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Proteinas G Y Sus Correlaciones (Paper) 23 Feb 2012 2
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PROTEINAS G

PROTEINAS G
CORRELACIONES CON METABOLISMO PRIMARIO Y SECUNDARIO

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    Proteinas G Y Sus Correlaciones (Paper) 23 Feb 2012 2 Proteinas G Y Sus Correlaciones (Paper) 23 Feb 2012 2 Document Transcript

    • PROTEÍNAS G Y SUS CORRELACIONES GLICÓMICAS, PROTEÓMICAS, METABOLÓMICAS Y ANTOCIANÍNICAS EN NANOFEMTOFISIOLOGÍA VEGETAL PARA AGRICULTURA PROTEGIDALuis Alberto Lightbourn Rojas. PhD1*, Dra. Josefa Adriana Sañudo Barajas1,2, Dra. JosefinaLeón Félix1,2, Dr. José Basilio Heredia1,2, IBQ. Rubén Gerardo León Chan1, MC. Luis AlfonsoAmarillas Bueno1, MC. Talia Fernanda Martínez Bastidas1, Biol. Gisela Jareth Lino López1.1 División de Generación, Excogitación y Transferencia de Conocimiento. Bioteksa S.A de C.V.(Bionanofemtotecnología en Sistemas Agrológicos). www.bioteksa.com. Carretera Las Pampas Km. 2.5, Col.Industrial, CP 33981. Jiménez, Chihuahua México. lalr@bioteksa.com.2 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Culiacán Carret. a Eldorado Km. 5.5Campo El Diez, Culiacán, Sin., 80129 México.Tel: (667) 7605536.Palabras claves: Bionanofemtofisiología, Nutrición Genomática Epigenética, Modelo BioquímicoLightbourn, In cerebrum. INTRODUCCIÓNLa característica principal del metabolismo de las plantas es su capacidad de adaptación yrespuesta a los cambios del medio ambiente, como temperatura, salinidad, los niveles deluminosidad, deficiencia de nutrientes y sequía (Lloyd y Zakheleniuk, 2004). Elcrecimiento y desarrollo de las plantas es mediado por una gran diversidad de vías deseñalización, coordinadas por factores exógenos que regulan todos los procesos fisiológicoscomo división y diferenciación celular, fotosíntesis y respiración.Las proteínas G están constituidas por tres diferentes subunidades (α, β y γ), las cualestienen una estructura altamente conservada y usualmente se encuentran unidas a un receptorespecifico de membrana (Trusov et al., 2009). Este receptor reconoce un amplio rango deligandos como agentes biogénicos, pigmentos, péptidos, feromonas de insectos, hongos ycambios ambientales, lo cual permite a la planta responder ante una extensa variedad deestímulos. Además, las proteínas G participan en la germinación, defensa ante el estrésoxidativo, desarrollo, regulación de apertura de canales iónicos, respuesta a fitohormonas yapertura de estomas (Millner, 2001; Nilson y Assmann, 2010). Sin embargo, a pesar de lasdiversas investigaciones relacionadas, aun no es claro como las proteínas G pueden realizarfunciones tan diversas en las plantas.En agricultura protegida, la nutrición implica la consideración de variables de trascendentalimportancia, se trata del equilibrio suelo-planta-agua-atmósfera en sus aspectos biológicos,físicos y químicos pero en condiciones limitantes. Por lo anterior, se debe considerar laintensidad lumínica, la temperatura y la húmedad relativa como factores que definen la 1
