Bacteriófagos y sus aplicaciones en seguridad alimentaria. Pilar García (IPLA-CSIC). Cáceres, Septiembre de 2012.

1. Pilar García Suárez
Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,
Asturias, Spain
Bacteriófagos y sus aplicaciones en
seguridad alimentaria
Jornadas Técnicas Sobre Biocontrol en
Fermentación Láctea. 6 y 7 de Septiembre -
Complejo Cultural San Francisco - Cáceres

2. Quesos
de
España
WWW. IPLA.CSIC.ES
Tecnología y Biotecnología de P.L.
Microbiología molecular
Fermentos lácticos y bioconservación
Físico-química
Microbiología y Bioquímica de P.L.
Probióticos, prebióticos y exopolisacáridos
Cultivos lácteos funcionales
INSTITUTO DE PRODUCTOS
LÁCTEOS DE ASTURIAS
CSIC

3. DairySafe Group
Ana Rodríguez
Beatriz Martínez
Pilar García
Clara Roces
Lorena Rodríguez
Diana Gutiérrez
Silvia Portilla
Ana B. Campelo
Rosana Calvo
Pablo González
Diana Lueces

4. ÍNDICE
1. SEGURIDAD ALIMENTARIA
2. BIOCONSERVACIÓN
3. LOS BACTERIÓFAGOS
4. PROTEÍNAS FÁGICAS
5. TERAPIA FÁGICA
6. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
7. PERSPECTIVAS DE FUTURO

5. SEGURIDAD ALIMENTARIA
Seguridad alimentaria en el mundo:
2.2 millones de muertes al año (OMS, 2012)
Países industrializados:
5,262 brotes en 2010 EU

6. NUEVAS TECNOLOGÍAS: - disminuir pérdidas económicas
- bajar los costes procesamiento
- cumplir las normativas legales
- impedir la trasmisión de patógenos
- satisfacer al consumidor (aditivos, poco
procesados, listos para comer, )
- sostenibilidad
CAUSAS:
- patógenos emergentes
- adaptación de patógenos conservación
- resistencia a antibióticos bacterias zoonóticas
SEGURIDAD ALIMENTARIA

7. BIOCONSERVACIÓN
La bioconservación es la utilización de
microorganismos, incluidos
bacteriofagos, sus productos
metabólicos o ambos para conservar los
alimentos (Montville & Chikindas,
2007).

8. * CULTIVOS INICIADORES Quesos artesanales asturianos
Lactococina 972
Biocontrol de patógenos
* BACTERIOCINAS
* BACTERIOFAGOS
BIOCONSERVACIÓN

9. LOS BACTERIÓFAGOS

10. LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad
- 1031 partículas (104-107 pfu/ml agua mar; 108 pfu/g suelo).
- Eliminan la mitad de la población bacteriana cada 48 h.
- Papel en la evolución de las bacterias acelerando la tasa de mutación.

11. LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad
- 5100 especies diferentes

12. LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida
Tail
Tail fibers
Core
Head
DNA

13. Environmental
signals
Bacteriophage
Host recognition
Adsorption
Insertion
(prophage)
Penetration
Replication
Synthesis
AssemblyRelease
LYTIC
CYCLE
LYSOGENIC
CYCLE
7
6
5
4
3
2
1

14. LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida

15. PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
Endolisinas
PG hidrolasas asociadas a virión
Lisis
Bacteriófago
Reconocimiento
Adsorción
Inserción
(profago)
Penetración
Replicación
Síntesis
Ensamblaje
CICLO
LITICO
CICLO
LISOGÉNICO
7
6
5
4
3
2
1
MEMBRANA
PEPTIDOGLICANO
ESPACIO PERIPLASMICO
CITOPLASMA
HIDROLASA
HOLINA
ENDOLISINA
CITOPLASMA
ESPACIO PERIPLASMICO
PEPTIDOGLICANO
Señales
ambientales

16. L-Ala D-Gln
D-Gln
L-Lys
D-Ala L-Lys
D-Ala
L-Ala
2
1
6
5
4
3
D-GlnD-Ala L-Lys
NAM
NAM
NAG
NAG
NAG
NAM
NAG
NAG
NAG
2
1
6
5
4
3
NAM
NAM
NAG
NAG
NAG
NAM
NAG
NAG
NAG
PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
Peptidoglycan hydrolase activities and their bond substrate in the cell wall. 1: N-acetylmuramoyl-L-alanine
amidase; 2: interpeptide bridge endopeptidase; 3: N-acetyl-β-D-glucosaminidase; 4: L-alanoyl-D-glutamate
endopeptidase; 5: N-acetyl- β-D-muramidase; 6: Transglycosylase.

