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- 1. フ リ ー ソ フ ト で は じ め る メ チ ル 化 デ ー タ 解 析 ⼊入 ⾨門 ＝ S e q C a p E p i デ ー タ 対 応 ＝ 第 4 0 回 勉 強 会 資 料料 2014年年12⽉月18⽇日
- 2. 上記はほんの⼀一部 ⽇日々、多くのソフトが公開されている Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 2 N G S デ ー タ 解 析 の フ リ ー ソ フ ト QC • cutadapt • FastQC • FastX-‐‑‒toolkit • Trimmomaic : 多くのツールは公開されているフリーソフトであり、LinuxというOSで動作する アライメント • bowtie • bwa • BSMAP • Tophat : ※Rなど、WindowsやMacでも動くものもある メチル化解析・⽐比較 ・アノテーション • BSMAP • methylKit • BisSNP :
- 3. Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 3 L i n u x と は UNIX互換のサーバー向けOS（オペレーティングシステム） つまり、多⼈人数で同時に利利⽤用し、常時稼働していることを想定したコンピューター UNIXは権利利問題などで、⼀一般⼈人の⼿手の届かない存在となったため、Linus⽒氏がUNIXを 参考にして、PCで動く独⾃自OSを開発 Linux ⼤大多数の解析ツールを使⽤用することができる 新しいツールが出た時、すぐ⾃自分で試せる 次世代シーケンシングデータのように、⼤大 きなデータは、Excel等で⾒見見る事が難しい ⾃自分の思い通りにデータの可視化や加⼯工ができる バイオインフォマティクスで使⽤用する解析ツールの 多くは、Linux⽤用に作成されている 「Primerを数百個作りたい」「数万個の配列列がどの遺伝⼦子に当たるの か確認したい」という時、同じ作業を何度度も繰り返す事は、難しい 繰り返し作業を⾃自動化する事ができる ⼤大量量データの扱い 繰り返し操作の簡易易化 解析ツールの問題
- 4. Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 4 L i n u x と は Linuxにはさまざまなディストリビューション（配布形式）がある Debian系・・・Ubuntuなど Red Hat系・・・Red Hat Enterprise Linux（商⽤用）、CentOS（無償）など ⾒見見た⽬目やパッケージ管理理形式が異異なるが、基本的な操作コマンドは同じ 解析サーバにCentOSをお奨めする理理由 • 更更新⽅方針が保守的で、アップデートが頻発しない • 枯れた技術を使っていて、安定している 弊社販売の 解析サーバで 使⽤用
- 5. Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 5 解 析 ⼿手 法 の ご 紹 介 • 今回の解析で⽤用いたサーバ OS CentOS6 64bit CPU Intel Corei7-‐‑‒3930K[3.2GHz/6Core] メモリ 64GB SSD 64GB（OS⽤用） HDD 2TB × 4台 時間がかかる処理理については実⾏行行時間を⽰示します
- 6. バ イ サ ル フ ァ イ ト シ ー ケ ン ス に よ る メ チ ル 化 解 析 で で き る こ と 次世代シーケンサによるメチル化解析は、⾼高解像度度に網羅羅的解析が可能 です。 • 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（WGBS）解析 • ターゲットメチローム解析 SeqCap Epi CpGiant Enrichment Kit （ロシュ） • ターゲットエンリッチメントされたライブラリー調整が可能 • ターゲットはヒトゲノム上の550万以上のCpGサイト 代表的なビーズアレイ（HumanMethyla2on450 DNA Analysis Kit）が検出 できる 45 万箇所に対して 12 倍以上 • SNVとメチル化を⾒見見分けることが可能 6Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved.
