Virus

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Un trabajo muy interesante sobre los virus.

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  1. 1. VIROLOGÍA1- INTRODUCCIÓN 1.1 Características generales de los virus 1.2 Agentes infecciosos subvirales 1.3 Acción de los agentes físicos y químicos2- CLASIFICACIÓN3- TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS4- MÉTODO DE CULTIVO 4.1 Animales de experimentación 4.2 Huevos embrionados 4.3 Cultivos tisulares 4.3.1 Cultivos celulares A- Cultivos celulares primarios B- Cultivos de células diploides C- Líneas celulares 4.3.2 Cultivos de órganos5- MÉTODOS DE IDENTIFICACION6- DIAGNÓSTICO7- PRINCIPALES VIRUS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOSHUMANOS A) VIRUS ADN 1) Virus Herpes Simple (VHS) 2) Virus varicela-Zoster (VVZ) 3) Virus de Epstein-Barr (VEB) 4) Virus de la Hepatitis B B) VIRUS ARN 1) Virus del resfriado común 2) Virus de la rubéola 3) Virus de la gripe 4) Virus del sarampión 5) Virus de la parotiditis 6) Virus de la rabia 7) Virus del SIDA 8) Virus de la hepatitis A, C, D, E 2
  2. 2. 1- INTRODUCCIÓN La virología es la rama de la biología que estudia los virus. La virología es una ciencia joven dentro de la Microbiología, puesprácticamente su historia se remonta al siglo XX. En 1933 Stanley cristaliza elvirus de mosaico del tabaco. Pero es a partir del descubrimiento del microscopioelectrónico cuando se empiezan a estudiar los virus. Las características peculiares de los virus han generado una especializacióndentro del laboratorio de microbiología. Los virus los podemos encontrar infectando y produciendo patología en todoslos seres vivos: bacterias (bacteriófagos), plantas y animales. Los virus que afectanal hombre, se encuentran dentro de los agentes que producen con mayorfrecuencia infecciones agudas, y en la actualidad se conocen mas de 500, pudiendoproducir desde enfermedades banales como el resfriado común, hasta síndromesde extrema gravedad como el SIDA.1.1Características generales de los virus Son agentes submicroscopicos, subcelulares y filtrables que consisten en unácido nucleico envuelto por una cubierta proteica protectora (cápside), que puede asu vez estar rodeada de una membrana lipoproteína. El ácido nucleico de un virus essolo de un tipo, ADN o ARN, a excepción de los oncornavirus, que, además de suARN, pueden contener pequeñas cantidades de ADN. No poseen mecanismos biosintéticos ni generadores de energía, por tanto,la replicación vírica requiere la participación activa de la célula huésped (sonparásitos intracelulares obligados). La replicación es un mecanismo particular, envirtud del cual el ácido nucleico del virus orienta el metabolismo de la célula haciala síntesis de sus propios componentes, que en una primera parte se forman porseparado, y posteriormente se integran para formar la partícula completa del virus.El ácido nucleico suministra la información para programar en la célula la síntesisde sus componentes. Forman pues, un grupo de seres que se diferencian claramente de losdemás microorganismos, tanto en su estructura como en sus característicasfisiológicas. El tamaño de las partículas víricas (viriones) se encuentra, en general, entre20 y 300 nm. El único modo de visualizarlas es el microscopio electrónico.Morfología y estructuraLos componentes estructurales de un virión son: a) Un núcleo central de ácido nucleico (nucleoide) b) Una cubierta proteica protectora (cápside) 3
  3. 3. c) Una membrana externa lipoproteína (envuelta) que se encuentra solo en ciertos grupos víricos. El núcleo y la cápside se denominan nucleocápside, que puede estar desnudao envuelta. La cápside es una estructura proteica compuesta por subunidades ocapsómeros. Los capsómeros se acoplan por un proceso de auto agrupación y paraello las subunidades proteicas se ordenan siguiendo un plan simétrico. De estaforma pueden adquirir distintas formas geométricas, que nos sirven paraclasificarlos en 4 grupos: 1) Virus con simetría icosaédrica 2) Virus con simetría helicoidal 3) Virus con simetría mixta o binaria 4) Virus de estructura compleja y simetría no bien definida1- Virus con simetría icosaédrica. Un gran número de virus se parecen a pequeños cristales de morfologíaicosaédrica, posiblemente debido a que el icosaedro es el modelo mas eficaz paraformar, a base de subunidades, una estructura compacta de la máxima fortaleza ycapacidad, con la mayor economía de material genético. El ácido nucleico puede encontrarse aislado debajo del cápside o asociado aproteínas básicas. En este caso forma en la parte central del virión una estructuraplegada y compacta. El nucleocápside, puede estar desnudo o envuelto por una envoltura denaturaleza lipoproteína que puede estar dotada de proyecciones o especulas deglicoproteinas. Asimismo, algunos virus desnudos como los adenovirus puedenpresentar especulas o fibras en los vértices de la partícula. Ejemplos de virus icosaédricos son: fago OX174, parvovirus, papovirus,reovirus, herpesvirus y adenovirus entre otros.2- Virus con simetría helicoidal El nucleocápside se representa como un tubo hueco formado por unfilamento de ácido nucleico dispuesto en espiral en el centro. Las unidades químicaso de estructura están constituidas por numerosas moléculas de un mismo tipo deproteína (protómeros), que se unen formando una estructura en forma de cinta quese enrolla alrededor del ácido nucleico.3- Virus con simetría mixta o binaria Algunos bacteriófagos presentan una simetría mixta, pues la cabeza tienesimetría cúbica y la cola, helicoidal. 4
  4. 4. 4- Virus de estructura compleja y simétrica no bien definida En este caso, se encuentran los poxvirus, que presentan una estructuraformada por una envoltura externa compuesta por subunidades proteicas de formatubular, dispuestas irregularmente, que encierran una parte central en forma delente bicóncava, que presenta a ambos lados dos formaciones ovoides o cuerposlaterales de naturaleza desconocida. La parte central contiene el ácido nucleico(ADN) asociado con propinas y no se conoce con certeza el tipo de simetría.1.2Agentes infecciosos subvirales Además de los virus, se han demostrado que algunas enfermedades de lasplantas, del hombre y de los animales pueden ser producidas por agentes filtrablesde tamaño muy pequeño, que presentarían algunas propiedades diferentes de losvirus. Los mas importantes son los tiroides y los virus convencionales son priones.Viroides Son pequeñas moléculas de ARN, que se encuentran plegadas y quepresentan una estructura secundaria particular con apareamiento intracatenarioparcial de las bases, que hace que existan regiones con ARN monocatenarioalternado con otras de ARN bicatenario, simulando asas y estando totalmentedesprovistas de cubierta proteica. Contienen información genética solo para su propia replicación. Hasta el presente solo de han demostrado en 11 enfermedades de lasplantas, como el mosaico del crisantemo, la clorosis del pepino, el exocortis de loscítricos, etc.Priones Desde hace tiempo, se conocía la existencia de enfermedades crónicas ydegenerativas del SNC de los animales y del hombre, como el scrapie o pruritolumbar de las ovejas, el kuru o ataxia degenerativa endémica y la enfermedad deCreutzdelt-Jakob (demencia presenil), que se podían transmitir a los animales porinoculación de cerebro de los enfermos y que se consideraba como virosis lentas,pero en las cuales no se había podido demostrar la presencia de virus. Se consiguió aislar de los enfermos unas glucoproteinas capaces detransmitir la enfermedad a ratones y hámster, a los que denomino “priones” porconsiderar que eran proteínas infecciosas de bajo peso molecular, no antigénicas,con una gran tendencia a la agregación y que al microscopio electrónico se observancomo fibrillas de 20 x200 nm. Son resistentes alas sustancias y procedimientos 5
  5. 5. que inactivan los virus (los rayos UV, calor, nucleasas, formol, glutaraldehido, oxidode etileno), pero se inactivan por una solución de NaOH 0,1 molar. No se conoce con certeza su mecanismo de replicación, pero se consideraque por su pequeño tamaño no pueden contener la información genética necesariapara su síntesis, sino que ésta se encuentra codificada en el ácido nucleico de lacélula huésped, que normalmente no se expresa, pero que la inyección o inoculaciónde priones producirían su desrrepresión y la producción de la enfermedad. Su resistencia a la inactivación y falta de antigenicidad ha hecho que seconsideren como moléculas de proteínas muy pequeñas o muy protegidas poragregación de las unidades infecciosas, que podrían ser los primeros agentesinfecciosos sin ácido nucleico, lo que aun no esta totalmente demostrado.1.3Acción de los agentes físicos y químicos Los agentes que producen la inactivación de los virus actúan directamentesobre sus componentes, en especial sobre las proteínas, lípidos o ácido nucleico delvirión.Agentes físicos Temperaturas de 56 a 65ºC mantenidas durante 1 hora inactivan la mayoríade virus, pues desnaturalizan las proteínas del cápside y de la membrana e inhibenla fijación y descapsidación del virión. Sin embargo, existen excepciones como losvirus de la hepatitis B, los virus adenoasociados y los viriones resistentes a estastemperaturas. La esterilización por autoclave (30 min. A 120º) o por calor seco (1hora a 160º) destruye todos los virus.En general los virus pueden conservarse: - A +4ºC (frigorífico ordinario) durante 1-2 días - A -30ºC (temperatura de congelación del congelador casero) durante algunos días, y los virus mas resistentes (enterovirus) durante largo tiempo. - A -70ºC (temperaturas de congelación de la nieve carbónica) durante largo tiempo. - A -196ºC (temperatura de congelación del nitrógeno liquido) durante años. Para evitar las perdidas de infectividad durante la conservación, seaconseja proceder a una congelación rápida de la suspensión vírica, en un medio quecontenga sustancias protectoras, como proteínas (suero, caldo, leche) o, aun mejor,dimetilsulfóxido. Por otra parte se han observado que ciertas sales a concentracionesmolares (MG, SO4Mg, SO4Na2) presentan una acción estabilizadora sobre algunassuspensiones de virus. La mayoría de los virus pueden conservarse por liofilización, es decir, pordeshidratación en el vacío, a partir de la suspensión congeladora. Los virus que 6
