• Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Be the first to comment
    Be the first to like this
No Downloads

Views

Total Views
3,541
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0

Actions

Shares
Downloads
112
Comments
0
Likes
0

Embeds 0

No embeds

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
    No notes for slide

Transcript

  • 1. LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI TRANSFORMASI GEN ke DALAM Escherichia coli (E.coli) dan ISOLASI PLASMID REKOMBINAN Disusun oleh : NAMA : EKA SAPUTRA STAMBUK : F1C1 10 069 KELOMPOK : II (DUA) ASISTEN : WAODE FITRIA SAKINAH JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALUOLEO 2013
  • 2. BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit
  • 3. dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. 1.2 Tujuan 1. Dapat melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman 2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA
  • 4. BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Isolasi DNA Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen(Campbell dkk.2004:221). DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf 2001:7). Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH.
  • 5. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220). B. DNA REKOMBINAN Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005). Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen. Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).
  • 6. C. SEL KOMPETEN
  • 7. D.
  • 8. E.
  • 9. Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen. Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).
  • 10. Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen. Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).
  • 11. Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang mempunyai ujung tidak rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan ujung rata (blunt end). Enzim ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan kovalen antara gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan, yang menghendaki satu nukleotida mempunyai ujung 5’ phosphate bebas dan nukleotida yang berdekatan mempunyai ujung 3’gugus hidroksil. Enzim ligase tidak membedakan DNA‐DNA dari organisme yang berbeda. Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun dapat digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian menjadi satu molekul DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA rekombinan ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan memperbanyaknya di dalam sel inang. Proses ini disebut sebagai transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005). Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).
  • 12. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah: 1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup (Sadava dkk.2004:220). 2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59). DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94). DNA juga dijumpai pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam lokasi hidupnya. Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi (Pierce2005:203). Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).
  • 13. Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan DNA. Prosedur ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya ≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-deoksiribosa akan dikonversi ke w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260 dan 280 nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm, sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan protein akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8. DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada gel agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal. Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa lebih lanjut menggunakan analisis PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan diferensiasi diulang dalam urutan genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan analisis. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam
  • 14. ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. KIRSMAN83.2010.isolasi DNA Elektroforesis Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. [2] Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan: Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA
  • 15. Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV Jenis Elektroforesis Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.
  • 16. 1.3 Metode Kerja Isolasi DNA Tanaman Alat : • mikrovivet berbagai ukuran • tabung 1,5 ml • tips mikropipet berbagai ukuran • saringan • gelas kimia • sendok • penangas • vorteks • mini sentrifuga • blender / lumping Bahan : • buffer ekstraksi (100 mM tris- HCl, Ph 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl, CTAB 2%) • Potasium asetat 5 M • SDS 20% • Kloroform : Isoamil alcohol (24:1) • Alkohol 100% (pa) • TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8) • Buah strowberi • CTAB 2%
  • 17. Elektoforesis DNA Range pemisahan molekul DNA dengan agarose gel Agarose % 0,3 Seaparsi optimal dari molekul DNA (Kb) 5,0-60 0,6 1,0-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7,0 1,2 0,4-6,0 1,5 0,2-4,0 2,0 0,1-3,0 Bahan kimia : • Buffer TAE 10 X (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA Ph 8 ) • Eidium bromida • Loading buffer • DNA Marker • Agarose Alat dan bahan : • Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray) • Power suply • Mikropipet digital • Transilluminator UV
  • 18. BAB II HASIL PENGAMATAN Tabel 1. Hasil Pengamatan Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan Keterangan Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit. Warna merah muda Sampel di homogenkan dengan cara dibolak-balik sebanyak 50x Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit Larutan Bening DNA
  • 19. Tabel 2. Pengamatan Hasil Elektroforensis DNA Foto Hasil Pengamatan Keterangan Tambahkan loading dye kedalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian Loading dye.
  • 20. Sampel dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel, alat siap dipasang dan disambungkan ke sumber listrik( elektroforesis pada daya 100 volt selama 30 menit )
  • 21. Fragmen DNA yg sempurna, karena tidak terurai Kontrol fragmen-fragmen DNA Fragmen DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna PERTANYAAN DAN JAWABAN Isolasi DNA 1. Hitung jumlah senyawa yang dimasukka pada tahapan kerja nomer 5, 14 dan 18! Buffer ekstraksi sebanyak 4 kali volume total sampel = 4 x Kloroform Isoamil Alkohol sebanyak ½ x volume total sampel = ½ x Alkohol sebanyak 2 x volume total sampel = 2 x 2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam isolasi DNA ! Buffer ekstraksi berperan dalam proses destruksi jaringan tanaman sehingga terjadi degradasi pada DNA. SDS berfungsi sebagai detergen yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein.
