Apresentação do Trabalho de Conclusão de Curso.

1. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus Araraquara
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Departamento de Fármacos e Medicamentos - Laboratório de Biotecnologia
Proposição de uma Nova Vacina para Brucelose
Bovina Usando uma Abordagem Biotecnológica
Denise Medeiros Selegato
Profa. Dra. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro

2. Revisão
Bibliográfica Sobre
a Vacinação Contra
Brucelose Bovina
Introdução
Sumário
Objetivos
Conclusões
Proposição de um
Processo Biotecnológico
para a Produção de
Proteínas Imunogênicas

3. Introdução
Mercado bovino:
 1° lugar em exportação de carnes (bovinos, suínos e frangos);
 Maior rebanho do mundo comercialmente: desenvolvimento e lucratividade na produção de
carne e leite.
Mercado veterinário:
 Bovinos representam maior porcentagem de participação e a maior lucratividade/espécie na
produção de insumos na indústria de produtos veterinários;
 3° maior no mercado de produtos veterinários mundial;
 Mercado de vacinas:
 Mais de 50% do mercado veterinário é voltado para produtos biológicos e antimicrobianos;
 Produção de imunobiológicos representa 30% do lucro total das indústrias.
GOVERNO BRASILEIRO (2010), IBGE (2011), SINDAN (2012).

4. Objetivos
Propor um processo
biotecnológico otimizado de
produção de ativos purificados
para serem usados em uma vacina
contra brucelose bovina.
Vacina possua eficácia e segurança
superiores às encontradas atualmente no
mercado.

5. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Brucelose Bovina
 Antropozoonose de distribuição universal e fácil contágio.
 Causada pela infecção de Brucella abortus nas células do
sistema mononuclear fagocitário (macrófagos).
 Bactéria dissemina-se pelos órgãos mais irrigados dos
animais (fígado, baço e linfonodos) e no sistema reprodutor
feminino, por tropismo.
Principais Manifestações:
 Aborto (1° gestação), esterilidade, retenção de
placenta, baixa produção de leite e
natimortalidade de bezerros;
 Orquite uni ou bilateral.
Lawinsky et al (2010), University of Georgia (2002).

6. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Brucelose Bovina
 Alta incidência e prevalência.
TRANSMISSÃO
 Mundo: no Mediterrâneo, Oriente Médio,
África e América.
 Transmissão: mucosa oro-faríngeana e mãe-feto.
 Mais infectante em animais púberes e vacas prenhas.
 Brasil: casos vem diminuindo com programa
de vacinação compulsória.
Problemas Sanitários e
Prejuízos Econômicos
MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006).

7. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Brucella abortus
 Parasita intracelular facultativo;
 Cocobacilo gram-negativo, não capsulado e imóvel;
 Dois cromossomos circulares e ausência de plasmídeos e
fagos.
 LPS:
o Principal componente da membrana externa;
o Cadeia O é a estrutura mais exposta da célula:
• Mais imunogênica: induz produção de IgG2 e
IgG3, principais isótopos na defesa imunológica
contra a Brucella;
• Principal componente para testes de triagem.
MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Lawinsky et al (2010).

8. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Resposta Imunológica
Resposta Imune Inata:
o Estágio inicial da infecção;
o Diminuir a concentração bacteriana do organismo.
Resposta Imune Adaptativa (mediada por células):
o É a mais eficaz no curso da infecção, pois produz
anticorpos bloqueadores (específico para o
antígeno O do LPS).
MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Rivers et al (2006).

9. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Vacinas Atuais

10. Características
B19
RB51
Animal Alvo
Bovinos e Bubalinos
Proteção
Cerca de 60% contra infecção e 70% contra aborto
Inocuidade
- Pode provocar aborto em vacas prenhas.
- Patogênica para bovinos machos e humanos.
Restrição quanto ao Sexo
Fêmeas
Proteção Cruzada
B. abortus
B. abortus, B. melitensis, B. suis e B. ovis
Cepa
B. abortus cepa lisa 19
B. abortus RB51 cepa rugosa
Interferências no
Diagnóstico
Sim
Não
Recomendação
Observações
Desvantagens
- Uso recomendado em fêmeas com 3 a 8 meses de vida. Uso recomendado somente quando B19 é ineficaz ou
- Proteção de até 7 anos após vacinação, segundo
em vacas com mais de 8 meses de vida.
fabricante.
Vacina mais utilizada no Brasil (PNCEBT).
Vacina mais utilizada nos Estados Unidos, México e
países da América Latina.
- Efetividade variável (depende de diversos fatores);
- Interferir no diagnóstico tradicional;
- Causar o aborto e orquite;
- Restrita ao sexo feminino;
- Ser possivelmente patogênica para humanos.
- Difícil homogeneização devido a estirpe ser mucóide.
- Possibilidade de inversão em cepa ativa;
- Ser possivelmente patogênica para humanos;
- Induzir o aborto e orquite;
- Restrita ao sexo feminino.
MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Lundblad et at (2010).

11. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Tendências – Vacinas Subcelulares
Elimina as desvantagens presentes em
vacinas de bactérias mortas ou atenuadas:
Não existe o risco de infecção do
manipulador;
Mostram eficácia inferior as vacinas
vivas atenuadas, necessitando de:
 Maior número de aplicações;
Não ocorre interferência no diagnóstico;
 Fusão de duas proteínas
imunodominantes;
Não é restrita ao sexo feminino;
 Uso de mediadores de entrega;
Diminui as chances de orquite ou aborto.
 Uso de adjuvantes imunogênicos.
MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Yang et at (2013).

12. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina
Tendências – Vacinas DNA e RNA
Vacinas DNA
Uso de plasmídeo bacteriano
com promotor viral forte.
Características
Vacinas RNA
Uso de vírus Semliki Forest (SFV).
Não ocorre expressão e
purificação da proteína.
Plasmídeo é fabricado sem Ori.
Possuem partículas virais suicidas
formadas por RNA autoreplicável.
Mesmas vantagens que as vacinas subcelulares.
Rivers et al (2006).

13. Proposição de um Processo
Biotecnológico
Processo de
Upstream
Processo de
Downstream

14. Processo de
Upstream
Ribossomal
L7/L12
o Induz importante resposta imune celular;
o Gene rplL (cromossomo I): 375 pb.
Pakzad et al (2009), Mallick et al (2009), Luo et al (2006).
Identificação
do Alvo
Lumazina
Sintetase
o
o
o
Induz importante resposta imune celular e humoral;
Apresenta estabilidade termodinâmica e arranjo
decamérico estável, facilitando sua manipulação no
processo industrial;
Gene ribH (cromossomo I): 474 pb.
Velikovsky et al (2003), Zhao et al (2009).
Escolha do Vetor
de Clonagem
o DNA dupla fita com 2686 pb.
o Marcadores de seleção: ampR e
lac Z inserido no MCS.
Lundblad et al (2010).

15. E. coli
o Amplo conhecimento de sua genética e fisiologia;
Escolha do Sistema
Vivo de Expressão
o Facilidade do controle do crescimento e expressão
gênica;
o BL21 (DE3);
o DH5;
o M15.
o Elevada multiplicação plasmidial.
Velikovsky et al (2002), Mallick (2007 a), Mallick (2007 b), Velikovsky et al (2003), Zhao et al (2009), Luo et al (2006).
Formação do Gene
de Fusão
Gene
ribH
1. Amplificação dos gene ribH.
2. Amplificação do gene rplL com a remoção do
códon de terminação;
3. Fusão dos genes das proteínas recombinantes;
4. Inserção do gene de fusão no vetor de
clonagem.
Sequência de Primer
Enzima de
Restrição
FO
5’-GGATCCATCGAGTTTCTC-3’
BamHI
RO-1
3’-GGGCCCCTAGTATCAGTT-5’
Xmal
Gene rplL
Sequência de Primer
Enzima de
Restrição
FL
RL-2
5’- AAGCTTATGGCTGATCTCG-3’
3’-CCTAGGCTTGAGTTC-5’
HindIII
BamHI
Luo et al (2006), Zhao et al (2009), NCBI.

16. Formação de
Células
Competentes
Transformação
Seleção de
Recombinantes
Fermentação
Extração do Gene
de Fusão
Tratamento com CaCl2.
Choque térmico (mudança de temperatura de 37 para
42°C).
Crescimento em meio de
cultura com ampicilina.
Crescimento em meio ágar
contendo IPTG e x-gal.
Crescimento em meio LB de 1-2 dias, à
37°C, com agitação.
o Kits comerciais de extração de plasmídeos:
agentes quelantes, detergentes, etc.
o Liberação do gene de fusão por digestão com
enzimas de restrição.
Maranhão et al (2003), Nascimento (1999).

17. Escolha do Vetor
de Expressão
Transformação
Seleção de
Recombinantes
o Meio LB com kanamicina;
Eletroporação
o Sequenciamento de
clones;
o Hibridização in situ.
o Marcadores de seleção (gene kan);
o Sistema de repressão de indução (gene lac);
o Promotor T7;
o Sequência de ligação do ribossomo (Shine
Dalgarno);
o Ori FL e Ori ColE1;
MAPA (2003), Davidson College (2003).

18. Processo de
Downstream
Cultivo das
Células
Clarificação e
Rompimento
Celular
Expressão da
Proteína de
Fusão
Formação do
Corpúsculo de Inclusão:
alto grau de pureza,
pouca contaminação e
proteção física contra
proteases.
Purificação e
Solubilização das
Proteínas
Recombinantes
Fonte: Adaptado de Luo et al (2006).
Caracterização
das Proteínas
Merck (2008).

19. Testes de Atividade
Imunização
Determinação de Ac
Específicos
Determinação da
Proliferação de IFNgama
Determinação da
Produção de
Citocinas
Determinação da
Proliferação de
Linfócitos
Fonte: Mallick et al (2007).

20. Conclusões
¡
¡
¡
Novas estratégias são necessárias para prevenir a brucelose bovina, bem como diminuir
as desvantagens nas vacinas de bactéria atenuada atualmente comercializadas.
Apesar das proteínas isoladas não conferirem uma imunização suficientemente forte para
substituição das vacinas de bactérias atenuadas, novos métodos de entrega dos
antígenos ganham destaque, como (a) utilização de vacinas de DNA; (b) vacinas de RNA;
(c) vacinas com mais de uma proteína imunogênica; (d) ou o acoplamento de proteínas
antigênicas a lipossomas e outros carregadores.
A combinação da proteína ribossomal L7/L12 (forte indutora de resposta celular) com a
lumazina sintetase (proteína estável com importante resposta celular e humoral) mostrase promissora no desenvolvimento de vacinas subcelulares, seja na sua forma livre, ou por
sistema de entrega.

21. Agradecimentos