• Like
Interferència d'RNA
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Interferència d'RNA

  • 408 views
Uploaded on

 

More in: Education
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Be the first to comment
    Be the first to like this
No Downloads

Views

Total Views
408
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0

Actions

Shares
Downloads
25
Comments
0
Likes
0

Embeds 0

No embeds

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
    No notes for slide

Transcript

  • 1.  
  • 2. RNA’s d’Interferència Molècules de 20-25 nt Precursors Llargs
  • 3. Tipus d’RNAi 2 tipus: principal diferencia és com silencien l'expressió dels gens (Knock Down)
    • Bloqueja traducció proteïnes
    • No degrada mRNA
    • Aparellament imperfecte
    • Degrada mRNA
    • Aparellament perfecte
  • 4. siRNA Precursor: llargues molècules de dsRNA Dicer: RNAsa Tipus III. Degrada dsRNA a siRNA RISC: RNA-induced-silencing complex . Riboproteïna que identifica mRNA en seqüencia complementària
  • 5. RISC El complex RISC està format per l’RNAi i per diverses proteïnes. La més important és Argonauta (Ago) . Es troba en unes zones del citoplasma d’alta degradació de l’mRNA anomenades cossos P . Aquestes regions es creu que també podrien estar implicades en la sintesi de miRNA Si el RISC es troba unit a un siRNA, indueix a la degradació de l’mRNA.
  • 6. miRNA Precursor: pri-microRNA (tipus de dsRNA) RNAses: Drosha, DGCR8 i Dicer Complex silenciador: miRISC/miRNP similars a siRISC
  • 7. Processament de miRNA
  • 8. Processament de miRNA 1. Transcrició de pri-miRNA's (RNApol II) 2. Formació de bucles al pri-miRNA 3. Processament al nucli: - Formació de pri-miRNA més petits (Drosha i DGR8) 4. Transport nucli-citoplasma (Exp.5 i RanGTP) 5. Processament al citoplasma: - Tall del bucle de pri-miRNA (Dicer) - Dúplex de RNA: miRNA/miRNA* 6. Acoplament de miRISC: degrada miRNA*, incorpora miRNA 7. Complex RISC-miRNA: - Reconeixement de regions diana al mRNA (miRNA) - Bloqueig de la traducció(RISC)
  • 9. Inhibició traduccional Els miRNA es caracteritzen per aparellament imperfecte amb la regió diana del mRNA, després d'aquest reconeixement reprimeixen l'expressió gènica (Knock down). Aquest procés ,també, es dóna als cossos P La inhibició transcripcional es pot dur a terme de 3 formes: -Repressió de la traducció abans que s'inicii -Inhibició de la traducció un cop iniciada -Desestabilització del RNA per deadenilació
  • 10. http://www.youtube.com/watch?v=kCxQdXX0Dbk
  • 11. Malatia d’Alzheimer
  • 12. Aplicació de siRNA contra BACE1 Raó principal: L’estructura característica del lloc actiu de BACE1 dificulta la possible creació de petites molècules inhibidores pel lloc actiu. Un cop vist que pels mètodes tradicionals no era viable, és va optar per l’alternativa d’utilitzar siRNA (lenti-siRNA, que actuen en cèl·lules no divisories com les neurones) contra BACE1. La idea és que el siRNA s’uneixi al mRNA que codifica per BACE1, inhibint així l’expressió d’aquest. Ja que un cop unit el siRNA al mRNA causa el seu bloqueig i la seva degradació.
  • 13. Experiment 1 (I)
    • Agafen 7 construccions de siRNA per comprovar quin és més efectiu.
    • D’aquests només són efectius 3, ja que són els que baixen la quantitat de BACE1 i els nivells de A β :
    • D’aquests 3 només el si-BACE1-1 i el si-BACE1-6 són aplicables a l’experiment ja que són els que actuen tant en humans com en ratolins, ja que nosaltres experimentem amb ratolins.
    • S’acaba escollint siBACE1-6 perquè és el més efectiu.
  • 14. Experiment 1 (II)
    • El tractament amb siBACE1-6 redueix l’acúmul del pèptid A β en cèl·lules transgèniques APP
  • 15. Experiment 2
    • Injecció de vectors lentivirals amb siBACE1-6 o siGlut4 (control) a l’hipocamp de ratolins transgènics APP i ratolins no transgènics
    • Immunodetecció de BACE1 a l’hipocamp disminueix en els ratolins tractats amb Lenti-BACE1-6 respecte als tractats amb Lenti-siGlut4. Al neocortex, on no hem injectat, la presència de BACE1 no depén del lentiviral sinó que hi ha diferència entre el trans-APP i el no trans.
  • 16. Experiment 3 Immunoreactivitat de APP i CTF a l’hipocamp (a): en transgènics APP tractats amb lenti-siGlut4, APP i CTF molt alts en comparació als tractats amb lenti-siBACE1-6. Els no transgènics presenten nivells normals ELISA A β 1-42 (b): en transgènics APP tractats amb lenti-siGlut4, els nivells de A β 1-42 són molt més alts que els no transgènics, mentres que els transgènics APP tractats amb lenti-BACE1-6 presenten nivells una mica més propers als no transgènics
  • 17.
    • Fluoresecència de proteïnes A β a l’hipocamp i neocortex : en els no transgènics no hi ha un acúmul notable, mentres que en els transgènics APP tractats amb Lenti-siGlut4 si que es pot apreciar l’A β (e,i). A l’hipocamp de transgènics APP tractats amb Lenti-BACE1-6 (f) hi ha una disminució de l’acúmul de A β , mentre que al neocortex on no vam injectar res no hi ha hagut canvis respecte a l’altre transgènic APP.
  • 18. Experiment 4
    • Per comprovar l’efecte de lenti-siBACE1-6 en la neurodegeneració  immunoreactivitat de Map2 per anticossos específics
  • 19. Experiment 5
    • Per comprovar si lenti-siBACE1-6 produeix un a millora en la conducta dels transgènics APP
    • Morris water maze: mètode de mesura de l’aprenentatge i la memòria espacial
  • 20.
    • Durant l’experiment es comprova que el transgènic APP tractat amb lenti-siBACE1-6 mostren un comportament molt similar al dels no transgènic (a). En canvi, el transgènic APP tractat amb lenti-Glut4 presenta més dificultats per desplaçar-se al lloc de la plataforma quan aquesta està amagada.