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Paradigma dell’Ingegneria Tissutalecellule                  coltivazione in vitro   tessuto ingegnerizzatoscaffold
Esempio di ingegneria tissutale        P. Bianco, Nature, 2001
Stato dell’arteJ. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010
Stato dell’arte-2Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010
Cellule: classificazione               Autologhe                CelluleSingeniche       per        Allogeniche            ...
Tipi di cellule                              Condrociti                              Osteoblasti            Specializzate ...
Cellule staminali• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di  cellule.• PLURIPOTENTI: possono specializzar...
Matrice extracellulare (ECM)Nei tessuti connettivi• Glicoproteine• Proteoglicani• Acido ialuronico• MineraliProteine (coll...
ScaffoldÈ un supporto (impalcatura) di tipo organico oinorganico, naturale o artificiale, polimerico onon.Funzioni princip...
Scaffold: caratteristiche ideali                   Bio-                compatibilità                                      ...
Scaffold: morfologiaFibroso          Spugnoso        Gelatinoso
Coltivazione in vitro                                Fasi•   Prelievo (biopsia)•   Isolamento (washing, filtrazione, centr...
Sistemi di coltivazione in vitro• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well  plates, flask)• Sistemi di espa...
Vantaggi di un bioreattoreUn bioreattore consente di:• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno  della coltura• P...
Stirred Flask Bioreactor
Rotating wall Bioreactor
Direct Perfusion Bioreactor
Modellazione matematicaLa modellazione matematica e la simulazionecomputazionale hanno lo scopo di:• Riduzione dei costi d...
Modellazione matematica-2I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dalProgramma di Bioingegneria del CRS4 sono...
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Cartilagini ingegnerizzate-2     Modello matematico
Cartilagini ingegnerizzate-3     Modello matematico-2
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Cartilagini ingegnerizzate-7Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA
Cartilagini ingegnerizzate-8Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA
Esempi di applicazione: IIEspansione e differenziazione di MSC in condrociti eosteoblasti (tessuto connettivo/osseo)Coltiv...
Espansione e differenziazione di MSC
Espansione e differenziazione di MSC-2          Modello matematico
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Espansione e differenziazione di MSC-6Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura
Esempi di applicazione: IIIEspansione e differenziazione di CNSSC in astrociti(tessuto non connettivo)Coltivazione in sist...
Espansione e differenziazione di CNSSC
Espansione e differenziazione di CNSSC-2           Modello matematico
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Espansione di MSC (cellule ovine)       Modello matematico
Espansione di MSC (cellule ovine)-2Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)
Esempi di applicazione: V             Espansione di condrociti oviniColtivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzio...
Espansione di condrociti ovini      Modello matematico
Espansione di condrociti ovini-2  Sistema statico, petri dishes, medium DMEM
Espansione di condrociti ovini-3
Esempi di applicazione: VI  Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVECColtivazione in sistemi statici, petri dishe...
Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC          Modello matematico
Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial Cell...
Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3
Possibili campi di applicazioneL’approccio modellistico presentato può essereutilizzato in diversi campi della biomedicina...
Riferimenti bibliografici•   R. Langer e J.P. Vacanti. Tissue engineering. Science, 260, 920-926, (1993).•   L.E. Freed e ...
Riferimenti bibliografici-2•   F. Barry, R.E. Boynton, B. Liu e J.M. Murphy. Chondrogenic differentiation of    mesenchyma...
Riferimenti bibliografici-3•   M. Pisu, A. Concas, N. Lai e G. Cao. A novel simulation model for engineered    cartilage g...
Riferimenti bibliografici-4•   L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, G. La Nasa, A.    Concas...