  6. 6. resisten la congelación pueden conservarse liofilizados durante mucho tiempo atemperatura ambiente y, prácticamente de forma indefinida a 4ºC. Las radiaciones, tanto los rayos ultravioleta como las radiaciones ionizantes(rayos X, radiaciones φ), inactivan los virus porque producen alteraciones en lacadena de nucleótidos (roturas, formación de dimeros). Los virus con ácido nucleicomonocatenario son los mas sensibles.Desinfectantes u antisépticos Los virus con envoltura de naturaleza lipoprotéica (herpesvirus,ortomixovirus, arenavirus, paramixovirus, rabdovirus, etc.) se inactivan confacilidad por los disolventes de las grasas como el éter, cloroformo, desoxicolatosodico y detergentes aniónicos. Por otra parte la sensibilidad al desoxicolatosodico explica que dichos virus se inactivan por la bilis y por lo general no seaninefectivos por vía digestiva. Los virus desnudos son resistentes a la mayoría de desinfectantes que seemplean para las bacterias, pero, en cambio, son sensibles a la acción: a) De los agentes oxidantes (hipocloritos, yodoforos), que a concentraciones elevadas 1000 ppm, inactivan la mayoría de los virus, incluso los de la hepatitis. b) Formol, que, por no alterar las propiedades antigénicas, se emplea en la preparación de las vacunas. c) Glutaraldehido y ácidos, en especial al ácido clorhídrico diluido, aunque existen virus acidorresistentes como los enterovirus. En el momento actual no se conoce ningún desinfectante de la piel, o antiséptico, que sea eficaz sobre los virus. En la desinfección ambiental, hay que tener presente que la eficacia delcloro depende de la cantidad de materia orgánica, por esto, se aconseja aumentarla dosis de cloro en las estaciones de depuración de aguas potables y en ladesinfección de productos patológicos que la contienen en abundancia (orina,heces, exudados) o sustituir el cloro por el formol o el ácido clorhídrico diluido.1.4Interferón El interferón esta constituido por un grupo de proteínas sintetizadas porlas células en respuesta a la acción de virus. Su propiedad mas importante es la deinhibir la replicación intracelular de los virus en las células, pero, además, se handemostrado otras propiedades biológicas sobre el huésped, como la accióninhibidora sobre el crecimiento de las células normales y malignas, y las acciónestimulante sobre la fagocitosis y moduladora de la respuesta inmune. 7
  7. 7. El interferón es un producto muy activo, pues la dosis para el hombre essolo de algunos microorganismos de proteína pura, lo que supone una actividadsemejante a la de algunas hormonas. Presenta una acción inespecífica y de amplio espectro, pues inhibe elproceso de replicación de diversos virus no relacionados, virus ADN y ARN(inespecificidad vírica). Sin embargo, solo puede sintetizarse en células de lamisma especia o especies relacionadas, de manera que el interferón activo para elhombre debe ser necesariamente producido en células humanas o de primates(especificidad celular) En el curso de la desinfección el interferón aparece precozmente, presentasu máxima acción en células y tejidos cercanos al lugar de producción, aunque noesta descartado que también puede actuar en órganos alejados y su acción semantiene durante poco tiempo. Se supone que en circunstancias naturales interviene en la recuperación yrestablecimiento de las infecciones víricas. Se ha empleado por vía tópica en el tratamiento de la queratitis herpetica,y por vía general en la profilaxis de algunas virosis respiratorias (adenovirus,resfriado común y gripe), para el tratamiento del herpes zoster, varicela, rabia yhepatitis B, y para prevenir las infecciones por citomegalovirus en transplantesrenales o de bazo.2. CLASIFICACION Durante mucho tiempo, los virus se han clasificado atendiendo al huéspedque se desarrollan, sus tropismos tisulares, a su epidemiología o a los cuadrosclínicos que producen, siempre muy diversos. Pero a medida que se ha progresadoen el conocimiento de su estructura y composición química, se ha podido elaboraruna clasificación más racional, basadas en sus propiedades físico-químicas, que elComité Internacional de Taxonomía ha ido perfeccionando progresivamente.Según el huésped Atendiendo al huésped en que se desarrollan, se pueden establecer cuatrograndes grupos de virus (taxa) según afecten específicamente a los vertebrados ,invertebrados, plantas o bacterias, y debe añadirse un quinto grupo para aquellosvirus capaces de afectar a mas de una clase de huésped.EpidemiologíaSegún la vía y mecanismo de transmisión se pueden dividir en: - Virus respiratorios: aquellos que ingresan y se desarrollan primariamente en las vías respiratorias. Comprenden los ortomixovirus, paramixovirus, coronavirus y rinovirus. 8
  8. 8. - Virus entéricos: aquellos que ingresan y se desarrollan primariamente en el tubo digestivo. Comprenden los enterovirus, adenovirus, reovirus y virus de la hepatitis. - Arbovirus: virus que afectan a diversas especies de animales y también al hombre y se caracterizan en que en su transmisión intervienen diversos artrópodos hematófagos. Comprenden las familias de los togavirus, rabdovirus y el genero arbivirus de los reovirus.Clínica Se dividen según que produzcan infecciones generalizadas o localizadas, y,en este caso, según el órgano o sistema predominantemente afectados, como elSNC, aparato respiratorio, piel, mucosas, conjuntiva, hígado y glándulas salivares.Físico- química Esta clasificación se basa en las características del virión, ácido nucleico yproteínas del cápside: 1- En el virión se consideran su morfología y estructura, en especial la forma y tamaño, la presencia de envoltura, la simetría del cápside, el numero de capsómeros y el diámetro de la espiral de ribonucleoproteinas. 2- En el ácido nucleico, se tiene en cuenta el tipo de ac nucleico, peso molecular, continuo o segmentado…etc. 3- En las proteínas de la cápside se considera fundamentalmente se numero. La clasificación y nomenclatura de los virus que afectan al hombre, deacuerdo al Comité de Taxonomía de Virus (1982)3- TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS3-1 Toma de muestras Antes de la inoculación es necesario efectuar una serie de operacionespreliminares que son de importancia fundamental, pues de su correcta ejecucióndepende muchas veces el éxito del aislamiento. Se debe seleccionar la muestra quetenga mayores probabilidades de contener el virus (secreciones respiratorias,heces, LCR, orina, etc.) y obtenerlas en el momento oportuno, especialmente en los 9
  9. 9. comienzos y fase aguda de la enfermedad (menos de 5 días), pues, mas adelantescon la aparición de AC es cada vez mas difícil. Además, suele ser aconsejable la obtención de 3 a 10 ml de sangrecoagulada en la fase aguda de la enfermedad, separando el suero y conservándola(por lo menos a -20ºC) para posible referencia en las pruebas serológicas, si mastarde se demuestra que puede ser de utilidad. Existen algunas reglas sencillas relacionadas con la recogida de lasmuestras. Para las gasas, torundas y otras muestras que pueden desecarse duranteel transporte al laboratorio es necesario un medio de transporte de virus (MTV).Generalmente se utiliza solución fisiológica tamponada con proteína comoestabilizador, a la que se añaden antibióticos, como penicilina o vancomicina,gentamicina y anfotericinaB, para eliminar el crecimiento bacteriano y fúngico. Elcaldo de infusión de ternera, 1% de albúmina sérica bovina y leche de vaca,ligeramente desnatada, constituyen alternativas utilizables. En la actualidad sedispone de diversos medios de transporte comerciales.La toma de muestra debe ser selectiva:Síndromes respiratorios El punto de recogida primario de las muestras son las vías respiratorias.Para la recogida de frotis faríngeos se utilizan torundas de algodón, rayón odracon. Las muestras nasofaríngeas se obtienen insertando en la nasofaringe unescotillón flexible, dejándolo durante 1 minuto. Los métodos alternativos incluyenaspirados o lavados nasofaríngeos. También resultan para detectar citomegalovirusen pacientes inmunodeprimidos.Síndromes del sistema nervioso central En los pacientes con meningitis o encefalitis se deben obtener heces,muestras de la garganta y LCR. Si se sospecha la existencia de paperas, lasmuestras de orina también pueden tener valor. De 5 a 10 g de heces, recogidas en un frasco con tapón de rosca, seprefieren para el aislamiento de enterovirus, pero esto puede retrasar la iniciacióndel trabajo mientras se espera que el paciente defeque. Una alternativa útilconsiste en la obtención de un frotis rectal, sumergido en MTV. En los enfermos en quienes se sospecha una encefalitis por herpes simplesuele ser necesario hacer una biopsia cerebral para poder establecer undiagnostico cronológico y exacto. El LCR, de 1 a 3 ml, se recoge en un tubo estéril y se conserva sin otroprocesamiento hasta su inoculación.Exantemas y enantemas 10