    • termodinámica de los procesos ligados directamente al metaboloma y secretomadelimitados por los fenómenos fotosintéticos y respiratorios.La producción de biomasa, vista como la tasa de formación de tejido, es directamenteproporcional al trabajo ejercido por la planta para sobrevivir y producir. Por lo que lanutrición en ambientes protegidos requiere de moléculas específicamente diseñadas enfunción de la arquitectura de las células y en sinergia con los delicados y precisos procesosmetabólicos que logran que el genoma se exprese en proteoma, que el metaboloma y elsecretoma funcionen en sincronía con los cambios, flujos y ritmos de las diversas fasespropias de las oscilaciones metabólicas y la difusión molecular de la nutrición genomáticaepigenética.La tautocronía del rayo de luz hacia la superficie foliar en condiciones de cobertura, es defundamental importancia no sólo para la fotosíntesis sino también para la respiración. Lasvibraciones transversas del rayo luminoso a través de los materiales filtro usados en laagricultura protegida generan espacios de constricción en los organelos especializados paracapturar esta intensidad lumínica, afectando en forma directa todos los procesos de manejode energía tanto generativa como vegetativa. Lo que genera una propuesta diferente para lanutrición en agricultura protegida.Según el Modelo Bioquímico Lightbourn (MBL), la eficiencia y eficacia en la asimilaciónde los nutrientes aportados por las moléculas usadas para alimentar a las plantas, respondendirectamente a su arquitectura femtológica, la cual es determinada y determinante por laarquitectura nanológica de la membrana celular (Lightbourn, 2011).Los pasos fundamentales para un diseño arquitectónico nano-femto son los siguientes: 1.Estudio topológico de la membrana celular, 2. Consideraciones termodinámicas yestereoquímicas, 3. Ingeniería metabólica, 4. Diseño de la molécula, 5. Producción de lamolécula, 6. Trazabilidad exo- endógena del nutriente, 7. Una nueva forma de interpretarlos análisis de suelo, agua y planta, 8. Glicobiología correlacional, 9. Programa de nutriciónad hoc, 10. Resultados precisamente proyectables, 11. Resultados confiablementecuantificables y, 12. Economía: energética, de recursos y de bajo impacto ambiental queequivalen a una mayor sustentabilidad.La profundidad del análisis va de acuerdo a las necesidades prácticas y propósitosespecíficos, siendo aconsejable la valoración de la mayor cantidad de parámetros de 2
    • relación. En el presente trabajo de investigación se presentan los análisis glicomicos yproteómicos correlacionado con proteínas G en nonofemtofisiología de plantas producidasen agricultura protegida. METODOLOGÍALa presente investigación integra un análisis in vivo, un in vitro y un in cerebrum.In vivoEsta etapa se desarrolló en la agrícola Paralelo 38, ubicada en el valle de Culiacán Sinaloa,con la siguiente ubicación geográfica: Oriente-norte latitud 24°35´23", longitud107°30´54", Oriente-sur latitud 24°34´53", longitud 107°31´01", Poniente-norte latitud24°35´23", longitud 107°31´24", Poniente-sur latitud 24°34´53", longitud 107°31´24".In vitroLa parte in vitro se desarrolló por el grupo de investigación BIOTEKSA RESEARCHTEAM realizando las siguientes actividades:Extracción de proteínas. Se realizó una extracción de proteínas de peciolo de acuerdo a lametodología de Mechin et al. (2007), que consiste en la trituración del tejido en un morteroy la precipitación de las proteínas con ácido tricloracético (TCA) y 2-mercaptoetanol enacetona fría. La concentración de proteínas se determinó con el método de Bradford usandoalbumina de suero bovino (BSA) como estándar.Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE). Las proteínasse separaron electroforéticamente en geles SDS-PAGE al 12 % de acuerdo a la metodologíade Laemmli (1970) y se corrieron en una cámara de MiniProtean (BIO-RAD), con bufferde corrida de Tris-HCl 25 mM, pH 8.3, a 70 V por 3 h. Se tiñeron con azul de CoomassieR-250 [azul de Coomassie 0.04% (p/v) en metanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v),agua 50% (v/v)] y se desteñieron con la misma solución pero sin el colorante (Garfin,1990).Electroforesis en dos dimensiones. El análisis en geles de segunda dimensión (2-DE) serealizó utilizando tiras de IPG (Immobilized pH gradient, BIORAD) de 3 a 10 y de 4 a 7 depH. Las tiras se hidrataron con 300 µg de proteínas en 125 µL de buffer de rehidratación(Urea 8 M, CHAPS 2 %, azul de bromofenol 0.02 %, DTT 0.56 %, IPG buffer 0.5 %) por16 h a 20 °C. La separación isoeléctrica de las proteínas se realizó en el equipo Protean IEF 3
    • Cell (BIO-RAD) durante 7.5 h a 20 °C. Después, las tiras se equilibraron por 10 min conbuffer de equilibrio [urea 6 M, SDS 2% (p/v), Tris-HCl 0.05 M, pH 8.8, glicerol 20% (v/v)conteniendo] I con DTT [2% (p/v)] y II con iodoacétamida [2.5% (p/v)]. Posteriormente lasproteínas isoeléctroenfocadas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12 % por 3 h a 70 V.Inmunodetección de proteínas G por Western blot. Previo al Western blot, las proteínasfueron separadas en geles de SDS-PAGE en 1 y 2 dimensiones. Las proteínas setransfirieron a membranas de PVDF (Difluoruro de polivinilideno, BIO-RAD) en unsistema de transferencia húmedo (Mini Trans-Blot Cell BIO-RAD) por 1.25 h a 100 V conbuffer de Tris-HCl 25 mM, pH 8.3, glicina 0.192 M, isopropanol 7.5% (v/v) (Villanueva,2008). La membrana de PVDF se sometió a bloqueo con 25 mL de leche descremada tipoSvelty (Nestle) al 5% (p/v) en buffer de Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 0.5 M (TBS) por 2h a 20 °C. Posteriormente se adicionó el anticuerpo Anti-Gα-Subunit Internal en TTBS(1:5,000) y se incubó durante 12 h a 4 °C. En seguida se incubó la membrana con unsegundo anticuerpo anticonejo (goat anti-rabbit IgG, BIO-RAD) (1:30,000 en TTBS) a 20°C por 2 h. Finalmente, la membrana de PVDF se colocó en 20 mL de buffer de reveladode Tris 0.1 M, pH 9.5, MgCl2 0.5 mM y con los sustratos BCIP (sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato p-tolouidina) y NBT (cloruro de p-nitro azul de tetrazolio) por 1 h.Análisis de CarbohidratosExtracción de Savia. La savia se obtuvo por centrifugación, se retiraron los extremos delos peciolos de hojas y se colocaron dentro de mallas Miracloth y posteriormente en untubo filtro falcón (sin membrana) se llevó a centrifugación a 10,000 rpm por 10 min a 4 °C.Análisis de carbohidratos. De la savia obtenida se analizaron los azúcares totales por elmétodo de antrona (Yemm y Willis, 1954) y el contenido de azúcares neutros por el métodode acetatos de alditol que consiste de una hidrólisis con ácido trifluoroacético (TFA) 2 Npor 1 h a 120 ºC, una reducción con borohidruro de sodio (20 mg/mL) y una posterioracetilación con anhidro acético e imidazol (10:1), finalmente se inyecta para su análisis aun cromatografo de gases equipado con un detector FID (250 °C), una columna capilar DB-23 (30 m X 0.25 mm) (210 °C), helio como gas acarreador a flujo constante (3 mL/min),empleándose mio-inositol (100 µg/mL) como estándar interno (Albersheim et al., 1967;Blakeney et al., 1983). 4
