Genética y Biología Molecular en Neurosporacrassa<br />Nallely Cano Domínguez<br />Instituto de Fisiología Celular UNAM<br...
Neurosporacrassaen la naturaleza<br />
De Moniliasitophilaa Neurospora<br />Premio de la Sociedad Americana de Botánica 1956<br />Bernard Ogilvie Dodge<br />
“Cada uno de esos miles de tipos de genes tienen, en general, una única especificidad. Esto significa que una enzima usual...
Experimentos de Beadle y Tatum<br />Encuentran tres mutantes distintas que necesitaban arginina (arg-1, arg-2 y arg-3) par...
reconoce a Neurosporacrassacomo uno de los 12 modelos eucariontes  para la investigación biomédica<br />The<br />¿Por qué ...
Su ciclo de vida asexual  <br />✔<br /><ul><li>Sus estructuras diferenciadas del ciclo asexual pueden identificarse fácilm...
Pueden reconocerse las distintas estructuras diferenciadas
Produce ascas grandes lo que facilita hacer estudios de meiosis</li></ul>Ascogonia<br />Protoperitecio<br />
Fácil mantenimiento en el laboratorio<br />✔<br />Medio Vogel y 1.5% de sacarosa<br />Medio con 2% de sorbosa<br />3 días ...
Fácil mantenimiento en el laboratorio<br />✔<br />Medio sintético de cruza<br />“Racetubes”<br />
✔<br />No es patógeno pero ha servido como modelo para el estudio de procesos que se han conservado en los hongos patógeno...
Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center (www.fgsc.net)<br />✔<br />Peritecios de la cepa mutante p...
✔<br />Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center afectadas en la formación de las ascosporas<br />As...
Su genoma se encuentra secuenciado<br />✔<br />Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68<br />
Características del genoma de N. crassa<br />Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68<br />
✔<br />La secuencia del genoma de Neurosporacrassase encuentra disponible en la red en la página del BROAD INSTITUTE<br />
Busquemos un gen… nor-1<br />
En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del ...
En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del ...
Se obtiene la secuencia génica y las regiones 5´y 3´que flanquean al gen nor-1<br />
Se pueden obtener mutantes nulas en un gen fácilmentePor la técnica del “Double Joint PCR”<br />✔<br />
Los métodos de transformación de Neurosporacrassa<br />Por electroporación<br />Por esferoplastos<br />Enzimas Líticas<br />
Existen herramientas disponibles para etiquetar proteínas (GFP, RFP, 6H, HA)<br />his-3<br />amp<br />pMF272<br />Promotor...
Localización de Proteínas mediante fusiones con GFP<br />
Microscopía confocal<br />Microscopía de TIRF de polimerización de microtúbulos de una hifa de una cepa WT Uchida M. et al...
Microscopía confocal y epifluorescencia<br />Hifas con una construcción  vma-1::rfp(se localiza en las vacuolas)<br />Bard...
Microscopia de BarridoConidia Anastomosis Tubes (CAT´s)<br />Roca, M. G. et al 2005. EukaryoticCell. P. 911-919 <br />
Ritmo circadiano<br />
Proceso de conidiación en N. crassa<br />1<br />ERO<br />6 – 15 min<br />40 min<br />Hifas en crecimiento<br />Adhesión de...
Hansbergy Aguirre, 1990 <br />Estado diferenciado<br />Estado no diferenciado<br />O2 + nutrientes<br />O2 + nutrientes<br...
PREDICCIONES<br />Mutaciones en los mecanismos antioxidantes<br />Mutaciones en los mecanismos pro-oxidantes<br />
Las NADPH oxidasas en células fagocíticas y sus ortólogos en hongos<br />O2<br /> O2.-<br />Flavocitocromo b558<br />gp91p...
NOX-1 isessentialfor sexual and asexual development<br />Δnox-1strains<br />NOX<br />p22phox<br />gp91phox<br /> WT <br />...
NOX-2 isrequieredfor sexual sporefunction<br />Δnox-2strains<br />NOX<br />p22phox<br />gp91phox<br />nox-2  x  nox-2<br...
NOR-1 isrequiredfor NOX-1 and NOX-2 activity<br />Δnor-1strains<br />NOX<br />p22phox<br />gp91phox<br />WT<br />nor-1<br...
Agradecimientos<br />Dr. Jesús Aguirre <br />Biol. Olivia Sánchez<br />Laboratorio 107 Oriente<br />Dr. Wilhelm Hansberg<b...
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Genética y Biología molecular de Neurospora crassa. Nallely Cano. Instituto de Fisiología Celular. UNAM.

