus ARN de la familia Retroviridae y subfamilia Lentiviridae. La
simetría de su cápsula es icosaedrica y su forma esférica. Se caracteriza por
sintetizar ADN a partir de ARN viral, a partir del enzima trascriptasa inversa.

Estructura y tipos

Consta de nucleocapside y envoltura. Sus principales genes son:

A. Estructurales

                  Gen                            Proteínas y Glucoproteinas
              GAG (Core)                               p7, p9, p17, p24
            ENV (Envoltura)                        Gp120, gp41, gp12, gp36
            POL (Polimerasa)                          P11, p13, p34, p51



B. Reguladores: Genes TAT, REV, NEF, VIF, VPT, VPU, VPX. Regulan la replicación
viral y el papel de todos ellos no esta completamente dilucidado.




                                        25
En la actualidad se conocen dos tipos: el VIH-1 y el VIH-2. Se diferencian
en que algunas de las proteínas que codifica su gen ENV son de distinto peso
molecular; así pues mientras que el VIH-1 la proteína de superficie es la gp 120 y la
de la transmembrana es la gp41, en el VIH-2 los son respectivamente la gp 125, y
la gp36.
    Además el VIH-1 es el responsable de la inmensa mayoría de casos de SIDA. El
VIH-2 presenta una virulencia inferior con mayor periodo de latencia y menos
proporción de desarrollo de SIDA.



Patogenia

        El VIH penetra en el organismo a través de líquidos corporales,
fundamentalmente sangre y semen, procedentes de individuos previamente
infectados.
Una vez en la sangre, el VIH entra en contacto con las células que contienen en su
membrana CD4 que funcionan como una especie de receptor. La glucoprotéina
gp120 de la envuelta del VIH se fija a la molécula CD4,iniciándose una fusión entre
la envoltura del VIH y la membrana celular permitiendo la penetración del VIH en
el citoplasma celular.
        Una vez dentro de la célula, la nucleocápside del virus se rompe y deja libre
el RNA y la transcriptasa inversa, tras lo cual se pone en marcha la síntesis de
DNA a partir del RNA vírico.
        A continuación, el DNA sintetizado se integra en el DNA celular,
formándose un provirus. En este proceso intervienen 2 tipos de enzimas víricas:
una endonucleasa que corta el DNA celular y unas ligasas que unen las 2 clases de
DNA.
        Como los linfocitos Th son CD4 ,son una de las células más importantes que
ataca al VIH. Los linfocitos Th infectados pueden permanecer en este estado
latente durante largos períodos de tiempo. Pero el provirus puede activarse debido
a distintos estímulos como, por ejemplo, la existencia de otra infección
concomitante. Al activarse el DNA provírico induce la síntesis del RNA viral y de
RNA mensajeros que van a inducir, a su vez, la síntesis de proteínas víricas.
Formándose, de esta manera, nuevas partículas virales.
        Las nuevas partículas virales salen de la célula, mediante gemación, y se
dirigen a atacar nuevos linfocitos Th.



Evolución de la enfermedad

       La evolución del SIDA evoluciona en tres fases: infección aguda, infección
asintomático e infección sintomática tardía.




                                         26
1) Infección aguda.

       Tras la entrada del VIH en el organismo se observa un período ventana en el
que sólo se puede determinar la presencia del virus mediante técnicas muy
complejas, como su aislamiento por cultivo, la detección de Ag p24 y la búsqueda de
DNA provírico mediante la prueba de PCR. El período ventana dura semanas o
meses(normalmente 3 meses)y puede acompañarse de unas manifestaciones clínicas
que reciben el nombre de enfermedad de la seroconversión. El fin del período
ventana coincide con el ascenso y, por lo tanto, con la detección en el suero de Ac
contra diferente proteínas víricas(seropositividad).Simultáneamente a esto último,
se verifica un descenso de la antigenicidad y de la viremia hasta hacerse
indetectables.

2) Infección asintomático o período de latencia.

       Tras la infección aguda comienza esta fase, que puede durar varios años y
en la que lo Ac de tipo IgG dirigidos contra las diferentes proteínas víricas se
mantienen en unos niveles detectables.



3) Fase sintomático tardía

        El descenso de los Ac dirigidos contra las proteínas codificadas por el gen
GAG(Ac anti GAG) y la detección, de nuevo, del Ag p24 son indicadores de una
reactivación de la infección y, por tanto, de su paso a una fase sintomático tardía.

Analíticamente, en el SIDA también se observa:

-una linfopenia (por descenso de linfocitos CD4)



                                      Linfocitos CD4
 -una disminución del cociente
                                 ---------------------------------------
                                          Linfocitos CD8

-un ascenso de la concentración de Ig en el suero.



Manifestaciones clínicas de la infección por VIH

         Clínicamente, la infección por VIH se clasifica en 4 grupos, del 1 al IV,
excluyentes entre sí, y que reflejan una progresión de la enfermedad, de tal forma
que un paciente una vez introducido en un grupo no puede ser clasificado
posteriormente en un grupo inferior.



                                          27
a)GRUPO I: corresponde a la enfermedad de la seroconversión y asemeja a un
cuadro gripal o mononucleósido(período ventana),pero puede ser asintomático.

b)GRUPO II: se relaciona con el período de latencia y, por tanto, en él hay una
ausencia de síntomas y signos clínicos.

c)GRUPO III: se caracteriza por la existencia de una linfadenopatía generalizada
persistente(PGL) que anatopatológicamente se observa como una hiperplasia
reactiva benigna de los ganglios linfáticos, pero es probable que evolucione hacia un
SIDA manifiesto.

d)GRUPO IV: incluye ya manifestaciones clínicas de SIDA y se divide, a su vez, en
5 subgrupos:

       -Subgrupo A: se denomina enfermedad constitucional y cursa con pérdida
de peso corporal, fiebre que persiste más de 1 mes, sudoración nocturna y diarrea
abundante que dura más de 1mes.

     -Subgrupo B: consiste en una enfermedad neurológica, debida a un ataque del
VIH a algunas células del Sistema Nervioso. Se manifiesta condemencia, mielopatía
y neuropatías periféricas.

    -Subgrupo C: comprende infecciones secundarias causadas, frecuentemente,
por microorganismos oportunistas como el causante de la Neumonía, Toxoplasma,
HSV, CMV, HERPES ZOSTER, infecciones recurrentes por Salmonella.

        -Subgrupo D: abarca cánceres secundarios, entre los cuales los más
relevantes son el Sarcoma de Kaposi y los linfomas no Hodgkinianos.

     -Subgrupo E: este subgrupo incluirá otras enfermedades. Es decir aquellos
estados patológicos que no pueden incluirse en ninguno de los subgrupos anteriores.

Se considera que un paciente tiene SIDA cuando:
- Es seropositivo
- El recuento de leucocitos Th es bajo
- Y sufre un cáncer secundario y/o una infección oportunista claramente
relacionados con una afectación por el VIH.



7-3) Epidemiología

        La OMS calcula que en el año 2000 los casos declarados de SIDA se
elevarían a 1400000, mientras que los casos reales estarían entre 8 a 10 millones,
siendo los portadores del virus de 25 a 30 millones.



                                         28
Vías de transmisión son:

-Sangre
-Mediante relaciones sexuales
-Transmisión vertical-perinatal

         En nuestro país cobra una especial importancia la transmisión por sangre,
ya que el principal grupo de afectados son los UDPV(usuarios de drogas por vía
parenteral), a diferencia de Francia o EEUU donde lo son los homosexuales.
En cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan entre 15-50%,cobrando una
especial importancia en África.
          La transmisión al personal sanitario se calcula entre un 0,2% y requiere
contacto con sangre, líquido corporal infeccioso o líquidos donde se haya cultivado
el virus. Esto hace que en la practica cotidiana se extremen las medidas de
precaución con estos pacientes ante la gravedad de la infección, considerando todo
líquido corporal de un enfermo de SIDA como potencialmente infecciosos.



7-4) Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH

         El diagnostico de la infección del SIDA en nuestro medio es
fundamentalmente serológico, cobrando especial importancia por las implicaciones
que conlleva.
        Existen diversos productos génicos del VIH que se consideran antígenos
principales para su utilización en las pruebas serológicas, estos incluyen las
proteínas y glucoproteínas codificadas por los genes GAG, ENV y POL. Estudiando
los niveles de Ag y Ac podremos diagnosticar y saber la evolución de la
enfermedad.
       Se realizan técnicas de ELISA en primera instancia, aplicando a los
positivos métodos de confirmación: Western Blot(VB),inmunofluorescencia(IFI)o
técnicas de radioinmunoprecipitación.
       Es el VB el más utilizado, ya que nos permite diferenciar los Ac frente a las
distintas proteínas del virus, apareciendo bandas inmunorreactivas en una tira de
nitrocelulosa. El VB tiene distintos criterios para la interpretación de los
resultados(la OMS y otras organizaciones)porque la presencia de distintas bandas
puede ser muy variable. De ahí que los resultados se clasifiquen en:

-POSITIVO: se observan reacciones al menos frente a un producto en cada una
de las 3 regiones génicas ENV, POL y GAG. Otras recomendaciones sugieren que
con observarse reacción en 2 regiones es suficiente.

-NEGATIVO: no se observan bandas reactivas en los lugares de los Ag víricos.




                                        29
-INDETERMINADO: se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna
proteína del virus. En este caso se recomienda una nueva prueba con un suero
recién extraído, y si todavía se cuestiona el resultado, se sugiere la repetición de
la prueba al cabo de 2 a 3 meses.

             Las causas de un WB indeterminado incluyen la infección en su etapa
inicial, una posible reacción cruzada con otros retrovirus, idiopatía, y pacientes con
Ac HLA, hiperbilirrubinemia, conectivopatías o gammpatopatías policlonales.
         Los métodos de ELISA son cada vez más sensibles y específicos, con
capacidad para detectar IgG e IgM, acortando el período ventana.
           También existen métodos rápidos, aplicables en situaciones de urgencia,
como son la aglutinación con partículas de látex y la aglutinación de los eritrocitos,
tienen una gran aplicación en casos de falta de recursos tecnológicos.
   Por último, están las técnicas de centros especializados: cultivo y PCR.
          El cultivo tiene la ventaja adicional de poder aplicar estudios de resistencia
a antivirales. La PCR es una técnica con mucho futuro que presenta una enorme
sensibilidad y especificidad, y aunque ya existen reactivos comercializados, aún no
están al alcance de la mayor parte de los laboratorios. Esta técnica permite la
amplificación enzimático automatizada del DNA provírico o del RNA vírico. Una
importante aplicación de estas técnicas es el diagnóstico de hijos de madres
portadoras del VIH, ya que en este caso la serología al nacer y el los primeros
meses de vida siempre es positiva por transferencia pasiva de Ac. Por lo tanto,
para saber si un niño está infectado, cosa que ocurre entre el 12-50%,se
necesitarán pruebas diagnósticas que detecten al virus.
              También existen una serie de marcadores del seguimiento de la
enfermedad, entre los que destaca el Ag p24,que se detecta en las fases precoces
y en las tardías. También en las fases tardías se puede observar la disminución de
los Ac anti p24.
          También se realiza el recuento de los linfocitos CD24, y el cociente
CD4/CD8

7-5)Prevención y tratamiento

       En la lucha contra el SIDA, la mejor medida es la PREVENCIÓN. Entre
ellas cabe destacar el uso de preservativos en las relaciones sexuales y el no
compartir la misma jeringuilla por parte de los toxicómanos intravenosos...
       Una vez instaurado el SIDA en el tratamiento de estos pacientes se
tendrán en cuenta las infecciones oportunistas y su profilaxis, su deterioro
inmunológico y una terapia específica antiviral.
         En el tratamiento antiviral cabe destacar la AZT(acidotimidina o
zidovudina) que, dificulta la trascripción inversa del RNA viral , pero no consigue
erradicar el virus, aunque prolonga y mejora las condiciones de vida. Muy
recientemente se han creado grandes expectativas con la multiterapia.
        La vacuna es muy difícil de obtener por la complejidad del virus aunque se
están haciendo pruebas en voluntarios.