  10. 10. Se deben obtener muestras por medio de torundas de la garganta orectales; además, cualquier lesión ulcerada debe frotarse directamente con latorunda y ésta se coloca en MTV. Si están presentes lesiones vesiculares o ampollares, pueden ser aspiradaspor medio de una jeringa de insulina o un tubo capilar, se coloca el contenido enMTV y a continuación se enjuaga el tubo o jeringa con MTV. También puedefrotarse la base de la lesión y colocar la torunda en el mismo vial de MTV. Laspequeñas lesiones pueden liberarse cuidadosamente de su cubierta. Con frecuenciaes útil conseguir muestras de varias lesiones y juntarlas en un solo vial de MTVpara conseguir un aumento de los virus obtenidos. En caso de sospechar sarampión,parotiditis o rubéola deben recogerse muestras de orina.Síndromes oftalmológicos Las muestras de secreciones de la conjuntiva se recogerán con un hisopoestéril mojado con solución de Hanks o solución salina, frotando con éste laconjuntiva palpebral. Se debe hacer una toma por cada ojo de formaindependiente, y se introduce en MTV. Los raspados cornéales y conjuntivalesdeben realizarse por un oftalmólogo.Otras muestras:-Orina Suele ser una buena fuente de cultivo para infecciones congénitas oadquiridas debidas a citomegalovirus, cistitis hemorrágica aguda asociada conadenovirus. En ocasiones los virus de la parotiditis también pueden detectarse enla orina hasta después de 2 semanas del inicio de la enfermedad. Las muestrasobtenidas del chorro medio, 5 a 10ml, se prefieren y han de transportarse lo máspronto posible al laboratorio. Algunos laboratorios prefieren, en caso de que existeuna espera de diversas horas ante de procesar la muestra, la alcalinización de laorina hasta pH de 7.-Líquido pleural, lavados traqueo bronquiales, líquido articular, etc Se recogen en recipientes estériles sin otro tratamiento antes deltransporte.-Sangre En general no suelen llevarse a cabo hemocultivos para los virus, sinembargo, vale la pena considerarlo en algunas circunstancias como cuando sesospechan infecciones por citomegalovirus en pacientes inmunodeprimidos, en casode fiebres hemorrágicas víricas, y en determinadas infecciones por arbovirus. Losresultados de estos cultivos es muy bajo. También se pueden realizar intentos de 11
  11. 11. aislamiento en el suero o en material leucocitario de muestras de sangreheparinizadas o citratadas.-Material de biopsias Se colocará el tejido en un frasco estéril con cierre de rosca. En general de1 a 3 gr. de tejido son suficientes. Si sólo se pueden conseguir piezas muy pequeñasdel tejido, deben colocarse en un vial de MTV para evitar que se sequen.-Especimenes post-mortem. Se deben obtener con instrumentos estériles, a fin de prevenircontaminaciones, y tratarse del mismo modo que los tejidos de biopsias.-Semen Es una buena muestra para aislar Cytomegalovirus. Se introducen 1-2 ml enMTV.3.2 Transporte de las muestras Cuanto más rápido se envíe una muestra al laboratorio, mayores serán lasposibilidades de aislamiento de los agentes virales. No dejar nunca una muestra atemperatura ambiente o en la estufa de incubación. Si no se va a procesarinmediatamente, lo mejor es mantener las muestras refrigeradasaproximadamente entre 2 y 8ºC, pero no congeladas. La congelación sólo debeefectuarse si ha de existir un retraso de 1 día o más entre la recogida y eltratamiento de las muestras. El transporte al laboratorio de la muestra refrigerada, se puede realizar dedistintos modos, que incluyen la utilización de cajas selladas de hielo en recipientesaislados, hielo en bolsas, o si las distancias que hay que recorrer son cortas, secolocarán los recipientes con las muestras en una caja con hielo triturado. Cuandola congelación no se puede evitar, se debe realizar una congelación instantánea dela muestra. Se pueden agregar citoprotectores como el sorbitol cuando esnecesario congelar la muestra, pero aún así las condiciones de congelación ydescongelación deben ser muy rígidas. Debemos de tener en cuenta que las muestras que tienen que remitirse porvía aérea o por correo deben estar marcadas adecuadamente como materialinfeccioso y embaladas correctamente de acuerdo con las normas vigentes. Lasmuestras transportadas localmente deben cerrarse cuidadosamente y colocarse enbolsas de plástico selladas.4- MÉTODOS DE CULTIVO 12
  12. 12. Los virus sólo se desarrollan en el interior de células vivas. Para suaislamiento y cultivo se han utilizado diversos procedimientos.4.1 Animales de experimentación La inoculación de virus en los animales de experimentación puede produciruna enfermedad con lesiones características. Es el método más antiguo para aislary conservar los virus. Los poliovirus por inoculación intracerebral al mono puedenproducir un cuadro paralítico y el virus de la gripe por instalación nasal al hurón, uncuadro febril benigno. Pero debido a su elevado costo, a la presencia de viruslatentes y por presentar dichos animales una respuesta inmunitaria, los métodos deinoculación se emplean cada vez menos y quedan reducidos a la inoculaciónintracerebral de ratones adultos y lactantes para el aislamiento del virus de larabia, togavirus y algunos virus Coxsackiea. Sin embargo, los animales se utilizan eninvestigaciones experimentales sobre virus oncogénicos, sobre la patogenia einmunidad de las virosis y para la obtención de antisueros.4.2 Huevos embrionados Presentan la ventaja de ser animales bacteriológicamente estériles, conescaso riesgo de virus latentes y sin producir respuesta inmunitaria. Los virus sepueden inocular en la cavidad alantoidea (virus de la gripe), y es posible obtener asíel crecimiento en toda la membrana corioalantoidea, en la cavidad amniótica, o seadirectamente en las vías respiratorias del embrión (virus de la gripe y de laparotiditis), o en el saco vitelino (virus del herpes). Para esto se practica unagujero en la cáscara de huevos embrionados de 7 a 14 días de incubación y seinyecta el inóculo en el líquido que baña la membrana que se desea infectar. Eldesarrollo del virus se manifiesta por la muerte del embrión (virus de la parotiditisy del herpes) o la producción de hemaglutininas (ortomixovirus). También puedeninocularse directamente en la membrana corioalantoidea y detectarse su desarrollopor la aparición de lesiones características, como ocurre en los poxvirus yherpesvirus. En la actualidad, el empleo de huevos embrionados ha quedadolimitado al cultivo de los poxvirus y sobretodo del virus de la gripe (ortomixovirus),tanto para su aislamiento como para la producción de vacunas.4.3 Cultivos tisulares Aunque los cultivos de tejidos o de células se conocen desde hace tiempo, nohan podido utilizarse de manera sistemática para el desarrollo de los virus, hasta eldescubrimiento de los antibióticos que han permitido evitar las contaminacionesbacterianas. Las células pueden cultivarse a partir de fragmentos de tejidos (cultivostisulares), de células aisladas o disociadas (cultivos celulares) o de cortes deórganos que conservan su arquitectura (cultivos de órganos). En la actualidad, loscultivos celulares constituyen el método de elección para el desarrollo de la 13
  13. 13. mayoría de virus, y se utilizan los cultivos de órganos para el aislamiento de virusde difícil desarrollo o en casos especiales. 4.3.1 Cultivos celulares El descubrimiento efectuado por Enders de que los virus eran capaces dedesarrollarse en cultivos de células aisladas o disociadas ha constituido el métodofundamental para el desarrollo de los virus. Los cultivos de células aisladas en medios artificiales son muy inestables, demanera que los cultivos primarios de células animales, al cabo de pocos pases ocultivos secundarios, mueren. En ocasiones pueden seleccionarse células, queconservan su morfología, carácter diploide, y mantienen su capacidad decrecimiento, lo que permite obtener una cepa de células diploides, que al cabo de unnúmero limitado de pases puede morir o dar lugar a algunas células muy alteradasen cuanto a morfología y dotación genética, que presentan la propiedad de crecermás rápidamente de manera continua y regular; son las líneas celulares. Estos trestipos de cultivos celulares son los más utilizados en virología. A – Cultivos celulares primarios Consisten en el cultivo de células aisladas procedentes de tejidos normales.Si se tratan tejidos u órganos del hombre o del animal con tripsina, las células deltejido se separan o disgregan obteniéndose suspensiones de células aisladas, que,una vez lavadas y contadas, se pueden sembrar en tubos o matraces que contenganun medio de cultivo adecuado. Las células sedimentan, se adhieren al vidrio y semultiplican (alrededor de una división diaria) formando islotes de crecimiento quese extienden progresivamente hasta que entran en contacto, momento en el que seinhibe su crecimiento (fenómeno de inhibición por contacto), formando una capamonocelular en la pared del tubo o matraz, que constituye el sustrato sobre el quese desarrollarán los virus. Los cultivos se mantienen cambiando el medio dos o tresveces por semana y, cuando están muy desarrollados, se añade al cultivo tripsina,obteniéndose células aisladas, lo que permite iniciar un nuevo pase (cultivossecundarios). Los cultivos de células de riñón de mono y de diversas célulasembrionarias (fibroblastos de embrión de pollo, células renales de embrión humanoy células amnióticas humanas) son los más empleados. Es el método más costoso, pero las células presentan un amplio espectro desensibilidad. B – Cultivos de células diploides Se observó que el cultivo de tejidos embrionarios humanos permitíaseleccionar en algunos casos cepas de fibroblastos que podían multiplicarsedurante 50-100 pases, sin perder su carácter diploide, es decir, conservando sucariotipo normal. Su sensibilidad a los virus es mayor que la de las célulasadaptadas (cepas WI-38 y MRC-5). 14
