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Genética y Biología Molecular de Neurospora

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Genética y Biología molecular de Neurospora crassa. Nallely Cano. Instituto de Fisiología Celular. UNAM.

Genética y Biología molecular de Neurospora crassa. Nallely Cano. Instituto de Fisiología Celular. UNAM.

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  • 1. Genética y Biología Molecular en Neurosporacrassa
    Nallely Cano Domínguez
    Instituto de Fisiología Celular UNAM
    Laboratorio 107 Oriente
  • 2. Neurosporacrassaen la naturaleza
  • 3. De Moniliasitophilaa Neurospora
    Premio de la Sociedad Americana de Botánica 1956
    Bernard Ogilvie Dodge
  • 4. “Cada uno de esos miles de tipos de genes tienen, en general, una única especificidad. Esto significa que una enzima usualmente tendrá su final específicamente en un grupo y sólo un gen”
    GEORGE WELLS BEADLE
    EDWARD L. TATUM
    Premio Nobel en Medicina 1958 por su hipótesis de “un gen-una enzima”
  • 5. Experimentos de Beadle y Tatum
    Encuentran tres mutantes distintas que necesitaban arginina (arg-1, arg-2 y arg-3) para crecer y probaron si eran capaces de crecer en medio con ornitina y/o citrulina
    arg-1
    arg-3
    arg-2
    Citrulina
    Arginina
    Ornitina
    Precursor
    “Las características de una célula (su fenotipo) a su vez están producidas por su metabolismo interno, que está controlado por las enzimas que intervienen en los distintos pasos metabólicos”.
    La adición de arginina al medio restaura el crecimiento
  • 6. reconoce a Neurosporacrassacomo uno de los 12 modelos eucariontes para la investigación biomédica
    The
    ¿Por qué Neurosporacrassaes un buen modelo genético?
  • 7. Su ciclo de vida asexual

    • Sus estructuras diferenciadas del ciclo asexual pueden identificarse fácilmente
    Conidio
    • Crece rápido
    Micelio
    • Suficiente biomasa para los análisis
  • Su ciclo de vida sexual

    Ascosporas
    Peritecio
    Ascas
    • Tiene dos tipos sexuales (matingtypeA y a) lo que permite hacer cruzas
    • 8. Pueden reconocerse las distintas estructuras diferenciadas
    • 9. Produce ascas grandes lo que facilita hacer estudios de meiosis
    Ascogonia
    Protoperitecio
  • 10. Fácil mantenimiento en el laboratorio

    Medio Vogel y 1.5% de sacarosa
    Medio con 2% de sorbosa
    3 días en oscuridad y 2 días en luz a 30°C
    2 días en oscuridad a 30°C
  • 11. Fácil mantenimiento en el laboratorio

    Medio sintético de cruza
    “Racetubes”
  • 12.
    No es patógeno pero ha servido como modelo para el estudio de procesos que se han conservado en los hongos patógenos
    Las cepas se pueden preservar durante mucho tiempo

  • 13. Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center (www.fgsc.net)

    Peritecios de la cepa mutante per-1
    Mutante “Band”
    Cepa “algodonosa” (fluffy)
  • 14.
    Mutantes de N. crassadisponibles en FungalGenetics Stock Center afectadas en la formación de las ascosporas
    Ascosporas mutante peak
    Ascas de la mutante Perforated
    Ascosporas gigantes mutante Banana
    Ascas de una cepa silvestre
    Ascosporas de las mutante cys-3
  • 15. Su genoma se encuentra secuenciado

    Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68
  • 16. Características del genoma de N. crassa
    Nature. 2003 Apr 24;422(6934):859-68
  • 17.
    La secuencia del genoma de Neurosporacrassase encuentra disponible en la red en la página del BROAD INSTITUTE
  • 18. Busquemos un gen… nor-1
  • 19. En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés
  • 20. En la página de BROAD INSTITUTE existen herramientas que nos permiten conocer algunas características de la secuencia del gen de interés
  • 21. Se obtiene la secuencia génica y las regiones 5´y 3´que flanquean al gen nor-1
  • 22. Se pueden obtener mutantes nulas en un gen fácilmentePor la técnica del “Double Joint PCR”

