Bioquímica da fermentação etanólica

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Bioquímica da fermentação etanólica

  1. 1. CAURÉ PORTUGAL
  2. 2. 1. Kloeckera, Hanseniaspora, Candida 2. Pichia, Metschnikowia 3. Saccharomyces cerevisiae Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosacchaomyces, Zygosaccharomyces, Br ettanomyces
  3. 3. Anaeróbios facultativos • Organismos aeróbios que conservaram a capacidade de recorrer à fermentação para produzir energia, nos curtos períodos em que o oxigênio não se encontra disponível. Anaeróbios obrigatórios • São seres que têm na fermentação a sua única fonte de obtenção de energia.
  4. 4. • Falta de nutrientes; acúmulo de etanol • Influência direta: temperatura; concentrações de amônia, aminoácidos e outros nutrientes; presença de oxigênio • Adaptação às condições
  5. 5. FASE LAG • Aclimatação: absorção de oxigênio, minerais, vitaminas (riboflavina, inositol, biotina) e aminoácidos (N)*. • Oxigênio: produção de esteróis (permeabilidade da membrana). • Baixa atividade celular.
  6. 6. FASE DE CRESCIMENTO EXPONENCIAL • Consumo de açúcares, produção de CO2, etanol e compostos aromáticos. • Fase de crescimento celular: utilização dos açúcares mais simples.
  7. 7. FASE ESTACIONÁRIA • Termina a produção da maioria dos compostos. • Reabsorção de alguns metabólitos produzidos durante a fermentação. • Início da floculação das células
  8. 8. FASE DE MORTE CELULAR • Autólise (destilados e vinhos espumantes) • Degradação por enzimas endógenas com liberação de diversos componentes (peptídeos, aminoácidos, ácidos graxos, nucleotídeos, nucleosídeos)
  9. 9. Metabolismo celular É o conjunto de reações químicas essenciais à vida realizadas pelas células de todos os seres vivos. CATABOLISMO ANABOLISMO Reações metabólicas em que os compostos orgânicos são degradados em moléculas mais simples, ocorrendo liberação de energia. Reações metabólicas em que ocorre formação de moléculas mais complexas a partir de moléculas mais simples, ocorrendo consumo de energia. OXIDAÇAO REDUÇAO
  10. 10. Transferência de energia contida nos compostos orgânicos para moléculas de ATP. Nestas vias, intervêm compostos (como o NAD+) que transportam os prótons (H+) e elétrons (e-) do hidrogênio, desde o substrato até um aceptor final. Respiração Aeróbia Respiração Anaeróbia Fermentação Aceptor final de elétrons: Aceptor final de elétrons: Aceptor final de elétrons: Oxigênio Outras moléculas inorgânicas Outras moléculas orgânicas Reaçoescatabólicas NAD+ + 2e- + 2 H+ NADH + H+ oxidação redução (forma oxidada) (forma reduzida)
  11. 11. • São duas vias catabólicas responsáveis pela transferência de energia de compostos orgânicos (glicose) para moléculas de ATP. • Em ambos os processos estão implicadas: Reações de descarboxilação (perda de CO2) Reações de fosforilação (transferência de Pi) Transferências de energia do tipo oxidação – redução. Fermentação e Respiração
  12. 12.  Utilização das reservas de glicogênio e oxigênio disponível no meio para revitalizar a membrana (permeabilidade e transferência).  Consumo de oxigênio e de açúcares e nutrientes (difusão facilitada e/ou transporte ativo).  Consumo de açúcares na seguinte ordem: 1. Glicose* 2. Frutose 3. Sacarose 4. Maltose 5. Maltotriose Consumo de açúcares: 1. FERMENTAÇÃO 2. RESPIRAÇÃO • LEVEDURAS: microorganismos anaeróbicos facultativos (capazes de metabolizar açúcares em ausência e em presença de oxigênio)
  13. 13. Glicose + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 Pi 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ MITOCÔNDRIA: Respiração aeróbica • Presença de O2 • Libera CO2 e H2O • 36-38 ATP CITOSSOL: Fermentaçao • Ausência de O2 • Acetaldeído > Etanol • 2 ATP EFEITO “CRABTREE” • Presença de O2 • Elevadas concentrações de glicose • Produção de Etanol GLICÓLISE
  14. 14. ATP ADP+Pi Hexoquinase Glicose-6-fosfato Frutose-6-fosfato Frutose-1,6-difosfato ATP ADP+Pi Fosfofrutoquinase Fosfoglicose isomerase Aldolase Gliceraldeído-3-fosfato Triose-fosfato isomerase NAD+ NADH+H+ Pi 1,3-difosfoglicerato 2 ATP 2 ADP+Pi 3-fosfoglicerato FG quinase 2-fosfoglicerato FG mutase H2O Fosfoenolpiruvato (PEP) 2 ATP 2 ADP+Pi Piruvato quinase Piruvato (2) D-Glicose D-Frutose Glicerol GLICÓLISE Fosfato de Di-hidroxiacetona
  15. 15. Fosforilação da glicose Isomerização da glicose Fosforilação da frutose-6-fosfato Clivagem da frutose-1,6-difosfato Interconversão das trioses Oxidação do gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-difosfoglicerato Transferência de Pi para o ADP Conversão do 3-fosfoglicerato em 2-fosfoglicerato Desidratação do 2-PG para Fosfoenolpiruvato Transferência do grupo-P para o ADP PREPARAÇÃO PRODUÇÃODEENERGIA
  16. 16. Glicólise
