Optimización de métodos para la producción de proteínas recombinantes en E. coli<br />
Una de las mayores limitaciones para la utilización de estrategias de alto desempeño en el estudio de proteínas es nuestra...
Ruta molecular de producción de proteínas<br />
Procedimiento general para la expresión de proteínas en E. coli<br />Los genes de interés son clonados en un vector de exp...
Parámetros optimizables<br />
Estrategias para optimización<br />Expresión de la proteína y niveles de solubilidad<br />Diseño de medios de cultivo bact...
Optimización de la transcripción<br />
Iniciación de la transcripción en E. coli<br />
Secuencias consenso<br />
Expresión de una proteína soluble a partir de un promotor consenso<br />1 y 2 – Sin inducir<br />3, 5 y 7 – Inducido con I...
¿Porqué IPTG?<br />LACTOSA PURA [500 g] $ 33.18<br />IPTG [500 g] $ 47, 409.00<br />
Represión catabólica<br />
Otros inductores: Arabinosa<br />
Sistema de expresión T7<br />
Expresión de una proteína fluorescente soluble a partir de un promotor T7<br />Marcador de peso molecular<br />1 -- Antes ...
Optimización de la traducción<br />
Uso de codones en genes de E. coli<br />
Comparación de uso de codones entre Arabidopsis y E. coli<br />Arabidopsis<br />E. coli<br />
Predicción de eficiencia de una proteína de Arabidopsis en E. coli<br />
Plan A<br />
Efecto del pRare en la expresión de una proteína de Arabidopsis en E. coli<br />
Plan B<br />
Estrategia experimental<br />
Otros parámetros<br />En cuanto a las condiciones de cultivo, los factores que han sido optimizados con mayor frecuencia s...
Crecimiento del cultivo al momento de la inducción con IPTG<br />
Modificación del medio de cultivo<br />
Concentración del inductor (IPTG)<br />
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Optimización de métodos para la producción de proteínas

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  1. 1. Optimización de métodos para la producción de proteínas recombinantes en E. coli<br />
  2. 2. Una de las mayores limitaciones para la utilización de estrategias de alto desempeño en el estudio de proteínas es nuestra baja capacidad para predecir los niveles de acumulación de los péptidos, ya sea usando sistemas libres de células o en E. coli.<br />
  3. 3. Ruta molecular de producción de proteínas<br />
  4. 4. Procedimiento general para la expresión de proteínas en E. coli<br />Los genes de interés son clonados en un vector de expresión adecuado y transformados en la cepa apropiada de E. coli<br />Las células se crecen en un medio que induzca la expresión del gene de interés<br />La biomasa del cultivo se cosecha por centrifugación , se lisan las células y la proteína de interés se purifica de los lisados celulares.<br />CADA UNO DE ESTOS PASOS PUEDE SER LIMITANTE Y POR LO TANTO ES SUSCEPTIBLE DE OPTIMIZACIÓN<br />
  5. 5. Parámetros optimizables<br />
  6. 6. Estrategias para optimización<br />Expresión de la proteína y niveles de solubilidad<br />Diseño de medios de cultivo bacterianos<br />Diseño de vectores de expresión<br />Diseño factorial de condiciones de cultivo<br />
  7. 7. Optimización de la transcripción<br />
  8. 8. Iniciación de la transcripción en E. coli<br />
  9. 9. Secuencias consenso<br />
  10. 10. Expresión de una proteína soluble a partir de un promotor consenso<br />1 y 2 – Sin inducir<br />3, 5 y 7 – Inducido con IPTG<br />4, 6 y 8 – Inducido con Lactosa<br />9 - Marcador de peso molecular<br />
  11. 11. ¿Porqué IPTG?<br />LACTOSA PURA [500 g] $ 33.18<br />IPTG [500 g] $ 47, 409.00<br />
  12. 12. Represión catabólica<br />
  13. 13. Otros inductores: Arabinosa<br />
  14. 14. Sistema de expresión T7<br />
  15. 15. Expresión de una proteína fluorescente soluble a partir de un promotor T7<br />Marcador de peso molecular<br />1 -- Antes de la inducción<br />2 -- Inducido con IPTG por 4 horas<br />
  16. 16. Optimización de la traducción<br />
  17. 17. Uso de codones en genes de E. coli<br />
  18. 18. Comparación de uso de codones entre Arabidopsis y E. coli<br />Arabidopsis<br />E. coli<br />
  19. 19. Predicción de eficiencia de una proteína de Arabidopsis en E. coli<br />
  20. 20. Plan A<br />
  21. 21. Efecto del pRare en la expresión de una proteína de Arabidopsis en E. coli<br />
  22. 22. Plan B<br />
  23. 23. Estrategia experimental<br />
  24. 24. Otros parámetros<br />En cuanto a las condiciones de cultivo, los factores que han sido optimizados con mayor frecuencia son la temperatura de crecimiento y temperatura de inducción, la densidad celular en el punto de inducción y la concentración de inductor<br />La composición del medio de cultivo también es un factor de gran interés, ya que los componentes del medio pueden afectar la producción basal de proteína recombinante, generar alta producción bajo condiciones no-inducidas o provocar liberación de la proteína al medio extracelular <br />
  25. 25. Crecimiento del cultivo al momento de la inducción con IPTG<br />
  26. 26. Modificación del medio de cultivo<br />
  27. 27. Concentración del inductor (IPTG)<br />

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