                                          30
8)VIRUS DE LA HEPATITIS A, C, D y E

VIRUS DE LA HEPATITIS A

             Es un virus ARN, perteneciente a la familia Picornarividae, género
Entenovirus, denominándose en la nueva nomenclatura virológica Entenovirus 72. El
virus puede cultivarse en células de rión de titi, células de riñón de feto Macacus
rhesus(FRhK6),células humanas de hepatoma, fibroblastos embrionarios humanos y
células diploides humanas de pulmón. El crecimiento puede demostrarse por
inmunofluorescencia ya que el virus no es citotóxico.
       Conocido ya históricamente, pues hace más de 2000 años griegos y romanos
ya describieron epidemias de "ictericia infecciosa".Posteriormente se han descrito
muchas epidemias sobre todo en períodos guerra. Sería MacCallum, en 1947,el que
introduciría el término Hepatitis A, para distinguirla de la B o hepatitis
"sérica".Esta terminología sería aceptada por las OMS en 1973.Es de distribución
mundial e infecta a hombres y a primates.

Transmisión y acción patógena del VHA

         El VHA penetra por vía oral o parenteral, siendo la principal ruta de
diseminación la feca-oral, en la que están implicadas el agua y los alimentos. Como
en muchas enfermedades infecciosas, el problema reside en que la mayor
eliminación del virus en heces se da en la semanas previas a la aparición de la
ictericia, sobre todo en la fase tardía de la incubación. La excreción fecal puede
continuar durante 1-2 semanas después de la aparición de la ictericia. Aunque se da
casos durante todo el año, tiene una incidencia estacional con picos en los meses de
otoño.
          En un año porcentaje de casos da lugar a una infección subclínica o una
hepatitis anictérica y en el resto(alrededor del 10%)a un cuadro de hepatitis
aguda, de rápida evolución, buen pronóstico y muy raras complicaciones o tendencia
a la cronicidad .Existen casos, aunque raros, de hepatitis fulminante 0,1%.

       La hepatitis anictérica puede cursar sin síntomas alguno o con vagos
síntomas de "empacho" o "afección gripal".Sólo la demostración de alteraciones
enzimáticos (transaminasas)o el estudio de Ac específicos permiten el diagnóstico.
Estas formas confirman la difusión del virus, pues entre 75-100% de la población
adulta posee Ac anti VHA.

        La hepatitis aguda del VHA tiene un período de incubación de 10 a 50 días
y un comienzo brusco. Tras un período preictérico con anorexia, astenia, dolores
abdominales, fiebre de 37-38ºC, cefaleas, artralgias, etc,.,aparece la ictericia con
orinas colúricas y heces hipopigmentadas, persisten los síntomas gastrointestinales
y aparece hepatomegalia, acompañada o no de esplenomegalia. El cuadro evoluciona
favorablemente y son muy raras las complicaciones. No se ha descrito el estado de
portador crónico de la Hepatits A No requiere tratamiento.



                                        31
Diagnóstico

        Junto a los datos clínicos, el diagnóstico debe ser comprobado con datos de
laboratorio, que demuestren el daño o lesión hepática o bien presencia del virus o
la respuesta humoral a él.

-Test de lesión hepática: aparece hiperbilirrubinemia, con aumento de las
transaminasas(principalmente ALT), lactodeshidrogenasa y fosfatasa alcalina.
-Demostración del virus: puede realizarse en las heces por observación al
microscopio electrónico hasta 2-3 semanas después de la aparición de la ictericia o
por inmunofluorescencia directa en cortes de parénquima hepático obtenidos por
punción-biopsia, donde aparece en el citoplasma del hepatocito y de las células de
Kupffer.
-Búsqueda de Ac: es el método más idóneo, pero, como el porcentaje de
seropositivos es muy alto en la población sana, el diagnóstico de infeccion se
realiza por la demostración de altos títulos de IgM anti-VHA. Las técnicas mas
usadas son el radioinmunoensayo(RIA) y el ELISA con Ag obtenidos de titis
infectados o heces humanas, y se recomiendan dos tomas de suero separadas por
15-20 días.



Epidemiología

       Los virus eliminados por las heces de los enfermos(semanas o meses) y
presentes en la sangre(2 semanas antes y 2 semanas después de la ictericia)
constituyen fuentes de infección claras, pero la presencia de formas anictéricas y
asintomáticas explica la gran difusión del VHA. Al lado del bien conocido
mecanismo de transmisión feco-hidrícica(manos contaminadas, agua, leche,
diversos alimentos e incluso utensilios de cocina, termómetros, etc)puede ocurrir
una transmisión parenteral, ya que se considera que el 30% de todas las hepatitis
por esta vía se producen por virus A.
          La hepatitis A afecta sobre todo a niños adolescentes de 5 a 15 años, y
aparecen los brotes epidémicos(finales verano y otoño)en guarderías, colegios,
orfanatos ,etc. Se han descrito epidemias en medio rural y en campamentos
militares; los mayores brotes epidémicos se deben a origen hídrico o alimentario.
En otras zonas la hepatitis A es endémica, con brotes cada 5-10 años. Se han
descrito casos humanos, cuyo origen estaría en primates(personal de zoológicos)

Inmunidad

        La Hepatitis A es una infección inaparente en la mayoría de la población, y
se conservan títulos de Ac protectores durante muchos años. En nuestro medio,
estos títulos aparecen en casi el 100% de las personas de edad superior a 35 años.




                                        32
Profilaxis

        La profilaxis la podemos llevar a cabo en 2 niveles: en el mecanismo de
transmisión o específica con ganma-globulina.

          En el mecanismo de transmisión se realiza mediante una correcta
desinfección, higiene individual, cloración de agua, higienización de la leche ,mejora
del saneamiento general, etc. El virus es relativamente resistente a la inacivacion
por calor a 60ºC durante y 1hora,al éter y a los ácidos, pero se destruye por
formalina a una concentración de 1/4000 a 37ºC durante 72h, y por cloro(1mg/l
durante 30 min.)
       La profilaxis con ganma-globulina debe administrarse, a ser posible, durante
el periodo de incubación o como mucho hasta 6 días después del comienzo de la
ictericia. Se dará en colectividades o familias en las que aparezcan un caso, en los
brotes que tengan un mismo origen(ej:hídrico) y en los visitantes de áreas
endémicas.
           Se encuentra en experimentación una vacuna formalizada con la cepa
CR3326(Costa Rica),cultivada en células FRhK6.



VIRUS DE LA HEPATITIS D o delta(VHD)

         Es un virus ARN incompleto que requiere HbsAg para su replicación. Es
decir, sólo se producirá infección por el agente delta en las personas que tengan
HbsAg en su sangre(hepatitis aguda o portadores crónicos),por lo que la
transmisión y prevención del VHB se puede extrapolar aquí, ya que si no hay
infección por VHB no lo hay por VHD.
        Suele aparecer en personas con múltiples exposiciones parenterales,
estando a la cabeza en nuestro país los ADVP(administración de drogas vía
parenteral).La prevalencia en nuestro país se ha evaluado en torno al 5-10%. Hay
zonas hiperendémicas en el mundo como la Amazona, África central o el sur de
Italia.

Tipos de infección

   El virus delta puede infectar de dos modos, que dependen del VHB:

1)Coinfección: se da la infeccion simultáneamente por ambos virus. El curso natural
de la infeccion por VHB no se modifica, ya que la tasa de portadores crónicos que
se obtiene es similar a la que se da cuando se infecta él sólo. Clínicamente es más
grave y la hepatitis fulminante es mayor.
2)Sobreinfección: cuando sobreinfecta el agente delta a portadores crónicos del
VHB. La mayor parte de las sobre infecciones(70%) desembocan en hepatitis
crónica.




                                         33
Diagnóstico

       Se suele realizar por métodos serológicos detectando Ac frente al
virus(totales y del tipo IgM). Se debe sospechar en portadores crónicos de HbsAg
con hepatitis aguda o crónica especialmente si la enfermedad es grave o el
paciente ha tenido múltiples exposiciones parenterales.



VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC)

         Es el virus más recientemente caracterizado y del que quedan aún muchos
interrogantes por resolver. Desde hace años, ya se conocía una forma de hepatitis
aguda o crónica, seronegativa para el VHA y VHB, y sin ninguna otra causa que
justificara la lesión hepática. Era la llamada Hepatitis no-A, no-B, en la que la
búsqueda de agentes etiológicos había sido infructuosa. Pero en 1988 Houghhton y
cols, anunciaron la identificación y clonación del genoma viral de un agente
causante de la hepatitis no-A, no-B. Es el llamado VHC. En la actualidad se sabe que
es el responsable del 80-90% de los casos de hepatitis esporádica.

Infección

        La Hepatitis C es una forma de hepatitis "sérica", es decir que la
diseminación tiene lugar fundamentalmente por la vía parenteral. Es la causa más
frecuente de hepatitis postransfusional y está ampliamente distribuido entre
ADPV, pacientes en diálisis y hemofílicos. La tasa de Ac en la población normal en
nuestro país es muy inferior a la del VHB.
       La clínica es similar a la hepatitis B, pero con gran tendencia a la cronicidad
en torno al 50-70%.



Diagnóstico

        Está basado en métodos serológicos. El primer método desarrollado fue
ELISA utilizando como Ag proteínas no estructurales y proteínas del core. El modo
de obtener estos Ad es por:

-Ingeniería genética, clonándolos en E.Coli, levaduras
-Ag de péptidos sintéticos

       En muchas ocasiones, se utilizan los llamados métodos de "confirmación",
pudiéndose utilizar un Western Blot. Estos métodos son especialmente útiles
cuando la reactividad por el método ELISA no es excesivamente alta. Se está
introduciendo la técnica de la PCR para la detección del ARN viral(por tanto
detección del virus y NO de Ac)




                                         34
Se utilizarán las medidas universales de precaución. Es decir, que todo suero
o líquido corporal es potencialmente infeccioso. Cualquier paciente con sospecha de
hepatitis en cualquiera de sus formas, debe considerarse potencialmente de alto
riesgo infeccioso y ha de llevar a extremar las medidas de precaución.




VIRUS DE LA HEPATITIS E          (VHE)

       La hepatitis C no explica todas las formas de hepatitis víricas no-A, no-B, y
especialmente algunas formas de transmisión fecal-oral descritas en la India,
Pakistán, África del Norte y Méjico,, que causan epidemias de las cuales es
responsable el VHE. En 1983 se demostraría como agente causal de una caso de
hepatitis.
       No cronificada, al igual que el VHA, tiene un pronóstico peor que éste ya que
la mortalidad es 10 veces superior al VHA, La forma más grave aparece en
gestantes en el tercer trimestres del embarazo en las cuales aumenta la
mortalidad.
       El virus se manifiesta en países que tienen un sistema sanitario deficiente,
siendo lo más habitual la transmisión a través del agua de bebida.