17. Daniel et al., 2010
S. aureus ClyS
Capacidad antimicrobiana: enzibióticos
PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
S. aureus LysH5
Obeso et al., 2008

18. TERAPIA FÁGICA

19. TERAPIA FÁGICA: los primeros ensayos
Phage discovery
1917 1920 1930 1940 Present
Phage
therapy
Antibiotics
production
Antibiotic therapy
Phage therapy in
former Soviet Union
and Poland
Intestinal disorders(Phagesti)
Bacterial infections (Phagepy,
PhageBioderm)
Food safety (LISTEX P100,
ListShieldTM, EcoShieldTM)
Crop safety (AgriPhage)
Animal health care (SPLX-1TM
PLSV-1TM, INT-401TM , BioTector)
Bacterial detection (FASTPlaque-
ResponseTM, FASTPlaqueTBTM,
MicroPhage MRSA/MSSA test,
MRSA screening test, MRSA/MSSA
blood culture test)
COMMERCIAL PRODUCTS
G. Eliave Bacteriophage, Virology and Microbiology InstituteD’Herelle, 1917

20. Terapia humana
TERAPIA FÁGICA: algunos productos

21. TERAPIA FÁGICA: ventajas y desventajas
Ventajas
Especificidad y capacidad de autorreplicación
Eficacia
Historia de uso seguro
No alteran las propiedades organolépticas
Las endolisinas no generan resistencia
Desventajas
Los fagos pueden llevar en su genoma genes codificantes de toxinas
Rango de huésped estrecho
Bacterias resistentes a fagos
Inactivación por las condiciones ambientales
Las endolisinas no actúan sobre gram negativos

22. TERAPIA FÁGICA: empresas
Company Country Web site Target
Gangagen USA http://www.gangagen.com/ Human infections
Intralytix USA http://www.intralytix.com/ Food safety
Omnilytics USA http://www.phage.com/home5.html Crops (Agriphage)
Phage Biotech Israel http://www.phage-biotech.com/ Human infections
Hexal Genentech Germany http://www.hexal-gentech.com/index.html Human infections
Novolytics UK http://www.novolytics.co.uk/ Human infections
Biophage Inc. Canadá http://www.biophagepharma.net/index.html Environment, human and animal
Biopharm Pharmaceuticals Georgia http://www.biopharmservices.com/Pharma.aspx Human infections
EBI Food Safety Netherlands http://www.ebifoodsafety.com Food safety.(Listex P100TM)
BigDNA UK (http://www.bigdna.com/) Animal infections
JSC Biochimpharm Georgia (http://www.biochimpharm.ge/) Human infections
Biocontrol UK (http://www.biocontrol-ltd.com/) Human infections
Innophage Portugal (http://www.innophage.com/) Human infections
Phico Therapeutics UK (http://www.phicotherapeutics.co.uk/) Human infections
Phage International USA, Georgia (http://www.phageinternational.com/) Human infections
Targanta Therapeutics USA (http://www.targanta.com/) Human infections
Viridax USA (http://www.viridax.com/) Human infections

23. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
Disinfection of
equipment contact
surfaces
Biopreservation
Reduction of
colonization
Phage therapy Biofilms removal
“Farm to fork”
Animals
Foodstuff
industry
Final product
Storage and
marketing
Phage
Biocontrol
Carcass meat
raw products
RTE products
Consumer

24. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

25. 1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO
E. coli O157:H7
Sheng et al. 2006
Tratados
10E6 cfu
10E10 pfu/4 días
10E6 pfu/ml agua
control
fagos SH1 and KH1

26. 1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO
Schmelcher et al., 2012
Staphylococcus aureus
12.5 µg each/gland
3.36-log decrease in CFU
Endolisinas

27. Staphylococcus aureus
Daniel et al., 2010
5 10E9 cfu
24h 1 mg endolisina ClyS
1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN MANIPULADORES
Endolisina ClyS

28. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

29. biofilm
2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES

30. 2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
Campylobacter jejuni
Fagos CP8, CP30 y PT14
Siringan et al., 2011
Control tratados

31. 2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
Endolisinas frente a S. aureus
Sass and Bierbaum 2007 Son et al. 2010
control endolisina

32. C PT C PT C PT
F12 CJBP1 CJBP3
S DS R
phi-IPLA5 biofilm S. epidermidis 7 días
3h
Gutiérrez et al., 2012
2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
biofilm
planctónico
Staphylococcus epidermidis

33. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

34. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
García et al., 2009
Leche S. aureus fagos phiH5 y phiA72
Pasteurizada Cruda semidesnatada Cruda entera
S. aureus + fagos
S. aureus