  14. 14. Presentan la ventaja de no llevar virus latentes, como las células primariasde origen animal, ni estar infectadas por micoplasmas. Se emplean para elaislamiento de los virus de la varicela, rinovirus, citomegalovirus, etc. C – Líneas celulares En el curso del tiempo se ha conseguido adaptar células al cultivo indefinidoin vitro, de manera que se pueden pasar de tubo a tubo de cultivo, sin tener querecurrir al tejido u órgano del que proceden. Las células adaptadas hanexperimentado una mutación en virtud de la cual presentan caracteres semejantes,cualquiera que sea su procedencia. Son de aspecto epitelial, su dotación de cromosomas es variable (aneploide)y su sensibilidad a los virus está muy limitada (poliovirus, virus Coxsackiea B,adenovirus, virus respiratorio sincitial, de la rubéola y del herpes). En la actualidad existen numerosas líneas de células adaptadas que puedenproceder de células neoplásicas derivadas de carcinomas humanos (cepas Hela*,KB, HEp-2) o normales, como las líneas de células renales de mono (Vero, LLC-MK2), hámster (BHK-21) y conejo (RK-13). 4.3.2 Cultivos de órganos Recientemente para el aislamiento de algunos virus de difícil cultivo se hanutilizado cultivos de órganos. Son cortes de órganos embrionarios, que en un medioadecuado pueden mantener su estructura y funciones durante un corto período detiempo. Se han empleado cultivos de tráquea embrionaria para el aislamiento decoronavirus y otros virus respiratorios y de intestino embrionario para loscoronavirus intestinales y algunos rotavirus.Factores a tener en cuenta en la conservación de medios de cultivo celulares: Los medios de cultivo celulares una vez preparados deben conservarsecongelados. La actividad celular puede ser mantenida a temperaturas de -70ºCdurante meses, y a -196ºC (con nitrógeno líquido) durante años. Estos productos deben ser fraccionados en partes alícuotas adecuadas, entubos de plástico estériles, debidamente identificados con la fecha, número delote y producto de que se trate. Las sucesivas congelaciones y descongelaciones de éstos van en detrimentodel medio, y la manipulación excesiva aumenta el riesgo de contaminación. Antes de ser congelados se les suele añadir un agente crioprotector comoglicerol o dimetilsulfóxido (DMSO). Reducen la pérdida de electrolitosintracelulares, y reducen la cantidad de agua disponible para la formación decristales de hielo, con lo que protegen las células durante la congelación ydescongelación. Se recomienda una congelación lenta de la suspensión celular. Descender latemperatura de 1-3ºC por minuto, esto se logra introduciendo los viales a congelaren un envase de poliestireno, rellenándolo con algodón. 15
  15. 15. La descongelación debe ser rápida para evitar el daño celular. A estos medios de cultivo se les deben de añadir una serie de componentessólo antes de ser utilizados.5- MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN Después de que las muestras son inoculadas en el cultivo celular apropiado,se incuban a 35-37ºC. La multiplicación del virus en estos cultivos puedereconocerse por manifestaciones diversas: 1) Por su efecto citopático (ECP) Los virus pueden producir diversas alteraciones de las células y del cultivomonocelular, que muchas veces son características. A nivel celular se puedenobservar: - Alteraciones nucleares (adenovirus, herpesvirus) - Alteraciones citoplásmicas (picornavirus, poxvirus) - Alteraciones de la envoltura, con fusión de las células vecinas, formación de sincitios o policariocitos (virus respiratorio sincitial y del sarampión) - Aparición de cuerpos de inclusión, que pueden acompañar o no las alteraciones anteriores. En la capa monocelular se observa que las células alteradas se redondean yretraen, pueden llegar a despegarse del vidrio del tubo o matraz, y su distribuciónpuede ser difusa o en focos aislados. La observación de estas lesiones puedeefectuarse ya en fresco en el propio tubo o matraz de cultivo celular o enpreparaciones teñidas, proporcionando datos de interés para la identificación delvirus. El virus del Herpes simple es uno de los más frecuentemente aislados en loslaboratorios, y tras su inoculación se observa que: - Alrededor del 60% de los cultivos presentan ECP dentro del primer día. - Alrededor del 75-80% muestran ECP durante el segundo día. - Alrededor del 91-98% muestran ECP durante el 5, 16 y 19 días. 2) Por la aparición de hemaglutininas o de Ag fijadores de complemento. Estos sólo aparecerán en el medio, si éste ha sido infectado por un virus queinduce a la célula parasitada la formación de estos Ag. 3) Hemadsorción. 16
  16. 16. Es la fijación de los glóbulos rojos en la membrana de las células infectadas. Sepresenta con los virus hemaglutinantes y es debida a la presencia de lahemaglutinina en la membrana de las células. 4) Fenómeno de interferencia. Las células infectadas por un virus no citopático pueden presentar unaspecto normal, pero no son sensibles a la súper infección por un virus queproduzca acción citopática; el primer virus bloquea el desarrollo del segundo einterfiere en él. EJEMPLO: El virus de la rubéola infecta el riñón primario de mono verdeafricano y se reproduce bien en él; sin embargo, no tiene lugar ECP nihemadsorción. La presencia del virus de la rubéola se demuestra mediante laincubación de los cultivos de las células infectadas durante 7 ó más días, yañadiendo a continuación otro virus “estimulante”, del que se sabe que infecta loscultivos celulares y produce ECP. Si el virus estimulante no logra causar ECP, esprobable que esté presente el virus de la rubéola y que haya interferido en lareplicación del segundo virus (probablemente por la producción de interferón). 5) Detección directa del virus por microscopía electrónica 6) Inhibición metabólica Las células infectadas por el virus no son capaces de metabolizar un sustratode glucosa, esto se aprecia mediante la colocación de un indicador de pH como RojoFenol y observando que no vira de color por la no acidificación del medio de cultivo. 7) Métodos inmunológicos -Inmunofluorescencia directa e indirecta, detectando la presencia del virus osus Ag en las células mediante el empleo de un suero inmune marcado consustancias fluorescentes. -Métodos inmunoenzimáticos -Reacciones de fijación de complemento La identificación del virus aislado se realiza en dos etapas; en primer lugar, seefectúa el diagnóstico provisional de familia o de grupo basándose en el cuadroclínico del enfermo, el animal o el tipo de células, en que se ha desarrollado el virusy la manifestación visible de su crecimiento (apartados 1 al 4 y 6). La identificaciónfinal o el diagnóstico de certeza se efectúa por pruebas serológicas utilizandocomo Ag el virus aislado. 17
  17. 17. 6- DIAGNÓSTICO Los métodos de diagnóstico de las infecciones producidas por virus puedendividirse en dos grandes grupos: métodos directos basados fundamentalmente enel aislamiento del virus de los productos del enfermo y métodos indirectosdirigidos a la demostración de un aumento del título de Ac en el curso de laenfermedad. Como estos métodos suministran por lo general resultados tardíos,han surgido técnicas de diagnóstico rápido, que se están desarrollando en laactualidad. A) Métodos de aislamiento Constan de tres etapas: toma de muestras, inoculación e identificación del virusaislado. B) Métodos serológicos Se basan en la demostración de un aumento del título de Ac durante el curso dela enfermedad. Para interpretar debidamente los resultados de las reaccionesserológicas deben tenerse en cuenta las fechas del comienzo de la enfermedad yde obtención del suero, así como el intervalo entre los dos sueros. También se puede efectuar el diagnóstico de presunción de infección recientecon una sola muestra de suero determinando los Ac ligados a las IgM, que son losque aparecen primero en la infección y desaparecen rápidamente. Se utilizaespecialmente en el diagnóstico de las infecciones congénitas (rubéola,citomegalovirus), pues, como las IgM maternas no atraviesan la placenta, suhallazgo en la sangre del cordón es significativa de infección reciente. Las reacciones serológicas más empleadas en virología clínica son: 1) Reacción de neutralización (búsqueda de Ac neutralizantes) 2) Reacción de fijación de complemento (busco Ac fijadores de complemento) 3) Reacción de inhibición de la hemoaglutinación. Algunos virus presentan la propiedad de aglutinar los hematíes de diversas especies de animales, propiedad que puede ser inhibida específicamente por los Ac existentes en el suero de los enfermos. 4) Otras técnicas: Inmunodifusion (ID) y Contrainmunoelectroforesis (CIE) 18