                                         35

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  • 2. VIROLOGÍA 1- INTRODUCCIÓN 1.1 Características generales de los virus 1.2 Agentes infecciosos subvirales 1.3 Acción de los agentes físicos y químicos 2- CLASIFICACIÓN 3- TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS 4- MÉTODO DE CULTIVO 4.1 Animales de experimentación 4.2 Huevos embrionados 4.3 Cultivos tisulares 4.3.1 Cultivos celulares A- Cultivos celulares primarios B- Cultivos de células diploides C- Líneas celulares 4.3.2 Cultivos de órganos 5- MÉTODOS DE IDENTIFICACION 6- DIAGNÓSTICO 7- PRINCIPALES VIRUS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS HUMANOS A) VIRUS ADN 1) Virus Herpes Simple (VHS) 2) Virus varicela-Zoster (VVZ) 3) Virus de Epstein-Barr (VEB) 4) Virus de la Hepatitis B B) VIRUS ARN 1) Virus del resfriado común 2) Virus de la rubéola 3) Virus de la gripe 4) Virus del sarampión 5) Virus de la parotiditis 6) Virus de la rabia 7) Virus del SIDA 8) Virus de la hepatitis A, C, D, E 2
  • 3. 1- INTRODUCCIÓN La virología es la rama de la biología que estudia los virus. La virología es una ciencia joven dentro de la Microbiología, pues prácticamente su historia se remonta al siglo XX. En 1933 Stanley cristaliza el virus de mosaico del tabaco. Pero es a partir del descubrimiento del microscopio electrónico cuando se empiezan a estudiar los virus. Las características peculiares de los virus han generado una especialización dentro del laboratorio de microbiología. Los virus los podemos encontrar infectando y produciendo patología en todos los seres vivos: bacterias (bacteriófagos), plantas y animales. Los virus que afectan al hombre, se encuentran dentro de los agentes que producen con mayor frecuencia infecciones agudas, y en la actualidad se conocen mas de 500, pudiendo producir desde enfermedades banales como el resfriado común, hasta síndromes de extrema gravedad como el SIDA. 1.1Características generales de los virus Son agentes submicroscopicos, subcelulares y filtrables que consisten en un ácido nucleico envuelto por una cubierta proteica protectora (cápside), que puede a su vez estar rodeada de una membrana lipoproteína. El ácido nucleico de un virus es solo de un tipo, ADN o ARN, a excepción de los oncornavirus, que, además de su ARN, pueden contener pequeñas cantidades de ADN. No poseen mecanismos biosintéticos ni generadores de energía, por tanto, la replicación vírica requiere la participación activa de la célula huésped (son parásitos intracelulares obligados). La replicación es un mecanismo particular, en virtud del cual el ácido nucleico del virus orienta el metabolismo de la célula hacia la síntesis de sus propios componentes, que en una primera parte se forman por separado, y posteriormente se integran para formar la partícula completa del virus. El ácido nucleico suministra la información para programar en la célula la síntesis de sus componentes. Forman pues, un grupo de seres que se diferencian claramente de los demás microorganismos, tanto en su estructura como en sus características fisiológicas. El tamaño de las partículas víricas (viriones) se encuentra, en general, entre 20 y 300 nm. El único modo de visualizarlas es el microscopio electrónico. Morfología y estructura Los componentes estructurales de un virión son: a) Un núcleo central de ácido nucleico (nucleoide) b) Una cubierta proteica protectora (cápside) 3
  • 4. c) Una membrana externa lipoproteína (envuelta) que se encuentra solo en ciertos grupos víricos. El núcleo y la cápside se denominan nucleocápside, que puede estar desnuda o envuelta. La cápside es una estructura proteica compuesta por subunidades o capsómeros. Los capsómeros se acoplan por un proceso de auto agrupación y para ello las subunidades proteicas se ordenan siguiendo un plan simétrico. De esta forma pueden adquirir distintas formas geométricas, que nos sirven para clasificarlos en 4 grupos: 1) Virus con simetría icosaédrica 2) Virus con simetría helicoidal 3) Virus con simetría mixta o binaria 4) Virus de estructura compleja y simetría no bien definida 1- Virus con simetría icosaédrica. Un gran número de virus se parecen a pequeños cristales de morfología icosaédrica, posiblemente debido a que el icosaedro es el modelo mas eficaz para formar, a base de subunidades, una estructura compacta de la máxima fortaleza y capacidad, con la mayor economía de material genético. El ácido nucleico puede encontrarse aislado debajo del cápside o asociado a proteínas básicas. En este caso forma en la parte central del virión una estructura plegada y compacta. El nucleocápside, puede estar desnudo o envuelto por una envoltura de naturaleza lipoproteína que puede estar dotada de proyecciones o especulas de glicoproteinas. Asimismo, algunos virus desnudos como los adenovirus pueden presentar especulas o fibras en los vértices de la partícula. Ejemplos de virus icosaédricos son: fago OX174, parvovirus, papovirus, reovirus, herpesvirus y adenovirus entre otros. 2- Virus con simetría helicoidal El nucleocápside se representa como un tubo hueco formado por un filamento de ácido nucleico dispuesto en espiral en el centro. Las unidades químicas o de estructura están constituidas por numerosas moléculas de un mismo tipo de proteína (protómeros), que se unen formando una estructura en forma de cinta que se enrolla alrededor del ácido nucleico. 3- Virus con simetría mixta o binaria Algunos bacteriófagos presentan una simetría mixta, pues la cabeza tiene simetría cúbica y la cola, helicoidal. 4
  • 5. 4- Virus de estructura compleja y simétrica no bien definida En este caso, se encuentran los poxvirus, que presentan una estructura formada por una envoltura externa compuesta por subunidades proteicas de forma tubular, dispuestas irregularmente, que encierran una parte central en forma de lente bicóncava, que presenta a ambos lados dos formaciones ovoides o cuerpos laterales de naturaleza desconocida. La parte central contiene el ácido nucleico (ADN) asociado con propinas y no se conoce con certeza el tipo de simetría. 1.2Agentes infecciosos subvirales Además de los virus, se han demostrado que algunas enfermedades de las plantas, del hombre y de los animales pueden ser producidas por agentes filtrables de tamaño muy pequeño, que presentarían algunas propiedades diferentes de los virus. Los mas importantes son los tiroides y los virus convencionales son priones. Viroides Son pequeñas moléculas de ARN, que se encuentran plegadas y que presentan una estructura secundaria particular con apareamiento intracatenario parcial de las bases, que hace que existan regiones con ARN monocatenario alternado con otras de ARN bicatenario, simulando asas y estando totalmente desprovistas de cubierta proteica. Contienen información genética solo para su propia replicación. Hasta el presente solo de han demostrado en 11 enfermedades de las plantas, como el mosaico del crisantemo, la clorosis del pepino, el exocortis de los cítricos, etc. Priones Desde hace tiempo, se conocía la existencia de enfermedades crónicas y degenerativas del SNC de los animales y del hombre, como el scrapie o prurito lumbar de las ovejas, el kuru o ataxia degenerativa endémica y la enfermedad de Creutzdelt-Jakob (demencia presenil), que se podían transmitir a los animales por inoculación de cerebro de los enfermos y que se consideraba como virosis lentas, pero en las cuales no se había podido demostrar la presencia de virus. Se consiguió aislar de los enfermos unas glucoproteinas capaces de transmitir la enfermedad a ratones y hámster, a los que denomino “priones” por considerar que eran proteínas infecciosas de bajo peso molecular, no antigénicas, con una gran tendencia a la agregación y que al microscopio electrónico se observan como fibrillas de 20 x200 nm. Son resistentes alas sustancias y procedimientos 5
  • 6. que inactivan los virus (los rayos UV, calor, nucleasas, formol, glutaraldehido, oxido de etileno), pero se inactivan por una solución de NaOH 0,1 molar. No se conoce con certeza su mecanismo de replicación, pero se considera que por su pequeño tamaño no pueden contener la información genética necesaria para su síntesis, sino que ésta se encuentra codificada en el ácido nucleico de la célula huésped, que normalmente no se expresa, pero que la inyección o inoculación de priones producirían su desrrepresión y la producción de la enfermedad. Su resistencia a la inactivación y falta de antigenicidad ha hecho que se consideren como moléculas de proteínas muy pequeñas o muy protegidas por agregación de las unidades infecciosas, que podrían ser los primeros agentes infecciosos sin ácido nucleico, lo que aun no esta totalmente demostrado. 1.3Acción de los agentes físicos y químicos Los agentes que producen la inactivación de los virus actúan directamente sobre sus componentes, en especial sobre las proteínas, lípidos o ácido nucleico del virión. Agentes físicos Temperaturas de 56 a 65ºC mantenidas durante 1 hora inactivan la mayoría de virus, pues desnaturalizan las proteínas del cápside y de la membrana e inhiben la fijación y descapsidación del virión. Sin embargo, existen excepciones como los virus de la hepatitis B, los virus adenoasociados y los viriones resistentes a estas temperaturas. La esterilización por autoclave (30 min. A 120º) o por calor seco (1 hora a 160º) destruye todos los virus. En general los virus pueden conservarse: - A +4ºC (frigorífico ordinario) durante 1-2 días - A -30ºC (temperatura de congelación del congelador casero) durante algunos días, y los virus mas resistentes (enterovirus) durante largo tiempo. - A -70ºC (temperaturas de congelación de la nieve carbónica) durante largo tiempo. - A -196ºC (temperatura de congelación del nitrógeno liquido) durante años. Para evitar las perdidas de infectividad durante la conservación, se aconseja proceder a una congelación rápida de la suspensión vírica, en un medio que contenga sustancias protectoras, como proteínas (suero, caldo, leche) o, aun mejor, dimetilsulfóxido. Por otra parte se han observado que ciertas sales a concentraciones molares (MG, SO4Mg, SO4Na2) presentan una acción estabilizadora sobre algunas suspensiones de virus. La mayoría de los virus pueden conservarse por liofilización, es decir, por deshidratación en el vacío, a partir de la suspensión congeladora. Los virus que 6
  • 7. resisten la congelación pueden conservarse liofilizados durante mucho tiempo a temperatura ambiente y, prácticamente de forma indefinida a 4ºC. Las radiaciones, tanto los rayos ultravioleta como las radiaciones ionizantes (rayos X, radiaciones φ), inactivan los virus porque producen alteraciones en la cadena de nucleótidos (roturas, formación de dimeros). Los virus con ácido nucleico monocatenario son los mas sensibles. Desinfectantes u antisépticos Los virus con envoltura de naturaleza lipoprotéica (herpesvirus, ortomixovirus, arenavirus, paramixovirus, rabdovirus, etc.) se inactivan con facilidad por los disolventes de las grasas como el éter, cloroformo, desoxicolato sodico y detergentes aniónicos. Por otra parte la sensibilidad al desoxicolato sodico explica que dichos virus se inactivan por la bilis y por lo general no sean inefectivos por vía digestiva. Los virus desnudos son resistentes a la mayoría de desinfectantes que se emplean para las bacterias, pero, en cambio, son sensibles a la acción: a) De los agentes oxidantes (hipocloritos, yodoforos), que a concentraciones elevadas 1000 ppm, inactivan la mayoría de los virus, incluso los de la hepatitis. b) Formol, que, por no alterar las propiedades antigénicas, se emplea en la preparación de las vacunas. c) Glutaraldehido y ácidos, en especial al ácido clorhídrico diluido, aunque existen virus acidorresistentes como los enterovirus. En el momento actual no se conoce ningún desinfectante de la piel, o antiséptico, que sea eficaz sobre los virus. En la desinfección ambiental, hay que tener presente que la eficacia del cloro depende de la cantidad de materia orgánica, por esto, se aconseja aumentar la dosis de cloro en las estaciones de depuración de aguas potables y en la desinfección de productos patológicos que la contienen en abundancia (orina, heces, exudados) o sustituir el cloro por el formol o el ácido clorhídrico diluido. 1.4Interferón El interferón esta constituido por un grupo de proteínas sintetizadas por las células en respuesta a la acción de virus. Su propiedad mas importante es la de inhibir la replicación intracelular de los virus en las células, pero, además, se han demostrado otras propiedades biológicas sobre el huésped, como la acción inhibidora sobre el crecimiento de las células normales y malignas, y las acción estimulante sobre la fagocitosis y moduladora de la respuesta inmune. 7