35. * Aplicación de la microbiología predictiva
100
80
60
40
20
Figura 11. Superficie de Respuesta del Modelo 4.
Los 3 ejes representan respectivamente el % de Mortalidad, la Temperatura, y el
log10 de la Concentración de Bacteriófagos Añadida.
%Mortalidad
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Log10fagos
10
15
20
25
30
35
40
Temperature,ºC
100%
98%
95%
90%
Figura 12. Líneas de contorno en 2D del Modelo 4 indicando las regiones de inhibición y
supervivencia de bacterias. Log10 fagos que garantiza la Mortalidad 100% a 15 ?C.
Log10 fagos
Temperatura(?C)
7,7
X = temperatura Y = log concent fagos
Mortalidad = – 125,86 + 5,96·x + 28,76·y – 0,745·xy
Obeso et al., 2010
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

36. logPFUmL-1
logCFUmL-1
0
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200 250
time(min)
0
2
4
6
8
10
logPFUmL-1
logCFUmL-1
0
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200 250
time(min)
0
2
4
6
8
10
logCFUmL-1
logPFUmL-1
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25
time(h)
4
5
6
7
logCFUmL-1
logPFUmL-1
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25
time(h)
4
5
6
7
CUAJADA ÁCIDA CUAJADA ENZIMÁTICA
Garcia et al., 2007
S. aureus fagos phiH5 y phiA72
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
pH
fagos
S. aureus
BAL
S. aureus + fagos
S. aureus + fagos
fagos
S. aureus

37. Φ35 y Φ88 S. aureus en queso
0
2
4
6
8
10
lechecuajada
24
h
48
h
queso
5
d
queso
8
d
queso
15
d
queso
30
d
Tiempo de maduración
2
3
4
5
6
7
0
2
4
6
8
10
leche
leche
3
hleche
6
h
cuajada
24
hqueso
7
dqueso
14
d
Tiempo de maduración
2
3
4
5
6
7
Mixta Ácida
pH
pH
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Bueno et al., 2012
pH
S. aureus
fagos
S. aureus + fagos

38. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Combinación de fagos y altas presiones
Tabla et al., 2012

39. L. monocytogenes phage P100 y A115
Guenther et al. 2009
1 10E3 cfu/gr ml
3 10E8 pfu/ gr ml
6 días a 6°C
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

40. Endolisina LysH5 S. aureus
Obeso et al., 2008
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
LysH5 (45U/ml)
LysH5 (160U/ml)
LysH5 (80U/ml)
control
control

41. * Construcción de proteínas quimera
166 465
CHAP156
CHAP166
LYZ161
LYZ171
6361
629
156 475
6xHis
149 483
CHAP LYZ2
15
HydH5
Lysostaphin
SH3bEndopeptidase
2491
13232 167
HydH5Lyso
8841
HydH5SH3b
7391
CHAPSH3b
1 261
156
Rodríguez-Rubio et al., 2012a
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

42. 3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
37 ºC RT
Time (min)
*** *** **
***
**
*** ***
*** ***
37 ºC RT37 ºC RT
Time (min)
*** *** **
***
**
*** ***
*** ***
Proteína CHAPSH3 S. aureus leche cruda
Rodríguez-Rubio et al., unpublished
control
con proteína

43. * Estudio de posibles sinergismos
Endolisina LysH5
(U/ml)
Nisin
a 6 µg/ml
0
5 ng/ml
50 0.078
García et al., 2010
Rodríguez-Rubio et al., 2012a
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
control
LysH5
nis
LysH5 + nis

44. SPlcn972 LysH5
1 1533 nt
506 aa1
GTA GCT CAA GCT ATG CAA GCA AAA CTA ACT AAA
76 108 nt
22 32 aaVal Ala Gln Ala Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys
lysH5SPlcn972
Rodríguez-Rubio et al., 2012b
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
* Cultivos iniciadores con capacidad protectora
Lactococcus lactis
LysH5
LysH5
LysH5
LysH5
LysH5
lysH5
Pnis
nisR nisK
nisK
nisR
LysH5
LysH5
LysH5
SPLcn972
Sec

45. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción

46. L. monocytogenes
1-10 CFU/gr
Kretzer et al., 2007
4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN
Bacillus cereus
Clostridium perfringens
NC
Catalytic Binding
Linker

47. CBD L. monocytogenes
Schmelcher et al., 2010CFP, cyan fluorescent protein; GFP, green fluorescent protein; RS, RedStar protein
4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN

48. Agricultura Veterinaria
INT-401™
Clostridium perfringens
PLSV-1™
Salmonella
Acuicultura, tratamiento de aguas, desinfección de
superficies, detección de bacterias, etc.
EcoShield™ ListShield™
SALMONELEX™
MICREOS
LISTEX™
MICREOS
PERSPECTIVAS DE FUTURO

49. Pilar García Suárez
Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,
Asturias, Spain
Bacteriófagos y sus aplicaciones en
seguridad alimentaria
GRACIAS POR SU ATENCIÓN