- 7. バ イ サ ル フ ァ イ ト シ ー ケ ン ス の 原 理理 メチル化 が存在 ⾮非メチル化 C が に シーケンス結果では が に シーケンシング バイサルファイト変換処理理 Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 7
- 8. テストデータと解 析 概 要 • 使⽤用テストデータ（ゲノムDNA） – ヒト末梢⾎血単核球(PBMC) – PBMC由来のiPS 細胞 • SeqCap Epi CpGiant Enrichment Kitを使⽤用してライブラリー調整 • Illumina Hiseq2000を使⽤用 – 150 bp – ペアエンド フリーソフトによる解析を コマンド例例と共に⼀一部紹介します Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 8
- 9. ク オ リ テ ィ コ ン ト ロ ー ル ｜ F a s t Q C • FastQCを⽤用いて、シーケンスリードのクオリティを確認 • FastQCの出⼒力力結果例例 $ fastqc –nogroup PBMC_R1.fastq PBMC_R2.fastq -o ./1_qc Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 9
- 10. 低クオリティリードのトリミング｜ Trimmomatic • Trimmomaicを⽤用いて、 クオリティの低い リードをトリミング • 4種類のファイルを出⼒力力 PBMC_R1_trimmed.fq PBMC_R1_unpaired.fq PBMC_R2_trimmed.fq PBMC_R2_unpaired.fq • Unpairedには、トリミングの結果、ペアのうち⽚片⽅方のリード⻑⾧長が 75 塩基未満となったリードが含まれる $ java -Xms30g -Xmx30g –jar /home/amelieff/bin/ ¥ trimmomatic-0.32.jar PE -threads 4 -phred33 ¥ PBMC_R1.fastq PBMC_R2.fastq ¥ PBMC_R1_trimmed.fq PBMC_R1_unpaired.fq ¥ PBMC_R2_trimmed.fq PBMC_R2_unpaired.fq ¥ LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:5:20 MINLEN:75 リードのトリミング条件 -‐‑‒ リードの両端のクオリティが 20（Phred-‐‑‒score）未満 -‐‑‒ 5 bpのウィンドウで塩基の平均クオリティが 20（Phred-‐‑‒score）未満 Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 10 コマンドは¥を除いて1⾏行行で⼊入⼒力力してください
- 11. マ ッ ピ ン グ ｜ B S M A P • BSMAPを⽤用いて、リードをリファレンスにマッピング hg19および λファージゲノム（NC_̲001416）をリファレンスとし て⽤用いる。 • Picardを⽤用いて、SAMをBAMに変換 $ bsmap -r 0 -s 16 -n 1 -a ../1_qc/PBMC_R1_trimmed.fq ¥ -b ../1_qc/PBMC_R2_trimmed.fq -d hg19.fa ¥ -p 4 –o PBMC.sam $ java -Xmx30g -Xms30g -jar /home/amelieff/bin/ ¥ AddOrReplaceReadGroups.jar ¥ VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT ¥ INPUT=PBMC.sam ¥ OUTPUT=PBMC.bam CREATE_INDEX=TRUE ¥ RGID=PBMC RGLB=PBMC RGPL=illumina ¥ RGSM=PBMC RGPU=platform_unit Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 11
- 12. メ チ ル 化 率率率 の 算 出 ｜ B S M A P • BSMAP（methratio.py）を⽤用いて、メチル化率率率を算出 [-i skip]オプション • 出⼒力力結果例例 $ python /home/amelieff/bin/methratio.py ¥ -d hg19.fa ¥ -s /home/amelieff/src/bsmap-2.74/samtools -m 1 ¥ -z -i skip –o PBMC.methylation_results.txt PBMC.bam Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 12 ：C の逆鎖が A になっている領領域は、SNPの可能性があるため出⼒力力しない … … すべての C の領領域について（1塩基毎）メチル化した塩基数を算出