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Genética y Biología Molecular de Neurospora

  1. 1. Genética y Biología Molecular en Neurosporacrassa<br />Nallely Cano Domínguez<br />Instituto de Fisiología Celular UNAM<br />Laboratorio 107 Oriente<br />
  2. 2. Neurosporacrassaen la naturaleza<br />
  3. 3. De Moniliasitophilaa Neurospora<br />Premio de la Sociedad Americana de Botánica 1956<br />Bernard Ogilvie Dodge<br />
  4. 4. “Cada uno de esos miles de tipos de genes tienen, en general, una única especificidad. Esto significa que una enzima usualmente tendrá su final específicamente en un grupo y sólo un gen”<br />GEORGE WELLS BEADLE<br />EDWARD L. TATUM<br />Premio Nobel en Medicina 1958 por su hipótesis de “un gen-una enzima”<br />
  5. 5. Experimentos de Beadle y Tatum<br />Encuentran tres mutantes distintas que necesitaban arginina (arg-1, arg-2 y arg-3) para crecer y probaron si eran capaces de crecer en medio con ornitina y/o citrulina<br />arg-1<br />arg-3<br />arg-2<br />Citrulina<br />Arginina<br />Ornitina<br />Precursor<br />“Las características de una célula (su fenotipo) a su vez están producidas por su metabolismo interno, que está controlado por las enzimas que intervienen en los distintos pasos metabólicos”.<br />La adición de arginina al medio restaura el crecimiento<br />
  6. 6. reconoce a Neurosporacrassacomo uno de los 12 modelos eucariontes para la investigación biomédica<br />The<br />¿Por qué Neurosporacrassaes un buen modelo genético?<br />
  7. 7. Su ciclo de vida asexual <br />✔<br /><ul><li>Sus estructuras diferenciadas del ciclo asexual pueden identificarse fácilmente</li></ul>Conidio<br /><ul><li>Crece rápido</li></ul>Micelio<br /><ul><li>Suficiente biomasa para los análisis </li></li></ul><li>Su ciclo de vida sexual<br />✔<br />Ascosporas<br />Peritecio<br />Ascas<br /><ul><li>Tiene dos tipos sexuales (matingtypeA y a) lo que permite hacer cruzas
  8. 8. Pueden reconocerse las distintas estructuras diferenciadas
  9. 9. Produce ascas grandes lo que facilita hacer estudios de meiosis</li></ul>Ascogonia<br />Protoperitecio<br />
  10. 10. Fácil mantenimiento en el laboratorio<br />✔<br />Medio Vogel y 1.5% de sacarosa<br />Medio con 2% de sorbosa<br />3 días en oscuridad y 2 días en luz a 30°C<br />2 días en oscuridad a 30°C<br />
  11. 11. Fácil mantenimiento en el laboratorio<br />✔<br />Medio sintético de cruza<br />“Racetubes”<br />
  12. 12. ✔<br />No es patógeno pero ha servido como modelo para el estudio de procesos que se han conservado en los hongos patógenos<br />Las cepas se pueden preservar durante mucho tiempo <br />✔<br />
  13. 13. Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center (www.fgsc.net)<br />✔<br />Peritecios de la cepa mutante per-1<br />Mutante “Band”<br />Cepa “algodonosa” (fluffy)<br />
  14. 14. ✔<br />Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center afectadas en la formación de las ascosporas<br />Ascosporas mutante peak<br />Ascas de la mutante Perforated<br />Ascosporas gigantes mutante Banana<br />Ascas de una cepa silvestre<br />Ascosporas de las mutante cys-3<br />
  15. 15. Su genoma se encuentra secuenciado<br />✔<br />Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68<br />
  16. 16. Características del genoma de N. crassa<br />Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68<br />
  17. 17. ✔<br />La secuencia del genoma de Neurosporacrassase encuentra disponible en la red en la página del BROAD INSTITUTE<br />
  18. 18. Busquemos un gen… nor-1<br />
  19. 19. En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés <br />
  20. 20. En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés <br />
  21. 21. Se obtiene la secuencia génica y las regiones 5´y 3´que flanquean al gen nor-1<br />
