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Genética y Biología Molecular de Neurospora
 

Genética y Biología Molecular de Neurospora

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Genética y Biología molecular de Neurospora crassa. Nallely Cano. Instituto de Fisiología Celular. UNAM.

Genética y Biología molecular de Neurospora crassa. Nallely Cano. Instituto de Fisiología Celular. UNAM.

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    Genética y Biología Molecular de Neurospora Genética y Biología Molecular de Neurospora Presentation Transcript

    • Genética y Biología Molecular en Neurosporacrassa
      Nallely Cano Domínguez
      Instituto de Fisiología Celular UNAM
      Laboratorio 107 Oriente
    • Neurosporacrassaen la naturaleza
    • De Moniliasitophilaa Neurospora
      Premio de la Sociedad Americana de Botánica 1956
      Bernard Ogilvie Dodge
    • “Cada uno de esos miles de tipos de genes tienen, en general, una única especificidad. Esto significa que una enzima usualmente tendrá su final específicamente en un grupo y sólo un gen”
      GEORGE WELLS BEADLE
      EDWARD L. TATUM
      Premio Nobel en Medicina 1958 por su hipótesis de “un gen-una enzima”
    • Experimentos de Beadle y Tatum
      Encuentran tres mutantes distintas que necesitaban arginina (arg-1, arg-2 y arg-3) para crecer y probaron si eran capaces de crecer en medio con ornitina y/o citrulina
      arg-1
      arg-3
      arg-2
      Citrulina
      Arginina
      Ornitina
      Precursor
      “Las características de una célula (su fenotipo) a su vez están producidas por su metabolismo interno, que está controlado por las enzimas que intervienen en los distintos pasos metabólicos”.
      La adición de arginina al medio restaura el crecimiento
    • reconoce a Neurosporacrassacomo uno de los 12 modelos eucariontes para la investigación biomédica
      The
      ¿Por qué Neurosporacrassaes un buen modelo genético?
    • Su ciclo de vida asexual

      • Sus estructuras diferenciadas del ciclo asexual pueden identificarse fácilmente
      Conidio
      • Crece rápido
      Micelio
      • Suficiente biomasa para los análisis
    • Su ciclo de vida sexual

      Ascosporas
      Peritecio
      Ascas
      • Tiene dos tipos sexuales (matingtypeA y a) lo que permite hacer cruzas
      • Pueden reconocerse las distintas estructuras diferenciadas
      • Produce ascas grandes lo que facilita hacer estudios de meiosis
      Ascogonia
      Protoperitecio
    • Fácil mantenimiento en el laboratorio

      Medio Vogel y 1.5% de sacarosa
      Medio con 2% de sorbosa
      3 días en oscuridad y 2 días en luz a 30°C
      2 días en oscuridad a 30°C
    • Fácil mantenimiento en el laboratorio

      Medio sintético de cruza
      “Racetubes”

    • No es patógeno pero ha servido como modelo para el estudio de procesos que se han conservado en los hongos patógenos
      Las cepas se pueden preservar durante mucho tiempo

    • Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center (www.fgsc.net)

      Peritecios de la cepa mutante per-1
      Mutante “Band”
      Cepa “algodonosa” (fluffy)

    • Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center afectadas en la formación de las ascosporas
      Ascosporas mutante peak
      Ascas de la mutante Perforated
      Ascosporas gigantes mutante Banana
      Ascas de una cepa silvestre
      Ascosporas de las mutante cys-3
    • Su genoma se encuentra secuenciado

      Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68
    • Características del genoma de N. crassa
      Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68

    • La secuencia del genoma de Neurosporacrassase encuentra disponible en la red en la página del BROAD INSTITUTE
    • Busquemos un gen… nor-1
    • En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés
    • En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés
    • Se obtiene la secuencia génica y las regiones 5´y 3´que flanquean al gen nor-1
    • Se pueden obtener mutantes nulas en un gen fácilmentePor la técnica del “Double Joint PCR”

