Fundamentos de técnicas
blotting: Southern,
Northern, Western.
Bioquímica I
DULCE CAROLINA ROJAS HERRERA

2013

FACULTAD C...
Universidad Autónoma de Sinaloa
Química Farmacéutica Bióloga

Nombre de la alumna:
Rojas Herrera Dulce Carolina

Nombre de...
En las últimas décadas la tecnología de
recombinación del ADN también
conocida como ingeniería genética, o
más acertadamen...
Una sonda es un fragmento de tamaño variable (de pocos nucleótidos como 50
pb hasta 2 kb) que puede ser ADN o ARN, que se ...
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Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de
RNA (moléculas de RNA marcadas con radioac...
Western blot.
El Western blot, o
analítica
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tisular).

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en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que
poseen carga negativa, migran hacia el electrodo...
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las posiciones de
hibridación de la sonda radiactiva sobre la membran...
Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el
Southern blot. Después de la hibridación con ...
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
 http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf

 http://prezi.com/5oqtln5q1xkx/fundamento-y-utilidad...
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  1. 1. Fundamentos de técnicas blotting: Southern, Northern, Western. Bioquímica I DULCE CAROLINA ROJAS HERRERA 2013 FACULTAD CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS
  2. 2. Universidad Autónoma de Sinaloa Química Farmacéutica Bióloga Nombre de la alumna: Rojas Herrera Dulce Carolina Nombre del maestro: Dr. Eduardo Armienta Aldana Materia: Bioquímica I Grupo: 204 Culiacán Rosales , Sinaloa 26 de Octubre de 2013
  3. 3. En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también conocida como ingeniería genética, o más acertadamente recombinación genética in vitro, ha revolucionado la biología. El campo de la salud es uno de los más beneficiados con el desarrollo de esta tecnología. Las investigaciones que se realizan en esta área están enfocadas a un diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su posible tratamiento a través de la terapia con moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la manipulación de genes proporciona una herramienta fundamental para la eliminación futura de enfermedades mortales para el hombre. Por estas razones resulta útil que el médico de asistencia esté familiarizado con conceptos básicos sobre biología molecular, su aplicación en la investigación biomédica, y en especial con sus posibles aplicaciones clínicas, conceptos estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la literatura biomédica, tanto básica como clínica. Entre los fenómenos que se estudian son la hibridación que es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de un proceso de unión de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena. Es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos. En otras palabras una purina siempre está encarada a una pirimidina. Las dos cadenas de polinucleótidos de la doble hélice están conectadas mediante uniones hidrógeno entre bases. En condiciones normales, una G se une específicamente con una C, mientras que una A solamente se puede unir con una T. El par de bases GC tiene tres uniones hidrógeno, mientras que el par AT tiene solamente dos. Como consecuencia, se necesita más energía para romper el par GC que el par AT. El hecho de que una cadena de ADN sea complementaria a la otra permite una reproducción exacta del material genético; así, cada cadena puede servir como molde (“template”) para la síntesis de otra. Cualquier hibridación en la que la complementariedad sea inferior al 70% se considerará como no-homóloga y, por tanto, ocurre en condiciones de baja astringencia (temperatura baja y/o concentración alta de sales). Esta técnica también permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas).
  4. 4. Una sonda es un fragmento de tamaño variable (de pocos nucleótidos como 50 pb hasta 2 kb) que puede ser ADN o ARN, que se une específicamente por complementariedad de bases a la 5 secuencia que se encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos más. Este sucede lo que mencionábamos anteriormente el evento de unión por bases complementarias que se conoce como hibridación. Se dice que la sonda “hibrida” con el fragmento específico. Una característica fundamental de la sonda es que lleva alguna “marca” para que pueda detectarse la unión y por ende, identificar la secuencia de interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Existen nucleótidos comerciales marcados con fósforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes técnicas le permite ser detectada mediante la exposición de la membrana a una placa autorradiográfica (como la de los rayos X). Existen varias técnicas basadas en la hibridación entre ellas PCR, CGH ISH: FISH, CISH, SISH y las de nuestro estudio que son las técnicas de transferencia o “blotting”: Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN y ARN respectivamente. La técnica de Southern fue desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y por analogía la separación de ARN se denominó Northern y la transferencia de proteínas que se denominó Western blot. El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes. Estas técnicas comienzan con una electroforesis en gel con el objetivo de separar las moléculas por su tamaño, posteriormente la transferencia a una membrana para finalmente identificar un fragmento específico de ADN, una molécula de ARN particular o una proteína de interés mediante la unión específica de otra molécula de ácido nucleico (sonda) para ADN o ARN o anticuerpo para proteínas. La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:   Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
  5. 5.  Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda ELECTROFORESIS Se separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis  Con proteínas se utiliza un gel de poliacrilamida  Con ácidos nucleicos se utiliza un gel de agarosa TRANSFERENCIA (BLOTTING) Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva. AUTORRADIOGRAFÍA Se añaden Anticuerpos radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B).
  6. 6. Western blot. El Western blot, o analítica usada específicas en una mezcla compleja de tisular). inmunoblot, es una técnica para detectar proteínas muestra determinada (una proteínas, como un extracto Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antígenos y de anticuerpos específicos. En la actualidad el Western blot es el estudio confirmatorio más empleado para el diagnóstico del SIDA. Se emplean antígenos virales obtenidos por cultivo celular. Mediante electroforesis se separan las diferentes proteínas víricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y secundariamente se incuban con el suero problema. Los anticuerpos se detectan añadiendo una antiIgG humana marcada con una enzima (peroxidasa) que produce una banda coloreada al añadir un sustrato. Esta técnica identifica anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas del VIH. Las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante la aplicación de un campo eléctrico y un tampón de transferencia para llevar las proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al positivo o ánodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sándwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana. Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de
  7. 7. proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana. La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere (especialmente en comparación con las otras técnicas). Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y un resultado indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser considerado como positivo. Southern blot. Es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda. Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern. Los pasos para Southern blot: 1. Extracción del ADN: Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. 2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción. El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,que es una enzima que corta el ADN bicatenarios en donde tenga una secuencia característica. 3. Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis
  8. 8. en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa 4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot"): Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. 5. Hibridación con sonda radioactiva: Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano.
  9. 9. 6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, La membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía. 7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales: En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN" Northern blot Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y Gelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las muestras de RNA son normalmente separadas en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante del RNA para obtener su estructura secundaria. Los geles pueden ser teñidos con bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta para observar el RNA. Los geles de poliacrilamida con urea también pueden utilizarse, aunque esto suele limitarse a fragmentos de RNA o miRNA, ya que crean un tamaño de poro mas estrecho en su matriz, por lo que el RNA que suele utilizarse no podría desplazarse por el gel.
  10. 10. Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido dela vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos.
  11. 11. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA  http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf  http://prezi.com/5oqtln5q1xkx/fundamento-y-utilidad-de-tecnicas-empleadas-para-el-diagnosticoen-la-inmunologia/  http://www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a%C3%B1o/bioquimica/molecular.pdf     http://www.jove.com/science-education/5065/el-western-blot?language=Spanish http://es.scribd.com/doc/7176351/Southern-Northern-Western-Blot http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp6.pdf

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