  • 22. Kloroform Isoamil Alkohol membantu proses denaturasi protein yang masih menempel pada kromosom. Alkohol digunakan untuk mempresipitasi asam nukleat. Elektroforesis DNA 1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis anda ! 2. Mengapa DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV ? Jelaskan ! DNA berukuran sangat kecil dan sulit untuk diamati, oleh karena itu untuk memudahkan pengamatan DNA diwarnai menggunakan Etidium bromida. Etidium bromida ini akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’. 3. Apakah Etidium Bromide ? Bagaimana cara kerja Etidium bromida dalam proses pewarnaan DNA ? Etidium bromida seperti telah disebutkan di atas adalah pewarna yang digunakan untuk mempermudah pengamatan DNA dalam gel. Etidium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’. BAB III PEMBAHASAN Isolasi DNA Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman strawberry. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan
  • 23. mengambil beberapa bagian dagiang buah strawberry yang dihancurkan didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi. Untuk mengisolasi jaringan buah strawberry, maka jaringan tanaman tersebut yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan warna larutan berubah menjadi merah. Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi larutan Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogeny sampel disimpan dalam wadah berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTABpotassium aesta-protein- debris sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada kecepatan 14.000 rpm selam 10 menit.
  • 24. Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna merah. Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya. Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1) yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 100%. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotorpengotornya. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung. Pembahasan Elektroforesis Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana, mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000pb. Selainitu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV. Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pitapita DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.Gambar pada hasil pengamatan kami ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai
  • 25. dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar. BAB IV KESIMPULAN DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. Pada praktikum isolasi DNA dari tanaman digunakan jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan, yaitu menggunakan daging buah. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi
  • 26. DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Dari hasil pengamatan dapat dilihat hasil dari tahap-tahap yang telah dilakukan. Isolasi DNA telah berhasil dilakukan. Hal tersebut dilihat dengan adanya benang-benang DNA yang terbentuk. Terbentuknya benang-benang tersebuut juga merupakan hasil dari proses tahapan-tahapan yang dilakukan dengan menggunakan larutan senyawa-senya tertentu. DAFTAR PUSTAKA Achmmad, Wendy., 2010. Isolasi DNA. Jusuf., 2010. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika DNA Rekombinan, Labortorium Bioteknologi. ITB. Wulan Sri, M., 2006. Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman
  • 27. Untuk Meningkatkan Kesejahteraan Hidup Manusia. Laboratorium Biologi Reproduksi, Jurusan Biologi, FMIPA – UNAIR http://www.macnature.com/2013/02/isolasi-dna-referensi-terpercaya.html http://kirsman83.weeb..com/2/post/2013/01/isolasi-dna http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis (diakses pada tanggal 10 Mei 2013) Lampiran Gambar
  • 28. Proses Penuangan larutan ke dalam sampel dengan menggunakan mikropipet Sentrifuge
  • 29. Pipet Ukur
  • 30. Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vector yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen maka dibawa oleh plasmid tersebut. Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transfoman dan sel non transforman. Sel transforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang member karakterisitik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Penelitian ini bermaksud untuk mentransformasi gen ke dalam sel inang Escherichia coli (E.coli) elektroforesis. dan plasmid rekombinan, serta dianalisis dengan
  • 31. C. SEL KOMPETEN Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. Praktikum ini menggunakan sel E. coli sebagai sel kompeten. Sel tersebut kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut transforman (Lodish et al.). Hasil yang diperoleh dari praktikum transformasi ini adalah koloni E. coli dalam cawan. Koloni E. coli tumbuh dalam cawan dengan membentuk koloni berwarna putih. Sel transforman dikultur pada media dengan ampisilin. Hal ini sesuai dengan teori yang ada. Sel tersebut mampu tumbuh pada media dengan ampisilin karena di dalam selnya terdapat plasmid (Lodish et al.). Keberadaan plasmid di dalam sel E. coli membuat sel tersebut resisten terhadap antibiotik ampisilin (http:// transformasi-dengan-sel-kompeten.html). D. TRANSFORMASI GEN ke DALAM SEL INANG Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi
  • 32. karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja (http:// pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html). F. ELEKTROFORESIS Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromide (http://elektroforesis) BAB III
  • 33. METODELOGI PRAKTIKUM A. Waktu Dan Tempat Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 4-28 maret 2013 dan bertempat di Laboratorium Bioteknologi Jurusan Kimia FMIPA Universitas Haluoleo Kendari. B. Alat Dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung eppendorf, shaker, water bath, vortex, sentrifuga, gelas kimia, batang pengaduk, es, Erlenmeyer, pipet mikro, tabung biru, tabung kuning, aluminium foil, cawan petri, sarung tangan, neraca analitik, elektroforesis, kawat ose, Bunsen, hot plate, oven, autoklaf dan korek api. 2. Bahan Bahan yang digunakan adalah media LB, campuran ligase (Vektor + DNA Ligase + gen sisipan), biakan bakteri E. coli ampisilin, aquabides, es batu, etanol dingin, etanol 70%, larutan lisis I, II, dan III, alcohol, buffer TAE, I x etidium bromide, CaCl 2 75 mM, kloroform, agarosa, loading dye.