  18. 18. C) Métodos de diagnostico rápido Recientemente se han desarrollado métodos de diagnostico mas rápidos, quepermiten obtener el resultado en el mismo día de la obtención de la muestra. 1. Microscopia electrónica. Observación directa de la morfología del virion mediante examen de la muestra al microscopio electrónico por el método de tinción negativa. 2. Inmunofluorescencia (IF). Se empieza a utilizar el diagnostico rápido de la virosis. Pero que exige un equipo costoso y personal especializado. Se utiliza en centros especializados. 3. Inmunoanalisis: − Radioinmunoanalisis (RIA) − Enzimoinmunoanalisis (EIA) y en especial ELISA. Ambas técnicas se están utilizando en el diagnostico de las virosis, para la detección tanto de Ag. Como de Ac (IgG e IgM). 4. Inmunocromatografia. 5. PCR o sonda genética.7. PRINCIPALES VIRUS IMPLICADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS A) VIRUS SIMPLE (VHS) Como todos los miembros de la familia Herpesviridae. Producen infeccioneslatentes, capaces de reactivarse, con o sin lesiones que sirven de fuente deinfección para individuos susceptibles. Existen dos tipos: VHS-1 y VHS-2,presentando el primero mayor tropismo por lesiones por encima de la cintura,encefalitis, infecciones oculares y en algunos casos infección diseminada. Esta muydistribuido por todo el mundo y la infección suele ser bastante leve. El VHS-2 seencuentra principalmente en los genitales, trasmitiéndose por vía venérea yproduciendo mayor parte de las infecciones generalizadas en el neonato. El diagnostico se puede realizar con tinción de Wright o Giemsa de célulasraspadas de lesiones herpéticas, para observar las características células gigantesmultinucleadas. También se puede cultivar. Los métodos serologicos son de escasautilidad. 19
  19. 19. B) VIRUS VARICELA-ZOSTER (VVZ) Pertenece a la familia Herpesviridae. La varicela y el herpes zoster representan diferentes manifestacionesclínicas de un mismo virus, el VVZ. La varicela es mas frecuente en niños y secaracteriza por fiebre y exantema vesicular diseminado. Constituye la infecciónprimaria y muestra una prevalencia estacional (fin del invierno – primavera). Lareactivación producirá el herpes zoster, que aparecerá normalmente en adultos ysin distribución estacional, consistiendo en una inflamación de las raíces dorsalesde los nervios raquídeos o de los ganglios sensitivos craneales. Frecuentementeaparece cuando hay una disminución de la inmunidad. El diagnostico de la infección por este virus suele ser de tipo clínico, peroen ocasiones puede ser importante la confirmación por el laboratorio(inmunodeprimidos, gestación) existiendo distintos métodos: − Serologia: Elisa − Cultivo celular. B) VIRUS DEL EPSTEIN BARR (VEB) Pertenece a al familia Hervesviridae. Es uno de los virus humanos mas ubicuos, cuya infección primaria es posible enla primera infancia, aumentando su seroprevalencia hasta el 60-70% en jóvenes yalcanzando el 80-90% en adultos. El síndrome clínico mas frecuente es lamononucleosis infecciosa, que puede presentarse con fiebre, adenopatías,faringitis, y linfocitosis con linfocitos atípicos, siendo característica de adultosjóvenes. El VEB también se ha asociado a carcinoma nasofaringeo y al linfoma deBurkitt. En cuanto al diagnostico de este virus, aunque existen algunas líneas celularessusceptibles de ser infectadas, lo mas utilizado es la serologia. La prueba mashabitual es la de Paul Bunnell o detección de Ac heterofilos, ya que es muy sencillay presenta una buena sensibilidad. También se pueden utilizar métodos de ELISA einmunofluorescencia, para al detección de marcadores específicos del virus como elAg de capside (VCA), Ag precoz (EA) o Ag nuclear (EBNA) C) VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) Pertenece a la nueva familia Hepadnaviridae. Con gran importancia socio-sanitaria y de distribución mundial. Se calcula que en el mundo hay unos 350millones de portadores del virus, de los que unos 350.000 desarrollaran cirrosishepática o carcinoma hepatocelular, que son las complicaciones mas importantesque puede causar. 20
  20. 20. 4.1 Estructura antigénica Se distinguen una serie de estructuras del virus que dan lugar a losmarcadores serologicos. En primer lugar, el Ag de superficie del virus HbsAg oantigeno Australia, que es un marcador de infecciosidad y esta codificado por elgen S. Su correspondiente anticuerpo HbsAc o anti-Hbs confiere inmunidad. Acontinuación, esta el antigeno del core o nucelocapside, HbcAg, codificado por elgen C y que no se detecta libremente en sangre, pero si su correspondienteanticuerpo, llamado HbcAc y que es un buen marcados epidemiológico ya que suelemantenerse de por vida. Además si se determina la IgM frente al core (IGM-HbcAc), se obtiene el marcador mas fiable de hepatitis B aguda. Por ultimo, seencuentra el antigeno soluble, el HbeAg y su correspondiente anticuerpo, HbeAcque se va a utilizar como marcadores de pronostico de la enfermedad pues secorrelacionan con el nivel de replicación del virus. Además, en el virusdistinguiremos su genoma (ADN) y una polimerasa. El virion completo recibe el nombre de partícula de Dane, ya que existenformas incompletas en sangre (HbsAg).4.2 Infección por VHB La mayor parte de las infecciones son subclínicas y únicamente se detectanen controles serologicos. Asimismo, la mayor parte de las infecciones sintomáticasson autolimitadas y se resuelven en menos de 6 meses. En cuanto a la lesiónhepática puede ser nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (0,25%). Lasintomatología clínica es similar a la hepatitis A, con fiebre, mialgias, fatiga,ictericia, anorexia, dolor de cabeza, o dolor en epigastrio acompañado de unaaumento de las transaminasas y hepatomegalia. El periodo de incubación es de 60-110 días y puede haber erupción maculopapular y urticaria.Entre el 5-10% de las infecciones se hacen persistentes y pueden mantenerse depor vida. En la mayor parte de las ocasiones, la función hepática y la histología semantienen normales, siendo por tanto un portador asintomático, pero en otrasocasiones dan lugar a síndromes designados como hepatitis crónica persistente(HCP) y hepatitis crónica activa (HCA). La HCP es menos progresiva que la HCA,que puede ser mas grave y desembocar en cirrosis. En la evolución de la enfermedad, la respuesta inmunitaria juega un papelimportante.4.3 Epidemiología La hepatitis B esta ampliamente distribuida por todo el mundo, pero existenáreas hiperendemicas, de endemia media y baja. Nuestro país perteneces alsegundo grupo. El único reservorio importante en el hombre. 21
  21. 21. Aunque la sangre y los productos sanguíneos son la fuente de infecciónmejor documentada, también se han detectado HbsAg en heces, orina, bilis,lagrimas, semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial ysangre de cordón. Pero solo se ha demostrado experimentalmente la transmisióncon sangre, saliva y semen. Siendo las vías mas importantes de la transmisión delvirus, la parenteral, y el contacto sexual. Esta claramente demostrado que el virusdifunde también mediante utensilios y materiales de hospitales de uso intimo, porcontacto con las musocas. De modo que el personal sanitario, los familiares deportadores crónicos y otros grupos de riesgo corre un mayor riesgo de contraer lainfección. La llamada transmisión vertical, del VIHB tiene gran importancia, no solopor la posibilidad de que se infecte el neonato, sino también por la gran frecuenciade evolución hacia el estado de portador crónico.4.4 Diagnostico Es necesario el diagnostico de laboratorio que es fundamentalmenteserologico. Además, el VHB requiere un control serologico posterior ya que, comoya se ha expuesto, la persistencia de HbsAg durante 6 meses implica el estado deportador crónico. En función de los Ag y Ac que se detecten, se puede especular sobre elestadio de la infección. Ejemplo, si a partir de los 6 meses de la infección sedetectan niveles altos de HbsAg siendo indetectable el AntiHBs, persistiendo lapresencia de AntiHBc y detectándose el HbeAg, estas personas sonpotencialmente infecciosas para otras, y puede evolucionar a una hepatitis crónicapersistente, o a hepatitis crónica activa, que puede progresar en cirrosis. De ahí la importancia ante un caso comprobado de hepatitis B, un controlserologico exhaustivo, para ver su pronostico individual, y la evolución de laenfermedad.4.5 Prevención La mejor medida para combatir las infecciones virales es la prevención,sobre todo en el caso del VHB, por el riesgo que conlleva de cronicidad. Teniendoen cuenta que es un virus muy contagioso. En la actualidad se dispone de medidas eficaces de inmunidad activa ypasiva. En cuanto a la inmunización pasiva se cuenta con una gammaglobulinahiperinmune eficaz en situaciones de pre y postexposicion, siendo este ultimo casoel mas utilizado. La inmunización activa se realiza mediante la administración deuna vacuna, en principio obtenida de concentrados de plasma y actualmentemediante ingeniería genética (obteniéndose el HbsAg de levaduras). La vacuna produce respuesta inmunitaria en un 90-95% de la poblaciónnormal, y en la actualidad se llevan a cabo programadas de vacunación en grupos deriesgo: personal sanitario, familiares o personas que conviven con portadorescrónicos, pacientes en diálisis, hijos nacidos de madres HbsAg positivo. 22