  22. 22. Se pueden obtener mutantes nulas en un gen fácilmentePor la técnica del “Double Joint PCR”<br />✔<br />
  23. 23. Los métodos de transformación de Neurosporacrassa<br />Por electroporación<br />Por esferoplastos<br />Enzimas Líticas<br />
  24. 24. Existen herramientas disponibles para etiquetar proteínas (GFP, RFP, 6H, HA)<br />his-3<br />amp<br />pMF272<br />Promotor de ccg-1<br />his-3<br />gfp<br />nor-1<br />
  25. 25. Localización de Proteínas mediante fusiones con GFP<br />
  26. 26. Microscopía confocal<br />Microscopía de TIRF de polimerización de microtúbulos de una hifa de una cepa WT Uchida M. et al. 2008. FungalGeneticBiology. 2008 May;45(5):683-92<br />Microscopía confocal de una cepa con la construcción arg-4::gfp(Bowman)<br />
  27. 27. Microscopía confocal y epifluorescencia<br />Hifas con una construcción vma-1::rfp(se localiza en las vacuolas)<br />Bardiya, N. et al 2008. Genetics. 178 (1): 593-6<br />
  28. 28. Microscopia de BarridoConidia Anastomosis Tubes (CAT´s)<br />Roca, M. G. et al 2005. EukaryoticCell. P. 911-919 <br />
  29. 29. Ritmo circadiano<br />
  30. 30. Proceso de conidiación en N. crassa<br />1<br />ERO<br />6 – 15 min<br />40 min<br />Hifas en crecimiento<br />Adhesión de las hifas<br />2<br />ERO<br />ERO<br />2.5 - 12 h<br />5 – 30 min<br />1.5 h – 2.5 h<br />3<br />ERO<br />6.5 h - 8.5 h<br />8.5 - 15 h<br />ERO: Especies <br /> Reactivas <br />de Oxígeno<br />Conidiación<br />Micelio Aéreo<br />
  31. 31. Hansbergy Aguirre, 1990 <br />Estado diferenciado<br />Estado no diferenciado<br />O2 + nutrientes<br />O2 + nutrientes<br />[ERO]<br />diferenciación<br />Muerte Celular<br />O2 + nutrientes<br />germinación<br />[ERO]<br />“La diferenciación celular de los microorganismos se da como respuesta a un estado hiperoxidante”<br />Aguirre, J. et al. (2005), Trends in Microbiol. 13(3):111-8 <br />
  32. 32. PREDICCIONES<br />Mutaciones en los mecanismos antioxidantes<br />Mutaciones en los mecanismos pro-oxidantes<br />
  33. 33. Las NADPH oxidasas en células fagocíticas y sus ortólogos en hongos<br />O2<br /> O2.-<br />Flavocitocromo b558<br />gp91phox<br />NOX<br />NOX<br />p22 phox<br />p22 phox<br />gp91phox<br />p47phox<br />Rac-GTP<br />p40phox<br />Proteínas reguladoras<br />p67phox<br />BEM-1<br />p40phox<br />NADPH<br />NADP+<br />p47phox<br />GEF<br />p67phox<br />Rac-GTP<br />Rac-GDP<br />RhoGDI<br />NOR-1<br />Modificado de Lambeth, D. (2004). Nature review.4:181-1189<br />
  34. 34. NOX-1 isessentialfor sexual and asexual development<br />Δnox-1strains<br />NOX<br />p22phox<br />gp91phox<br /> WT <br />WT<br />∆nox-1<br />∆nox-1 (a) <br />WT<br />nox-1<br />p40phox<br />NOX-1 isessentialfor sexual frutingbodiesdevelopmentandalsorequiredfor normal developmentofaerialhyphaeandconidiation, as well as forvegetativegrowth.<br />p47phox<br />Cano-Dominguezet al. 2008. EukaryoticCell, 7(8):1352-61 <br />NOR-1<br />Rac-GTP<br />p67phox<br />
  35. 35. NOX-2 isrequieredfor sexual sporefunction<br />Δnox-2strains<br />NOX<br />p22phox<br />gp91phox<br />nox-2 x nox-2<br />WT x WT<br />p40phox<br />p47phox<br />TheascosporesfromΔnox-2 homozygouscrossesfailedtogerminate<br />NOR-1<br />Rac-GTP<br />p67phox<br />
  36. 36. NOR-1 isrequiredfor NOX-1 and NOX-2 activity<br />Δnor-1strains<br />NOX<br />p22phox<br />gp91phox<br />WT<br />nor-1<br />p47phox<br />p40phox<br />∆nox-2 X ∆nor-1<br />WT X WT<br />NOR-1<br />Rac-GTP<br />p67phox<br />
  37. 37. Agradecimientos<br />Dr. Jesús Aguirre <br />Biol. Olivia Sánchez<br />Laboratorio 107 Oriente<br />Dr. Wilhelm Hansberg<br />Dr. Pablo Rangel<br />Laboratorio 103 Oriente<br />
  38. 38. GRACIAS!!!<br />

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