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Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule

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L’ingegneria tissutale ha dato impulso allo sviluppo della tecnica di coltivazione in vitro delle cellule che possono essere fatte crescere, espandere e differenziare su adatti terreni di coltura e con l’impiego di specifici fattori di crescita. La coltivazione delle cellule/tessuto può avvenire con l’ausilio di bioreattori di una certa semplicità costruttiva (stirrer flask) o di maggiore complessità (perfusion bioreactor, horizontal rotating wall bioreactor). In linea teorica la coltura cellulare può essere effettuata con cellule già specializzate (cardiomiociti, condrociti, cellule epiteliali, endoteliali, etc.) o con cellule staminali indifferenziate. Queste ultime sono attualmente oggetto di intenso studio nei laboratori di tutto il mondo, sia per l’individuazione dei meccanismi di base dello sviluppo cellulare, sia per la messa a punto di terapie innovative. I trattamenti medici per la riparazione di tessuti/organi necessitano di numerose cellule che però sono disponibili solo in quantità esigue richiedendo, pertanto, lo sviluppo di efficienti tecniche di coltivazione in vitro. Nel corso del seminario sarà presentata l’attività di ricerca svolta dai ricercatori del Programma di Bioingegneria del CRS4 nel recente passato, con particolare riferimento ai modelli di simulazione e codici di calcolo sviluppati per descrivere la crescita, espansione e differenziazione di cellule con tecniche di coltivazione in vitro.

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Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule

  1. 1. Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita edifferenziazione in vitro di cellule Massimo Pisu CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina massimo@crs4.it
  2. 2. Indice degli argomenti• Breve introduzione all’Ingegneria tissutale• Coltivazioni cellulari e bioreattori• Modellazione matematica e simulazione• Risultati ottenuti: alcuni esempi• Potenziali applicazioni
  3. 3. Ingegneria Tissutale: Definizione «L’Ingegneria Tissutale è un campointerdisciplinare della bioingegneria che applica diversi principi dell’ingegneria e delle scienzebiologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o migliorare funzioni di tessuti o organi» R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)
  4. 4. Causa patologie e terapie correnti• L’organo/tessuto può essere danneggiato per patologie, anomalie congenite, incidenti, interventi chirurgici• Attualmente, per la cura di questi difetti del tessuto, si procede col trapianto d’organo o inserimento di altro tessuto dello stesso paziente, inserimento di dispositivi artificiali e trattamento farmacologico
  5. 5. Paradigma dell’Ingegneria Tissutalecellule coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzatoscaffold
  6. 6. Esempio di ingegneria tissutale P. Bianco, Nature, 2001
  7. 7. Stato dell’arteJ. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010
  8. 8. Stato dell’arte-2Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010
  9. 9. Cellule: classificazione Autologhe CelluleSingeniche per Allogeniche impianto Xenogeniche
  10. 10. Tipi di cellule Condrociti Osteoblasti Specializzate EndotelialiCellule Non specializzate Epatociti (Staminali) ……..
  11. 11. Cellule staminali• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di cellule.• PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.• MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare.
  12. 12. Matrice extracellulare (ECM)Nei tessuti connettivi• Glicoproteine• Proteoglicani• Acido ialuronico• MineraliProteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG),Minerali (idrossiapatite)L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge lafunzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e didivisione tra i diversi tessuti
  13. 13. ScaffoldÈ un supporto (impalcatura) di tipo organico oinorganico, naturale o artificiale, polimerico onon.Funzioni principali dello scaffold• Conferire la forma 3D desiderata del tessuto• Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM• Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto impiantato prima della biodegradazione in vivo.
