2. CITOGENÉTICA CONVENCIONAL
Estudio de cromosomas, estructura y herencia.
Los transtornos cromosómicos constituyen una entidad
dentro de las enfermedades genéticas.
3. Estudio Citogenético/
Cromosómico
Células estén división celular (Mitosis)
Análisis cromosómico (morfología y patrón de bandas)
en Metafase.
Algunas células normalmente en proceso de
proliferación y diferenciación por lo que no necesitan de
un estimulante mitogénico para que entren división.
Otras células ya diferenciadas requieren de un
estimulante mitógeno para que entren en mitosis.
Cultivos Indirectos y Cultivos Directos
Cultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo
4. Cultivo Celular Directo
La célula no requiere de un estimulante mitogénico para entrar
en división celular.
Cultivo de Células Fetales
Cultivo a largo plazo (10-14 d)
Muestra: Liquido Amniótico obtenido por Amniocentesis
alrededor de la 16ª semana de gestación.
Dx prenatal de una alteración cromosómica.
Cultivo de Vellosidades Coriales
Cultivo corto plazo (24 –48 horas) y Cultivo largo plazo (1014 d)
Muestra: Biopsia aspiración de Vellosidades Coriónicas
alrededor de la 10ª sem. de gestación.
Dx prenatal de una alteración cromosómica.
Cultivo de Restos Endouterinos
Cultivo largo plazo (10-14 días)
Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado
Detectar una anomalía cromosómica del producto.
5. Procedimiento (“Cultivo Directo” de
Líquidos Orgánicos )
Centrifugar a 1000 RPM
por 10min.
Eliminar sobrenadante y
colectar los sedimentos
Adicionar 6 ml. De
Solución Hipotónica ( ClK
0.075 M ) agitar con
Pipeta Pasteur
Incubar a 37°C por 30
min.
Centrifugar a 1000 RPM
por 10 min. Eliminar el
sobrenandante.
6. Procedimiento (“Cultivo Directo”
de Líquidos Orgánicos )
Añadir 5 ml de Fijador. Agitar
con Pipeta Pasteur y dejar a TA
por 30 min.
Centrifugar a 1000 RPM por 10
min, eliminar sobrenandante y
añadir 5 ml de Fijador. Repetir
este paso 2 o 3 veces.
Colocar 3 a 4 gotas sobre una
lámina portaobjeto y fijarlo al
calor.
Coloración convencional
(Giemsa).
Bandeo Cromosómico (Banda
GTG).
Observación Microscópica.
7. Cultivo Celular Indirecto
La célula requiere de un estimulante mitogénico
para que entre en división celular.
Cultivo de Linfocitos
Cultivo a corto plazo (72 horas)
Muestra: Sangre Periférica
Se realiza para detectar cualquier alteración
cromosómica constitucional (que el defecto
cromosómico este presente en todas las células
de nuestro organismo).
Se utiliza para detectar las autosomopatías
(Síndromes Down, Patau, Edwards, etc.) y las
Gonosomopatías (Síndromes de Turner,
Triple X, Klinefelter, etc.)
8. Cultivo Celular: MEDIOS DE CULTIVO
CELULAR
Contienen todos los aminoácidos, vitaminas,
cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones,
indicadores de pH. Todo lo necesario para que la
célula pueda dividirse in vitro.
Existen distintos medios de cultivo los cuales se
seleccionan dependiendo del tipo de muestra o
tipo de célula a cultivar y lograr que estos
respondan adecuadamente con un crecimiento
celular.
9. Cultivo Celular
Medios de Cultivo más Utilizados
1. Medio McCoy’s 5A Modified
Cultivo Sangre Periférica
(Linfocitos)
2. Medio RPMI 1640:
Cultivo Sangre Periférica
(Linfocitos)
3. Medio Tc199:
Cultivo Sangre Periférica
(Linfocitos)
4. Medio Ham F10 ó Ham F12
Cultivo de células fetales
10. Cultivo Celular
SUPLEMENTOS
Las células requieren para su crecimiento y división
celular de suplementos, los cuales serán utilizados
dependiendo del tipo de células que se desea
cultivar y del tipo de estudio citogenético
requerido.
1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : Se utiliza a
diferentes concentraciones:
20% para el cultivo de SP
30% para el cultivo de células fetales
11. Cultivo Celular
2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: Utilizado como
antibióticos para evitar la contaminación bacteriana.
3.- ANTIMICOTICOS: Fungizona para evitar el
crecimiento de hongos, si es que fuera necesario.
4.- L- GLUTAMINA: Aa que en su forma levógira
mejora el crecimiento celular.
5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para
estimular el proceso de mitosis en el cultivo de
linfocitos.
Fitohemaglutinina (PHA)
15. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
Toma de Muestra
. Condiciones de
asepsia
. Anticoagulante
heparina
. Volumen de muestra
16. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
Selección de los medios de cultivo y suplementos
17. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
Sedimentar la mx 2h aprox.
18. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
Eliminar el
P.G
(dejar un
pequeño remanente)
dejando la interfase
(Globulos blancos)
y el plasma.
19. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
Se utilizará para la
siembra( 20 gotas).
20. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. Incubar a 37ºc por
72 horas
21. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. El índice máximo de
mitosis se obtiene a las
70-72horas. Por lo
tanto
habrán más células en
metafase
22. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. Diariamente se
debe mezclar el
frasco de cultivo.
. Controlar cambios
de color que indica
cambios del ph o
turbidez que indica
contaminación.
23. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. COSECHA
1. Colchicinización
. Agregar Colchicina
100 uL. Mezclar
suavemente
24. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. Incubar a 37ºC por
15 minutos
25. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
Eliminar el
sobrenadante.
Trabajar siempre
con el sedimento
26. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
2. Hipotonización
. Adicionar solución
hipotónica: Cloruro
de Potasio 0.075 M
7mL y homogenizar.
27. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. Incubar a 37ºC
por 12
minutos.
28. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
3. FIJACIÓN:
. Adicionar Fijador
(Metanol +Acido
Acético Glacial )
V/V
. Sacar el tubo de la estufa y
adicionar 5 mL de fijador Carnoy
para detener la acción de la
solución hipotónica.
Observar color marrón oscuro.
. Homogenizar
. Centrifugar 2500 RPM por 12
minutos.
29. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
. Eliminar el
sobrenadante y
repetir el paso
anterior 3 veces
hasta que ya no
haya turbidez.
El último sedimento
resuspender con
1mL de fijador.
30. CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA
(LINFOCITOS)
4. Preparado Cromosómico
. Adicionar 3 a 4 gotas
sobre
una lámina portaobjetos
helada.
. Secar al calor de un
mechero.
. Guardar en una gradilla