  22. 22. Actualmente ya se ha incluido esta vacuna en el calendario de vacunación infantil,aplicando tres dosis, a los 0.1 y 7 meses. Los niños que no han entrado en estenuevo calendario, se les aplica la vacuna a los 12 años.B) VIRUS ARN 1. VIRUS DEL RESFRIADO COMUN EL agente etiológico mas frecuente del resfriado común es un Rhinovirusperteneciente a la familia Picornaviridae. Existen al menos 100 tipos diferentes yrara vez es necesario el diagnostico del laboratorio, para lo que se puede utilizar elcultivo, aunque son agentes que presentan dificultades en el mismo. 2. VIRUS DE LA RUBÉOLA EL agente etiológico es un Rubivirus perteneciente a la familia Togaviridae.En 1940 en una epidemia de rubéola en Australia de el considero el responsable demuchas malformaciones congénitas, con elevado numero de cataratas congénitas ycegueras. La infección en niños o adultos suele ser benigna y autolimitada. Secaracteriza por síntomas respiratorios superiores leves, erupción eritematosa ylinfadenopatia. En adultos jóvenes se puede complicar con artritis transitoria oartralgias. Rara vez produce encefalitis o púrpura trombocitopenica. Muyimportante en la infección de gestantes, sobre todo en el primer trimestre, ya queconduce a la aparición de sordera neurosensitiva, alteraciones cardiacas,cataratas, retraso del crecimiento y síntomas encefaliticos. La incubación dura de14 a 21 días. Los métodos serologicos se utilizan para saber el estado inmunitario (IgG)sobre todo en la gestación, ya que en un resultado positivo indica inmunizaciónfrente al virus. También son validos para la detección de infección aguda (IgM), yes el método a utilizar como diagnostico aunque el virus sea cultivable. Se utilizandistintas técnicas, siendo muy utilizado el ELISA. Actualmente, es poco frecuente la rubéola congénita, debido a que la vacunade la rubéola es obligatoria, y se incluye en la triple vírica (paperas, sarampión yrubéola), que se administra a los 15 meses y a los 11 años a todos los niños. 3. VIRUS DE LA GRIPE El agente etiológico es un Inluenzavirus perteneciente a la familiaOrthomyxoviridae. La gripe es una infección respiratoria aguda que suele ser epidémica condistribución estacional (noviembre a abril). La vía de transmisión es aérea, con unperiodo de incubación de 1-4 días seguido de un espectro variable demanifestaciones clínicas respiratorias, que puede ser grave en los ancianos. 23
  23. 23. Además tiene gran importancia socioeconómica por la perdida de horas de trabajoque produce. Se realizan campañas de vacunación todos los años, ya que estos viruspresentan gran variabilidad antigénica que implica que la vacuna sea activa frenteal serotipo que esta causando la epidemia. En la actualidad se dirige a ancianos opacientes con enfermedades broncopulmonares. Hay tres tipos; A, B, C, siendo los dos primeros los que causan epidemias deimportancia. Los virus influenza A se subdividen según la diferente composiciónantigénica de la hemaglutinina y neuraminidasa. La nomenclatura que aconseja laOMS comprende el tipo, el origen geográfico, el numero de cepa, el año deaislamiento y los subtipos de hemaglutinina y neuaminidasa. Así el virus que produjola epidemia de 1987 s denomina S/Shangai/11/87 (H3N2). El diagnostico de estas infecciones suele ser de tipo clínico, estandoreservando el diagnostico de laboratorio para casos especiales o centros dereferencia, e incluye el cultivo del virus y los métodos serologicos (EIA, inhibiciónde la hemoaglutinación). Para el diagnostico rápido del virus influenza se puedeutilizar la inmunofluorescencia directa en aspirados nasofaringeos, esputos obiopsias de pulmón. 4. VIRUS DEL SARAMPIÓN El agente etiológico es un Morbillivirus perteneciente a la familiaParamyxoviridae. El sarampión es una enfermedad aguda, febril, exantematica, de gravedadvariable. Los rasgos característicos de sus síntomas clínicos hace posible sudiagnostico en la mayor parte de los casos sin ayuda del laboratorio. Sonpatognomónicas las manchas de KopliK. Las complicaciones mas graves sonencefalitis y neumonía. En la actualidad han disminuido mucho los casos de sarampión, aunque siguehabiendo brotes debido a la introducción en el calendario de vacunación oficial dela vacuna triple vírica (paperas, rubéola y sarampión) a los 15 meses de edad y a los11 años. En casos excepcionales se puede diagnosticar preferentemente pormétodos serologicos debido a la complejidad técnica del cultivo.. 5. VIRUS DE LA PAROTIDA O PAPERAS El agente etiológico es un Paramyxovirus perteneciente a la familiaParamyxoriviridae. Las paperas son una enfermedad contagiosa aguda con fiebremoderada de corta duración y cuyo rasgo clínico mas común es la parotiditis uni obilateral. Por ser tan característica la confirmación de laboratorio generalmentees innecesaria.. El periodo de incubación suele ser de 18 a 21 días, transmitiéndose por víarespiratoria. El virus se excreta en saliva y orina, desde 6 días antes hasta 9después de la inflamación de las parotidas. Entre un 25-50% de los casos puedenser asintomático. 24
  24. 24. En la actualidad es de vacunación obligatoria (triple vírica), produciendoinmunidad a largo plazo. Como complicaciones destacan las que afectan al testículo,ovarios y SNC, y menos habitualmente al páncreas, nervios periférico, ojo y oídointerno. Para su diagnóstico se dispone de métodos serologicos (actualmente seprefiere la detección de IgM), aunque el virus también es cultivable. 6. VIRUS DE LA RABIA El agente etiológico es un Lyssavirus perteneciente a la familiaRhabdoviridae. Enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran importanciahistórica por los trabajos de Pasteur. En nuestro país actualmente hay muy pocoscasos, pero en todo el mundo aun esta lejos de ser erradicada. De hecho, existe laobligación de vacunar todos los perros y garos. Se puede decir que la rabia es unazoonosis. El virus esta presente a menudo en la saliva de animales rabiosos,transmitiéndose por mordeduras. Las fuentes mas comunes de infección humanason los perros, los gatos, los zorros, los coyotes y los murciélagos.El diagnóstico solía realizarse postmorten, mediante la observación de los cuerposde Negri en el asta de Ammon (hipocampo). También se puede practicar lainoculación a ratones o métodos serologicos, pero estas técnicas están reservadaspara laboratorios muy especializados. Es importante realizarlo ante una sospecha,ya que es una enfermedad habitualmente mortal. El diagnostico se tratara derealizar en el animal que ha mordido al hombre. 7. VIRUS DEL SIDA (VIH) Es un virus ARN de la familia Retroviridae y subfamilia Lentiviridae. Lasimetría de su cápsula es icosaedrica y su forma esférica. Se caracteriza porsintetizar ADN a partir de ARN viral, a partir del enzima trascriptasa inversa.Estructura y tiposConsta de nucleocapside y envoltura. Sus principales genes son:A. Estructurales Gen Proteínas y Glucoproteinas GAG (Core) p7, p9, p17, p24 ENV (Envoltura) Gp120, gp41, gp12, gp36 POL (Polimerasa) P11, p13, p34, p51B. Reguladores: Genes TAT, REV, NEF, VIF, VPT, VPU, VPX. Regulan la replicaciónviral y el papel de todos ellos no esta completamente dilucidado. 25
  25. 25. En la actualidad se conocen dos tipos: el VIH-1 y el VIH-2. Se diferencianen que algunas de las proteínas que codifica su gen ENV son de distinto pesomolecular; así pues mientras que el VIH-1 la proteína de superficie es la gp 120 y lade la transmembrana es la gp41, en el VIH-2 los son respectivamente la gp 125, yla gp36. Además el VIH-1 es el responsable de la inmensa mayoría de casos de SIDA. ElVIH-2 presenta una virulencia inferior con mayor periodo de latencia y menosproporción de desarrollo de SIDA.Patogenia El VIH penetra en el organismo a través de líquidos corporales,fundamentalmente sangre y semen, procedentes de individuos previamenteinfectados.Una vez en la sangre, el VIH entra en contacto con las células que contienen en sumembrana CD4 que funcionan como una especie de receptor. La glucoprotéinagp120 de la envuelta del VIH se fija a la molécula CD4,iniciándose una fusión entrela envoltura del VIH y la membrana celular permitiendo la penetración del VIH enel citoplasma celular. Una vez dentro de la célula, la nucleocápside del virus se rompe y deja libreel RNA y la transcriptasa inversa, tras lo cual se pone en marcha la síntesis deDNA a partir del RNA vírico. A continuación, el DNA sintetizado se integra en el DNA celular,formándose un provirus. En este proceso intervienen 2 tipos de enzimas víricas:una endonucleasa que corta el DNA celular y unas ligasas que unen las 2 clases deDNA. Como los linfocitos Th son CD4 ,son una de las células más importantes queataca al VIH. Los linfocitos Th infectados pueden permanecer en este estadolatente durante largos períodos de tiempo. Pero el provirus puede activarse debidoa distintos estímulos como, por ejemplo, la existencia de otra infecciónconcomitante. Al activarse el DNA provírico induce la síntesis del RNA viral y deRNA mensajeros que van a inducir, a su vez, la síntesis de proteínas víricas.Formándose, de esta manera, nuevas partículas virales. Las nuevas partículas virales salen de la célula, mediante gemación, y sedirigen a atacar nuevos linfocitos Th.Evolución de la enfermedad La evolución del SIDA evoluciona en tres fases: infección aguda, infecciónasintomático e infección sintomática tardía. 26