  17. 17. Acetil CoA Coenzimas reduzidas Piruvato desidrogenasePiruvato CO2 NAD+ NADH+H+ HS CoA Ciclo de Krebs CO2 Coenzimas oxidadas RESPIRAÇÃO CADEIA RESPIRATÓRIA O2 H2O NADH, FADH2 38 ATP
  18. 18. Etanol FERMENTAÇAO Frutose-1,6-difosfato 2 ATP 2 ADP+ 2 Pi Gliceraldeído-3-fosfato D-Glicose D-Frutose Fosfato de Di-hidroxiacetona 1,3-difosfoglicerato Piruvato Etanol CO2 Acetaldeído NAD+ NADH + H+ 4 ADP + 4 Pi 4 ATP Regeneração de NAD+
  19. 19. Produtos da Fermentação Alcoólica
  20. 20. Etanol Ácido acético Monoterpenos Ácidos graxos Ésteres Ácido succínico Alcoóis superiores Aldeídos CetoácidosAcetaldeído Glicerol Diacetil H2SPrincipais metabólicos sensorialmente ativos produzidos durante a fermentação alcoólica Swiegers et al. 2005. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavour. Australian J Grape Wine Res, 11(2):139-73.
  21. 21. Principais compostos aromáticos ÁLCOOIS SUPERIORES Origem: início da fOH • via degradativa: descarboxilação e desaminação de aminoácidos presentes no meio; • via biosintética (após depleção do meio) Fatores: altas temperaturas, alta concentração de inóculo, aeração. ÁCIDOS ORGÂNICOS Origem: • vias metabólicas intermediárias (acetato*, malato, succinato) • via biosintética de ácidos graxos Fatores: adição de alcalinos; concentração de P, Mg e biotina.
  22. 22. ÉSTERES Origem: final da fOH • reações entre álcoois e acil-CoA • diretamente proporcional à produção de álcoois Principal: acetato de etila (acetil-CoA + etanol) Fatores: anaerobiose; restrição de crescimento (falta de aeração e nitrogênio) COMPOSTOS CARBONÍLICOS Diacetilo*, aldeídos** (acetaldeído) Origem: descarboxilação oxidativa de hidroxiácidos*; intermediários na produção de álcoois superiores Metabolizados pela levedura ao final da fOH. Fatores: cinética e eficiência da fermentação
  23. 23. COMPOSTOS SULFUROSOS Origem: matéria-prima; metabolismo do enxofre; enxofre inorgânico; suplementação. • Sulfeto de hidrogênio (H2S): quebra de metionina e cisteína (autólise ou turnover proteico)
  24. 24. Regulação entre respiração e fermentação O2 • Cinética da fermentação • Consumo de açúcares • Produção de etanol Biomassa Efeito Pasteur Alta demanda de ADP na mitocôndria (substrato para oxidação fosforilativa) Carência de ADP e Pi no citoplasma Redução do transporte de açúcares Inibição da fermentação Consumo de açúcares pelas leveduras Liberação de CO2 Deslocamento do O2 disponível Condições semi- anaeróbicas
  25. 25. Regulação entre respiração e fermentação EFEITO PASTEUR Sob condições anaeróbicas, a cinética da glicólise é maior do que em aerobiose, ou alternativamente, a fermentação é suprimida em presença de oxigênio.  Condições: baixas concentrações de glicose ou limitações de nutrientes. EFEITO CRABTREE OU PASTEUR-NEGATIVO Mesmo sob condições aeróbicas, a fermentação predomina sobre a respiração (NADH gerado na glicólise é oxidado pela via fermentativa)  Condições: altas concentrações de glicose ou limitações de nutrientes.
  26. 26. Regulação entre respiração e fermentação EFEITO CUSTER Inibição transitória da fermentação em condições anaerobióticas.  Oxigênio estimula a produção de etanol devido â ausência de NAD+ intracelular devido à secreção de acetato pela célula  Condições: pequenas concentrações de oxigênio ou aceptores orgânicos de hidrogênio (acetoína) > atuam como aceptor exógeno de H para reestabelecer o equilíbrio redox e regenerar NAD+
  27. 27. Outros tipos de fermentação Fermentação gliceropirúvica 1. Presença de sulfito (SO3 2− ) no meio, que se combina com acetaldeído, impedindo regeneraçao de NAD+ pela alcool-desidrogenase. 2. Síntese intensa de proteínas, lipídios, nucleotídeos, etc. (início da fOH) = alto requerimento de piruvato como substrato. • Levedura oxida NADH a partir do fosfato de dihidroxiacetona. • Ocorre consumo de ATP (!), mas que é necessário para recuperar o balanço redox intracelular.
  28. 28. Outros tipos de fermentação “Fermentação maloláctica” 1. Ocorre posteriormente à fermentaçao alcoólica em vinhos. 2. Bactérias capazes de resistir ao ambiente de baixo pH e elevado teor alcoólico. 3. Oenococcus oeni.
  29. 29. Parada e lentidão de fermentação 1. Elevadas concentrações de açúcares Excessiva concentração de etanol 2. Extremos de temperatura Modificações na fluidez da membrana. 3. Anaerobiose Oxigênio é necessário para sintetizar ergosterol: crescimento e adaptação ao meio. 4. Deficiência de nutrientes
  30. 30. 4. Presença de substâncias antifúngicas Resíduos de pesticidas. 5. Presença de ácidos graxos de cadeia média (6 a 10 C) Afetam a viabilidade celular (baixas temperaturas e ausencia de aeraçao) 6. Antagonismo entre microorganismos Competição por nutrientes.

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