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  • 1. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD XOCHIMILCO UEA: “ENERGÍA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES” CICLO DEL
  • 2. CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO
    • IMPORTANCIA BIOMÉDICA
    • El ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs, ciclo de los ácidos tricarboxílicos) consiste en una serie de reacciones en las mitocondrias que oxidan residuos de acetilo (en forma de acetil CoA) y reducen coenzimas que, en la reoxidación, se forma ATP.
    • El ciclo del ácido cítrico es la ruta oxidativa central de la respiración, el proceso mediante el cual se catabolizan todos los combustibles metabólicos (hidratos de carbono, lípidos y proteínas) en los organismos y tejidos aerobios. También tiene una función fundamental en la gluconeogénesis, la lipogénesis y la interconversión de aminoácidos; muchos de estos procesos ocurren en la mayor parte de los tejidos, pero más en el hígado, por ello las repercusiones son profundas cuando sé dañan grandes cantidades de células hepáticas como en la hepatitis aguda, o se son reemplazadas por tejido conectivo, como en la cirrosis.
  • 3. Visión general de la oxidación del piruvato y del ciclo del ácido cítrico LAS TRES ETAPAS DE LA RESPIRACIÓN La oxidación metabólica de los sustratos orgánicos es un procesos de tres etapas: la etapa 1 consiste en la generación de un fragmento activado de dos carbonos, el grupo acetil de la acetil – coenzima A. La etapa 2 es la oxidación de esos dos átomos de carbono en el ciclo del ácido cítrico. La etapa 3 es el transporte electrónico y la fosforilación oxidativa, en donde los transportadores electrónicos reducidos que se generan en el ciclo del ácido cítrico vuelven a oxidarse, junto con la síntesis de ATP.
  • 4. En la etapa 1, el carbono de los combustibles metabólicos se incorpora a la acetil – CoA. En la etapa 2, el ciclo del ácido cítrico,l la oxidación del del carbono produce CO 2 , transportadores electrónico reducidos y una pequeña cantidad de ATP. En la etapa 3, los transportadores electrónicos reducidos se reoxidan, aportando energía paara la síntesis de más ATP.
  • 5. La etapa 1 está formada por una familia de rutas, que actúan por separado sobre los hidratos de carbono, las grasas y las proteínas. El carbno procedente de los hidratos de carbono entra en la etapa 1 en forma de piruvato. La degradación de las grasas genera acetil – CoA, principalmente mediante la β – oxidación de los ácidos grasos, mientras que varias rutas distintas generan acetil – CoA e intermediarios del ciclo del ácido cítrico a partir del catabolismo de los aminoácidos. Las reacciones de las dos primeras etapas de la respiración ocurren en la matriz interior de la mitocondria, semejante a un gel, y el transporte electrónico y la fosforilación oxidativa están catalizadas por las enzimas ligadas a la membrana en las crestas, proyecciones de la membrana mitocondrial interna que se extienden, apiladas y pegadas, en el interior de la matriz.
  • 6. Estrategia del ácido cítrico El grupo acetilo de la acetil – CoA se transfiere de un ácido orgánico de cuatro carbonos, el oxaloacetato, para dar un ácido tricarboxílico de seis carbonos, el citrato. El citrato, entra en una serie de siete reacciones durante las cuales se liberan dos carbonos en forma de CO 2 y los cuatro carbonos restantes se regeneran en forma de oxaloacetato, que puede iniciar de nuevo el proceso. De ahí la naturaleza cíclica de la ruta: el oxaloacetato está presente al principio, para reaccionar con un fragmento activado de dos carbonos, y está presente al final, después de que se hayan oxidado los dos carbonos hasta CO 2. De las ocho reacciones en el ciclo, cuatro son deshidrogenaciones, que conjuntamente generan cofactores reducidos.