    • También se obtuvieron los azúcares solubles (azúcares libres, solubles en acetona) einsolubles (azúcares de polisacáridos, insolubles en alcohol) y neutros. Los insolubles seobtuvieron adicionándole a la savia 4 volúmenes (v) de etanol e incubación por 12 h a 4 ºC.Los azúcares solubles se obtuvieron de la adición de acetona fría (4:1 v/v) e incubación a -20 ºC por 12 h. Los azúcares insolubles se obtuvieron por centrifugación a 3,000 rpm por 5min, mientras que los solubles se centrifugaron a 10,000 rpm por 15 min a 4 ºC.De los azúcares insolubles se determinó los extremos reductores (Gross, 1982) y glucosa(Gluc), sacarosa (Sac) y fructosa (Fruc) por método enzimático que consiste en la toma detres absorbancias (Abs) a 340 nm: Abs1, incubación de la muestra (100 µL) con invertasa10 min, seguida de la adición de la enzima NADP+ más ATP e imidazol e incubación 10min más. Abs2, incubación con hexoquinasa más glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6P)por 10 min. Abs3, incubación con la enzima PGI (fosfoglucosa isomerasa) por 10 min.Todas las incubaciones se realizaron a 30 ºC.In cerebrumEsta parte consiste en la integración de todos los resultados y observaciones obtenidos y laaplicación del Modelo Bioquímico Lightbourn. RESULTADOS Y DISCUSIÓNEn las Figuras 1A, B y C, se muestran los perfiles proteicos de plantas de chile morrón entres etapas fenológicas, mostrando variación en el contenido de proteínas. En la Figura 1Dse muestra el perfil de reconocimiento, por inmunodetección, con el anticuerpo contra lasubunidad alfa de la proteína G (Anti-Gα-Subunit Internal), encontrándose la detección debandas con pesos moleculares de 57, 46 y 37 kDa, pesos moleculares reportados paraproteínas G en otras especies de plantas.En la Figura 2, se muestra el perfil en geles de 2-DE de proteínas de chile morrón y suinmunodetección por Western blot, donde se observa el reconocimiento de una proteína de57 kDa con un punto isoeléctrico de 5.9. 5
    • A B C DFigura 1. Perfil electroforético de proteínas de chile en etapas de floración (A)fructificación (B) y producción (C) y Western blot (D). MPM, marcador de peso molecularen kDa; 1, Malla 1; 2, Malla 2. A BFigura 2. Perfil de proteínas de chile en gel 2-DE (A) e inmunodeteccion tipo western blotde proteínas Gα (Anti-Gα-Subunit Internal). MPM, marcador de peso molecular en kDa.También se analizaron las proteínas de savia de chile por SDS-PAGE (Figura 3A) yWestern blot (Figura 3B). Se encontró el reconocimiento en mayor intensidad de una bandade 67 kDa en los carriles 1, 3 y 4 correspondiente a las etapas de trasplante, fructificación yfructificación/producción. En la etapa de floración se detectaron 2 proteínas de 28 kDa y 24kDa. Además, en la etapa de producción (carril 5) se encontró el reconocimiento de lasproteínas de 67 y 28 kDa con mayor intensidad, además de otras bandas. 6
    • A BFigura 3. Perfil electroforético de proteínas de savia de chile en distintas etapas (A) y suinmunodetección por Western blot (B). MPM, marcador de peso molecular en kDa; 1,Trasplante en mallas; 2, Floración; 3, Fructificación; 4, Fructificación/Producción; 5,Producción.En la Figura 4A, se muestran las concentraciones de glucosa, fructosa y sacarosa, de chilemorrón en distintas etapas producido en agricultura protegida. Se puede observar que en laetapa de floración se presentó la menor cantidad de dichos azúcares con 0.36, 0.05, 0.06 y0.66 mg/mL de savia, respectivamente. Mientras que los mayores resultados se encontraronal inicio del trasplante de las plantas a las mallas.En los azúcares neutros libres (Figura 4B), se encontró que la glucosa fue el azúcarpredominante, seguido por galactosa, manosa, ramnosa, arabinosa, xilosa y fucosa. En losazúcares neutros de polisacáridos obtenidos de su precipitación con alcohol, se encontró elsiguiente orden de mayor a menor abundancia: galactosa, arabinosa, xilosa, glucosa,manosa, ramnosa y fucosa (Figura 4C). 7
