Enzimas de estricción

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Enzimas de estricción

  1. 1. Digestión de ADN usando Enzimas de Restricción Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Dr, Jose A. Carde-Serrano Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
  2. 2. Objetivos <ul><li>Repasar conceptos basicos de enzimologia </li></ul><ul><li>Conocer sobre enzimas de restriccion </li></ul><ul><li>Usar enzimas de restricción para cortar el ADN. </li></ul><ul><li>Electroforesis. </li></ul><ul><li>Separar los fragmentos usando electroforésis. </li></ul><ul><li>Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes enzimas de restricción. </li></ul>
  3. 3. Enzimologia <ul><li>Enzimas: </li></ul><ul><li>E + S -> [ES] -> P + E </li></ul><ul><li>Energia de Activacion </li></ul><ul><li>Restriccion </li></ul>
  4. 4. Enzimologia <ul><li>Enzimas: </li></ul><ul><li>E + S -> [ES] -> P + E </li></ul><ul><li>Energia de Activacion </li></ul><ul><li>Restriccion </li></ul>
  5. 5. Historia <ul><li>1968 – Descubiertas por Werner Arber </li></ul><ul><li>1969 – Enzimas de restricción tipo II identificadas por Hamilton O. Smith. Daniel Nathans, ayudo avanzar la técnica de recombinación del ADN (primer mapa genético usando enzimas de restricción). </li></ul><ul><li>Premio Nobel en Fisiología/Medicina 1978. </li></ul>
  6. 7. Enzimas de Restricción <ul><li>Diferentes tipos </li></ul><ul><ul><li>Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA en sitios no específicos > de 1,000 pb </li></ul></ul><ul><ul><li>Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan dentro de la secuencia </li></ul></ul><ul><ul><li>Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y cortan de 24-27 pb “down stream ” del sitio </li></ul></ul><ul><li>Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las secuencias especificas </li></ul>
  7. 8. Enzimas de restricción <ul><li>También conocidas como endonucleasas , cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen.(exonucleasas?) </li></ul><ul><li>La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica ( secuencia que se lee igual en ambas direcciones ). </li></ul><ul><li>Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula. </li></ul><ul><li>Las enzimas a usar en este laboratorio - Bam HI, Hin dIII, Eco RI, y Kpn I toman el nombre de las bacterias que la producen: </li></ul><ul><ul><li>Eco RI: E = género Escherichia . </li></ul></ul><ul><ul><li> co = especie coli </li></ul></ul><ul><ul><li> R = cepa RV 13 </li></ul></ul><ul><ul><li> I = primera endonucleasa aislada de esta cepa </li></ul></ul>
  8. 9. Enzimas de Restriccion <ul><ul><li>Llamadas enzimas de restricción porque restringen la actividad de bacteriófagos </li></ul></ul><ul><ul><li>“ Sistema inmunológico” de las bacterias </li></ul></ul><ul><ul><li>Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la bacteria y lo metila </li></ul></ul><ul><ul><li>enzimas de restricción solo atacan secuencias no metiladas (“restriction/modification systems”) </li></ul></ul>
  9. 10. Enzimas de Restricción <ul><li>Se han identificado cientos de enzimas de restricción. </li></ul><ul><li>Mayoría reconocen secuencias palindrómicas </li></ul><ul><li>Pueden producir cortes abruptos o pegajosos. </li></ul>
  10. 12. Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes: <ul><li>Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes. </li></ul><ul><li>Abruptos o truncados: cortan en un sólo punto. </li></ul>
  11. 13.   Corte cohesivo con EcoRI:
  12. 14. Algunas enzimas de restricción <ul><li>Eco RI 5'-G | AATTC </li></ul><ul><li>Eco RV 5'-GAT | ATC </li></ul><ul><li>Hin D III 5'-A | AGCTT </li></ul><ul><li>Sac I 5'-GAGCT | C </li></ul><ul><li>Sma I 5'-CCC | GGG </li></ul><ul><li>Xma I 5'-C | CCGGG </li></ul><ul><li>Bam HI I 5'-G | GATCC </li></ul><ul><li>Pst I I 5'-CTGCA | G </li></ul>
  13. 17. Bases Teóricas de enzimas de restricción <ul><li>La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas : </li></ul><ul><ul><li>pH </li></ul></ul><ul><ul><li>Temperatura </li></ul></ul><ul><ul><li>Concentración de sal </li></ul></ul><ul><ul><li>Iones </li></ul></ul><ul><li>Una unidad enzimática (u) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones optimas: </li></ul><ul><ul><li>3-5 u/ug de ADN genómico </li></ul></ul><ul><ul><li>1 u/ug de ADN plasmico </li></ul></ul>
  14. 18. Reacción enzimática <ul><li>Buffer (10X) 2 μ L </li></ul><ul><li>DNA (1 μ g) 1 μ L </li></ul><ul><li>Enzimas 2 unidades </li></ul><ul><li>H 2 O _________ </li></ul><ul><ul><li> 20 μ L Volumen total </li></ul></ul><ul><ul><li>Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I, </li></ul></ul>
  15. 19. ELECTROFORESIS DE GELATINA
  16. 20. ¿Qué es la electroforesis de gelatina? <ul><li>Es un proceso para separar una mezcla de moléculas a través de un material estacionario (“gel”) en un campo eléctrico. </li></ul>