  • 7. La acetil – CoA que se incorpora al ciclo del ácido cítrico está marcada (en azul) para indicar el destino de sus dos carbonos a través de la reacción 4. Tras la reacción 5, los átomos de carbono que han entrado más recientemente ya no se resaltan, ya que el succinato es una molécula simétrica. Los grupos carboxilo que abandonan el ciclo en forma de CO 2 en las reacciones 3 y 4, se muestran en verde, estos grupos que salen contienen carbonos incorporados como acetil – CoA en las primeras vueltas del ciclo.
  • 8. Oxidación del piruvato, ruta de entrada principal del carbono en el ciclo del ácido cítrico El piruvato procedente de la oxidación de los hidratos de carbono es uno de los principales suministradores de acetil – CoA para la oxidación en el ciclo del ácido cítrico. La conversión del piruvato en acetil – CoA catalizada por la piruvato deshidrogenasa, es una descarboxilación oxidativa. En la reacción global, el gupo carboxilo se pierde como CO 2 mientras que los dos carbonos restantes forman la porción de la acetil – CoA: + NAD + + coenzima A + NAD + + CO 2 Δ Gº´= -33.5 kJ/mol
  • 9. La reacción comporta la generación de un transportador electrónico reducido (NADH), la descarboxilación del piruvato y la activación metabólica de los dos carbonos restantes del piruvato. La reacción es muy exergónica e, in vivo, es prácticamente irreversible. Intervienen en ella tres enzimas, junto con cinco coenzimas, que incluyen las dos coenzimas, NAD + y coenzima A, que aparecen en la reacción global, Las tres enzimas que participan se ensamblan en un complejo multienzimático muy organizado, denominado complejo piruvato deshidrogenasa. Las reacciones catalizadas por las tres enzimas individuales son piruvato deshidrogenasa (E1), dihidrolipoamida transacetilasa (E2) y dihidrolipoamida deshidrogenasa (E3).
  • 10. Este diagrama simplificado muestra la oxidación del piruvato a acetil – CoA por el complejo piruvato deshidrogenasa. En la oxidación intervienen tres enzimas y cinco coenzimas. Tres de estas coenzimas (TPP, FAD y ácido lipoico) están unidas a las enzimas del complejo.
  • 11. Ciclo del ácido cítrico El ciclo actúa en dos fases: 1) Adición de una porción de dos carbonos (acetil – CoA) a un compuesto de cuatro carbonos (oxaloacetato) para dar un anión orgánico de seis carbonos, el citrato, seguido de la pérdida de dos carbonos en forma de CO 2 . 2) Regeneración del oxaloacetato.
  • 12. FASE 1: Introducción y pérdida de dos átomos de carbono Paso 1: Introducción de dos átomos de carbono en forma de acetil – CoA La reacción inicial, catalizada por la citrato sintasa, es semejante a una condensación aldólica. + + H 2 O + CoA – SH + H +
  • 13. Paso 1: Un residuo básico (B:) de la enzima extrae un protón del grupo metilo de la acetil – CoA, creando un carbanión nucleófilo que ataca al carbono ceto del oxaloacetato. Paso 2: La citroil – CoA formada en el paso 1 se hidroliza espontáneamente, mientras está unido a la enzima para dar productos. En el primer paso de entrada a una ruta, la reacción es muy exergónica.
  • 14. Paso 2: Isomerización de citrato Los sustratos de las reacciones de descarboxilación son generalmente α ò β cetoácidos; el grupo hidroxilo del alcohol terciario del citrato debe migrar para experimentar una oxidación a carbonilo, la isomerización catalizada por la aconitasa, genera un alcohol secundario isocitrato, que puede oxiadarse. La reacción comporta una deshidratación e hidratación sucesivas, a través del cis – aconitato como intermediario deshidratado, que se mantiene unido a la enzima: Cis - aconitato H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O
  • 15. Una mezcla en equilibrio de estos tres ácidos a 25ºC contiene aproximadamente un 90% de citrato, un 4% de cis – aconitato y un 6% de isocitrato, pero el carácter exergónico de la siguiente reacción desplaza la reacción hacia la derecha, tal como está escrita. La enzima contiene hierro no hemo y azufre acidolábil, en una agrupación denominada centro hierro –azufre 4Fe – 4S, que normalmente se asocia a las oxidorreductasas . La aconitasa es el lugar de acción del efecto tóxico del fluoroacetato, un producto vegetal que se ha utilizado como pesticida. Este compuesto bloquea el ciclo del ácido cítrico mediante su conversión metabólica en flurocitrato que es un potente inhibidor de la aconitasa
  • 16. Paso 3: Generación de CO 2 por una deshidrogenasa ligada al NAD + La primera de las dos descarboxilaciones oxidativas del ciclo la cataliza la isocitrato deshidrogenasa: + NAD + (NADP + ) + NADH + CO 2 (NADPH) La reacción comporta la deshidrogenación a oxalosuccinato, un intermediario inestable unido a la enzima, que espontáneamente se descarboxila antes de liberar el producto.