    • A B CFigura 4. Contenido de azúcares en savia de chile a diferentes etapas desarrollo en agricultura protegida. 8
    • In cerebrumFigura 5. Aplicación del Modelo Bioquímico Lightbourn en la nutrición coloidalbionanotecnológica (Lightbourn, 2011). 9
    • Figura 6. Diagrama general del “Science Driven” del instituto Lightbourn.PERSPECTIVASEl presente trabajo representa el inicio de una investigación integral que involucra las disciplinas deproteómica, glicómica y metabolómica, en la cual se pretende realizar el análisis de moléculaspredictivas del estado fisiológico de las plantas, con el propósito de establecer un sistema teórico debiometría homológica que funcione en la práctica para la formación de biomasa y con ello, lograruna producción con mayor consistencia, mejor calidad y mayor rendimiento unitario en períodosmás amplios de cosecha. Por ello, el objetivo inicial de la investigación es conocer e implementarlas técnicas para identificar y caracterizar las proteínas G, una de las principales moléculasreguladoras del metabolismo de las plantas. 10
    • BIBLIOGRAFIAAlbersheim P., Nevins D. J., English P. D., Karr A. 1967. A method for the analysis of sugars in plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydrate Research 5: 340-345.Blakeney A.B., Harris P.J., Henry R.J., Stone B.A. 1983. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydrate Research 113: 291-299.Garfin D.E. 1990. One-dimensional gel electrophoresis. In: Methods in Enzymology. Deutscher M.P. (Editor). Academic Press, San Diego, California, pp. 425-488.Gross K.C. 1982. A rapid and sensitive spectrophotometric method for assaying polygalacturonase using 2-cyano-acetamide. HortScience 17: 933-934.Hooley R. 1999. A role for G proteins in plant hormone signaling?. Plant Physiology Biochemical: 37; 393-402.Trusov Y., Sewelam N., Rookes J., Kunkel M., Nowak E., Schenk M., Botella J. 2009. Heterotrimeric G proteins-mediated resistance to necrotrophic pathogens includes mechanisms independent of salicylic acid, jasmonic acid/ethylene and abscisic acid- mediated defense signaling. The Plant Journal: 58; 69-81.Lightbourn Rojas L.A. 2011. Arquitectura Celular y Arquitectura Molecular. En: MODELO DE GESTIÓN DE TECNOLOGÍA BIOTEKSA I+D+i = 2i. Fabro Editores. ISBN 978-0-9833321-7-6.Lloyd C., Zakhleniuk V. 2004. Responses of primary and secondary metabolism to sugar accumulation revealed by microarray expression analysis of the Arabidopsis mutant, pho3. Journal of Experimental Botany: 55; 1221-1230.Nilson E., Assmann M. 2010. Heterotrimeric G proteins regulate reproductive trait plasticity in response to water availability. New Phytologist: 185; 734-746.Méchin V., Damerval C., Zivy M. 2007. Total Protein Extraction with TCA-Acetone. In: Plant Proteomics : Methods and Protocols. Thiellement H., Zivy M., DamervaL C., Méchin V. (Editors). Springer Protocols. Pp. 1-8.Millner P. 2001. Heterotrimeric G-proteins in plant cell signaling. New Physiology: 151; 165-174.Villanueva M. 2008. Electrotransfer of proteins in an environmentally friendly methanol- free transfer buffer. Analytical Biochemistry 373:377-379.Xue C., Hsueh Y., Heitman J. 2008. Magnificent seven: roles of G protein-coupled receptors in extracellular sensing in fungi. FEMS Microabiology: 32; 1010-1032.Yemm E.W., Willis A.J. 1954. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. Biochemical Journal. 57: 508-514. 11