- 13. バ イ サ ル フ ァ イ ト 変 換 効 率率率 の 算 出 ｜ BSMAP • λファージゲノムのメチル化率率率を算出 • バイサルファイト変換効率率率を算出 – LAMBDA_Cs: 2431 LAMBDA_METHYLATED_Cs: 10 LAMBDA_CONVERSION_EFFICIENCY: 99.5886 $ python /home/amelieff/bin/methratio.py ¥ -d hg19.fa ¥ -s /home/amelieff/src/bsmap-2.74/samtools ¥ -m 1 -z -i skip –c NC_001416 ¥ –o PBMC.NC_001416.methylation_results.txt PBMC.bam $ awk ‘$2>=4500 && $2<=6500{c+=$7; ct+=$8}END ¥ {print "LAMBDA_Cs:", ct, "LAMBDA_METHYLATED_Cs:", ¥ c, "LAMBDA_CONVERSION_EFFICIENCY:", ¥ (1-(c/ct))*100}‘ ¥ PBMC.NC_001416.methylation_results.txt ⼀一般的に 99.5 %以上であれば実験に問題はないと判断 Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 13
- 14. サ ン プ ル 間 で メ チ ル 化 率率率 を ⽐比 較 ｜ methylKit • methylKitを⽤用いて、PBMCとPBMC由来iPS細胞のメチル化率率率を⽐比較 – methylKitのFisherテストにおいて、qvalue< 0.01 、かつ メチル化率率率に 25 %以上の差が⾒見見られた領領域を出⼒力力 • 出⼒力力ファイル（diff25pct.txt）の例例 R --vanilla --slave --args sample_num sample_list.tsv ¥ graph_output refseq.bed.txt cpgi.bed.txt < ¥ sce_methylkit.R コントロールと⽐比較して、⾼高メチル化（＋）低メチル化（−） Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 14
- 15. ア ノ テ ー シ ョ ン ｜ m e t h y l K i t • methylKitを⽤用いて、メチル化率率率の⽐比較と同時にUCSCのアノテー ション情報を付加することも可能 メチル化程度度に差があった領領域を、アノテーションごとに分類して図を出⼒力力 Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 15
- 16. ア ノ テ ー シ ョ ン ｜ m e t h y l K i t • メチル化 C の TSS（翻訳開始点）からの距離離を算出 – dist.to.feature（bp）： TSSとの距離離 – feture.name ： 近傍の遺伝⼦子名 省 略 ここで出⼒力力される領領域は、すべて qvalue< 0.01 , メチル化率率率の差 25 ％以上 TSSが 上流流 にある場合は（−） 下流流 にある場合は（＋）で表記 順鎖から⾒見見た時の 遺伝⼦子の向き 5’ → 3’（＋） 3’ → 5’（−） Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 16
- 17. S N P の 検 出 ｜ B i s -‐‑‒ S N P • Bis-‐‑‒SNPを⽤用いて、既知のSNP情報を利利⽤用してSNPを検出 • dbSNPに登録されているSNP情報を与える • SNPして検出された C が、VCFファイルに出⼒力力される （PBMC.snp.raw.vcf） $ java -Xmx30g -jar /home/amelieff/bin/ ¥ BisSNP-0.82.2.jar -R hg19.fa -I ¥ PBMC.recal.bam -T BisulfiteGenotyper ¥ –D dbsnp_135.hg19.sort.vcf ¥ -vfn1 PBMC.cpg.raw.vcf –vfn2 PBMC.snp.raw.vcf ¥ -L 130912_HG19_CpGiant_4M_EPI_CpG.bed ¥ -stand_call_conf 20 -stand_emit_conf 0 ¥ -mmq 30 -mbq 0 -nt 4 Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 17
- 18. 結 果 の 可 視 化 ｜ I G V 順鎖のメチル化率率率：ピンク 逆鎖のメチル化率率率：ブルー 25 %以上差のある⾼高メチル化：レッド 25 ％以上差のある低メチル化：グリーン PBMC iPS diff25pct PBMC (BAM) iPS (BAM) SNP SNP情報 refSeq(ID) refSeq(name) Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 18 (Integra2ve Genomics Viewer -‐ Broad Ins2tute)
- 19. 結 果 の 可 視 化 ｜ I G V PBMC iPS diff25pct PBMC (BAM) iPS (BAM) BAMファイルでマッピング結果を確認しなが らメチル化率率率をチェック可能 Strand別に結果を確認可能 リファレンスが C の時には、 ⾮非メチル化 C が T としてBAMで確認される Copyright © Amelieff Corpora2on. All Rights Reserved. 19 (Integra2ve Genomics Viewer -‐ Broad Ins2tute)
- 20. Copyright © Amelieff Corpora2on All Rights Reserved. 20 アメリエフ バイオインフォマティクス 調査リクエストサービス バイオ研究の解析に使⽤用するソフトや解析⼿手法について、 無償で調査するサービスです。調査結果はアメリエフの ブログでご紹介いたします。 申込みフォーム http://goo.gl/g3SOtU ア メ リ ク