  26. 26. 1) Infección aguda. Tras la entrada del VIH en el organismo se observa un período ventana en elque sólo se puede determinar la presencia del virus mediante técnicas muycomplejas, como su aislamiento por cultivo, la detección de Ag p24 y la búsqueda deDNA provírico mediante la prueba de PCR. El período ventana dura semanas omeses(normalmente 3 meses)y puede acompañarse de unas manifestaciones clínicasque reciben el nombre de enfermedad de la seroconversión. El fin del períodoventana coincide con el ascenso y, por lo tanto, con la detección en el suero de Accontra diferente proteínas víricas(seropositividad).Simultáneamente a esto último,se verifica un descenso de la antigenicidad y de la viremia hasta hacerseindetectables.2) Infección asintomático o período de latencia. Tras la infección aguda comienza esta fase, que puede durar varios años yen la que lo Ac de tipo IgG dirigidos contra las diferentes proteínas víricas semantienen en unos niveles detectables.3) Fase sintomático tardía El descenso de los Ac dirigidos contra las proteínas codificadas por el genGAG(Ac anti GAG) y la detección, de nuevo, del Ag p24 son indicadores de unareactivación de la infección y, por tanto, de su paso a una fase sintomático tardía.Analíticamente, en el SIDA también se observa:-una linfopenia (por descenso de linfocitos CD4) Linfocitos CD4 -una disminución del cociente --------------------------------------- Linfocitos CD8-un ascenso de la concentración de Ig en el suero.Manifestaciones clínicas de la infección por VIH Clínicamente, la infección por VIH se clasifica en 4 grupos, del 1 al IV,excluyentes entre sí, y que reflejan una progresión de la enfermedad, de tal formaque un paciente una vez introducido en un grupo no puede ser clasificadoposteriormente en un grupo inferior. 27
  27. 27. a)GRUPO I: corresponde a la enfermedad de la seroconversión y asemeja a uncuadro gripal o mononucleósido(período ventana),pero puede ser asintomático.b)GRUPO II: se relaciona con el período de latencia y, por tanto, en él hay unaausencia de síntomas y signos clínicos.c)GRUPO III: se caracteriza por la existencia de una linfadenopatía generalizadapersistente(PGL) que anatopatológicamente se observa como una hiperplasiareactiva benigna de los ganglios linfáticos, pero es probable que evolucione hacia unSIDA manifiesto.d)GRUPO IV: incluye ya manifestaciones clínicas de SIDA y se divide, a su vez, en5 subgrupos: -Subgrupo A: se denomina enfermedad constitucional y cursa con pérdidade peso corporal, fiebre que persiste más de 1 mes, sudoración nocturna y diarreaabundante que dura más de 1mes. -Subgrupo B: consiste en una enfermedad neurológica, debida a un ataque delVIH a algunas células del Sistema Nervioso. Se manifiesta condemencia, mielopatíay neuropatías periféricas. -Subgrupo C: comprende infecciones secundarias causadas, frecuentemente,por microorganismos oportunistas como el causante de la Neumonía, Toxoplasma,HSV, CMV, HERPES ZOSTER, infecciones recurrentes por Salmonella. -Subgrupo D: abarca cánceres secundarios, entre los cuales los másrelevantes son el Sarcoma de Kaposi y los linfomas no Hodgkinianos. -Subgrupo E: este subgrupo incluirá otras enfermedades. Es decir aquellosestados patológicos que no pueden incluirse en ninguno de los subgrupos anteriores.Se considera que un paciente tiene SIDA cuando:- Es seropositivo- El recuento de leucocitos Th es bajo- Y sufre un cáncer secundario y/o una infección oportunista claramenterelacionados con una afectación por el VIH.7-3) Epidemiología La OMS calcula que en el año 2000 los casos declarados de SIDA seelevarían a 1400000, mientras que los casos reales estarían entre 8 a 10 millones,siendo los portadores del virus de 25 a 30 millones. 28
  28. 28. Vías de transmisión son:-Sangre-Mediante relaciones sexuales-Transmisión vertical-perinatal En nuestro país cobra una especial importancia la transmisión por sangre,ya que el principal grupo de afectados son los UDPV(usuarios de drogas por víaparenteral), a diferencia de Francia o EEUU donde lo son los homosexuales.En cuanto a las tasas de transmisión madre-hijo oscilan entre 15-50%,cobrando unaespecial importancia en África. La transmisión al personal sanitario se calcula entre un 0,2% y requierecontacto con sangre, líquido corporal infeccioso o líquidos donde se haya cultivadoel virus. Esto hace que en la practica cotidiana se extremen las medidas deprecaución con estos pacientes ante la gravedad de la infección, considerando todolíquido corporal de un enfermo de SIDA como potencialmente infecciosos.7-4) Diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH El diagnostico de la infección del SIDA en nuestro medio esfundamentalmente serológico, cobrando especial importancia por las implicacionesque conlleva. Existen diversos productos génicos del VIH que se consideran antígenosprincipales para su utilización en las pruebas serológicas, estos incluyen lasproteínas y glucoproteínas codificadas por los genes GAG, ENV y POL. Estudiandolos niveles de Ag y Ac podremos diagnosticar y saber la evolución de laenfermedad. Se realizan técnicas de ELISA en primera instancia, aplicando a lospositivos métodos de confirmación: Western Blot(VB),inmunofluorescencia(IFI)otécnicas de radioinmunoprecipitación. Es el VB el más utilizado, ya que nos permite diferenciar los Ac frente a lasdistintas proteínas del virus, apareciendo bandas inmunorreactivas en una tira denitrocelulosa. El VB tiene distintos criterios para la interpretación de losresultados(la OMS y otras organizaciones)porque la presencia de distintas bandaspuede ser muy variable. De ahí que los resultados se clasifiquen en:-POSITIVO: se observan reacciones al menos frente a un producto en cada unade las 3 regiones génicas ENV, POL y GAG. Otras recomendaciones sugieren quecon observarse reacción en 2 regiones es suficiente.-NEGATIVO: no se observan bandas reactivas en los lugares de los Ag víricos. 29
  29. 29. -INDETERMINADO: se detecta la presencia de alguna banda frente a algunaproteína del virus. En este caso se recomienda una nueva prueba con un suerorecién extraído, y si todavía se cuestiona el resultado, se sugiere la repetición dela prueba al cabo de 2 a 3 meses. Las causas de un WB indeterminado incluyen la infección en su etapainicial, una posible reacción cruzada con otros retrovirus, idiopatía, y pacientes conAc HLA, hiperbilirrubinemia, conectivopatías o gammpatopatías policlonales. Los métodos de ELISA son cada vez más sensibles y específicos, concapacidad para detectar IgG e IgM, acortando el período ventana. También existen métodos rápidos, aplicables en situaciones de urgencia,como son la aglutinación con partículas de látex y la aglutinación de los eritrocitos,tienen una gran aplicación en casos de falta de recursos tecnológicos. Por último, están las técnicas de centros especializados: cultivo y PCR. El cultivo tiene la ventaja adicional de poder aplicar estudios de resistenciaa antivirales. La PCR es una técnica con mucho futuro que presenta una enormesensibilidad y especificidad, y aunque ya existen reactivos comercializados, aún noestán al alcance de la mayor parte de los laboratorios. Esta técnica permite laamplificación enzimático automatizada del DNA provírico o del RNA vírico. Unaimportante aplicación de estas técnicas es el diagnóstico de hijos de madresportadoras del VIH, ya que en este caso la serología al nacer y el los primerosmeses de vida siempre es positiva por transferencia pasiva de Ac. Por lo tanto,para saber si un niño está infectado, cosa que ocurre entre el 12-50%,senecesitarán pruebas diagnósticas que detecten al virus. También existen una serie de marcadores del seguimiento de laenfermedad, entre los que destaca el Ag p24,que se detecta en las fases precocesy en las tardías. También en las fases tardías se puede observar la disminución delos Ac anti p24. También se realiza el recuento de los linfocitos CD24, y el cocienteCD4/CD87-5)Prevención y tratamiento En la lucha contra el SIDA, la mejor medida es la PREVENCIÓN. Entreellas cabe destacar el uso de preservativos en las relaciones sexuales y el nocompartir la misma jeringuilla por parte de los toxicómanos intravenosos... Una vez instaurado el SIDA en el tratamiento de estos pacientes setendrán en cuenta las infecciones oportunistas y su profilaxis, su deterioroinmunológico y una terapia específica antiviral. En el tratamiento antiviral cabe destacar la AZT(acidotimidina ozidovudina) que, dificulta la trascripción inversa del RNA viral , pero no consigueerradicar el virus, aunque prolonga y mejora las condiciones de vida. Muyrecientemente se han creado grandes expectativas con la multiterapia. La vacuna es muy difícil de obtener por la complejidad del virus aunque seestán haciendo pruebas en voluntarios. 30