  • 8. El interferón es un producto muy activo, pues la dosis para el hombre es solo de algunos microorganismos de proteína pura, lo que supone una actividad semejante a la de algunas hormonas. Presenta una acción inespecífica y de amplio espectro, pues inhibe el proceso de replicación de diversos virus no relacionados, virus ADN y ARN (inespecificidad vírica). Sin embargo, solo puede sintetizarse en células de la misma especia o especies relacionadas, de manera que el interferón activo para el hombre debe ser necesariamente producido en células humanas o de primates (especificidad celular) En el curso de la desinfección el interferón aparece precozmente, presenta su máxima acción en células y tejidos cercanos al lugar de producción, aunque no esta descartado que también puede actuar en órganos alejados y su acción se mantiene durante poco tiempo. Se supone que en circunstancias naturales interviene en la recuperación y restablecimiento de las infecciones víricas. Se ha empleado por vía tópica en el tratamiento de la queratitis herpetica, y por vía general en la profilaxis de algunas virosis respiratorias (adenovirus, resfriado común y gripe), para el tratamiento del herpes zoster, varicela, rabia y hepatitis B, y para prevenir las infecciones por citomegalovirus en transplantes renales o de bazo. 2. CLASIFICACION Durante mucho tiempo, los virus se han clasificado atendiendo al huésped que se desarrollan, sus tropismos tisulares, a su epidemiología o a los cuadros clínicos que producen, siempre muy diversos. Pero a medida que se ha progresado en el conocimiento de su estructura y composición química, se ha podido elaborar una clasificación más racional, basadas en sus propiedades físico-químicas, que el Comité Internacional de Taxonomía ha ido perfeccionando progresivamente. Según el huésped Atendiendo al huésped en que se desarrollan, se pueden establecer cuatro grandes grupos de virus (taxa) según afecten específicamente a los vertebrados , invertebrados, plantas o bacterias, y debe añadirse un quinto grupo para aquellos virus capaces de afectar a mas de una clase de huésped. Epidemiología Según la vía y mecanismo de transmisión se pueden dividir en: - Virus respiratorios: aquellos que ingresan y se desarrollan primariamente en las vías respiratorias. Comprenden los ortomixovirus, paramixovirus, coronavirus y rinovirus. 8
  • 9. - Virus entéricos: aquellos que ingresan y se desarrollan primariamente en el tubo digestivo. Comprenden los enterovirus, adenovirus, reovirus y virus de la hepatitis. - Arbovirus: virus que afectan a diversas especies de animales y también al hombre y se caracterizan en que en su transmisión intervienen diversos artrópodos hematófagos. Comprenden las familias de los togavirus, rabdovirus y el genero arbivirus de los reovirus. Clínica Se dividen según que produzcan infecciones generalizadas o localizadas, y, en este caso, según el órgano o sistema predominantemente afectados, como el SNC, aparato respiratorio, piel, mucosas, conjuntiva, hígado y glándulas salivares. Físico- química Esta clasificación se basa en las características del virión, ácido nucleico y proteínas del cápside: 1- En el virión se consideran su morfología y estructura, en especial la forma y tamaño, la presencia de envoltura, la simetría del cápside, el numero de capsómeros y el diámetro de la espiral de ribonucleoproteinas. 2- En el ácido nucleico, se tiene en cuenta el tipo de ac nucleico, peso molecular, continuo o segmentado…etc. 3- En las proteínas de la cápside se considera fundamentalmente se numero. La clasificación y nomenclatura de los virus que afectan al hombre, de acuerdo al Comité de Taxonomía de Virus (1982) 3- TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS 3-1 Toma de muestras Antes de la inoculación es necesario efectuar una serie de operaciones preliminares que son de importancia fundamental, pues de su correcta ejecución depende muchas veces el éxito del aislamiento. Se debe seleccionar la muestra que tenga mayores probabilidades de contener el virus (secreciones respiratorias, heces, LCR, orina, etc.) y obtenerlas en el momento oportuno, especialmente en los 9
  • 10. comienzos y fase aguda de la enfermedad (menos de 5 días), pues, mas adelantes con la aparición de AC es cada vez mas difícil. Además, suele ser aconsejable la obtención de 3 a 10 ml de sangre coagulada en la fase aguda de la enfermedad, separando el suero y conservándola (por lo menos a -20ºC) para posible referencia en las pruebas serológicas, si mas tarde se demuestra que puede ser de utilidad. Existen algunas reglas sencillas relacionadas con la recogida de las muestras. Para las gasas, torundas y otras muestras que pueden desecarse durante el transporte al laboratorio es necesario un medio de transporte de virus (MTV). Generalmente se utiliza solución fisiológica tamponada con proteína como estabilizador, a la que se añaden antibióticos, como penicilina o vancomicina, gentamicina y anfotericinaB, para eliminar el crecimiento bacteriano y fúngico. El caldo de infusión de ternera, 1% de albúmina sérica bovina y leche de vaca, ligeramente desnatada, constituyen alternativas utilizables. En la actualidad se dispone de diversos medios de transporte comerciales. La toma de muestra debe ser selectiva: Síndromes respiratorios El punto de recogida primario de las muestras son las vías respiratorias. Para la recogida de frotis faríngeos se utilizan torundas de algodón, rayón o dracon. Las muestras nasofaríngeas se obtienen insertando en la nasofaringe un escotillón flexible, dejándolo durante 1 minuto. Los métodos alternativos incluyen aspirados o lavados nasofaríngeos. También resultan para detectar citomegalovirus en pacientes inmunodeprimidos. Síndromes del sistema nervioso central En los pacientes con meningitis o encefalitis se deben obtener heces, muestras de la garganta y LCR. Si se sospecha la existencia de paperas, las muestras de orina también pueden tener valor. De 5 a 10 g de heces, recogidas en un frasco con tapón de rosca, se prefieren para el aislamiento de enterovirus, pero esto puede retrasar la iniciación del trabajo mientras se espera que el paciente defeque. Una alternativa útil consiste en la obtención de un frotis rectal, sumergido en MTV. En los enfermos en quienes se sospecha una encefalitis por herpes simple suele ser necesario hacer una biopsia cerebral para poder establecer un diagnostico cronológico y exacto. El LCR, de 1 a 3 ml, se recoge en un tubo estéril y se conserva sin otro procesamiento hasta su inoculación. Exantemas y enantemas 10
  • 11. Se deben obtener muestras por medio de torundas de la garganta o rectales; además, cualquier lesión ulcerada debe frotarse directamente con la torunda y ésta se coloca en MTV. Si están presentes lesiones vesiculares o ampollares, pueden ser aspiradas por medio de una jeringa de insulina o un tubo capilar, se coloca el contenido en MTV y a continuación se enjuaga el tubo o jeringa con MTV. También puede frotarse la base de la lesión y colocar la torunda en el mismo vial de MTV. Las pequeñas lesiones pueden liberarse cuidadosamente de su cubierta. Con frecuencia es útil conseguir muestras de varias lesiones y juntarlas en un solo vial de MTV para conseguir un aumento de los virus obtenidos. En caso de sospechar sarampión, parotiditis o rubéola deben recogerse muestras de orina. Síndromes oftalmológicos Las muestras de secreciones de la conjuntiva se recogerán con un hisopo estéril mojado con solución de Hanks o solución salina, frotando con éste la conjuntiva palpebral. Se debe hacer una toma por cada ojo de forma independiente, y se introduce en MTV. Los raspados cornéales y conjuntivales deben realizarse por un oftalmólogo. Otras muestras: -Orina Suele ser una buena fuente de cultivo para infecciones congénitas o adquiridas debidas a citomegalovirus, cistitis hemorrágica aguda asociada con adenovirus. En ocasiones los virus de la parotiditis también pueden detectarse en la orina hasta después de 2 semanas del inicio de la enfermedad. Las muestras obtenidas del chorro medio, 5 a 10ml, se prefieren y han de transportarse lo más pronto posible al laboratorio. Algunos laboratorios prefieren, en caso de que existe una espera de diversas horas ante de procesar la muestra, la alcalinización de la orina hasta pH de 7. -Líquido pleural, lavados traqueo bronquiales, líquido articular, etc Se recogen en recipientes estériles sin otro tratamiento antes del transporte. -Sangre En general no suelen llevarse a cabo hemocultivos para los virus, sin embargo, vale la pena considerarlo en algunas circunstancias como cuando se sospechan infecciones por citomegalovirus en pacientes inmunodeprimidos, en caso de fiebres hemorrágicas víricas, y en determinadas infecciones por arbovirus. Los resultados de estos cultivos es muy bajo. También se pueden realizar intentos de 11
  • 12. aislamiento en el suero o en material leucocitario de muestras de sangre heparinizadas o citratadas. -Material de biopsias Se colocará el tejido en un frasco estéril con cierre de rosca. En general de 1 a 3 gr. de tejido son suficientes. Si sólo se pueden conseguir piezas muy pequeñas del tejido, deben colocarse en un vial de MTV para evitar que se sequen. -Especimenes post-mortem. Se deben obtener con instrumentos estériles, a fin de prevenir contaminaciones, y tratarse del mismo modo que los tejidos de biopsias. -Semen Es una buena muestra para aislar Cytomegalovirus. Se introducen 1-2 ml en MTV. 3.2 Transporte de las muestras Cuanto más rápido se envíe una muestra al laboratorio, mayores serán las posibilidades de aislamiento de los agentes virales. No dejar nunca una muestra a temperatura ambiente o en la estufa de incubación. Si no se va a procesar inmediatamente, lo mejor es mantener las muestras refrigeradas aproximadamente entre 2 y 8ºC, pero no congeladas. La congelación sólo debe efectuarse si ha de existir un retraso de 1 día o más entre la recogida y el tratamiento de las muestras. El transporte al laboratorio de la muestra refrigerada, se puede realizar de distintos modos, que incluyen la utilización de cajas selladas de hielo en recipientes aislados, hielo en bolsas, o si las distancias que hay que recorrer son cortas, se colocarán los recipientes con las muestras en una caja con hielo triturado. Cuando la congelación no se puede evitar, se debe realizar una congelación instantánea de la muestra. Se pueden agregar citoprotectores como el sorbitol cuando es necesario congelar la muestra, pero aún así las condiciones de congelación y descongelación deben ser muy rígidas. Debemos de tener en cuenta que las muestras que tienen que remitirse por vía aérea o por correo deben estar marcadas adecuadamente como material infeccioso y embaladas correctamente de acuerdo con las normas vigentes. Las muestras transportadas localmente deben cerrarse cuidadosamente y colocarse en bolsas de plástico selladas. 4- MÉTODOS DE CULTIVO 12
  • 13. Los virus sólo se desarrollan en el interior de células vivas. Para su aislamiento y cultivo se han utilizado diversos procedimientos. 4.1 Animales de experimentación La inoculación de virus en los animales de experimentación puede producir una enfermedad con lesiones características. Es el método más antiguo para aislar y conservar los virus. Los poliovirus por inoculación intracerebral al mono pueden producir un cuadro paralítico y el virus de la gripe por instalación nasal al hurón, un cuadro febril benigno. Pero debido a su elevado costo, a la presencia de virus latentes y por presentar dichos animales una respuesta inmunitaria, los métodos de inoculación se emplean cada vez menos y quedan reducidos a la inoculación intracerebral de ratones adultos y lactantes para el aislamiento del virus de la rabia, togavirus y algunos virus Coxsackiea. Sin embargo, los animales se utilizan en investigaciones experimentales sobre virus oncogénicos, sobre la patogenia e inmunidad de las virosis y para la obtención de antisueros. 4.2 Huevos embrionados Presentan la ventaja de ser animales bacteriológicamente estériles, con escaso riesgo de virus latentes y sin producir respuesta inmunitaria. Los virus se pueden inocular en la cavidad alantoidea (virus de la gripe), y es posible obtener así el crecimiento en toda la membrana corioalantoidea, en la cavidad amniótica, o sea directamente en las vías respiratorias del embrión (virus de la gripe y de la parotiditis), o en el saco vitelino (virus del herpes). Para esto se practica un agujero en la cáscara de huevos embrionados de 7 a 14 días de incubación y se inyecta el inóculo en el líquido que baña la membrana que se desea infectar. El desarrollo del virus se manifiesta por la muerte del embrión (virus de la parotiditis y del herpes) o la producción de hemaglutininas (ortomixovirus). También pueden inocularse directamente en la membrana corioalantoidea y detectarse su desarrollo por la aparición de lesiones características, como ocurre en los poxvirus y herpesvirus. En la actualidad, el empleo de huevos embrionados ha quedado limitado al cultivo de los poxvirus y sobretodo del virus de la gripe (ortomixovirus), tanto para su aislamiento como para la producción de vacunas. 4.3 Cultivos tisulares Aunque los cultivos de tejidos o de células se conocen desde hace tiempo, no han podido utilizarse de manera sistemática para el desarrollo de los virus, hasta el descubrimiento de los antibióticos que han permitido evitar las contaminaciones bacterianas. Las células pueden cultivarse a partir de fragmentos de tejidos (cultivos tisulares), de células aisladas o disociadas (cultivos celulares) o de cortes de órganos que conservan su arquitectura (cultivos de órganos). En la actualidad, los cultivos celulares constituyen el método de elección para el desarrollo de la 13