  14. 14. Scaffold: caratteristiche ideali Bio- compatibilità Bio- degradabilitàPorosità Proprietà in vivo controllata Garantire adesione cellulare
  15. 15. Scaffold: morfologiaFibroso Spugnoso Gelatinoso
  16. 16. Coltivazione in vitro Fasi• Prelievo (biopsia)• Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga)• Seeding su scaffold• Espansione/crescita/differenziazione Analisi e caratterizzazione• Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA)• Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker)• Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter• Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso
  17. 17. Sistemi di coltivazione in vitro• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well plates, flask)• Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari tipi)I bioreattori consentono il raggiungimento di altedensità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemistatici (106/cm3)
  18. 18. Vantaggi di un bioreattoreUn bioreattore consente di:• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno della coltura• Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari• Monitorare e regolare i parametri fisico- chimici in tempo reale• Produzione su larga scala di cellule e tessuti
  19. 19. Stirred Flask Bioreactor
  20. 20. Rotating wall Bioreactor
  21. 21. Direct Perfusion Bioreactor
  22. 22. Modellazione matematicaLa modellazione matematica e la simulazionecomputazionale hanno lo scopo di:• Riduzione dei costi della sperimentazione• Progettazione di apparecchiature• Ottimizzazione delle condizioni operative
  23. 23. Modellazione matematica-2I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dalProgramma di Bioingegneria del CRS4 sono basatiprincipalmente su:• Principi di conservazione della massa (specie coinvolte, ossigeno, nutrienti, ECM, GFs)• Bilancio di popolazione (sulle cellule)- I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa / dimensione caratteristica / diametro).- I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti, ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare, trasformazione (differenziazione)
  24. 24. Modellazione matematica-3• Le equazioni del modello sono implementate in un codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN• La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o algebrico-differenziali risultanti viene effettuata tramite librerie matematiche standard (esempio IMSL)• Un singolo run di calcolo, in base alla complessità, può richiedere pochi minuti o parecchie ore.• Il modello viene validato mediante confronto diretto con i dati sperimentali disponibili.
  25. 25. Sistemi investigati• Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate;• Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo);• Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo);• Espansione di MSC (cellule ovine);• Espansione di condrociti ovini;• Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
  26. 26. Esempi di applicazione: IEspansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzateColtivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASAcommissionato per il MIT) , utilizzo di condrocitiarticolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti abase di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
  27. 27. Cartilagini ingegnerizzate Culture Culture medium bulk medium Sterile gas a incubator Culture medium z Scaffolds h/2 d/2 b 0 y q x z r h/2 d d/2 c 0 r d
  28. 28. Cartilagini ingegnerizzate-2 Modello matematico
  29. 29. Cartilagini ingegnerizzate-3 Modello matematico-2
  30. 30. Cartilagini ingegnerizzate-4 PO2=80 mm hg t=10 days
  31. 31. Cartilagini ingegnerizzate-5 PO2=40 mm hg t=5 weeks
  32. 32. Cartilagini ingegnerizzate-6Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg
  33. 33. Cartilagini ingegnerizzate-7Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA
  34. 34. Cartilagini ingegnerizzate-8Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA
  35. 35. Esempi di applicazione: IIEspansione e differenziazione di MSC in condrociti eosteoblasti (tessuto connettivo/osseo)Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellulemesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM,uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1
  36. 36. Espansione e differenziazione di MSC
  37. 37. Espansione e differenziazione di MSC-2 Modello matematico
  38. 38. Espansione e differenziazione di MSC-3 Modello matematico-2
  39. 39. Espansione e differenziazione di MSC-4Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily
  40. 40. Espansione e differenziazione di MSC-5 t=21 daysSistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1
  41. 41. Espansione e differenziazione di MSC-6Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura
  42. 42. Esempi di applicazione: IIIEspansione e differenziazione di CNSSC in astrociti(tessuto non connettivo)Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine,aggiunta di LIF, Activin-A
  43. 43. Espansione e differenziazione di CNSSC
  44. 44. Espansione e differenziazione di CNSSC-2 Modello matematico
  45. 45. Espansione e differenziazione di CNSSC-4 Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF
  46. 46. Espansione e differenziazione di CNSSC-5 Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A
  47. 47. Espansione e differenziazione di CNSSC-6 t=3 days Coltivazione con aggiunta di Activin A
  48. 48. Esempi di applicazione: IV Espansione di MSC (cellule ovine)Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine,soluzione di nutrienti a base di MEM (MinimumEssential Medium Eagle)
  49. 49. Espansione di MSC (cellule ovine) Modello matematico
  50. 50. Espansione di MSC (cellule ovine)-2Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)
  51. 51. Esempi di applicazione: V Espansione di condrociti oviniColtivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione dinutrienti a base di DMEM
  52. 52. Espansione di condrociti ovini Modello matematico
  53. 53. Espansione di condrociti ovini-2 Sistema statico, petri dishes, medium DMEM
  54. 54. Espansione di condrociti ovini-3
  55. 55. Esempi di applicazione: VI Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVECColtivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione dinutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) +EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)
  56. 56. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC Modello matematico
  57. 57. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial CellGrowth Medium (EGM-2)
  58. 58. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3
  59. 59. Possibili campi di applicazioneL’approccio modellistico presentato può essereutilizzato in diversi campi della biomedicina:• Ingegneria Tissutale;• Medicina rigenerativa;• Coltivazione cellulare per Terapia Genica;• Studio dell’evoluzione di masse tumorali.