  • 17. Paso 4: Generación de un segundo CO 2 por un complejo multienzimático La cuarta reacción del ciclo del ácido cítrico es una reacción de varios pasos totalmente comparable a la reacción del piruvato deshidrogenasa. Un sustrato α – cetoácido experimenta una descarboxilación oxidativa, con formación simultánea de un acil – CoA: + NAD + + CoA – SH CO 2 + NADH El complejo de la deshidrogenasa del alfa cetoglutarato requiere de los mismos cofactores que el complejo de la piruvato deshidrogenasa: difosfato de tiamina, lipoato, NAD+, FAD y CoA. El equilibrio de esta reacción favorece la formación de la succinil CoA, por lo que debe considerarse unidireccional desde el punto de vista fisiológico. El arseniato inhibe la reacción, lo que ocasiona que se acumule el sustrato alfa cetoglutarato.
  • 18. Fase 2: Regeneración del oxalacetato En este punto del ciclo, se han introducido dos átomos de carbono en forma de acetil – CoA (por la citrato sintasa) y se han perdido otros dos en forma de CO 2 . Dada la estereoquímica de la reacción de la aconitasa, los dos átomos de carbono perdidos no son los mismos que los dos átomos de carbono introducidos al comienzo del ciclo. En las reacciones restantes, el intermediario de cuatro carbonos succinil – CoA se convierte en el producto de cuatro carbonos oxaloacetato, mediante un procesos en el que dos de los cuatro pasos comportan reacciones de deshidrogenación.
  • 19. Paso 5: Una fosforilación a nivel de sustrato La succinil – CoA es un compuesto de energía elevada, y su energía elevada, y su energía potencial se utiliza para impulsar la formación de un nucleósido trifosfato a partir de un difosfato. Esta reacción, catalizada por la succinil – CoA sintetasa, es comparable a las dos reacciones de fosforilación a nivel de sustrato de la glucólisis, excepto porque en las células animales el nucleótido producto de energía elevada no es siempre ATP, sino que en algunos tejidos es el GTP. + Pi + GDP ó ADP + GTP ó ATP + CoA – SH En los animales, las células hepáticas contienen principalmente la succinil CoA sintetasa, ligada al GTP, mientras que en el cerebro y el corazón predomina la enzima ligada al ATP. Gran parte del GTP formado impulsa la síntesis final de ATP, mediante la acción de la nucleósido disfosfato quinasa.
  • 20. Paso 6: Deshidrogenación dependiente de flavina Para completar el ciclo se produce una conversión del succinato de cuatro carbonos en el oxalacetato de cuatro carbonos. La primera de las tres reacciones que interviene, catalizada por la succinato deshidrogenasa, es la deshidrogenación dependiente del FAD de dos carbonos saturados a un doble enlace: + E - FAD + E – FADH 2 La enzima contiene FAD y centros hierro – azufre (Fe:S) y reduce directamente a la ubiquinona en la cadena respiratoria.
  • 21. Paso 7: Hidratación de un doble enlace carbono – carbono La hidratación trans esteroespecífica del doble enlace carbono – carbono la cataliza la fumarato hidratasa, denominada más comúnmente fumarasa: + H 2 O El isómero cis del fumarato, que recibe el nombre de maleato, no es un sustrato de la reacción hacia delante, y la enzima no puede actuar sobre el D – malato en la dirección contraria.