  • 14. mayoría de virus, y se utilizan los cultivos de órganos para el aislamiento de virus de difícil desarrollo o en casos especiales. 4.3.1 Cultivos celulares El descubrimiento efectuado por Enders de que los virus eran capaces de desarrollarse en cultivos de células aisladas o disociadas ha constituido el método fundamental para el desarrollo de los virus. Los cultivos de células aisladas en medios artificiales son muy inestables, de manera que los cultivos primarios de células animales, al cabo de pocos pases o cultivos secundarios, mueren. En ocasiones pueden seleccionarse células, que conservan su morfología, carácter diploide, y mantienen su capacidad de crecimiento, lo que permite obtener una cepa de células diploides, que al cabo de un número limitado de pases puede morir o dar lugar a algunas células muy alteradas en cuanto a morfología y dotación genética, que presentan la propiedad de crecer más rápidamente de manera continua y regular; son las líneas celulares. Estos tres tipos de cultivos celulares son los más utilizados en virología. A – Cultivos celulares primarios Consisten en el cultivo de células aisladas procedentes de tejidos normales. Si se tratan tejidos u órganos del hombre o del animal con tripsina, las células del tejido se separan o disgregan obteniéndose suspensiones de células aisladas, que, una vez lavadas y contadas, se pueden sembrar en tubos o matraces que contengan un medio de cultivo adecuado. Las células sedimentan, se adhieren al vidrio y se multiplican (alrededor de una división diaria) formando islotes de crecimiento que se extienden progresivamente hasta que entran en contacto, momento en el que se inhibe su crecimiento (fenómeno de inhibición por contacto), formando una capa monocelular en la pared del tubo o matraz, que constituye el sustrato sobre el que se desarrollarán los virus. Los cultivos se mantienen cambiando el medio dos o tres veces por semana y, cuando están muy desarrollados, se añade al cultivo tripsina, obteniéndose células aisladas, lo que permite iniciar un nuevo pase (cultivos secundarios). Los cultivos de células de riñón de mono y de diversas células embrionarias (fibroblastos de embrión de pollo, células renales de embrión humano y células amnióticas humanas) son los más empleados. Es el método más costoso, pero las células presentan un amplio espectro de sensibilidad. B – Cultivos de células diploides Se observó que el cultivo de tejidos embrionarios humanos permitía seleccionar en algunos casos cepas de fibroblastos que podían multiplicarse durante 50-100 pases, sin perder su carácter diploide, es decir, conservando su cariotipo normal. Su sensibilidad a los virus es mayor que la de las células adaptadas (cepas WI-38 y MRC-5). 14
  • 15. Presentan la ventaja de no llevar virus latentes, como las células primarias de origen animal, ni estar infectadas por micoplasmas. Se emplean para el aislamiento de los virus de la varicela, rinovirus, citomegalovirus, etc. C – Líneas celulares En el curso del tiempo se ha conseguido adaptar células al cultivo indefinido in vitro, de manera que se pueden pasar de tubo a tubo de cultivo, sin tener que recurrir al tejido u órgano del que proceden. Las células adaptadas han experimentado una mutación en virtud de la cual presentan caracteres semejantes, cualquiera que sea su procedencia. Son de aspecto epitelial, su dotación de cromosomas es variable (aneploide) y su sensibilidad a los virus está muy limitada (poliovirus, virus Coxsackiea B, adenovirus, virus respiratorio sincitial, de la rubéola y del herpes). En la actualidad existen numerosas líneas de células adaptadas que pueden proceder de células neoplásicas derivadas de carcinomas humanos (cepas Hela*, KB, HEp-2) o normales, como las líneas de células renales de mono (Vero, LLC- MK2), hámster (BHK-21) y conejo (RK-13). 4.3.2 Cultivos de órganos Recientemente para el aislamiento de algunos virus de difícil cultivo se han utilizado cultivos de órganos. Son cortes de órganos embrionarios, que en un medio adecuado pueden mantener su estructura y funciones durante un corto período de tiempo. Se han empleado cultivos de tráquea embrionaria para el aislamiento de coronavirus y otros virus respiratorios y de intestino embrionario para los coronavirus intestinales y algunos rotavirus. Factores a tener en cuenta en la conservación de medios de cultivo celulares: Los medios de cultivo celulares una vez preparados deben conservarse congelados. La actividad celular puede ser mantenida a temperaturas de -70ºC durante meses, y a -196ºC (con nitrógeno líquido) durante años. Estos productos deben ser fraccionados en partes alícuotas adecuadas, en tubos de plástico estériles, debidamente identificados con la fecha, número de lote y producto de que se trate. Las sucesivas congelaciones y descongelaciones de éstos van en detrimento del medio, y la manipulación excesiva aumenta el riesgo de contaminación. Antes de ser congelados se les suele añadir un agente crioprotector como glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO). Reducen la pérdida de electrolitos intracelulares, y reducen la cantidad de agua disponible para la formación de cristales de hielo, con lo que protegen las células durante la congelación y descongelación. Se recomienda una congelación lenta de la suspensión celular. Descender la temperatura de 1-3ºC por minuto, esto se logra introduciendo los viales a congelar en un envase de poliestireno, rellenándolo con algodón. 15
  • 16. La descongelación debe ser rápida para evitar el daño celular. A estos medios de cultivo se les deben de añadir una serie de componentes sólo antes de ser utilizados. 5- MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN Después de que las muestras son inoculadas en el cultivo celular apropiado, se incuban a 35-37ºC. La multiplicación del virus en estos cultivos puede reconocerse por manifestaciones diversas: 1) Por su efecto citopático (ECP) Los virus pueden producir diversas alteraciones de las células y del cultivo monocelular, que muchas veces son características. A nivel celular se pueden observar: - Alteraciones nucleares (adenovirus, herpesvirus) - Alteraciones citoplásmicas (picornavirus, poxvirus) - Alteraciones de la envoltura, con fusión de las células vecinas, formación de sincitios o policariocitos (virus respiratorio sincitial y del sarampión) - Aparición de cuerpos de inclusión, que pueden acompañar o no las alteraciones anteriores. En la capa monocelular se observa que las células alteradas se redondean y retraen, pueden llegar a despegarse del vidrio del tubo o matraz, y su distribución puede ser difusa o en focos aislados. La observación de estas lesiones puede efectuarse ya en fresco en el propio tubo o matraz de cultivo celular o en preparaciones teñidas, proporcionando datos de interés para la identificación del virus. El virus del Herpes simple es uno de los más frecuentemente aislados en los laboratorios, y tras su inoculación se observa que: - Alrededor del 60% de los cultivos presentan ECP dentro del primer día. - Alrededor del 75-80% muestran ECP durante el segundo día. - Alrededor del 91-98% muestran ECP durante el 5, 16 y 19 días. 2) Por la aparición de hemaglutininas o de Ag fijadores de complemento. Estos sólo aparecerán en el medio, si éste ha sido infectado por un virus que induce a la célula parasitada la formación de estos Ag. 3) Hemadsorción. 16
  • 17. Es la fijación de los glóbulos rojos en la membrana de las células infectadas. Se presenta con los virus hemaglutinantes y es debida a la presencia de la hemaglutinina en la membrana de las células. 4) Fenómeno de interferencia. Las células infectadas por un virus no citopático pueden presentar un aspecto normal, pero no son sensibles a la súper infección por un virus que produzca acción citopática; el primer virus bloquea el desarrollo del segundo e interfiere en él. EJEMPLO: El virus de la rubéola infecta el riñón primario de mono verde africano y se reproduce bien en él; sin embargo, no tiene lugar ECP ni hemadsorción. La presencia del virus de la rubéola se demuestra mediante la incubación de los cultivos de las células infectadas durante 7 ó más días, y añadiendo a continuación otro virus “estimulante”, del que se sabe que infecta los cultivos celulares y produce ECP. Si el virus estimulante no logra causar ECP, es probable que esté presente el virus de la rubéola y que haya interferido en la replicación del segundo virus (probablemente por la producción de interferón). 5) Detección directa del virus por microscopía electrónica 6) Inhibición metabólica Las células infectadas por el virus no son capaces de metabolizar un sustrato de glucosa, esto se aprecia mediante la colocación de un indicador de pH como Rojo Fenol y observando que no vira de color por la no acidificación del medio de cultivo. 7) Métodos inmunológicos -Inmunofluorescencia directa e indirecta, detectando la presencia del virus o sus Ag en las células mediante el empleo de un suero inmune marcado con sustancias fluorescentes. -Métodos inmunoenzimáticos -Reacciones de fijación de complemento La identificación del virus aislado se realiza en dos etapas; en primer lugar, se efectúa el diagnóstico provisional de familia o de grupo basándose en el cuadro clínico del enfermo, el animal o el tipo de células, en que se ha desarrollado el virus y la manifestación visible de su crecimiento (apartados 1 al 4 y 6). La identificación final o el diagnóstico de certeza se efectúa por pruebas serológicas utilizando como Ag el virus aislado. 17
  • 18. 6- DIAGNÓSTICO Los métodos de diagnóstico de las infecciones producidas por virus pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos directos basados fundamentalmente en el aislamiento del virus de los productos del enfermo y métodos indirectos dirigidos a la demostración de un aumento del título de Ac en el curso de la enfermedad. Como estos métodos suministran por lo general resultados tardíos, han surgido técnicas de diagnóstico rápido, que se están desarrollando en la actualidad. A) Métodos de aislamiento Constan de tres etapas: toma de muestras, inoculación e identificación del virus aislado. B) Métodos serológicos Se basan en la demostración de un aumento del título de Ac durante el curso de la enfermedad. Para interpretar debidamente los resultados de las reacciones serológicas deben tenerse en cuenta las fechas del comienzo de la enfermedad y de obtención del suero, así como el intervalo entre los dos sueros. También se puede efectuar el diagnóstico de presunción de infección reciente con una sola muestra de suero determinando los Ac ligados a las IgM, que son los que aparecen primero en la infección y desaparecen rápidamente. Se utiliza especialmente en el diagnóstico de las infecciones congénitas (rubéola, citomegalovirus), pues, como las IgM maternas no atraviesan la placenta, su hallazgo en la sangre del cordón es significativa de infección reciente. Las reacciones serológicas más empleadas en virología clínica son: 1) Reacción de neutralización (búsqueda de Ac neutralizantes) 2) Reacción de fijación de complemento (busco Ac fijadores de complemento) 3) Reacción de inhibición de la hemoaglutinación. Algunos virus presentan la propiedad de aglutinar los hematíes de diversas especies de animales, propiedad que puede ser inhibida específicamente por los Ac existentes en el suero de los enfermos. 4) Otras técnicas: Inmunodifusion (ID) y Contrainmunoelectroforesis (CIE) 18