  • 23. Los métodos de transformación de Neurosporacrassa
    Por electroporación
    Por esferoplastos
    Enzimas Líticas
  • 24. Existen herramientas disponibles para etiquetar proteínas (GFP, RFP, 6H, HA)
    his-3
    amp
    pMF272
    Promotor de ccg-1
    his-3
    gfp
    nor-1
  • 25. Localización de Proteínas mediante fusiones con GFP
  • 26. Microscopía confocal
    Microscopía de TIRF de polimerización de microtúbulos de una hifa de una cepa WT Uchida M. et al. 2008. FungalGeneticBiology. 2008 May;45(5):683-92
    Microscopía confocal de una cepa con la construcción arg-4::gfp(Bowman)
  • 27. Microscopía confocal y epifluorescencia
    Hifas con una construcción vma-1::rfp(se localiza en las vacuolas)
    Bardiya, N. et al 2008. Genetics. 178 (1): 593-6
  • 28. Microscopia de BarridoConidia Anastomosis Tubes (CAT´s)
    Roca, M. G. et al 2005. EukaryoticCell. P. 911-919
  • 29. Ritmo circadiano
  • 30. Proceso de conidiación en N. crassa
    1
    ERO
    6 – 15 min
    40 min
    Hifas en crecimiento
    Adhesión de las hifas
    2
    ERO
    ERO
    2.5 - 12 h
    5 – 30 min
    1.5 h – 2.5 h
    3
    ERO
    6.5 h - 8.5 h
    8.5 - 15 h
    ERO: Especies
    Reactivas
    de Oxígeno
    Conidiación
    Micelio Aéreo
  • 31. Hansbergy Aguirre, 1990
    Estado diferenciado
    Estado no diferenciado
    O2 + nutrientes
    O2 + nutrientes
    [ERO]
    diferenciación
    Muerte Celular
    O2 + nutrientes
    germinación
    [ERO]
    “La diferenciación celular de los microorganismos se da como respuesta a un estado hiperoxidante”
    Aguirre, J. et al. (2005), Trends in Microbiol. 13(3):111-8
  • 32. PREDICCIONES
    Mutaciones en los mecanismos antioxidantes
    Mutaciones en los mecanismos pro-oxidantes
  • 33. Las NADPH oxidasas en células fagocíticas y sus ortólogos en hongos
    O2
    O2.-
    Flavocitocromo b558
    gp91phox
    NOX
    NOX
    p22 phox
    p22 phox
    gp91phox
    p47phox
    Rac-GTP
    p40phox
    Proteínas reguladoras
    p67phox
    BEM-1
    p40phox
    NADPH
    NADP+
    p47phox
    GEF
    p67phox
    Rac-GTP
    Rac-GDP
    RhoGDI
    NOR-1
    Modificado de Lambeth, D. (2004). Nature review.4:181-1189
  • 34. NOX-1 isessentialfor sexual and asexual development
    Δnox-1strains
    NOX
    p22phox
    gp91phox
    WT
    WT
    ∆nox-1
    ∆nox-1 (a)
    WT
    nox-1
    p40phox
    NOX-1 isessentialfor sexual frutingbodiesdevelopmentandalsorequiredfor normal developmentofaerialhyphaeandconidiation, as well as forvegetativegrowth.
    p47phox
    Cano-Dominguezet al. 2008. EukaryoticCell, 7(8):1352-61
    NOR-1
    Rac-GTP
    p67phox
  • 35. NOX-2 isrequieredfor sexual sporefunction
    Δnox-2strains
    NOX
    p22phox
    gp91phox
    nox-2 x nox-2
    WT x WT
    p40phox
    p47phox
    TheascosporesfromΔnox-2 homozygouscrossesfailedtogerminate
    NOR-1
    Rac-GTP
    p67phox
  • 36. NOR-1 isrequiredfor NOX-1 and NOX-2 activity
    Δnor-1strains
    NOX
    p22phox
    gp91phox
    WT
    nor-1
    p47phox
    p40phox
    ∆nox-2 X ∆nor-1
    WT X WT
    NOR-1
    Rac-GTP
    p67phox
  • 37. Agradecimientos
    Dr. Jesús Aguirre
    Biol. Olivia Sánchez
    Laboratorio 107 Oriente
    Dr. Wilhelm Hansberg
    Dr. Pablo Rangel
    Laboratorio 103 Oriente
  • 38. GRACIAS!!!

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