  30. 30. 8)VIRUS DE LA HEPATITIS A, C, D y EVIRUS DE LA HEPATITIS A Es un virus ARN, perteneciente a la familia Picornarividae, géneroEntenovirus, denominándose en la nueva nomenclatura virológica Entenovirus 72. Elvirus puede cultivarse en células de rión de titi, células de riñón de feto Macacusrhesus(FRhK6),células humanas de hepatoma, fibroblastos embrionarios humanos ycélulas diploides humanas de pulmón. El crecimiento puede demostrarse porinmunofluorescencia ya que el virus no es citotóxico. Conocido ya históricamente, pues hace más de 2000 años griegos y romanosya describieron epidemias de "ictericia infecciosa".Posteriormente se han descritomuchas epidemias sobre todo en períodos guerra. Sería MacCallum, en 1947,el queintroduciría el término Hepatitis A, para distinguirla de la B o hepatitis"sérica".Esta terminología sería aceptada por las OMS en 1973.Es de distribuciónmundial e infecta a hombres y a primates.Transmisión y acción patógena del VHA El VHA penetra por vía oral o parenteral, siendo la principal ruta dediseminación la feca-oral, en la que están implicadas el agua y los alimentos. Comoen muchas enfermedades infecciosas, el problema reside en que la mayoreliminación del virus en heces se da en la semanas previas a la aparición de laictericia, sobre todo en la fase tardía de la incubación. La excreción fecal puedecontinuar durante 1-2 semanas después de la aparición de la ictericia. Aunque se dacasos durante todo el año, tiene una incidencia estacional con picos en los meses deotoño. En un año porcentaje de casos da lugar a una infección subclínica o unahepatitis anictérica y en el resto(alrededor del 10%)a un cuadro de hepatitisaguda, de rápida evolución, buen pronóstico y muy raras complicaciones o tendenciaa la cronicidad .Existen casos, aunque raros, de hepatitis fulminante 0,1%. La hepatitis anictérica puede cursar sin síntomas alguno o con vagossíntomas de "empacho" o "afección gripal".Sólo la demostración de alteracionesenzimáticos (transaminasas)o el estudio de Ac específicos permiten el diagnóstico.Estas formas confirman la difusión del virus, pues entre 75-100% de la poblaciónadulta posee Ac anti VHA. La hepatitis aguda del VHA tiene un período de incubación de 10 a 50 díasy un comienzo brusco. Tras un período preictérico con anorexia, astenia, doloresabdominales, fiebre de 37-38ºC, cefaleas, artralgias, etc,.,aparece la ictericia conorinas colúricas y heces hipopigmentadas, persisten los síntomas gastrointestinalesy aparece hepatomegalia, acompañada o no de esplenomegalia. El cuadro evolucionafavorablemente y son muy raras las complicaciones. No se ha descrito el estado deportador crónico de la Hepatits A No requiere tratamiento. 31
  31. 31. Diagnóstico Junto a los datos clínicos, el diagnóstico debe ser comprobado con datos delaboratorio, que demuestren el daño o lesión hepática o bien presencia del virus ola respuesta humoral a él.-Test de lesión hepática: aparece hiperbilirrubinemia, con aumento de lastransaminasas(principalmente ALT), lactodeshidrogenasa y fosfatasa alcalina.-Demostración del virus: puede realizarse en las heces por observación almicroscopio electrónico hasta 2-3 semanas después de la aparición de la ictericia opor inmunofluorescencia directa en cortes de parénquima hepático obtenidos porpunción-biopsia, donde aparece en el citoplasma del hepatocito y de las células deKupffer.-Búsqueda de Ac: es el método más idóneo, pero, como el porcentaje deseropositivos es muy alto en la población sana, el diagnóstico de infeccion serealiza por la demostración de altos títulos de IgM anti-VHA. Las técnicas masusadas son el radioinmunoensayo(RIA) y el ELISA con Ag obtenidos de titisinfectados o heces humanas, y se recomiendan dos tomas de suero separadas por15-20 días.Epidemiología Los virus eliminados por las heces de los enfermos(semanas o meses) ypresentes en la sangre(2 semanas antes y 2 semanas después de la ictericia)constituyen fuentes de infección claras, pero la presencia de formas anictéricas yasintomáticas explica la gran difusión del VHA. Al lado del bien conocidomecanismo de transmisión feco-hidrícica(manos contaminadas, agua, leche,diversos alimentos e incluso utensilios de cocina, termómetros, etc)puede ocurriruna transmisión parenteral, ya que se considera que el 30% de todas las hepatitispor esta vía se producen por virus A. La hepatitis A afecta sobre todo a niños adolescentes de 5 a 15 años, yaparecen los brotes epidémicos(finales verano y otoño)en guarderías, colegios,orfanatos ,etc. Se han descrito epidemias en medio rural y en campamentosmilitares; los mayores brotes epidémicos se deben a origen hídrico o alimentario.En otras zonas la hepatitis A es endémica, con brotes cada 5-10 años. Se handescrito casos humanos, cuyo origen estaría en primates(personal de zoológicos)Inmunidad La Hepatitis A es una infección inaparente en la mayoría de la población, yse conservan títulos de Ac protectores durante muchos años. En nuestro medio,estos títulos aparecen en casi el 100% de las personas de edad superior a 35 años. 32
  32. 32. Profilaxis La profilaxis la podemos llevar a cabo en 2 niveles: en el mecanismo detransmisión o específica con ganma-globulina. En el mecanismo de transmisión se realiza mediante una correctadesinfección, higiene individual, cloración de agua, higienización de la leche ,mejoradel saneamiento general, etc. El virus es relativamente resistente a la inacivacionpor calor a 60ºC durante y 1hora,al éter y a los ácidos, pero se destruye porformalina a una concentración de 1/4000 a 37ºC durante 72h, y por cloro(1mg/ldurante 30 min.) La profilaxis con ganma-globulina debe administrarse, a ser posible, duranteel periodo de incubación o como mucho hasta 6 días después del comienzo de laictericia. Se dará en colectividades o familias en las que aparezcan un caso, en losbrotes que tengan un mismo origen(ej:hídrico) y en los visitantes de áreasendémicas. Se encuentra en experimentación una vacuna formalizada con la cepaCR3326(Costa Rica),cultivada en células FRhK6.VIRUS DE LA HEPATITIS D o delta(VHD) Es un virus ARN incompleto que requiere HbsAg para su replicación. Esdecir, sólo se producirá infección por el agente delta en las personas que tenganHbsAg en su sangre(hepatitis aguda o portadores crónicos),por lo que latransmisión y prevención del VHB se puede extrapolar aquí, ya que si no hayinfección por VHB no lo hay por VHD. Suele aparecer en personas con múltiples exposiciones parenterales,estando a la cabeza en nuestro país los ADVP(administración de drogas víaparenteral).La prevalencia en nuestro país se ha evaluado en torno al 5-10%. Hayzonas hiperendémicas en el mundo como la Amazona, África central o el sur deItalia.Tipos de infección El virus delta puede infectar de dos modos, que dependen del VHB:1)Coinfección: se da la infeccion simultáneamente por ambos virus. El curso naturalde la infeccion por VHB no se modifica, ya que la tasa de portadores crónicos quese obtiene es similar a la que se da cuando se infecta él sólo. Clínicamente es másgrave y la hepatitis fulminante es mayor.2)Sobreinfección: cuando sobreinfecta el agente delta a portadores crónicos delVHB. La mayor parte de las sobre infecciones(70%) desembocan en hepatitiscrónica. 33
  33. 33. Diagnóstico Se suele realizar por métodos serológicos detectando Ac frente alvirus(totales y del tipo IgM). Se debe sospechar en portadores crónicos de HbsAgcon hepatitis aguda o crónica especialmente si la enfermedad es grave o elpaciente ha tenido múltiples exposiciones parenterales.VIRUS DE LA HEPATITIS C (VHC) Es el virus más recientemente caracterizado y del que quedan aún muchosinterrogantes por resolver. Desde hace años, ya se conocía una forma de hepatitisaguda o crónica, seronegativa para el VHA y VHB, y sin ninguna otra causa quejustificara la lesión hepática. Era la llamada Hepatitis no-A, no-B, en la que labúsqueda de agentes etiológicos había sido infructuosa. Pero en 1988 Houghhton ycols, anunciaron la identificación y clonación del genoma viral de un agentecausante de la hepatitis no-A, no-B. Es el llamado VHC. En la actualidad se sabe quees el responsable del 80-90% de los casos de hepatitis esporádica.Infección La Hepatitis C es una forma de hepatitis "sérica", es decir que ladiseminación tiene lugar fundamentalmente por la vía parenteral. Es la causa másfrecuente de hepatitis postransfusional y está ampliamente distribuido entreADPV, pacientes en diálisis y hemofílicos. La tasa de Ac en la población normal ennuestro país es muy inferior a la del VHB. La clínica es similar a la hepatitis B, pero con gran tendencia a la cronicidaden torno al 50-70%.Diagnóstico Está basado en métodos serológicos. El primer método desarrollado fueELISA utilizando como Ag proteínas no estructurales y proteínas del core. El modode obtener estos Ad es por:-Ingeniería genética, clonándolos en E.Coli, levaduras-Ag de péptidos sintéticos En muchas ocasiones, se utilizan los llamados métodos de "confirmación",pudiéndose utilizar un Western Blot. Estos métodos son especialmente útilescuando la reactividad por el método ELISA no es excesivamente alta. Se estáintroduciendo la técnica de la PCR para la detección del ARN viral(por tantodetección del virus y NO de Ac) 34
  34. 34. Se utilizarán las medidas universales de precaución. Es decir, que todo sueroo líquido corporal es potencialmente infeccioso. Cualquier paciente con sospecha dehepatitis en cualquiera de sus formas, debe considerarse potencialmente de altoriesgo infeccioso y ha de llevar a extremar las medidas de precaución.VIRUS DE LA HEPATITIS E (VHE) La hepatitis C no explica todas las formas de hepatitis víricas no-A, no-B, yespecialmente algunas formas de transmisión fecal-oral descritas en la India,Pakistán, África del Norte y Méjico,, que causan epidemias de las cuales esresponsable el VHE. En 1983 se demostraría como agente causal de una caso dehepatitis. No cronificada, al igual que el VHA, tiene un pronóstico peor que éste ya quela mortalidad es 10 veces superior al VHA, La forma más grave aparece engestantes en el tercer trimestres del embarazo en las cuales aumenta lamortalidad. El virus se manifiesta en países que tienen un sistema sanitario deficiente,siendo lo más habitual la transmisión a través del agua de bebida. 35

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