  • 19. C) Métodos de diagnostico rápido Recientemente se han desarrollado métodos de diagnostico mas rápidos, que permiten obtener el resultado en el mismo día de la obtención de la muestra. 1. Microscopia electrónica. Observación directa de la morfología del virion mediante examen de la muestra al microscopio electrónico por el método de tinción negativa. 2. Inmunofluorescencia (IF). Se empieza a utilizar el diagnostico rápido de la virosis. Pero que exige un equipo costoso y personal especializado. Se utiliza en centros especializados. 3. Inmunoanalisis: − Radioinmunoanalisis (RIA) − Enzimoinmunoanalisis (EIA) y en especial ELISA. Ambas técnicas se están utilizando en el diagnostico de las virosis, para la detección tanto de Ag. Como de Ac (IgG e IgM). 4. Inmunocromatografia. 5. PCR o sonda genética. 7. PRINCIPALES VIRUS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS A) VIRUS SIMPLE (VHS) Como todos los miembros de la familia Herpesviridae. Producen infecciones latentes, capaces de reactivarse, con o sin lesiones que sirven de fuente de infección para individuos susceptibles. Existen dos tipos: VHS-1 y VHS-2, presentando el primero mayor tropismo por lesiones por encima de la cintura, encefalitis, infecciones oculares y en algunos casos infección diseminada. Esta muy distribuido por todo el mundo y la infección suele ser bastante leve. El VHS-2 se encuentra principalmente en los genitales, trasmitiéndose por vía venérea y produciendo mayor parte de las infecciones generalizadas en el neonato. El diagnostico se puede realizar con tinción de Wright o Giemsa de células raspadas de lesiones herpéticas, para observar las características células gigantes multinucleadas. También se puede cultivar. Los métodos serologicos son de escasa utilidad. 19
  • 20. B) VIRUS VARICELA-ZOSTER (VVZ) Pertenece a la familia Herpesviridae. La varicela y el herpes zoster representan diferentes manifestaciones clínicas de un mismo virus, el VVZ. La varicela es mas frecuente en niños y se caracteriza por fiebre y exantema vesicular diseminado. Constituye la infección primaria y muestra una prevalencia estacional (fin del invierno – primavera). La reactivación producirá el herpes zoster, que aparecerá normalmente en adultos y sin distribución estacional, consistiendo en una inflamación de las raíces dorsales de los nervios raquídeos o de los ganglios sensitivos craneales. Frecuentemente aparece cuando hay una disminución de la inmunidad. El diagnostico de la infección por este virus suele ser de tipo clínico, pero en ocasiones puede ser importante la confirmación por el laboratorio (inmunodeprimidos, gestación) existiendo distintos métodos: − Serologia: Elisa − Cultivo celular. B) VIRUS DEL EPSTEIN BARR (VEB) Pertenece a al familia Hervesviridae. Es uno de los virus humanos mas ubicuos, cuya infección primaria es posible en la primera infancia, aumentando su seroprevalencia hasta el 60-70% en jóvenes y alcanzando el 80-90% en adultos. El síndrome clínico mas frecuente es la mononucleosis infecciosa, que puede presentarse con fiebre, adenopatías, faringitis, y linfocitosis con linfocitos atípicos, siendo característica de adultos jóvenes. El VEB también se ha asociado a carcinoma nasofaringeo y al linfoma de Burkitt. En cuanto al diagnostico de este virus, aunque existen algunas líneas celulares susceptibles de ser infectadas, lo mas utilizado es la serologia. La prueba mas habitual es la de Paul Bunnell o detección de Ac heterofilos, ya que es muy sencilla y presenta una buena sensibilidad. También se pueden utilizar métodos de ELISA e inmunofluorescencia, para al detección de marcadores específicos del virus como el Ag de capside (VCA), Ag precoz (EA) o Ag nuclear (EBNA) C) VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) Pertenece a la nueva familia Hepadnaviridae. Con gran importancia socio- sanitaria y de distribución mundial. Se calcula que en el mundo hay unos 350 millones de portadores del virus, de los que unos 350.000 desarrollaran cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular, que son las complicaciones mas importantes que puede causar. 20
  • 21. 4.1 Estructura antigénica Se distinguen una serie de estructuras del virus que dan lugar a los marcadores serologicos. En primer lugar, el Ag de superficie del virus HbsAg o antigeno Australia, que es un marcador de infecciosidad y esta codificado por el gen S. Su correspondiente anticuerpo HbsAc o anti-Hbs confiere inmunidad. A continuación, esta el antigeno del core o nucelocapside, HbcAg, codificado por el gen C y que no se detecta libremente en sangre, pero si su correspondiente anticuerpo, llamado HbcAc y que es un buen marcados epidemiológico ya que suele mantenerse de por vida. Además si se determina la IgM frente al core (IGM- HbcAc), se obtiene el marcador mas fiable de hepatitis B aguda. Por ultimo, se encuentra el antigeno soluble, el HbeAg y su correspondiente anticuerpo, HbeAc que se va a utilizar como marcadores de pronostico de la enfermedad pues se correlacionan con el nivel de replicación del virus. Además, en el virus distinguiremos su genoma (ADN) y una polimerasa. El virion completo recibe el nombre de partícula de Dane, ya que existen formas incompletas en sangre (HbsAg). 4.2 Infección por VHB La mayor parte de las infecciones son subclínicas y únicamente se detectan en controles serologicos. Asimismo, la mayor parte de las infecciones sintomáticas son autolimitadas y se resuelven en menos de 6 meses. En cuanto a la lesión hepática puede ser nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (0,25%). La sintomatología clínica es similar a la hepatitis A, con fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza, o dolor en epigastrio acompañado de una aumento de las transaminasas y hepatomegalia. El periodo de incubación es de 60 -110 días y puede haber erupción maculopapular y urticaria. Entre el 5-10% de las infecciones se hacen persistentes y pueden mantenerse de por vida. En la mayor parte de las ocasiones, la función hepática y la histología se mantienen normales, siendo por tanto un portador asintomático, pero en otras ocasiones dan lugar a síndromes designados como hepatitis crónica persistente (HCP) y hepatitis crónica activa (HCA). La HCP es menos progresiva que la HCA, que puede ser mas grave y desembocar en cirrosis. En la evolución de la enfermedad, la respuesta inmunitaria juega un papel importante. 4.3 Epidemiología La hepatitis B esta ampliamente distribuida por todo el mundo, pero existen áreas hiperendemicas, de endemia media y baja. Nuestro país perteneces al segundo grupo. El único reservorio importante en el hombre. 21
  • 22. Aunque la sangre y los productos sanguíneos son la fuente de infección mejor documentada, también se han detectado HbsAg en heces, orina, bilis, lagrimas, semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de cordón. Pero solo se ha demostrado experimentalmente la transmisión con sangre, saliva y semen. Siendo las vías mas importantes de la transmisión del virus, la parenteral, y el contacto sexual. Esta claramente demostrado que el virus difunde también mediante utensilios y materiales de hospitales de uso intimo, por contacto con las musocas. De modo que el personal sanitario, los familiares de portadores crónicos y otros grupos de riesgo corre un mayor riesgo de contraer la infección. La llamada transmisión vertical, del VIHB tiene gran importancia, no solo por la posibilidad de que se infecte el neonato, sino también por la gran frecuencia de evolución hacia el estado de portador crónico. 4.4 Diagnostico Es necesario el diagnostico de laboratorio que es fundamentalmente serologico. Además, el VHB requiere un control serologico posterior ya que, como ya se ha expuesto, la persistencia de HbsAg durante 6 meses implica el estado de portador crónico. En función de los Ag y Ac que se detecten, se puede especular sobre el estadio de la infección. Ejemplo, si a partir de los 6 meses de la infección se detectan niveles altos de HbsAg siendo indetectable el AntiHBs, persistiendo la presencia de AntiHBc y detectándose el HbeAg, estas personas son potencialmente infecciosas para otras, y puede evolucionar a una hepatitis crónica persistente, o a hepatitis crónica activa, que puede progresar en cirrosis. De ahí la importancia ante un caso comprobado de hepatitis B, un control serologico exhaustivo, para ver su pronostico individual, y la evolución de la enfermedad. 4.5 Prevención La mejor medida para combatir las infecciones virales es la prevención, sobre todo en el caso del VHB, por el riesgo que conlleva de cronicidad. Teniendo en cuenta que es un virus muy contagioso. En la actualidad se dispone de medidas eficaces de inmunidad activa y pasiva. En cuanto a la inmunización pasiva se cuenta con una gammaglobulina hiperinmune eficaz en situaciones de pre y postexposicion, siendo este ultimo caso el mas utilizado. La inmunización activa se realiza mediante la administración de una vacuna, en principio obtenida de concentrados de plasma y actualmente mediante ingeniería genética (obteniéndose el HbsAg de levaduras). La vacuna produce respuesta inmunitaria en un 90-95% de la población normal, y en la actualidad se llevan a cabo programadas de vacunación en grupos de riesgo: personal sanitario, familiares o personas que conviven con portadores crónicos, pacientes en diálisis, hijos nacidos de madres HbsAg positivo. 22
  • 23. Actualmente ya se ha incluido esta vacuna en el calendario de vacunación infantil, aplicando tres dosis, a los 0.1 y 7 meses. Los niños que no han entrado en este nuevo calendario, se les aplica la vacuna a los 12 años. B) VIRUS ARN 1. VIRUS DEL RESFRIADO COMUN EL agente etiológico mas frecuente del resfriado común es un Rhinovirus perteneciente a la familia Picornaviridae. Existen al menos 100 tipos diferentes y rara vez es necesario el diagnostico del laboratorio, para lo que se puede utilizar el cultivo, aunque son agentes que presentan dificultades en el mismo. 2. VIRUS DE LA RUBÉOLA EL agente etiológico es un Rubivirus perteneciente a la familia Togaviridae. En 1940 en una epidemia de rubéola en Australia de el considero el responsable de muchas malformaciones congénitas, con elevado numero de cataratas congénitas y cegueras. La infección en niños o adultos suele ser benigna y autolimitada. Se caracteriza por síntomas respiratorios superiores leves, erupción eritematosa y linfadenopatia. En adultos jóvenes se puede complicar con artritis transitoria o artralgias. Rara vez produce encefalitis o púrpura trombocitopenica. Muy importante en la infección de gestantes, sobre todo en el primer trimestre, ya que conduce a la aparición de sordera neurosensitiva, alteraciones cardiacas, cataratas, retraso del crecimiento y síntomas encefaliticos. La incubación dura de 14 a 21 días. Los métodos serologicos se utilizan para saber el estado inmunitario (IgG) sobre todo en la gestación, ya que en un resultado positivo indica inmunización frente al virus. También son validos para la detección de infección aguda (IgM), y es el método a utilizar como diagnostico aunque el virus sea cultivable. Se utilizan distintas técnicas, siendo muy utilizado el ELISA. Actualmente, es poco frecuente la rubéola congénita, debido a que la vacuna de la rubéola es obligatoria, y se incluye en la triple vírica (paperas, sarampión y rubéola), que se administra a los 15 meses y a los 11 años a todos los niños. 3. VIRUS DE LA GRIPE El agente etiológico es un Inluenzavirus perteneciente a la familia Orthomyxoviridae. La gripe es una infección respiratoria aguda que suele ser epidémica con distribución estacional (noviembre a abril). La vía de transmisión es aérea, con un periodo de incubación de 1-4 días seguido de un espectro variable de manifestaciones clínicas respiratorias, que puede ser grave en los ancianos. 23