  • 22. Paso 8: Una deshidrogenación que regenera el oxalacetato Finalmente, el ciclo se completa con la deshidrogenación, dependiente del NAD + , del malato a oxalacetato, catalizada por la malato – deshidrogenasa + NAD + + NAD + + H + Esta reacción muy endergónica se decanta hacia la derecha, tal como está escrita, debido a que la reacción de la citrato sintasa muy exergónica mantiene las concentraciones intramitocondriales de oxalacetato extremadamente bajas (inferiores a 10 -6 M).
  • 23. Estequiometría y energética del ciclo del ácido cítrico El ciclo se inició cuando un fragmento de dos carbonos (acetil – CoA) se combinó con un aceptor de cuatro carbonos (oxalacetato). Luego se eliminaron dos carbonos en forma de CO 2 al metabolizarse posteriormente el citrato resultante. Se produjeron cuatro reacciones de oxidación durante el ciclo, en las que el NAD+ actuó como coenzima en tres casos, y el FAD en el cuarto. Se generó fosfato de energía elevada directamente en una sola reacción (catalizada por la succinil – CoA). Por último se regeneró el oxalacetato que está preparado para volver a iniciar el ciclo de nuevo mediante la condensación con otra molécula de acetil CoA.
  • 24. Una vuelta del ciclo del ácido cítrico genera un fosfato de alta energía elevada a través de una fosforilación a nivel de sustrato, más tres NADH y un FADH 2 para la posterior reoxidación
  • 25. Se puede escribir una ecuación química equilibrada que corresponde a la suma de las ocho reacciones que intervienen en una vuelta del ciclo: Acetil – CoA + 2H 2 O + 3NAD + + FAD + GDP + Pi 2CO 2 + 3NADH + FADH 2 + CoA – SH + GTP El GTP formado en la reacción de la succinil CoA sintetasa en los animales es energéticamente equivalente al ATP, ya que la nucleósido difosfato quinasa puede convertir el GTP que se forma en ATP sin costo neto de energía libre.
  • 26. Si se tiene en cuenta la reacción del piruvato deshidrogenasa, y si recordamos que cada molécula de glucosa genera dos moléculas de piruvato, se puede establecer la siguiente ecuación para el catabolismo de la glucosa a través de la glucosa y el ciclo del ácido cítrico: Glucosa + 2H 2 O + 10NAD + + 2FAD + 4ADP + 4Pi 6CO 2 + 10NADH + 6H + + 2FADH 2 + 4ATP Hasta aquí la producción de ATP por mol de glucosa metabolizada no ha aumentado mucho respecto a la producción obtenida en la glucólsis: 2 moles de ATP por glucólisis sola, frente a 4 moles aquí. La mayor parte del ATP generado durante la oxidación de la glucosa no se forma directamente a partir de las reacciones de la glucólisis y del ciclo del ácido cítrico, sino que se forma a partir de la reoxidación de los transportadores electrónicos reducidos en la cadena respiratoria.
  • 27. Vitaminas clave Cuatro de las vitaminas B son esenciales en el ciclo del ácido cítrico y, por lo tanto en el metabolismo que produce energía: 1) Riboflavina: en la forma de flavin adenin dinucleótido (FAD), cofactor en el complejo α – cetoglutarato deshidrogenasa y en la succinato deshidrogenasa. 2) Niacina: en la forma de nicotinamida adenin dinucleótido (NAD), coenzima para tres deshidrogenasas en el ciclo, isocitrato deshidrogenasa, la α – cetoglutarato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. 3) Tiamina (B1): como difosfato de tiamina, la coenzima para la descarboxilación en la reacción de la α – cetoglutarato deshidrogenasa. 4) Ácido pantoténico: como parte de la coenzima A, el cofactor unido a residuos de ácido carboxílico “activos, como la acetil – CoA y la succinil – CoA.
