Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule

Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita edifferenziazione in vitro di cellule Massimo Pisu CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina massimo@crs4.it

Indice degli argomenti• Breve introduzione all’Ingegneria tissutale• Coltivazioni cellulari e bioreattori• Modellazione matematica e simulazione• Risultati ottenuti: alcuni esempi• Potenziali applicazioni

Ingegneria Tissutale: Definizione «L’Ingegneria Tissutale è un campointerdisciplinare della bioingegneria che applica diversi principi dell’ingegneria e delle scienzebiologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o migliorare funzioni di tessuti o organi» R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)

Causa patologie e terapie correnti• L’organo/tessuto può essere danneggiato per patologie, anomalie congenite, incidenti, interventi chirurgici• Attualmente, per la cura di questi difetti del tessuto, si procede col trapianto d’organo o inserimento di altro tessuto dello stesso paziente, inserimento di dispositivi artificiali e trattamento farmacologico

Paradigma dell’Ingegneria Tissutalecellule coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzatoscaffold

Esempio di ingegneria tissutale P. Bianco, Nature, 2001

Stato dell’arteJ. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010

Stato dell’arte-2Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010

Cellule: classificazione Autologhe CelluleSingeniche per Allogeniche impianto Xenogeniche

Tipi di cellule Condrociti Osteoblasti Specializzate EndotelialiCellule Non specializzate Epatociti (Staminali) ……..

Cellule staminali• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di cellule.• PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.• MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare.

Matrice extracellulare (ECM)Nei tessuti connettivi• Glicoproteine• Proteoglicani• Acido ialuronico• MineraliProteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG),Minerali (idrossiapatite)L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge lafunzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e didivisione tra i diversi tessuti

ScaffoldÈ un supporto (impalcatura) di tipo organico oinorganico, naturale o artificiale, polimerico onon.Funzioni principali dello scaffold• Conferire la forma 3D desiderata del tessuto• Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM• Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto impiantato prima della biodegradazione in vivo.

Scaffold: caratteristiche ideali Bio- compatibilità Bio- degradabilitàPorosità Proprietà in vivo controllata Garantire adesione cellulare

Scaffold: morfologiaFibroso Spugnoso Gelatinoso

Coltivazione in vitro Fasi• Prelievo (biopsia)• Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga)• Seeding su scaffold• Espansione/crescita/differenziazione Analisi e caratterizzazione• Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA)• Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker)• Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter• Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso

Sistemi di coltivazione in vitro• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well plates, flask)• Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari tipi)I bioreattori consentono il raggiungimento di altedensità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemistatici (106/cm3)

Vantaggi di un bioreattoreUn bioreattore consente di:• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno della coltura• Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari• Monitorare e regolare i parametri fisico- chimici in tempo reale• Produzione su larga scala di cellule e tessuti

Stirred Flask Bioreactor

Rotating wall Bioreactor

Direct Perfusion Bioreactor

Modellazione matematicaLa modellazione matematica e la simulazionecomputazionale hanno lo scopo di:• Riduzione dei costi della sperimentazione• Progettazione di apparecchiature• Ottimizzazione delle condizioni operative

Modellazione matematica-2I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dalProgramma di Bioingegneria del CRS4 sono basatiprincipalmente su:• Principi di conservazione della massa (specie coinvolte, ossigeno, nutrienti, ECM, GFs)• Bilancio di popolazione (sulle cellule)- I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa / dimensione caratteristica / diametro).- I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti, ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare, trasformazione (differenziazione)

Modellazione matematica-3• Le equazioni del modello sono implementate in un codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN• La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o algebrico-differenziali risultanti viene effettuata tramite librerie matematiche standard (esempio IMSL)• Un singolo run di calcolo, in base alla complessità, può richiedere pochi minuti o parecchie ore.• Il modello viene validato mediante confronto diretto con i dati sperimentali disponibili.

Sistemi investigati• Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate;• Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo);• Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo);• Espansione di MSC (cellule ovine);• Espansione di condrociti ovini;• Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC

Esempi di applicazione: IEspansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzateColtivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASAcommissionato per il MIT) , utilizzo di condrocitiarticolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti abase di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

Cartilagini ingegnerizzate Culture Culture medium bulk medium Sterile gas a incubator Culture medium z Scaffolds h/2 d/2 b 0 y q x z r h/2 d d/2 c 0 r d

Cartilagini ingegnerizzate-2 Modello matematico

Cartilagini ingegnerizzate-3 Modello matematico-2

Cartilagini ingegnerizzate-4 PO2=80 mm hg t=10 days

Cartilagini ingegnerizzate-5 PO2=40 mm hg t=5 weeks

Cartilagini ingegnerizzate-6Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg

Cartilagini ingegnerizzate-7Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA

Cartilagini ingegnerizzate-8Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA

Esempi di applicazione: IIEspansione e differenziazione di MSC in condrociti eosteoblasti (tessuto connettivo/osseo)Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellulemesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM,uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1

Espansione e differenziazione di MSC

Espansione e differenziazione di MSC-2 Modello matematico

Espansione e differenziazione di MSC-3 Modello matematico-2

Espansione e differenziazione di MSC-4Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily

Espansione e differenziazione di MSC-5 t=21 daysSistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1

Espansione e differenziazione di MSC-6Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura

Esempi di applicazione: IIIEspansione e differenziazione di CNSSC in astrociti(tessuto non connettivo)Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine,aggiunta di LIF, Activin-A

Espansione e differenziazione di CNSSC

Espansione e differenziazione di CNSSC-2 Modello matematico

Espansione e differenziazione di CNSSC-4 Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF

Espansione e differenziazione di CNSSC-5 Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A

Espansione e differenziazione di CNSSC-6 t=3 days Coltivazione con aggiunta di Activin A

Esempi di applicazione: IV Espansione di MSC (cellule ovine)Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine,soluzione di nutrienti a base di MEM (MinimumEssential Medium Eagle)

Espansione di MSC (cellule ovine) Modello matematico

Espansione di MSC (cellule ovine)-2Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)

Esempi di applicazione: V Espansione di condrociti oviniColtivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione dinutrienti a base di DMEM

Espansione di condrociti ovini Modello matematico

Espansione di condrociti ovini-2 Sistema statico, petri dishes, medium DMEM

Espansione di condrociti ovini-3

Esempi di applicazione: VI Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVECColtivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione dinutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) +EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)

Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC Modello matematico

Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial CellGrowth Medium (EGM-2)

Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3

Possibili campi di applicazioneL’approccio modellistico presentato può essereutilizzato in diversi campi della biomedicina:• Ingegneria Tissutale;• Medicina rigenerativa;• Coltivazione cellulare per Terapia Genica;• Studio dell’evoluzione di masse tumorali.

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Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule

by CRS4 Research Center in Sardinia on Nov 14, 2011

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