  • 24. Además tiene gran importancia socioeconómica por la perdida de horas de trabajo que produce. Se realizan campañas de vacunación todos los años, ya que estos virus presentan gran variabilidad antigénica que implica que la vacuna sea activa frente al serotipo que esta causando la epidemia. En la actualidad se dirige a ancianos o pacientes con enfermedades broncopulmonares. Hay tres tipos; A, B, C, siendo los dos primeros los que causan epidemias de importancia. Los virus influenza A se subdividen según la diferente composición antigénica de la hemaglutinina y neuraminidasa. La nomenclatura que aconseja la OMS comprende el tipo, el origen geográfico, el numero de cepa, el año de aislamiento y los subtipos de hemaglutinina y neuaminidasa. Así el virus que produjo la epidemia de 1987 s denomina S/Shangai/11/87 (H3N2). El diagnostico de estas infecciones suele ser de tipo clínico, estando reservando el diagnostico de laboratorio para casos especiales o centros de referencia, e incluye el cultivo del virus y los métodos serologicos (EIA, inhibición de la hemoaglutinación). Para el diagnostico rápido del virus influenza se puede utilizar la inmunofluorescencia directa en aspirados nasofaringeos, esputos o biopsias de pulmón. 4. VIRUS DEL SARAMPIÓN El agente etiológico es un Morbillivirus perteneciente a la familia Paramyxoviridae. El sarampión es una enfermedad aguda, febril, exantematica, de gravedad variable. Los rasgos característicos de sus síntomas clínicos hace posible su diagnostico en la mayor parte de los casos sin ayuda del laboratorio. Son patognomónicas las manchas de KopliK. Las complicaciones mas graves son encefalitis y neumonía. En la actualidad han disminuido mucho los casos de sarampión, aunque sigue habiendo brotes debido a la introducción en el calendario de vacunación oficial de la vacuna triple vírica (paperas, rubéola y sarampión) a los 15 meses de edad y a los 11 años. En casos excepcionales se puede diagnosticar preferentemente por métodos serologicos debido a la complejidad técnica del cultivo.. 5. VIRUS DE LA PAROTIDA O PAPERAS El agente etiológico es un Paramyxovirus perteneciente a la familia Paramyxoriviridae. Las paperas son una enfermedad contagiosa aguda con fiebre moderada de corta duración y cuyo rasgo clínico mas común es la parotiditis uni o bilateral. Por ser tan característica la confirmación de laboratorio generalmente es innecesaria.. El periodo de incubación suele ser de 18 a 21 días, transmitiéndose por vía respiratoria. El virus se excreta en saliva y orina, desde 6 días antes hasta 9 después de la inflamación de las parotidas. Entre un 25-50% de los casos pueden ser asintomático. 24
  • 25. En la actualidad es de vacunación obligatoria (triple vírica), produciendo inmunidad a largo plazo. Como complicaciones destacan las que afectan al testículo, ovarios y SNC, y menos habitualmente al páncreas, nervios periférico, ojo y oído interno. Para su diagnóstico se dispone de métodos serologicos (actualmente se prefiere la detección de IgM), aunque el virus también es cultivable. 6. VIRUS DE LA RABIA El agente etiológico es un Lyssavirus perteneciente a la familia Rhabdoviridae. Enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran importancia histórica por los trabajos de Pasteur. En nuestro país actualmente hay muy pocos casos, pero en todo el mundo aun esta lejos de ser erradicada. De hecho, existe la obligación de vacunar todos los perros y garos. Se puede decir que la rabia es una zoonosis. El virus esta presente a menudo en la saliva de animales rabiosos, transmitiéndose por mordeduras. Las fuentes mas comunes de infección humana son los perros, los gatos, los zorros, los coyotes y los murciélagos. El diagnóstico solía realizarse postmorten, mediante la observación de los cuerpos de Negri en el asta de Ammon (hipocampo). También se puede practicar la inoculación a ratones o métodos serologicos, pero estas técnicas están reservadas para laboratorios muy especializados. Es importante realizarlo ante una sospecha, ya que es una enfermedad habitualmente mortal. El diagnostico se tratara de realizar en el animal que ha mordido al hombre. 7. VIRUS DEL SIDA (VIH) Es un virus ARN de la familia Retroviridae y subfamilia Lentiviridae. La simetría de su cápsula es icosaedrica y su forma esférica. Se caracteriza por sintetizar ADN a partir de ARN viral, a partir del enzima trascriptasa inversa. Estructura y tipos Consta de nucleocapside y envoltura. Sus principales genes son: A. Estructurales Gen Proteínas y Glucoproteinas GAG (Core) p7, p9, p17, p24 ENV (Envoltura) Gp120, gp41, gp12, gp36 POL (Polimerasa) P11, p13, p34, p51 B. Reguladores: Genes TAT, REV, NEF, VIF, VPT, VPU, VPX. Regulan la replicación viral y el papel de todos ellos no esta completamente dilucidado. 25
  • 26. En la actualidad se conocen dos tipos: el VIH-1 y el VIH-2. Se diferencian en que algunas de las proteínas que codifica su gen ENV son de distinto peso molecular; así pues mientras que el VIH-1 la proteína de superficie es la gp 120 y la de la transmembrana es la gp41, en el VIH-2 los son respectivamente la gp 125, y la gp36. Además el VIH-1 es el responsable de la inmensa mayoría de casos de SIDA. El VIH-2 presenta una virulencia inferior con mayor periodo de latencia y menos proporción de desarrollo de SIDA. Patogenia El VIH penetra en el organismo a través de líquidos corporales, fundamentalmente sangre y semen, procedentes de individuos previamente infectados. Una vez en la sangre, el VIH entra en contacto con las células que contienen en su membrana CD4 que funcionan como una especie de receptor. La glucoprotéina gp120 de la envuelta del VIH se fija a la molécula CD4,iniciándose una fusión entre la envoltura del VIH y la membrana celular permitiendo la penetración del VIH en el citoplasma celular. Una vez dentro de la célula, la nucleocápside del virus se rompe y deja libre el RNA y la transcriptasa inversa, tras lo cual se pone en marcha la síntesis de DNA a partir del RNA vírico. A continuación, el DNA sintetizado se integra en el DNA celular, formándose un provirus. En este proceso intervienen 2 tipos de enzimas víricas: una endonucleasa que corta el DNA celular y unas ligasas que unen las 2 clases de DNA. Como los linfocitos Th son CD4 ,son una de las células más importantes que ataca al VIH. Los linfocitos Th infectados pueden permanecer en este estado latente durante largos períodos de tiempo. Pero el provirus puede activarse debido a distintos estímulos como, por ejemplo, la existencia de otra infección concomitante. Al activarse el DNA provírico induce la síntesis del RNA viral y de RNA mensajeros que van a inducir, a su vez, la síntesis de proteínas víricas. Formándose, de esta manera, nuevas partículas virales. Las nuevas partículas virales salen de la célula, mediante gemación, y se dirigen a atacar nuevos linfocitos Th. Evolución de la enfermedad La evolución del SIDA evoluciona en tres fases: infección aguda, infección asintomático e infección sintomática tardía. 26
  • 27. 1) Infección aguda. Tras la entrada del VIH en el organismo se observa un período ventana en el que sólo se puede determinar la presencia del virus mediante técnicas muy complejas, como su aislamiento por cultivo, la detección de Ag p24 y la búsqueda de DNA provírico mediante la prueba de PCR. El período ventana dura semanas o meses(normalmente 3 meses)y puede acompañarse de unas manifestaciones clínicas que reciben el nombre de enfermedad de la seroconversión. El fin del período ventana coincide con el ascenso y, por lo tanto, con la detección en el suero de Ac contra diferente proteínas víricas(seropositividad).Simultáneamente a esto último, se verifica un descenso de la antigenicidad y de la viremia hasta hacerse indetectables. 2) Infección asintomático o período de latencia. Tras la infección aguda comienza esta fase, que puede durar varios años y en la que lo Ac de tipo IgG dirigidos contra las diferentes proteínas víricas se mantienen en unos niveles detectables. 3) Fase sintomático tardía El descenso de los Ac dirigidos contra las proteínas codificadas por el gen GAG(Ac anti GAG) y la detección, de nuevo, del Ag p24 son indicadores de una reactivación de la infección y, por tanto, de su paso a una fase sintomático tardía. Analíticamente, en el SIDA también se observa: -una linfopenia (por descenso de linfocitos CD4) Linfocitos CD4 -una disminución del cociente --------------------------------------- Linfocitos CD8 -un ascenso de la concentración de Ig en el suero. Manifestaciones clínicas de la infección por VIH Clínicamente, la infección por VIH se clasifica en 4 grupos, del 1 al IV, excluyentes entre sí, y que reflejan una progresión de la enfermedad, de tal forma que un paciente una vez introducido en un grupo no puede ser clasificado posteriormente en un grupo inferior. 27
  • 28. a)GRUPO I: corresponde a la enfermedad de la seroconversión y asemeja a un cuadro gripal o mononucleósido(período ventana),pero puede ser asintomático. b)GRUPO II: se relaciona con el período de latencia y, por tanto, en él hay una ausencia de síntomas y signos clínicos. c)GRUPO III: se caracteriza por la existencia de una linfadenopatía generalizada persistente(PGL) que anatopatológicamente se observa como una hiperplasia reactiva benigna de los ganglios linfáticos, pero es probable que evolucione hacia un SIDA manifiesto. d)GRUPO IV: incluye ya manifestaciones clínicas de SIDA y se divide, a su vez, en 5 subgrupos: -Subgrupo A: se denomina enfermedad constitucional y cursa con pérdida de peso corporal, fiebre que persiste más de 1 mes, sudoración nocturna y diarrea abundante que dura más de 1mes. -Subgrupo B: consiste en una enfermedad neurológica, debida a un ataque del VIH a algunas células del Sistema Nervioso. Se manifiesta condemencia, mielopatía y neuropatías periféricas. -Subgrupo C: comprende infecciones secundarias causadas, frecuentemente, por microorganismos oportunistas como el causante de la Neumonía, Toxoplasma, HSV, CMV, HERPES ZOSTER, infecciones recurrentes por Salmonella. -Subgrupo D: abarca cánceres secundarios, entre los cuales los más relevantes son el Sarcoma de Kaposi y los linfomas no Hodgkinianos. -Subgrupo E: este subgrupo incluirá otras enfermedades. Es decir aquellos estados patológicos que no pueden incluirse en ninguno de los subgrupos anteriores. Se considera que un paciente tiene SIDA cuando: - Es seropositivo - El recuento de leucocitos Th es bajo - Y sufre un cáncer secundario y/o una infección oportunista claramente relacionados con una afectación por el VIH. 7-3) Epidemiología La OMS calcula que en el año 2000 los casos declarados de SIDA se elevarían a 1400000, mientras que los casos reales estarían entre 8 a 10 millones, siendo los portadores del virus de 25 a 30 millones. 28
  • 29. Vías de transmisión son: -Sangre -Mediante relaciones sexuales -Transmisión vertical-perinatal En nuestro país cobra una especial importancia la transmisión por sangre, ya que el principal grupo de afectados son los UDPV(usuarios de drogas por vía parenteral), a diferencia de Francia o EEUU donde lo son los homosexuales. En cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan entre 15-50%,cobrando una especial importancia en África. La transmisión al personal sanitario se calcula entre un 0,2% y requiere contacto con sangre, líquido corporal infeccioso o líquidos donde se haya cultivado el virus. Esto hace que en la practica cotidiana se extremen las medidas de precaución con estos pacientes ante la gravedad de la infección, considerando todo líquido corporal de un enfermo de SIDA como potencialmente infecciosos. 7-4) Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH El diagnostico de la infección del SIDA en nuestro medio es fundamentalmente serológico, cobrando especial importancia por las implicaciones que conlleva. Existen diversos productos génicos del VIH que se consideran antígenos principales para su utilización en las pruebas serológicas, estos incluyen las proteínas y glucoproteínas codificadas por los genes GAG, ENV y POL. Estudiando los niveles de Ag y Ac podremos diagnosticar y saber la evolución de la enfermedad. Se realizan técnicas de ELISA en primera instancia, aplicando a los positivos métodos de confirmación: Western Blot(VB),inmunofluorescencia(IFI)o técnicas de radioinmunoprecipitación. Es el VB el más utilizado, ya que nos permite diferenciar los Ac frente a las distintas proteínas del virus, apareciendo bandas inmunorreactivas en una tira de nitrocelulosa. El VB tiene distintos criterios para la interpretación de los resultados(la OMS y otras organizaciones)porque la presencia de distintas bandas puede ser muy variable. De ahí que los resultados se clasifiquen en: -POSITIVO: se observan reacciones al menos frente a un producto en cada una de las 3 regiones génicas ENV, POL y GAG. Otras recomendaciones sugieren que con observarse reacción en 2 regiones es suficiente. -NEGATIVO: no se observan bandas reactivas en los lugares de los Ag víricos. 29