  17. 21. Historia <ul><li>1933 - la técnica fue introducida por Tiselius </li></ul><ul><li>1959 - el “gel” policridamida fue introducido por Raymond y Weintraub </li></ul><ul><li>1975 - la electroforesis de dos dimensiones fue anunciada por P. H. O’Farrell </li></ul>
  18. 22. Geles comúnmente usados: <ul><li>Agarosa: polisacárido extraído de algas. </li></ul><ul><ul><li>No tóxico. </li></ul></ul><ul><ul><li>Poco poder de resolución pero alto grado de separación. </li></ul></ul><ul><ul><li>Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb. </li></ul></ul><ul><li>Poliacrilamida: polímero de acrilamida . </li></ul><ul><ul><li>Tóxico. </li></ul></ul><ul><ul><li>Menor grado de separación pero alto poder de resolución. </li></ul></ul><ul><ul><li>Usado para fragmentos de DNA de 500 pb. </li></ul></ul><ul><ul><li>Usado para separar mezclas de proteínas. </li></ul></ul>
  19. 23. Marcadores de Peso Molecular <ul><li>Son usualmente una mezcla de ADN con pesos moleculares conocidos. </li></ul><ul><li>Son usados para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN en una muestra de ADN. </li></ul>
  20. 24. Sistema de Amortiguadores <ul><li>TBE vs TAE </li></ul><ul><ul><li>TBE: DNA < 1kb </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Mejor resolucion </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Alta capacidad de amortiguador </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>TAE: DNA > 12 kb </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Menor capacidad amortiguador </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Para DNA q se va a recobrar </li></ul></ul></ul><ul><li>Continúa. </li></ul><ul><li>Discontinúa. </li></ul>
  21. 25. Preparación del “gel” Agarosa
  22. 26. Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) <ul><li>Tiene que pesarse y ser mezclada con el disolvente </li></ul><ul><ul><li>Gel agarosa 1% </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>1.0 g agarosa </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>99.0 ml 1X TAE </li></ul></ul></ul>
  23. 27. Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) <ul><li>Como la agarosa no es soluble con el amortiguador a temperatura ambiente tiene que ser hervida. </li></ul>
  24. 28. Preparación de gel: <ul><li>La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir. </li></ul>
  25. 29. <ul><li>Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, servir con cuidado la mezcla en la bandeja. </li></ul><ul><li>Dejar que se torne opaco y sólido. </li></ul>Preparación de gel:
  26. 30. Aparato del “gel” <ul><li>Consiste de: </li></ul><ul><li>bandeja </li></ul><ul><li>soporte </li></ul><ul><li>peineta </li></ul>
  27. 31. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>Colocación del “gel” a la bandeja. </li></ul>
  28. 32. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>El tanque es llenado con amortiguador. </li></ul><ul><ul><li>1X TAE </li></ul></ul>
  29. 33. <ul><li>Cuando el gel solidifique y se torne opaco, sacar la peinilla y poner gel en cámara de electroforésis con fosas del lado del polo negativo. </li></ul><ul><li>Proceder a pipetear las muestras en las fosas. </li></ul><ul><li>Correr gel. </li></ul><ul><li>Teñir. </li></ul>Aparato de “gel” (Cont.)
  30. 34. Práctica de uso de micropipetas: <ul><li>Apoye brazo que esté agarrando micropipeta en superficie firme. </li></ul><ul><li>Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta </li></ul><ul><li>Introduzca punta de micropipeta dentro de fosa, sin tocar el gel </li></ul><ul><li>Vierta el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia </li></ul>
  31. 35. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>El “gel” agarosa es cargado con muestras de ADN. </li></ul>
  32. 36. Organización del gel cargado con λ ADN/Enzimas de restricción Marcador λ DNA/Eco RI Marcador λ DNA uncut λ DNA/BAM HI λ DNA/ECO RI λ DNA/HIN DIII λ DNA/KPN I A B C D E F
  33. 37. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>Campo eléctrico. </li></ul><ul><ul><li>100 V </li></ul></ul><ul><ul><li>30-45 minutos </li></ul></ul>
  34. 38. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>Distancia migratoria. </li></ul>
  35. 39. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>El “gel”es colocado en un transluminador con luz UV. </li></ul>
  36. 40. Aparato de “gel” (Cont.) <ul><li>Partículas de ADN. </li></ul><ul><li>Cortar las bandas </li></ul><ul><ul><li>Guardar en microtubos </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>rotular </li></ul></ul></ul>
  37. 43. ¿ Preguntas?
  38. 44. Preguntas <ul><li>¿ Cual es la función de las sales en la eficiencia de las enzimas de restricción? </li></ul><ul><li>¿ Por que las enzimas de restricción no atacan el ADN de las bacterias que lo poseen? </li></ul>

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