  60. 60. Riferimenti bibliografici• R. Langer e J.P. Vacanti. Tissue engineering. Science, 260, 920-926, (1993).• L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Tissue engineering of cartilage. In: J.D. Bronzino, ed. The Biomedical Engineering Handbook. New York: CRC Press, 1995, pp. 1788– 1806, (1995).• G. Vunjak-Novakovic, L.E. Freed, R.J. Biron e R. Langer. Effects of mixing on the composition and morphology of tissue engineered cartilage. AIChE J 42, 850, (1996).• B. Obradovic, J.H. Meldon, L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Glycosaminoglycan deposition in engineered cartilage: experiments and mathematical model. A.I.Ch.E. Journal 46, 1860, (2000).• M. Satoh, H. Sugino e T. Yoshida. Activin promotes astrocytic differentiation of a multipotent neural stem cell line and an astrocyte progenitor cell line from murine central nervous system. Neuroscience Letters 284, 143–146, (2000).• P. Bianco. Stem cells in tissue engineering. Nature, 414,118-121, (2001).
  61. 61. Riferimenti bibliografici-2• F. Barry, R.E. Boynton, B. Liu e J.M. Murphy. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp. Cell Res. 268, 189–200, (2001).• C.G. Wilson, L.J. Bonassar e S.S. Kohles. Modeling the dynamic composition of engineered cartilage. Arch. Biochem. Biophys. 408, 246, (2002).• M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, F. Delogu e G. Cao. A simulation model for the growth of tissue engineered cartilage on polymeric scaffolds. Journal of Chemical Reaction Engineering, http://www.bepress.com/ijcre/vol1/A38, (2003).• M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, A. Concas e G. Cao. Modeling of engineered cartilage growth in rotating bioreactors. Chemical Engineering Science, 59, 5035-5040, (2004).• X. Bai, Z. Xiao, Y. Pan, J. Hu, J. Pohl, J. Wen e L. Li. Cartilage-derived morphogenetic protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes. Biochem, Biophys. Res. Commun. 325, 453–460, (2004).
  62. 62. Riferimenti bibliografici-3• M. Pisu, A. Concas, N. Lai e G. Cao. A novel simulation model for engineered cartilage growth in static systems. Tissue Engineering, 12, 2311-2320, (2006).• M. Pisu, A. Concas e G. Cao. A novel simulation model for stem cells differentiation. Journal of Biotechnology. 130, 171-182, (2007).• M. Pisu, A. Concas, S. Fadda, A. Cincotti e G. Cao. A simulation model for stem cells differentiation into specialized cells of non-connective tissues, Journal of Computational Biology and Chemistry. 32, 338-344, (2008).• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, E. Desogus, F. Piras, G. Piga, G. La Nasa e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro mesenchymal stem cells proliferation. Cell Proliferation, 42,602-616 (2009).• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, A. Cincotti, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modelling of bone marrow mesenchimal stem cells proliferation. Chemical Engineering Science, 65, 562-568 (2010).
  63. 63. Riferimenti bibliografici-4• L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, G. La Nasa, A. Concas e G. Cao, In vitro ovine articular chondrocytes proliferation: experiments and modeling. Cell Proliferation, 43, 310-320 (2010).• L. Mancuso, M. Scanu, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro HUVECs proliferation in the presence of various types of drugs. Cell Proliferation, 43, 617-628 (2010).• J. Vacanti. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art, Journal of Pediatric Surgery, 45, 291–294, (2010).• R. Tozzi. Nuovi Idrogeli per lIngegneria Tissutale ed il Drug Delivery, Dipartimento farmaceutico, Università di Parma. PhD Thesis, http://hdl.handle.net/1889/1437 (2010).
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