  • 30. -INDETERMINADO: se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna proteína del virus. En este caso se recomienda una nueva prueba con un suero recién extraído, y si todavía se cuestiona el resultado, se sugiere la repetición de la prueba al cabo de 2 a 3 meses. Las causas de un WB indeterminado incluyen la infección en su etapa inicial, una posible reacción cruzada con otros retrovirus, idiopatía, y pacientes con Ac HLA, hiperbilirrubinemia, conectivopatías o gammpatopatías policlonales. Los métodos de ELISA son cada vez más sensibles y específicos, con capacidad para detectar IgG e IgM, acortando el período ventana. También existen métodos rápidos, aplicables en situaciones de urgencia, como son la aglutinación con partículas de látex y la aglutinación de los eritrocitos, tienen una gran aplicación en casos de falta de recursos tecnológicos. Por último, están las técnicas de centros especializados: cultivo y PCR. El cultivo tiene la ventaja adicional de poder aplicar estudios de resistencia a antivirales. La PCR es una técnica con mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, y aunque ya existen reactivos comercializados, aún no están al alcance de la mayor parte de los laboratorios. Esta técnica permite la amplificación enzimático automatizada del DNA provírico o del RNA vírico. Una importante aplicación de estas técnicas es el diagnóstico de hijos de madres portadoras del VIH, ya que en este caso la serología al nacer y el los primeros meses de vida siempre es positiva por transferencia pasiva de Ac. Por lo tanto, para saber si un niño está infectado, cosa que ocurre entre el 12-50%,se necesitarán pruebas diagnósticas que detecten al virus. También existen una serie de marcadores del seguimiento de la enfermedad, entre los que destaca el Ag p24,que se detecta en las fases precoces y en las tardías. También en las fases tardías se puede observar la disminución de los Ac anti p24. También se realiza el recuento de los linfocitos CD24, y el cociente CD4/CD8 7-5)Prevención y tratamiento En la lucha contra el SIDA, la mejor medida es la PREVENCIÓN. Entre ellas cabe destacar el uso de preservativos en las relaciones sexuales y el no compartir la misma jeringuilla por parte de los toxicómanos intravenosos... Una vez instaurado el SIDA en el tratamiento de estos pacientes se tendrán en cuenta las infecciones oportunistas y su profilaxis, su deterioro inmunológico y una terapia específica antiviral. En el tratamiento antiviral cabe destacar la AZT(acidotimidina o zidovudina) que, dificulta la trascripción inversa del RNA viral , pero no consigue erradicar el virus, aunque prolonga y mejora las condiciones de vida. Muy recientemente se han creado grandes expectativas con la multiterapia. La vacuna es muy difícil de obtener por la complejidad del virus aunque se están haciendo pruebas en voluntarios. 30
  • 31. 8)VIRUS DE LA HEPATITIS A, C, D y E VIRUS DE LA HEPATITIS A Es un virus ARN, perteneciente a la familia Picornarividae, género Entenovirus, denominándose en la nueva nomenclatura virológica Entenovirus 72. El virus puede cultivarse en células de rión de titi, células de riñón de feto Macacus rhesus(FRhK6),células humanas de hepatoma, fibroblastos embrionarios humanos y células diploides humanas de pulmón. El crecimiento puede demostrarse por inmunofluorescencia ya que el virus no es citotóxico. Conocido ya históricamente, pues hace más de 2000 años griegos y romanos ya describieron epidemias de "ictericia infecciosa".Posteriormente se han descrito muchas epidemias sobre todo en períodos guerra. Sería MacCallum, en 1947,el que introduciría el término Hepatitis A, para distinguirla de la B o hepatitis "sérica".Esta terminología sería aceptada por las OMS en 1973.Es de distribución mundial e infecta a hombres y a primates. Transmisión y acción patógena del VHA El VHA penetra por vía oral o parenteral, siendo la principal ruta de diseminación la feca-oral, en la que están implicadas el agua y los alimentos. Como en muchas enfermedades infecciosas, el problema reside en que la mayor eliminación del virus en heces se da en la semanas previas a la aparición de la ictericia, sobre todo en la fase tardía de la incubación. La excreción fecal puede continuar durante 1-2 semanas después de la aparición de la ictericia. Aunque se da casos durante todo el año, tiene una incidencia estacional con picos en los meses de otoño. En un año porcentaje de casos da lugar a una infección subclínica o una hepatitis anictérica y en el resto(alrededor del 10%)a un cuadro de hepatitis aguda, de rápida evolución, buen pronóstico y muy raras complicaciones o tendencia a la cronicidad .Existen casos, aunque raros, de hepatitis fulminante 0,1%. La hepatitis anictérica puede cursar sin síntomas alguno o con vagos síntomas de "empacho" o "afección gripal".Sólo la demostración de alteraciones enzimáticos (transaminasas)o el estudio de Ac específicos permiten el diagnóstico. Estas formas confirman la difusión del virus, pues entre 75-100% de la población adulta posee Ac anti VHA. La hepatitis aguda del VHA tiene un período de incubación de 10 a 50 días y un comienzo brusco. Tras un período preictérico con anorexia, astenia, dolores abdominales, fiebre de 37-38ºC, cefaleas, artralgias, etc,.,aparece la ictericia con orinas colúricas y heces hipopigmentadas, persisten los síntomas gastrointestinales y aparece hepatomegalia, acompañada o no de esplenomegalia. El cuadro evoluciona favorablemente y son muy raras las complicaciones. No se ha descrito el estado de portador crónico de la Hepatits A No requiere tratamiento. 31
  • 32. Diagnóstico Junto a los datos clínicos, el diagnóstico debe ser comprobado con datos de laboratorio, que demuestren el daño o lesión hepática o bien presencia del virus o la respuesta humoral a él. -Test de lesión hepática: aparece hiperbilirrubinemia, con aumento de las transaminasas(principalmente ALT), lactodeshidrogenasa y fosfatasa alcalina. -Demostración del virus: puede realizarse en las heces por observación al microscopio electrónico hasta 2-3 semanas después de la aparición de la ictericia o por inmunofluorescencia directa en cortes de parénquima hepático obtenidos por punción-biopsia, donde aparece en el citoplasma del hepatocito y de las células de Kupffer. -Búsqueda de Ac: es el método más idóneo, pero, como el porcentaje de seropositivos es muy alto en la población sana, el diagnóstico de infeccion se realiza por la demostración de altos títulos de IgM anti-VHA. Las técnicas mas usadas son el radioinmunoensayo(RIA) y el ELISA con Ag obtenidos de titis infectados o heces humanas, y se recomiendan dos tomas de suero separadas por 15-20 días. Epidemiología Los virus eliminados por las heces de los enfermos(semanas o meses) y presentes en la sangre(2 semanas antes y 2 semanas después de la ictericia) constituyen fuentes de infección claras, pero la presencia de formas anictéricas y asintomáticas explica la gran difusión del VHA. Al lado del bien conocido mecanismo de transmisión feco-hidrícica(manos contaminadas, agua, leche, diversos alimentos e incluso utensilios de cocina, termómetros, etc)puede ocurrir una transmisión parenteral, ya que se considera que el 30% de todas las hepatitis por esta vía se producen por virus A. La hepatitis A afecta sobre todo a niños adolescentes de 5 a 15 años, y aparecen los brotes epidémicos(finales verano y otoño)en guarderías, colegios, orfanatos ,etc. Se han descrito epidemias en medio rural y en campamentos militares; los mayores brotes epidémicos se deben a origen hídrico o alimentario. En otras zonas la hepatitis A es endémica, con brotes cada 5-10 años. Se han descrito casos humanos, cuyo origen estaría en primates(personal de zoológicos) Inmunidad La Hepatitis A es una infección inaparente en la mayoría de la población, y se conservan títulos de Ac protectores durante muchos años. En nuestro medio, estos títulos aparecen en casi el 100% de las personas de edad superior a 35 años. 32
  • 33. Profilaxis La profilaxis la podemos llevar a cabo en 2 niveles: en el mecanismo de transmisión o específica con ganma-globulina. En el mecanismo de transmisión se realiza mediante una correcta desinfección, higiene individual, cloración de agua, higienización de la leche ,mejora del saneamiento general, etc. El virus es relativamente resistente a la inacivacion por calor a 60ºC durante y 1hora,al éter y a los ácidos, pero se destruye por formalina a una concentración de 1/4000 a 37ºC durante 72h, y por cloro(1mg/l durante 30 min.) La profilaxis con ganma-globulina debe administrarse, a ser posible, durante el periodo de incubación o como mucho hasta 6 días después del comienzo de la ictericia. Se dará en colectividades o familias en las que aparezcan un caso, en los brotes que tengan un mismo origen(ej:hídrico) y en los visitantes de áreas endémicas. Se encuentra en experimentación una vacuna formalizada con la cepa CR3326(Costa Rica),cultivada en células FRhK6. VIRUS DE LA HEPATITIS D o delta(VHD) Es un virus ARN incompleto que requiere HbsAg para su replicación. Es decir, sólo se producirá infección por el agente delta en las personas que tengan HbsAg en su sangre(hepatitis aguda o portadores crónicos),por lo que la transmisión y prevención del VHB se puede extrapolar aquí, ya que si no hay infección por VHB no lo hay por VHD. Suele aparecer en personas con múltiples exposiciones parenterales, estando a la cabeza en nuestro país los ADVP(administración de drogas vía parenteral).La prevalencia en nuestro país se ha evaluado en torno al 5-10%. Hay zonas hiperendémicas en el mundo como la Amazona, África central o el sur de Italia. Tipos de infección El virus delta puede infectar de dos modos, que dependen del VHB: 1)Coinfección: se da la infeccion simultáneamente por ambos virus. El curso natural de la infeccion por VHB no se modifica, ya que la tasa de portadores crónicos que se obtiene es similar a la que se da cuando se infecta él sólo. Clínicamente es más grave y la hepatitis fulminante es mayor. 2)Sobreinfección: cuando sobreinfecta el agente delta a portadores crónicos del VHB. La mayor parte de las sobre infecciones(70%) desembocan en hepatitis crónica. 33
  • 34. Diagnóstico Se suele realizar por métodos serológicos detectando Ac frente al virus(totales y del tipo IgM). Se debe sospechar en portadores crónicos de HbsAg con hepatitis aguda o crónica especialmente si la enfermedad es grave o el paciente ha tenido múltiples exposiciones parenterales. VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC) Es el virus más recientemente caracterizado y del que quedan aún muchos interrogantes por resolver. Desde hace años, ya se conocía una forma de hepatitis aguda o crónica, seronegativa para el VHA y VHB, y sin ninguna otra causa que justificara la lesión hepática. Era la llamada Hepatitis no-A, no-B, en la que la búsqueda de agentes etiológicos había sido infructuosa. Pero en 1988 Houghhton y cols, anunciaron la identificación y clonación del genoma viral de un agente causante de la hepatitis no-A, no-B. Es el llamado VHC. En la actualidad se sabe que es el responsable del 80-90% de los casos de hepatitis esporádica. Infección La Hepatitis C es una forma de hepatitis "sérica", es decir que la diseminación tiene lugar fundamentalmente por la vía parenteral. Es la causa más frecuente de hepatitis postransfusional y está ampliamente distribuido entre ADPV, pacientes en diálisis y hemofílicos. La tasa de Ac en la población normal en nuestro país es muy inferior a la del VHB. La clínica es similar a la hepatitis B, pero con gran tendencia a la cronicidad en torno al 50-70%. Diagnóstico Está basado en métodos serológicos. El primer método desarrollado fue ELISA utilizando como Ag proteínas no estructurales y proteínas del core. El modo de obtener estos Ad es por: -Ingeniería genética, clonándolos en E.Coli, levaduras -Ag de péptidos sintéticos En muchas ocasiones, se utilizan los llamados métodos de "confirmación", pudiéndose utilizar un Western Blot. Estos métodos son especialmente útiles cuando la reactividad por el método ELISA no es excesivamente alta. Se está introduciendo la técnica de la PCR para la detección del ARN viral(por tanto detección del virus y NO de Ac) 34
  • 35. Se utilizarán las medidas universales de precaución. Es decir, que todo suero o líquido corporal es potencialmente infeccioso. Cualquier paciente con sospecha de hepatitis en cualquiera de sus formas, debe considerarse potencialmente de alto riesgo infeccioso y ha de llevar a extremar las medidas de precaución. VIRUS DE LA HEPATITIS E (VHE) La hepatitis C no explica todas las formas de hepatitis víricas no-A, no-B, y especialmente algunas formas de transmisión fecal-oral descritas en la India, Pakistán, África del Norte y Méjico,, que causan epidemias de las cuales es responsable el VHE. En 1983 se demostraría como agente causal de una caso de hepatitis. No cronificada, al igual que el VHA, tiene un pronóstico peor que éste ya que la mortalidad es 10 veces superior al VHA, La forma más grave aparece en gestantes en el tercer trimestres del embarazo en las cuales aumenta la mortalidad. El virus se manifiesta en países que tienen un sistema sanitario deficiente, siendo lo más habitual la transmisión a través del agua de bebida. 35