    • Los métodos de transformación de Neurosporacrassa
      Por electroporación
      Por esferoplastos
      Enzimas Líticas
    • Existen herramientas disponibles para etiquetar proteínas (GFP, RFP, 6H, HA)
      his-3
      amp
      pMF272
      Promotor de ccg-1
      his-3
      gfp
      nor-1
    • Localización de Proteínas mediante fusiones con GFP
    • Microscopía confocal
      Microscopía de TIRF de polimerización de microtúbulos de una hifa de una cepa WT Uchida M. et al. 2008. FungalGeneticBiology. 2008 May;45(5):683-92
      Microscopía confocal de una cepa con la construcción arg-4::gfp(Bowman)
    • Microscopía confocal y epifluorescencia
      Hifas con una construcción vma-1::rfp(se localiza en las vacuolas)
      Bardiya, N. et al 2008. Genetics. 178 (1): 593-6
    • Microscopia de BarridoConidia Anastomosis Tubes (CAT´s)
      Roca, M. G. et al 2005. EukaryoticCell. P. 911-919
    • Ritmo circadiano
    • Proceso de conidiación en N. crassa
      1
      ERO
      6 – 15 min
      40 min
      Hifas en crecimiento
      Adhesión de las hifas
      2
      ERO
      ERO
      2.5 - 12 h
      5 – 30 min
      1.5 h – 2.5 h
      3
      ERO
      6.5 h - 8.5 h
      8.5 - 15 h
      ERO: Especies
      Reactivas
      de Oxígeno
      Conidiación
      Micelio Aéreo
    • Hansbergy Aguirre, 1990
      Estado diferenciado
      Estado no diferenciado
      O2 + nutrientes
      O2 + nutrientes
      [ERO]
      diferenciación
      Muerte Celular
      O2 + nutrientes
      germinación
      [ERO]
      “La diferenciación celular de los microorganismos se da como respuesta a un estado hiperoxidante”
      Aguirre, J. et al. (2005), Trends in Microbiol. 13(3):111-8
    • PREDICCIONES
      Mutaciones en los mecanismos antioxidantes
      Mutaciones en los mecanismos pro-oxidantes
    • Las NADPH oxidasas en células fagocíticas y sus ortólogos en hongos
      O2
      O2.-
      Flavocitocromo b558
      gp91phox
      NOX
      NOX
      p22 phox
      p22 phox
      gp91phox
      p47phox
      Rac-GTP
      p40phox
      Proteínas reguladoras
      p67phox
      BEM-1
      p40phox
      NADPH
      NADP+
      p47phox
      GEF
      p67phox
      Rac-GTP
      Rac-GDP
      RhoGDI
      NOR-1
      Modificado de Lambeth, D. (2004). Nature review.4:181-1189
    • NOX-1 isessentialfor sexual and asexual development
      Δnox-1strains
      NOX
      p22phox
      gp91phox
      WT
      WT
      ∆nox-1
      ∆nox-1 (a)
      WT
      nox-1
      p40phox
      NOX-1 isessentialfor sexual frutingbodiesdevelopmentandalsorequiredfor normal developmentofaerialhyphaeandconidiation, as well as forvegetativegrowth.
      p47phox
      Cano-Dominguezet al. 2008. EukaryoticCell, 7(8):1352-61
      NOR-1
      Rac-GTP
      p67phox
    • NOX-2 isrequieredfor sexual sporefunction
      Δnox-2strains
      NOX
      p22phox
      gp91phox
      nox-2 x nox-2
      WT x WT
      p40phox
      p47phox
      TheascosporesfromΔnox-2 homozygouscrossesfailedtogerminate
      NOR-1
      Rac-GTP
      p67phox
    • NOR-1 isrequiredfor NOX-1 and NOX-2 activity
      Δnor-1strains
      NOX
      p22phox
      gp91phox
      WT
      nor-1
      p47phox
      p40phox
      ∆nox-2 X ∆nor-1
      WT X WT
      NOR-1
      Rac-GTP
      p67phox
    • Agradecimientos
      Dr. Jesús Aguirre
      Biol. Olivia Sánchez
      Laboratorio 107 Oriente
      Dr. Wilhelm Hansberg
      Dr. Pablo Rangel
      Laboratorio 103 Oriente
    • GRACIAS!!!