  • 28. Regulación de ciclo del ácido cítrico Dado que el ciclo del ácido cítrico es una fuente de intermediarios biosintéticos, así como una ruta para la generación de energía metabólica, la regulación del ciclo es algo más compleja que si se tratara solamente de una ruta de generación de energía. Al igual que en la glucólisis, la regulación se produce a nivel de la entrada de combustible al ciclo, y a nivel del control de las reacciones clave dentro del ciclo
  • 29.
    • Principales factores reguladores que controlan la piruvato deshidrogenasa y el ciclo del ácido cítrico.
    • Círulos rojos indican la dependencia de la concentración.
    • El NADH puede inhibir mediante interacciones alostéricas, pero la aparente inhibición por el NADH puede ser también un reflejo de la disponibilidad reducida de NAD + .
  • 30. El flujo a través del ácido cítrico se controla mediante interacciones alostéricas, no obstante las concentraciones de los sustratos tienen un papel crucial. El factor más importante que controla la actividad del ácido cítrico es la relación intramitocondrial del [NAD+] respecto al [NADH]. El NAD+ es un sustrato de tres enzimas del ciclo, así como de la piruvato deshidrogenasa. (tres adentro una afuera) En las condiciones en las que disminuye la relación [NAD+]/[NADH], como por ejemplo en presencia de una limitación del aporte de oxígeno, la baja concentración de NAD+ puede limitar las actividades de estas deshidrogenasas.
  • 31. Los lugares clave de la regulación alostérica son las reacciones catalizadas por la isocitrato deshidrogenasa y la α – cetoglutarato deshidrogenasa. En muchas células, la isocitrato deshidrogenasa se activa por el ADP y se inhibe directamente por el NADH. Este control se suma a la reducción indirecta de la actividad que se observa en presencia de una relación [NAD+]/[NADH] baja. La isocitrato deshidrogenasa también se inactiva por la fosforilación de un residuo de serina, lo cual impide la unión del isocitrato. La actividad de la α – cetoglutarato deshidrogenasa se inhibe por la succinil – CoA y por el NADH. Los mecanismos son comparables a los que permiten que las concentraciones de acetil – CoA y de NADH controlen la actividad de la piruvato deshidrogenasa.
  • 32. Participación del ciclo del ácido cítrico en otros procesos Los intermediarios del ciclo son glucogénicos, porque dan lugar al oxalacetato y , por lo tanto, a la producción neta de glucosa. La enzima clave que cataliza la transferencia neta fuera del ciclo en la gluconeogénesis es la fosfoenolpiruvato carboxicinasa, que descarboxila el oxalacetato a fosfoenolpiruvato, el GTP actúa como donador de fosfato. La transferencia total hacia el ciclo es resultado de reacciones anapleróticas y entre las importantes está la formación de oxalacetato mediante la carboxilación de piruvato catalizada por la piruvato carboxilasa. Es importante para mantener una concentración adecuada de oxalacetato para la reacción de condensación con la acetil – CoA.
  • 33. En las reacciones de la aminotransferasa (transaminasa) se forma piruvato a partir de alanina, oxaloacetato a partir de aspartato y α – cetoglutarato a partir de glutamato. Como estas reacciones son reversibles, e ciclo también sirve como fuente de estructura de carbono para la síntesis de estos aminoácidos. Otros aminoácidos contribuyen a la gluconeogénesis, porque sus estructuras de carbono dan lugar a los intermediarios del ciclo del ácido cítrico; la alanina, cisteína, glicina, hidroxiprolina, serina, treoninay triptófano producen piruvato; la arginina, histidina, glutamina y prolina producen α – cetoglutarato; la isoleucina, metionina y valina dan succinil – CoA y la tirosina y fenilalanina dan fumarato.
  • 34. BIBLIOGRAFÍA  Murray R, Mayes P, Granner D, Rodwell V. Harper, Bioquímica ilustrada. Ed. El Manual Moderno, México 2004. 16ª edición, pp. 145 – 151.  Mathews C, Van Holde K, Ahern K. Bioquímica . Ed. Pearson Addison Wesley, España 2002. 3ª edición, pp. 541 – 564.

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